CN113755481A - 一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用。本发明利用细胞球培养板三维培养技术，制备无支架牙周膜干细胞球并将无支架牙周膜干细胞球应用到成骨分化相关的组织工程。本发明的无支架牙周膜干细胞球具有良好的稳定性和生物活性，及较强的成骨分化效能，可用作牙周组织工程、骨组织工程领域中的细胞骨替代材料或与支架材料结合运用，提高成骨效能。通过该发明培养收集所得的无支架牙周膜干细胞球大小均匀一致，能够维持较长时间的细胞活性；与此同时，本发明制备方法可重复，简便易行，不需要依赖大型设备或装置，有利于快速有效获得细胞球结构。

Description

一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用。
背景技术
目前，传统的细胞培养以培养瓶或培养皿为代表的二维培养模式为主。该培养模式并不具备活体组织的空间形态，在培养过程中，细胞往往出现某一特定组织性质丢失的情况。在真实的人体环境中，相邻细胞之间以及胞外基质间相互渗透沟通，形成立体的空间组织，构成复杂的生物化学信号网络，这一结构对细胞的正常生理活动意义重大。多数情况下，二维细胞培养方法体外研究所得结果与体内实验不相符合，一方面与细胞在体外环境下随着传代次数的增多逐渐丧失其原有性状有关，另一方面也与体内实验受到多种因素和复杂环境影响所致。为了尽可能真实地模拟细胞所处的体内微环境，越来越多的研究开始关注细胞三维培养。
研究发现，细胞球成球机理主要与细胞的黏附和分化有关，在细胞球的形成过程中整合素、钙粘蛋白、胞外纤维等被发现或表达上调。制作细胞球的方法主要有悬滴培养(hanging drop)、利用旋转生物反应器(rotating bioreactor)培养、无黏附表面的塑料制品培养、利用外部力量制作、改变培养基成分、微基板等方法。上述方法往往存在批量生产较困难、所获得细胞球尺寸、数目及形态有差异、培养细胞类型有限，需专门设备成本高等问题。相对而言，细胞培养板法操作简便，可批量生产，逐渐应用于三维细胞培养领域。该方法以琼脂糖凝胶等为载体，利用预置尺寸的模具在6孔板、24孔板或96孔板中制作不同尺寸孔板，通过接种不同种类和数量的的细胞来制备细胞球。
牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)来源于新鲜牙周膜组织，具有很高的增殖和克隆形成能力，高表达间充质干细胞标记物STRO-1和CD146/MCU18，具备多向分化潜能，是较为理想的牙周组织再生的种子细胞来源。研究表明相较于二维培养细胞，三维培养所得的PDLSC细胞球成骨分化能力有所提高。应用三维动态微重力装置培养PDLSCs发现，经过成骨诱导后细胞基质矿化结节有所增加，相关基因表达上调。将hPDLSCs包裹于海藻酸钠微球中，应用生物反应器模拟体内环境观察动态液流对PDLSCs生物活性的影响。经过14天成骨诱导后，细胞表现出更为显著的矿化能力，结果显示生物反应器培养有利于细胞成骨分化和矿化基质的形成。将PDLSCs接种于葡聚糖微载体，比较旋转微重力培养环境与普通重力环境对细胞生长状态的影响，发现在微重力环境下微载体表面细胞多呈半球形，细胞生长速度明显加快。与普通培养方式相比，PDLSC细胞球呈现出一定的成骨趋势。采用悬滴培养法形成牙周膜成纤维细胞球，将其与胶原/聚乙二醇膜复合，发现细胞球能黏附于膜上，免疫组化染色结果显示细胞表达Col-I、periostin和Runx2。上述所制备的无支架牙周膜干细胞球在制备和使用过程中大多需要依赖支架材料。然而，多数支架材料的降解速度与细胞的生长分化不一定能相互协调。部分支架材料的降解产物为酸性，可能导致局部炎症的发生。支架材料在原料及配比选择、层次结构及降解性能等方面尚有待改善，才能更真实模拟细胞外基质环境。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种无支架牙周膜干细胞球及其制备方法与应用。本发明不依赖于支架材料，由细胞自组装形成三维细胞结构。在这个三维结构中，细胞与细胞以及细胞所分泌的细胞基质直接接触。相邻细胞之间以及胞外基质间相互渗透沟通，形成立体的空间组织，构成复杂的生物化学信号网络。传统的细胞培养以培养瓶或培养皿为代表的二维培养模式为主。二维培养模式并不具备活体组织的空间形态，在培养过程中，细胞往往出现某一特定组织性质丢失的情况。然而，本发明中的三维细胞结构能够更好地提供类似真实人体内细胞外基质环境，增加细胞间的连接，促进细胞间的相互作用，对细胞的正常生理活动意义重大。通过该方法培养收集所得的无支架牙周膜干细胞球体积形态均一，能够维持较长时间的细胞活性，同时比二维培养细胞成骨能力显著提高，在体内可形成类骨样组织。制作方法可重复，简便易行，不需要依赖大型设备或装置，有利于快速有效获得细胞球结构。本发明开发具有成骨效应的无支架牙周膜干细胞球应用于组织工程领域，有很好的前景和价值。
本发明的发明目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备细胞球培养板：配置琼脂糖溶液加入到二维细胞培养六孔板的孔中，将模具放置在六孔板的琼脂糖(agarose)溶液内，待琼脂糖溶液凝固后拔出模具，使得琼脂糖凝胶中形成井孔，即得到细胞球培养板；
(2)井孔润洗：用PBS润洗细胞球培养板的每个井孔；
(3)牙周膜干细胞接种：将牙周膜干细胞细胞悬液加入细胞球培养板的井孔中，井孔中加入培养液，然后将细胞球培养板放入细胞培养箱中；
(4)无支架牙周膜干细胞球培养：培养1天后，更换培养液，以后每隔2天换一次培养液；
(5)利用显微镜观察其生长状况，待形成无支架牙周膜干细胞球后进行收集。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，配置琼脂糖溶液并加热，待琼脂糖溶液为液体状态时将模具沿着一侧孔边缘向另一侧边缘缓缓放入；待琼脂糖溶液凝固成形后，垂直拔出模具。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述琼脂糖溶液中琼脂糖与去离子水的质量比为1：100。
在本发明的一个实施方式中，在接种细胞之前，需要在细胞球培养板每井孔中加入至少1ml PBS溶液进行润洗，以赶走孔中气泡并浸润球板表面，保证含有细胞的培养液能迅速渗入，避免细胞无法进入细胞球井孔。
在本发明的一个实施方式中，细胞球培养板每井孔接种牙周膜干细胞1.0×103个～1.5×103个，接种细胞量过少生物活性程度低，接种细胞量过大容易造成细胞球中心细胞的死亡。
在本发明的一个实施方式中，将细胞球培养板静置在细胞培养箱中。
在本发明的一个实施方式中，所述更换培养液的方式为半换液方式及沿培养板侧壁吸取培养液，即每次仅更换一半体积的培养液，避免触碰到球体；吸液或加液时需要沿着孔洞侧壁轻轻吸取或加入液体，以避免损失细胞球。
在本发明的一个实施方式中，细胞球在接种24小时后会形成球体。在接种初期，随着细胞增殖细胞数量增多，但细胞球呈现体积变小向中心聚集的状态。在这种状态下，可能由于营养输送不及时和废物排泄不通畅导致球体中心细胞坏死。故相较于传统培养方法中每2-3天更换一次培养基，细胞球培养中要求培养基的更换频率为每1-2天更换一次。并且，培养基的量要足够，6孔板中每孔每次更换2ml或更多。
在本发明的一个实施方式中，无支架牙周膜干细胞球收集过程中，用枪头吸取PBS液体进行吹吸，将含有细胞球的PBS液体轻轻放入离心管中，静置一段时间后，弃上清得到细胞球。
在本发明的一个实施方式中，可以通过小于细胞球直径的细胞筛收集无支架牙周膜干细胞球。
本发明的第二个目的是提供一种无支架牙周膜干细胞球，所述无支架牙周膜干细胞球通过上述方法制备得到。
本发明的第三个目的是提供一种无支架牙周膜干细胞球的应用，所述无支架牙周膜干细胞球应用于组织工程领域。
在本发明的一个实施方式中，无支架牙周膜干细胞球具有良好的成骨分化性能，单独使用或与支架材料结合使用可形成新生骨组织。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明形成的无支架牙周膜干细胞球，不依赖于支架材料，由细胞自组装形成球状三维结构。相邻细胞之间以及胞外基质间相互渗透沟通，形成立体的空间组织，构成复杂的生物化学信号网络，从而增加细胞间的连接，促进细胞间的相互作用。
(2)本发明培养收集所得的无支架牙周膜干细胞球大小均匀一致，能够维持较长时间的细胞活性。通过骨诱导，无支架牙周膜干细胞球在体外表现出比二维培养细胞更好的成骨分化能力，同时在裸小鼠体内可形成类骨样组织。
(3)本发明制备方法可重复，简便易行，不需要依赖大型设备或装置，有利于快速有效获得无支架牙周膜干细胞球结构。
(4)本发明制备得到的无支架牙周膜干细胞球，可单独使用或与支架材料结合使用可形成新生骨组织，可用于牙周组织再生﹑骨组织再生等组织工程领域。无支架牙周膜干细胞球与支架材料结合运用于骨组织再生，不限于特定类型的支架材料。
附图说明
图1为无支架牙周膜干细胞球制备示意图。
图2为无支架牙周膜干细胞球成球过程形态示意图。
图3为无支架牙周膜干细胞球成球过程各项参数示意图。
图4为无支架牙周膜干细胞球细胞凋亡检测示意图。
图5为无支架牙周膜干细胞球细胞存活率示意图。
图6为无支架牙周膜干细胞球DNA含量测定示意图。
图7为无支架牙周膜干细胞球活死细胞染色检测示意图。
图8为成骨诱导后，无支架牙周膜干细胞球成骨相关基因检测示意图。
图9为成骨诱导后，无支架牙周膜干细胞球茜素红染色实验示意图。
图10为成骨诱导后，无支架牙周膜干细胞球茜素红定量检测数据分析图。
图11为成骨诱导后，无支架牙周膜干细胞球ALP含量检测示意图。
图12为裸小鼠体内异位植入实验，无支架牙周膜干细胞球组形成类骨组织。
图中缩略词说明：
PDLSCs：periodontal ligament stem cells，牙周膜干细胞；
Monolayer：二维培养细胞；
Speroid：细胞球；
CPC：calcium phosphate ceramics，磷酸钙陶瓷；
nB:new bone,新生骨样结构。
具体实施方式
本发明提供一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备细胞球培养板：配置琼脂糖溶液加入到二维细胞培养六孔板的孔中，将模具放置在六孔板的琼脂糖溶液内，待琼脂糖溶液凝固后拔出模具，使得琼脂糖凝胶中形成井孔，即得到细胞球培养板；
(2)井孔润洗：用PBS润洗细胞球培养板的每个井孔；
(3)牙周膜干细胞接种：将牙周膜干细胞细胞悬液加入细胞球培养板的井孔中，井孔中加入培养液，然后将细胞球培养板放入细胞培养箱中；
(4)无支架牙周膜干细胞球培养：培养1天后，更换培养液，以后每隔2天换一次培养液；
(5)利用显微镜观察其生长状况，待形成无支架牙周膜干细胞球后进行收集。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，配置琼脂糖溶液并加热，待琼脂糖溶液为液体状态时将模具沿着一侧孔边缘向另一侧边缘缓缓放入；待琼脂糖溶液凝固成形后，垂直拔出模具。
在本发明的一个实施方式中，所述琼脂糖溶液中琼脂糖与去离子水的质量比为1：100。
在本发明的一个实施方式中，在接种细胞之前，需要在细胞球培养板每井孔中至少加入1ml PBS溶液进行润洗，以赶走孔中气泡并浸润球板表面，保证含有细胞的培养液能迅速渗入，避免细胞无法进入细胞球井孔。
在本发明的一个实施方式中，细胞球培养板每井孔接种牙周膜干细胞1.0×103个～1.5×103个，接种细胞量过少生物活性程度低，接种细胞量过大容易造成细胞球中心细胞的死亡。
在本发明的一个实施方式中，将细胞球培养板静置在细胞培养箱中。
在本发明的一个实施方式中，所述更换培养液的方式为半换液方式及沿培养板侧壁吸取培养液，即每次仅更换一半体积的培养液，避免触碰到球体；吸液或加液时需要沿着孔洞侧壁轻轻吸取或加入液体，以避免损失细胞球。
在本发明的一个实施方式中，细胞球在接种24小时后会形成球体。在接种初期，随着细胞增殖细胞数量增多，但细胞球呈现体积变小向中心聚集的状态。在这种状态下，可能由于营养输送不及时和废物排泄不通畅导致球体中心细胞坏死。故相较于传统培养方法中每2-3天更换一次培养基，细胞球培养中要求培养基的更换频率为每1-2天更换一次。并且，培养基的量要足够，6孔板中每孔每次更换2ml或更多。
在本发明的一个实施方式中，无支架牙周膜干细胞球收集过程中，用枪头吸取PBS液体进行吹吸，将含有细胞球的PBS液体轻轻放入离心管中，弃上清得到细胞球。
在本发明的一个实施方式中，通过小于细胞球直径的细胞筛收集无支架牙周膜干细胞球。
本发明还提供一种无支架牙周膜干细胞球，所述无支架牙周膜干细胞球通过上述方法制备得到。
本发明还提供一种无支架牙周膜干细胞球的应用，所述无支架牙周膜干细胞球应用于组织工程领域。在本发明的一个实施方式中，无支架牙周膜干细胞球具有良好的成骨分化性能，单独使用或与支架材料结合使用可形成新生骨组织。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例提供一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，包括以下步骤：
如图1所示：
(1)制备细胞球培养板：按照需要选取特定孔数和密度的细胞球板模具。细胞球培养板的主要材料为琼脂糖凝胶，利用其疏水性，阻止细胞贴壁，使细胞悬浮生长。配置琼脂糖溶液，用微波炉加热溶液，液体冒泡3次后停止加热，待溶液为液体状态时将模具沿着一侧孔边缘向另一侧边缘缓缓放入，避免产生气泡待琼脂糖溶液凝固成形后，垂直拔出模具，保证每井孔具有均匀一致的深度和体积；所得每孔中含176或76井小孔(有两种模具)，检查每个孔里的井孔是否深度一致，若发现有的孔不合格则重做。整个过程需注意无菌操作。细胞板制备好后，在紫外灯下照射30min后使用。
(2)于灭菌后的细胞球培养板每孔中加入1ml PBS，润洗，以赶走孔中气泡。
(3)每井接种牙周膜干细胞以1.5×103个计，将细胞悬液沿侧壁加入孔中，每孔加入培养液2ml，平稳地将培养板放入细胞培养箱中，勿剧烈晃动。
(4)培养1天后，更换培养液，以后每隔2天换一次培养液，每次2ml。
(5)显微镜下观察细胞球生长情况。
如图2所示，牙周膜干细胞接种于培养板井孔内12h后，细胞逐渐向井孔中心聚集，大概在24h后形成边界较为清楚的细胞球。从第2天到第6天，细胞球体积逐渐减小，边界逐渐清晰。接种后第1天到第2天，细胞球表面积(Area)有所增大，然而从第2天到第7天，细胞球表面积逐渐减小，第7天到第9天，表面积基本不再发生显著变化。费雷特直径(Feret)用于表示不规则颗粒的大小，在接种后9天内，该参数持续降低(图3)。另一个参考指标为圆度(Circularity)，是指在某一截面上最大和最小半径间的差值。细胞球在接种后的第1-4天，圆度不断增大，而从第5天到9天圆度呈小幅度降低(图3)。这一现象说明细胞在接种后前4天可能处于快速扩增阶段，而从第5天起细胞可能处于稳定生长期。密实度(Solidity)表示细胞分布面积占其分布区域的比例。在第1-5天，细胞球密实度不断增加，此时球体中的细胞向中心聚集并扩增，与镜下观察以及圆度分析的结果相一致。第5天以后，细胞球密实度呈小幅度降低，第7-9天无显著变化。这一结果说明球体中细胞向中心聚集的趋势逐渐减小。
实施例2
本实施例提供一种无支架牙周膜干细胞球生物活性检测方法。
(1)无支架牙周膜干细胞球细胞凋亡检测
按照上述方法制备无支架牙周膜干细胞球，连续培养8天，在收集样本的前一天换用不含血清培养液孵育细胞过夜。每天选取其中3孔无支架牙周膜干细胞球，PBS缓冲液洗2次后，再用PBS缓冲液吹取井中细胞球分别收集于15ml离心管中，用不含EDTA的胰酶消化无支架牙周膜干细胞球(0.25％胰酶消化80s，辅以轻轻吹打)，普通培养液终止消化，800rpm离心3min，弃上清。PBS洗2次，弃上清。每管加入500μl Binding Buffer重悬细胞，200目细胞筛网过滤移入流式管中。实验组加入5μl Annexin-FITC混匀后，再加入5μl PropidiumIodide，混匀；单阳组分别加入5μl Annexin-FITC和5μl Propidium Iodide，混匀；对照组不加入Annexin-FITC和Propidium Iodide。室温，避光，反应10min。上机检测前重悬细胞，200目细胞筛网过滤移入流式管中，加染液1h内，进行流式细胞仪检测。
细胞凋亡检测结果显示(图4和图5)，凋亡细胞和死细胞所占比例在培养后期逐渐增高。在接种到三维培养板后的最初5d内，球内细胞处于快速增殖阶段，而在第6-8天细胞发生了一定程度的凋亡。
(2)无支架牙周膜干细胞球DNA定量
按照上述方法制备无支架牙周膜干细胞球，接种1天后，选取其中3孔细胞球，PBS缓冲液洗2次后，用PBS缓冲液吹取井中细胞球分别收集于1.5ml离心管中，标记为D1，置于-80℃冰箱中保存，留待检测。按照上述取样方法，吹取第2-8天细胞球样本，分别标记为D2-D8，置于-80℃冰箱中保存，留待检测。同时，制备常规二维培养牙周膜干细胞悬液，按细胞球培养板单孔接种密度接种于6cm培养皿中，提取第1-8天细胞样本，分别标记为D1-D8，置于-80℃冰箱中保存，留待检测。将上述样本反复冻融3次，使细胞破碎释放DNA。2000rpm，离心5min，取上清。按照Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits说明书对上述样本进行检测，每个样本设置3个复孔。
DNA定量检测结果显示(图6)，在接种培养的第1-6天，细胞球中细胞所含DNA量始终高于常规培养的二维细胞。这一结果表明在细胞球形成初期，细胞球培养未对细胞的生长产生不良影响。细胞球内细胞DNA含量在第5天达到最大，第6-8天逐渐降低。
(3)无支架牙周膜干细胞球活-死染色
按照上述方法制备无支架牙周膜干细胞球，分别吹取第1-7天细胞球，收集于离心管中。取部分细胞球于常规24孔板中，胰酶消化剩余细胞球(0.25％胰酶消化80s，辅以轻轻吹打)，800rpm离心3min，弃上清，PBS重悬细胞后转移至常规24孔板中。按照Live/DeadViability/Cytotoxicity kit说明书，将工作液加入相应孔中，37℃孵育0.5h。荧光倒置显微镜下观察、拍照。
细胞活-死染色结果显示(图7)，PDLSC细胞球在培养的第1-6天基本都是活细胞，仅在第7天出现部分死细胞，与前述实验结果相一致，可以作为后续实验时间节点的参考依据。
实施例3
本实施例提供一种无支架牙周膜干细胞球成骨分化性能的检测方法。
(1)qRT-PCR检测成骨相关基因表达
按实施例1所述方法制备无支架牙周膜干细胞球，在细胞球培养板中接种24h后，观察形成球体后，将普通培养液换为成骨诱导培养液(普通培养液中加入50μg/ml VitC，10mMβ-甘油磷酸钠和10nM地塞米松)。以二维培养的细胞为对照组。分别于成骨诱导第4、7天，提取各组细胞总RNA，使用Primescript反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。
①细胞总RNA提取
在整个提取总RNA的过程中需避免RNA酶污染，操作时佩戴手套口罩，使用经除RNA酶处理的离心管、枪头等耗材及相关溶液，操作步骤如下：弃除培养液，PBS洗3次，加入500μl Trizol混匀，将细胞吹打裂解后转移至1.5ml EP管，室温静置5min。每管加入100μl三氯甲烷，充分混匀，室温静置5min。4℃下12000rpm离心15min，吸取上层无色水相至新的1.5mlEP管。每管加入等量异丙醇，充分混匀，室温静置10min。4℃下12000rpm离心10min，EP管内可见白色RNA沉淀，小心弃上清。加入500μl预冷75％乙醇/DEPC水混匀，洗涤RNA沉淀。4℃下12000rpm离心5min，小心弃上清，室温干燥RNA沉淀10-15min。每管加入10μl DEPC水溶解重悬RNA样品。RNA样品纯度按260nm/280nm吸光值(A260/A280)测算，比值在1.8-2.0之间为符合要求。逆转录前，RNA样品可保存于-80℃。
②逆转录
10μl反应体系：
0.5×PrimeScript Buffer(for RT)2μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μl
Oligo dT Primer(50μM)0.5μl
Random 6mers(100μM)0.5μl
总RNA 500ng
RNase Free ddH2O加至10μl
反应条件:
37℃15min；85℃5s
所得产物冰浴冷却，-20℃保存。
③实时荧光定量PCR
按照引物设计原则设计与合成引物，实验中所用PCR引物见表1，由Invitrogen公司合成并经质量检测。开盖前4℃下12000rpm离心10min，加入DEPC水稀释引物浓度至100μM，分装，-20℃备用。
表1引物序列表
Figure BDA0003238283980000101
qRT-PCR引物使用时稀释至10μM，每个样本均设三个平行对照管，加入反应体系时注意在冰上尽量避光操作；
20μl反应体系：
SYBR Premix Ex Taq(2×) 10μl
PCR Forward Primers(10μM) 0.4μl
PCR Reverse Primers(10μM) 0.4μl
DNA模板(cDNA) 2μl
ddH2O 7.2μl
扩增条件：
预变性95℃30s
PCR反应(cycle×40)95℃3s
60℃30s
根据所得数据，绘制标准曲线，用ΔΔCt值进行统计分析，比较各组目的基因表达情况。
qRT-PCR检测结果显示(图8)，无支架牙周膜干细胞球组Runx2(P<0.05)、COL-I(P<0.05)、ALP(P<0.05)、OPN(P<0.05)、OCN(P<0.05)mRNA的表达量均较二维培养牙周膜干细胞显著升高。
(2)茜素红染色及定量分析
按实施例1所述方法制备无支架牙周膜干细胞球，培养7天后将细胞球接种于二维培养板。将普通培养液换为成骨诱导培养液。以二维培养的细胞为对照组。成骨诱导培养14天后，采用茜素红染色法检测矿化结节的形成，步骤如下：去离子水冲洗2次，4％多聚甲醛固定30min；去离子水冲洗2次，加入茜素红染液，室温下孵育10min；镜下观察、拍照。将茜素红染色沉淀物溶解于含10％氯化十六烷基吡啶的10mM磷酸钠溶液(pH 7.0)中，分光光度法测定562nm处吸光值。
钙结节茜素红染色结果显示，成骨诱导培养后无支架牙周膜干细胞球细胞和二维培养的牙周膜干细胞，均能观察到红色钙结节状结构，但无支架牙周膜干细胞球细胞形成红色钙结节状结构数量明显更多(图9)。钙结节茜素红定量检测结果与之一致(图10)。
(3)ALP活性检测
按实施例1所述方法制备无支架牙周膜干细胞球，在细胞球培养板中接种24h后，观察形成球体后，将普通培养液换为成骨诱导培养液。以二维培养的细胞为对照组。分别于成骨诱导第4、7天，测定ALP含量。具体步骤如下：取样后冰PBS漂洗3次，彻底吸弃PBS；加入细胞裂解液(pH 8.0,50mM Tris/HCl buffer,150mM NaCl and 1％Triton X-100)，低温超声2次，每次超声15s；4℃，12000rpm离心10min后，吸取上清液，按照ALP试剂盒所示步骤进行检测；测定520nm处的吸光值通过细胞内总蛋白量来标准化ALP活性。
ALP活性检测结果显示(图11)，在成骨诱导第4、7天，无支架牙周膜干细胞球的ALP活性均显著高于对照组(P<0.05)，这表明三维培养对牙周膜干细胞的矿化能力具有显著增强作用。
(4)体内实验：采用异位异体方法，初步验证无支架牙周膜干细胞球形成骨组织样结构的效果。
按实施例1所述方法制备无支架牙周膜干细胞球，在细胞球培养板中接种24h后，观察形成球体后，将普通培养液换为成骨诱导培养液(普通培养液中加入50μg/ml VitC，10mMβ-甘油磷酸钠和10nM地塞米松)。成骨诱导7天后，将细胞球与磷酸钙陶瓷材料(calcium phosphate ceramics，CPC)混合。细胞球与支架材料混合培养24h后，植入裸鼠背部皮下。以二维培养的细胞为对照组。植入后8周取出植入物，HE染色和Masson染色观察新骨再生情况。
体内研究结果如图12，移植8周后，无支架牙周膜干细胞球组在材料表面可观察到新的骨样结构形成，而在二维培养牙周膜细胞组则几乎没有检测到显著的矿化组织(图12A)；Masson染色中表明该结构为未成熟的骨组织(图12B)；无支架牙周膜干细胞球可加速细胞介导的骨样组织形成(图12C)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备细胞球培养板：配置琼脂糖溶液加入到二维细胞培养六孔板的孔中，将模具放置在六孔板的琼脂糖溶液内，待琼脂糖溶液凝固后拔出模具，使得琼脂糖凝胶中形成井孔，即得到细胞球培养板；
(2)井孔润洗：用PBS润洗细胞球培养板的每个井孔；
(3)牙周膜干细胞接种：将牙周膜干细胞细胞悬液加入细胞球培养板的井孔中，井孔中加入培养液，然后将细胞球培养板放入细胞培养箱中；
(4)无支架牙周膜干细胞球培养：培养1天后，更换培养液，以后每隔2天换一次培养液；
(5)利用显微镜观察其生长状况，待形成无支架牙周膜干细胞球后进行收集。
2.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，配置琼脂糖溶液并加热，待琼脂糖溶液为液体状态时将模具沿着一侧孔边缘向另一侧边缘缓缓放入；待琼脂糖溶液凝固成形后，垂直拔出模具。
3.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述琼脂糖溶液中琼脂糖与去离子水的质量比为1：100。
4.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，制备细胞球培养板的过程保证无菌；制备得到的细胞球培养板井孔保持深度一致。
5.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，在接种细胞之前，在细胞球培养板每井孔中加入至少1mlPBS溶液进行润洗。
6.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，每井孔接种牙周膜干细胞1.0×103个～1.5×103个。
7.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述更换培养液的方式为半换液方式及沿培养板侧壁吸取培养液。
8.根据权利要求1所述的一种无支架牙周膜干细胞球的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，无支架牙周膜干细胞球收集过程中，用枪头吸取PBS液体进行吹吸，将含有细胞球的PBS液体放入离心管中，静置一段时间后，弃上清得到细胞球；或者通过小于细胞球直径的细胞筛收集无支架牙周膜干细胞球。
9.一种无支架牙周膜干细胞球，其特征在于，所述无支架牙周膜干细胞球通过权利要求1-8任一所述方法制备得到。
10.一种如权利要求9所述的无支架牙周膜干细胞球的应用，其特征在于，所述无支架牙周膜干细胞球应用于组织工程领域。
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