CN107224607A - 牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法 - Google Patents

牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107224607A
CN107224607A CN201610170298.XA CN201610170298A CN107224607A CN 107224607 A CN107224607 A CN 107224607A CN 201610170298 A CN201610170298 A CN 201610170298A CN 107224607 A CN107224607 A CN 107224607A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tendon
stem cell
tgf
parodontium
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610170298.XA
Other languages
English (en)
Inventor
张建国
周彦恒
施松涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Tai Sheng Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Tai Sheng Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Tai Sheng Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Tai Sheng Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610170298.XA priority Critical patent/CN107224607A/zh
Publication of CN107224607A publication Critical patent/CN107224607A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/365—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/3662—Ligaments, tendons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/10—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of tendons or ligaments

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明公开了一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法。其特征在于，利用海藻酸盐微球耦合RGD三肽装载TGF‑β3提供一个独特的肌腱组织工程3d细胞交架的方法来改善牙源性细胞分化成肌腱组织的微环境，同时评估了从牙周膜和牙龈中提取的干细胞与上述海藻酸盐微球复合参与肌腱再生的能力。通过体外及体内试验，证明了上述复合体系能够支持干细胞的活性和分化成肌腱样组织。建立牙源性MSC作为肌腱组织的再生的种子细胞，强调了微环境及感应信号(TGF‑β3)对于牙源性MSC的活性和向肌腱样组织分化起着重要的作用。该方法对优化肌腱再生及四肢骨骼的修复具有很好的应用前景。

Description

牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种装载TGF-β3、RGD修饰的并载入了牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞的海藻酸盐微球共载体系的牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法。
背景技术
肌腱损伤可引起患者长期疼痛、不适和功能障碍。其有限的自我修复能力使得用再生治疗方法来功能性修复肌腱损伤显得尤为必要。间充质干细胞的应用可能为肌腱再生和修复提供新的治疗选择。
因为取材方便，在牙源性间充质干细胞中的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞引来广泛关注，其可从口腔临床中废弃的生理组织中提取。该牙源性干细胞已经通过体内外的实验证明了其多向分化的能力。另外，因为牙周韧带含有肌腱样的胶原束，可以承受口腔咬合力，在肌腱再生治疗中，牙周膜干细胞表现出作为种子干细胞独特的潜力。
研究表明TGF-β通路在肌腱再生中起着很重要的作用。TGF-β3由于它是一个与促进皮肤伤口和肌腱愈合无纤维疤痕形成有关的同种型。由TGF-β3引导的间充质干细胞分化，能促进肌腱组织形成。为了修饰微环境特性和引导细胞向特定表型分化，将海藻酸凝胶和RGD相结合。海藻酸盐能提供一种利于MSCs的空间分布的三维支架，从而能得到一种类似于体内微环境的结构组织。
最近，本研究团队通过体内外实验发现，结合RGD的海藻酸凝胶可用于复合PDLSCs和GMSCs用作软骨再生，开发了一个能给牙源性MSCs(PDLSCs和GMSCs)的复合提供三维架构的共载体系。假设装有TGF-β3，复合PDLSCs和GMSCs的RGD修饰的海藻酸水凝胶微球具有肌腱再生能力，对肌腱组织工程是一项有前景的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤a.祖细胞分离和培养
选择并收集18-25岁因需拔牙的健康患者第三周磨牙的牙龈组织和牙齿，要求无任何牙周病史，送至实验室；
步骤b.生物材料制备
选取RGD-coupled海藻酸盐作为支架材料，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β3混合。
步骤c.细胞复合
将上述混合有TGF-β3配体的海藻酸盐中复合牙源性干细胞，将其添加到CaCl2溶液中以形成微球。
所述步骤b中还包括以下分步骤：
分步骤1，选取RGD-coupled的海藻酸盐，对其进行纯化和部分氧化(2％)，以增加其降解性；
分步骤2，收集该海藻酸盐、对其进行减压、冷冻及干燥处理；
分步骤3，将上述经过处理后的海藻酸盐与TFG-β3进行混合。
所述步骤c中还包括以下分步骤：
分步骤1，将步骤b中所得到的含有TGF-β3的RGD-coupled海藻酸盐溶液分别与PDLSCs、GMSC两种细胞以2*106cells/mL的比例混合；
分步骤2，逐滴将上述混合物(MSC-混合物)添加到100mMCaCl2的溶液中行成微球；
分步骤3，将上述微球在37℃环境中孵育45分钟以完成交联；
分步骤4，用不完全的DMEM清洗上述微球，清洗三遍。
本发明所提供的方法有益效果是：通过含有TGF-β3配体的RGD三肽耦合海藻酸盐微球作为牙源性MSC的复合载体，改善了牙源性细胞分化成肌腱样组织的微环境，为肌腱组织工程提供了一个独特的3d细胞交架。GMSCs很容易从口腔中获取，或者从废弃组织中提取，这些MSC源可以被认为是理想的干细胞库来源，在基于MSC的组织再生中很有潜力，该方法对于优化肌腱再生以及四肢骨骼修复等方面都有潜在应用前景。
附图说明
图1是本发明的步骤流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：参照图所示，本发明所提供的一种牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法包括以下步骤：
步骤1.祖细胞分离和培养
牙龈组织和牙齿是从二十岁左右的来自南加州大学的健康男性患者的第三磨牙中收集的(18-25岁)，无任何牙周病史的样本才能被纳入本研究。
步骤2.生物材料制备和细胞复合
使用RGD-coupled海藻酸盐(NovaMatrix FMC Biopolymer,Norway)作为支架材料。进行海藻酸的纯化和部分氧化(2％)来增加其降解性。随后，海藻酸盐被收集起来，在减压下冷冻干燥，和TGF-β3(Invitrogen,Carlsbad,CA)混合。
PDLSCs、GMSC和hBMMSCs(作为阳性对照)分别复合在含有TGF-β3配体的海藻酸盐中。细胞被复合在海藻酸盐的密度是2*106cells/mL。逐滴把MSC-海藻酸盐混合物添加到100mM CaCl2溶液中形成微球。形成的微球在37℃孵育45分钟来完成交联，然后用不完全DMEM洗三遍。没有细胞(也不带有TGF-β3)的RGD-coupled海藻酸盐水凝胶作为阴性对照。
步骤3.活细胞/死细胞染色
培养14天后，复合的MSC细胞的活性使用钙黄绿素染色活细胞和溴化乙锭二聚体染色死细胞(Invitrogen)。用NIH ImageJ测量软件(NIH，Bethesda，MD)测量活细胞的百分比。通过没有RGD的复合牙源性MSC，hBMMSCs的藻酸盐微球培养14天后的活细胞/死细胞染色测定，来评估RGD三肽的存在对复合MSC的活性的影响。
步骤4.扫描电镜(SEM)
通过扫描电子显微镜(SEM)(JEOL 5300,Peabody,MA)来观察微球的形态和结构特征。在常规培养基培养14天后，MSC藻酸盐微球用2毫升PBS洗一遍，用1％戊二醛固定过夜。样本使用酒精溶液分级脱水，溅射镀黄金，并用扫描电镜观察。
步骤5.共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)
使用CLSM(Fluoview FV10i,Olympus Corp,Tokyo,Japan)进一步来观察复合MSC的藻酸盐微球样品形貌。在培养的第14天，复合的细胞用多聚甲醛(4％)固定30分钟，用PBS(pH＝7.4)清洗，然后用0.1％Triton x-100在室温下孵育5分钟。抗CD146-FITC和CD105-PE抗体(Abcam)作为MSC的阳性标记物。此外，抗CD34-PE抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)作为阴性标记物。所有的标本用DAPI进行细胞核染色复染。
步骤6.体外释放曲线
为了描述TGF-β3、RGD-coupled海藻酸微球的释放曲线，装载三个不同浓度(10、50、100毫克/毫升)TGF-β3，在500ul high-glucose DMEM与100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素在48孔板中培养，37℃摇床一周。在每个选定的时间间隔(1、3、5、7、10、12、14天)收集其培养基，使用TGF-β3ELISA试剂盒(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)来分析TGF-β3的释放。在释放曲线研究的最后，将余留的TGF-β3从微球中提取出来，通过50mM柠檬酸钠脱水溶液(SigmaAldrich，St Louis，MO)在蒸馏水中溶解藻酸盐支架，来测量总共释放的TGF-β3的百分比。最后，释放的TGF-β3的百分比通过两周后的释放量占最初添加量的百分比来计算。
步骤7.体外培养和免疫荧光染色
为了诱导腱向分化、复合的PDLSCs和GMSC，hBMMSCs(2*106cells/mlTGF-β3装载的海藻酸微球)在含有DMEM 15％的血清，2mML-glutamine，100nMDex，1003M ascorbic酸2Mm sodium丙酮酸(R&D Systems Inc.)，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的成腱培养基中培养。无细胞RGD-coupled没有装载TGF-β3海藻酸微球作为阴性对照。
诱导4周后，样本用4％PFA固定，石蜡包埋切片。切片使用一抗Tenomodulin(Tnmd)Eya 1,Eya2(from Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Dallas,TX)，和Scleraxis(Abcam)标记4℃过夜，Alexafluor染料标记的二抗(1:200稀释；Invitrogen)检测，再用DAPI复染。
步骤8.RNA提取、逆转录和实时定量PCR
按照以往文献发表的方法将细胞培养2周后，提取RNA。10个藻酸盐微球被收集起来，在一个包含50mM柠檬酸钠脱水溶液和80mM氯化钠(SigmaAldrich)的无菌解聚缓冲液温和搅拌15-20分钟使其溶解。溶散后，无荚膜的细胞在9400g离心机离心10分钟，微球用PBS清洗，9400g再次离心3分钟。总RNA使用试剂盒试剂(Invitrogen)提取。100ng总RNA使用一个标注着IIIcDNA合成试剂盒(Invitrogen)来合成单链的cDNA。用2DDCt方法进行数据分析，规范化看家基因GAPDH(甘油醛3脱氢酶甘油醛)的Ct。
步骤9.免疫印迹分析
培养四周后，干细胞的分化使用免疫印迹法进行了分析。干细胞藻酸盐在柠檬酸缓冲液(6％w/v，pH值7.4)溶解。离心分离得到的细胞球，用PBS洗两次，用蛋白质提取缓冲液(Bio-Rad,Irvine,CA)溶解30s。离心分离弃上清，通过一个已知BSA标准系列浓度在一个数量级连续稀释外推的BCA试验(Pierce,Rockford,IL)测蛋白浓度。取相同质量的细胞裂解液，上样，电泳，转膜封闭。硝化纤维膜用针对孵化腱调蛋白(Tnmd)(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)的兔抗体孵育。免疫蛋白复合物用1:500(polyclonal goat anti-rabbitIgG/HRP,EMD Millipore,Billerica,MA)二抗检测。剪膜，重新用抗b-actin的抗体检测，以保证每一条带添加的质量相同。化学荧光试剂(Amersham LifeScience,Pittsburgh,PA)添加到膜上1分钟，X光片自动洗片机来洗片，曝光不同时间来观察图像。
步骤10.肌腱组织再生动物模型
我们体内试验中所有的动物均根据南加州大学对动物的使用和护理指导法规进行处理。PDLSCs、GMSC和hBMMSCs(大约4*106细胞)复合在装满TGF-β3的藻酸盐微球上，10微球(500毫升)移植入5个月大的裸小鼠(Harlan,Livermore,CA；N1/44for each group)背部皮下。8周后，小鼠被处死，微球和周围组织利用组织学和免疫组织化学切片染色分析。无细胞的没有TGF-β3的RGD-coupled海藻酸微球作为阴性对照。
步骤11.组织学和免疫组织化学分析
组织学分析：标本用10％福尔马林溶液固定，在一系列上升浓度的乙醇中脱水，石蜡包埋。用切片机切成6um切片，放在载玻片上。每个移植样本随机选择4个横切片，进行HE和Masson染色。另外，组织切片用偏振光显微镜观察评价胶原合成。
免疫组化分析：石蜡切片浸泡在3％过氧化氢/甲醇15分钟，抑制非特异性内源性过氧化物酶活性。切片用一抗(1：200-1：300稀释)孵育1h。切片用anti-Tenomodulin(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,1:100dilution)，anti-Eya 1,anti-Eya2(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,1:100dilution)，anti-Scleraxis(Abcam,1:100dilution)进行免疫组织化学分析，并用苏木精复染。
RGD三肽对复合MSC肌腱再生能力的的影响与无RGD的藻酸盐微球相比较。将微球用上述方法进行移植，并将切片进行HE和Masson染色。阳性染色由每个实验组4个独立样本测定。从每个样本随机选择五个区域，然后每一区域阳性染色区用NIH ImageJ软件测量，计算其占总区域的百分比。
步骤12.统计分析
用Kruskal-Wallis rank sum test来分析数据，a＝0.05为显著性检验水平。同时，如需要时，用two-tailed Student’st-test来进行配对检验。定量数据表示为mean±SD。
结果分析：
1.生物材料制备和特性
用一个复合RGD海藻酸盐体系来研究PDLSCs和GMCSs对肌腱组织分化和再生的能力。通过hBMMSCs复合藻酸盐微球作为阳性对照，而藻酸盐微球作为阴性对照。此外还检测了RGD-coupled海藻酸对MSC的活性和分化作用。制造的藻酸盐微球的平均直径为1±0.1mm。PDLSC、GMSC和hBMMSC组之间的活细胞比例没有明显的差异(P>0.05)。
经过两周的培养，进一步用CLSM检测复合的牙源性干细胞的特性，显示细胞表达干细胞特异性抗体CD146和CD105，但不表达CD34。这些结果证明了RGD耦合的海藻酸盐作为PDLSCs，GMSC以及hBMMSCs复合的生物材料的适用性。
下一步，预备三种不同TGF-β3浓度(10、50和100毫克/毫升)的藻酸盐微球，描绘两周内TGF-β3从RGD耦合海藻酸支架的释放曲线。总的释放曲线证实TGF-β3释放长达14天。通过评估最初TGF-β3占配体的比例，证实50毫克/毫升TGFb3呈现出最好的释放曲线。因此接下来的实验研究选择了该浓度。
2.牙源性MSC在体外的腱向分化
腱调蛋白(Tnmd)是II型跨膜糖蛋白，主要表达于肌腱和韧带等组织。已经被证实早期表达Scleraxis的祖细胞最终形成肌腱组织。Eya1和Eya2基因在肢体肌腱发育和编码激活转录功能中被表达。这些转录因子参与包括肌腱和韧带发育的许多细胞和发育过程。
对TGF-β3装载的海藻酸盐微球在肌腱再生中的分子机制进行研究。用几个与肌腱分化相关的基因标记物来检测相关基因的表达，包括转录因子Scleraxis(Scx)，细胞外基质蛋白Decorin(Dcn)和表面标记Tenomodulin(Tnmd)，以及二聚糖(Bgy)，这是一个一型的富含亮氨酸的蛋白多糖(SLRP)，参与调节胶原蛋白的原纤维形成。这些基因的表达水平是通过RT-PCR来证实和比较。然而对所有的检测基因，PDLSCs比GMSC或hBMMSCs有显著更高的表达水平(p<0.05)。在Scx、DCnTnmd或Bgy表达水平上，hBMMSCs和GMSC之间没有的显著差异(P>0.05)。然而，对于所有的测试基因，hBMMSCs比GMSC有更高的表达。进一步的分析清晰地证实在细胞腱向分化中，TGF-β3比RGD扮演着更重要的角色。在TGF-β3配体存在下，对体外腱向分化两周的没有支架复合的hBMMSCs PDLSCs，GMSC的Dcn和Tnmd表达水平进行检测。
3.体内异位肌腱再生
通过免疫缺陷的老鼠皮下异位移植实验评估PDLSCs和GMSC复合在RGD耦合的装载TGF-β3的藻酸盐微球中再生肌腱组织的能力。组织学切片HE和Masson染色显示了波形排列的腱样结构的纤维存在。实验和阳性对照组三色染色进一步证实了移植8周后肌腱样组织的存在，但在阴性对照组，无细胞移植组，没有组织学证据显示肌腱样组织再生。PDLSC组比hBMMSC，GMSC组观察到更多的黄色(网状)染色的胶原。用免疫组化来检测基因表达蛋白从而进一步描述牙源性MSC介导的肌腱体内再生的特性。

Claims (3)

1.牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤a.祖细胞分离和培养
选择并收集18-25岁因需拔牙的健康患者第三周磨牙的牙龈组织和牙齿，要求无任何牙周病史，送至实验室；
步骤b.生物材料制备
选取RGD-coupled海藻酸盐作为支架材料，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β3混合；
步骤c.细胞复合
将上述混合有TGF-β3配体的海藻酸盐中复合牙源性干细胞，将其添加到CaCl2溶液中以形成微球。
2.根据权利要求1所述的牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：所述步骤b中的生物材料制备还包括以下分步骤：
分步骤1，选取RGD-coupled的海藻酸盐，对其进行纯化和部分氧化(2％)，以增加其降解性；
分步骤2，收集该海藻酸盐、对其进行减压、冷冻及干燥处理；
分步骤3，将上述经过处理后的海藻酸盐与TFG-β3进行混合。
3.根据权利要求1所述的牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法，其特征在于：所述步骤c中的细胞复合还包括以下分步骤：
分步骤1，将步骤b中所得到的含有TGF-β3的RGD-coupled海藻酸盐溶液分别与PDLSCs、GMSC两种细胞以2*106cells/mL的比例混合；
分步骤2，逐滴将上述混合物(MSC-混合物)添加到100mM CaCl2的溶液中行成微球；
分步骤3，将上述微球在37℃环境中孵育45分钟以完成交联；
分步骤4，用不完全的DMEM清洗上述微球，清洗三遍。
CN201610170298.XA 2016-03-23 2016-03-23 牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法 Pending CN107224607A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610170298.XA CN107224607A (zh) 2016-03-23 2016-03-23 牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610170298.XA CN107224607A (zh) 2016-03-23 2016-03-23 牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107224607A true CN107224607A (zh) 2017-10-03

Family

ID=59931452

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610170298.XA Pending CN107224607A (zh) 2016-03-23 2016-03-23 牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107224607A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755481A (zh) * 2021-08-31 2021-12-07 上海市口腔医院(上海市口腔健康中心) 一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144069A (zh) * 2007-08-22 2008-03-19 黄显成 从口腔组织中培养间质干细胞的方法
CN102747033A (zh) * 2012-06-26 2012-10-24 亚太干细胞科研中心有限公司 一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法
CN104046587A (zh) * 2013-03-11 2014-09-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种调控干细胞体外三维定向分化的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144069A (zh) * 2007-08-22 2008-03-19 黄显成 从口腔组织中培养间质干细胞的方法
CN102747033A (zh) * 2012-06-26 2012-10-24 亚太干细胞科研中心有限公司 一种由牙龈组织培养间充质干细胞和成纤维组织的方法
CN104046587A (zh) * 2013-03-11 2014-09-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种调控干细胞体外三维定向分化的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALIREZA MOSHAVERINIA: "Application of stem cells derived from the periodontal ligament or gingival tissue sources for tendon tissue regeneration", 《BIOMATERIALS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755481A (zh) * 2021-08-31 2021-12-07 上海市口腔医院(上海市口腔健康中心) 一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Moshaverinia et al. Application of stem cells derived from the periodontal ligament or gingival tissue sources for tendon tissue regeneration
Yang et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix-based scaffold
Merckx et al. Chorioallantoic membrane assay as model for angiogenesis in tissue engineering: Focus on stem cells
US8192987B2 (en) Human dental follicle stem cells and methods for obtaining
Seib et al. Tissue engineering a surrogate niche for metastatic cancer cells
KR102339700B1 (ko) 입자상 탈세포화 조직을 포함하는 하이브리드 겔
CN109666629A (zh) 人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及用途
Sequeira et al. Regeneration of pulp-dentin complex using human stem cells of the apical papilla: In vivo interaction with two bioactive materials
CN101263224A (zh) 脂肪组织衍生的基质干细胞在治疗瘘中的用途
JP2021518331A (ja) 細胞加齢の反転のための一過性細胞リプログラミング
Hashemi et al. Decellularized pancreas matrix scaffolds for tissue engineering using ductal or arterial catheterization
CN106492194A (zh) 一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用
Zhang et al. Recapitulation of growth factor-enriched microenvironment via BMP receptor activating hydrogel
Allen et al. Environmental manipulation to promote stem cell survival in vivo: use of aggregation, oxygen carrier, and BMP-2 co-delivery strategies
CN113677700A (zh) 细胞结构体及细胞结构体的制造方法
CN103748215A (zh) 骨和软骨的自体人成熟多能性极小胚胎样(hvsel)干细胞的细胞再生
Mahoney et al. Adipose derived delivery vehicle for encapsulated adipogenic factors
KR20030043937A (ko) 혈관분포된 조직 이식편
JP6198199B2 (ja) 平行線維性結合組織の製造方法
KR102286779B1 (ko) 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체
JPWO2019178296A5 (zh)
Liang et al. Perfusable adipose decellularized extracellular matrix biological scaffold co-recellularized with adipose-derived stem cells and L6 promotes functional skeletal muscle regeneration following volumetric muscle loss
CN107224607A (zh) 牙周膜和牙龈干细胞实现肌腱组织再生的方法
KR101617673B1 (ko) 성체줄기세포 및 엘라스틴 유사 폴리펩타이드를 포함하는 상처 치료 촉진용 약학적 조성물
Zhou et al. Involvement of bone marrow stem cells in periodontal wound healing

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171003