CN107224613A - 牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：通过一种新型的共载体系作为牙源性间充质干细胞介导软骨分化的载体，这种新型共载体系载有TFG‑β1、精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸(RGD)耦合的藻酸盐微球包裹着牙周膜干细胞或牙龈间充质干细胞。该共载体系是一个三维的可注射可生物降解的软骨组织工程细胞运载支架，通过体内体外试验验证了本材料是一种高质量软骨再生模型，并说明了微环境和诱导信号(TFG‑β1)对本材料中牙源性间充质干细胞存活和成软骨分化的重要作用，第一次介绍了PDLSCs和GMSCs两种有望运用于颞下颌关节修复的软骨再生种子细胞。

Description

牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法。
背景技术
间充质干细胞分化再生软骨是一种优良的组织工程方法，间充质干细胞是一种能接受天然微环境信号而多向分化的多能干细胞。当提供合适的生长因子，间充质干细胞在细胞球状培养和多种生物材料中能生成软骨和分泌软骨特有基质。
在牙源性间充质干细胞中，牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞因其易从口腔和牙科操作废弃的生物组织中获取而拥有独特优势，且通过体内体外试验均验证了这些牙源性间充质干细胞的多向分化能力。
间充质干细胞有效分化为软骨细胞需要核实的微环境和信号分子，如TFG-β1、BMP-4和FGF-2等生长因子。干细胞载体对于干细胞体内活动和再生过程也具有重要作用。
因此，通过改造干细胞外基质的理化性质来设计一种合适的微环境，以创造合适的干细胞环境，而引导干细胞分化为特定表型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，为实现上述方法本发明提供如下技术方案：
牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤a.祖细胞提取和培养
选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18-25岁的健康男性成人，无牙周病史。
为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*106个细胞并培养14天，再用甲苯胺蓝染色，将超过50个细胞数的克隆作为一个阳性CFU-F。实验组选用第四代细胞，人骨髓间充质干细胞作为阳性对照组。
步骤b.细胞流式分析
选取数量约为5*105个第四代细胞，用PE或者FITC鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgGs作为同型对照。
步骤c.生物材料的制备
采用高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β1混合。
步骤d.细胞的包被
选取PDLSC和GMSC以及作为阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中以形成微球。
所述步骤c中的生物材料的制备还包括以下分步骤：
分步骤1：选取高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐；
分步骤2：为提高上述藻酸盐的生物降解性，将其进行纯化处理，以及部分氧化(2％)处理；
分步骤3：将上述经过处理后的藻酸盐与TGF-β1(500ug/ml)充分搅拌混合，浓缩、真空冻干。
所述步骤d中的细胞包被还包括以下分步骤：
分步骤1：将PDLSC和GMSC以及阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中；
分步骤2：采用注射器将藻酸盐(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流体装置，藻酸盐被大豆油分离成液滴；
分步骤3：将上述液滴逐滴滴入装有100mM CaCl2溶液的petri盘中进而形成微球；
分步骤4：将上述微球置于37℃环境下孵育45分钟从而完成交联；
分步骤5：采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。
本发明所提供的方法有益效果是：利用RGD修饰的藻酸盐所具有的独特的三维支架结构，并添加有TFG-β1配体，包被着牙源性间充质干细胞，产生最佳的软骨再生效果，有望应用于颞下颌关节盘的重建和四肢骨骼修复。这种材料能够支持PDLSCs和GMSCs在体内和体外的存活、新陈代谢和成软骨分化，有望将其运用于颞下颌关节盘的软骨再生种子细胞。本系统包埋牙源性间充质干细胞容易操作，是一个三维可注射可生物降解的软骨组织工程细胞运载支架。
附图说明
图1是本发明的步骤流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：参照图1所示，本发明所提供的一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法包括以下步骤：
步骤1.祖细胞提取和培养
选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18-25岁的健康男性成人，无牙周病史。
为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*106个细胞并培养14天，再用甲苯胺蓝染色，将超过50个细胞数的克隆作为一个阳性CFU-F。实验组选用第四代细胞，人骨髓间充质干细胞作为阳性对照组。
步骤2.细胞流式分析
选取数量约为5*105个第四代细胞，用PE或者FITC鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgGs作为同型对照。
步骤3.生物材料的制备
选取高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐，为提高上述藻酸盐的生物降解性，将其进行纯化处理，以及部分氧化(2％)处理；将上述经过处理后的藻酸盐与TGF-β1(500ug/ml)充分搅拌混合，浓缩、真空冻干。
步骤4.细胞的包被
将PDLSC和GMSC以及阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中；采用注射器将藻酸盐(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流体装置，藻酸盐被大豆油分离成液滴；将上述液滴逐滴滴入装有100mMCaCl2溶液的petri盘中进而形成微球；将上述微球置于37℃环境下孵育45分钟从而完成交联；采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。
步骤5.体外释放研究
加载有TGF-β1(50ug/ml)的藻酸盐微球在含双抗(100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)高糖DMEM培养基的中孵育1周(摇床，37℃，48孔板)。在选择的时间点，使用抗人重组TGF-β1免疫没脸检测盒来检测培养基中释放的TGF-β1。最后，通过使用10％柠檬酸钠溶解微球支架，释放微球中残留的TGF-β1，然后检测总的含量。
步骤6.细胞存活率试验
对包被的MSCs染色，钙黄绿素染活细胞，溴化乙锭染死细胞。活细胞百分比由ImageJ软件测量而得。此外，使用MTT试验检测MSCs的新陈代谢活性。
步骤7.体外成软骨试验
将包被的PDLSs、GMSCs和hBMMSCs(每ml藻酸盐中2*106个细胞)在含有15％FBS，2mML-谷氨酰胺，1％ITS，100Nm Dex，100uM维生素C，2mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM成软骨诱导培养基中培养。
经过4周的诱导，4％多聚甲醛固定样本，制备石蜡切片。成软骨分化表现为软骨基质的形成，使用番红O和甲苯胺蓝可以使其阳性着色。因为藻酸盐的多聚离子会使背景着色增强，所以需先用不含Ca2+的PBS溶液洗片以在染色前去除交联的Ca2+而游离藻酸盐。
然后使用Sox9和二型胶原的一抗免疫标记切片(4℃过夜)，然后用Alexa荧光标记的二抗检测(200倍稀释率)并用DAPI复染。每组包括三个独立样本，从每个样本中随机选出五个区域，然后用NIH Image-J软件计算这些区域中阳性着色的面积及其所占面积比例。
步骤8.RNA提取、逆转录和扩增
分别将上述含有TGF-β1和三种细胞的藻酸盐用人重组BMP-4(100ng/ml)或FGF2(50ug/ml)处理或者不处理。两周成软骨诱导后，提取10个藻酸盐凝胶中所有细胞的RNA，使用含50mM柠檬酸钠脱水剂和80mM氯化钠的无菌解聚液裂解15-20分钟，配合轻微搅拌。裂解后，将其在9400g下离心10分钟，用PBS洗涤离心沉淀，再9400g条件下离心3分钟。根据Trizol reagent试剂说明书的方法，提取总RNA。使用Superscript III cDNA synthesis kit试剂盒将100ng总RNA合成为单链cDNA。
步骤9.牙源性间充质干细胞介导的体内组织再生
将分别含有上述三种细胞的凝胶系统(约4*106个细胞)植入5个月大的灰黄色裸鼠(nude XID III(NU/NU))背部皮下(每组N＝5)。8周后处死小鼠，外科取出植入结构及其周围组织，并通过组织学，组织化学，免疫荧光染色分析样本。
步骤10.组织学和组织化学评估
将取材样本用10％福尔马林溶液固定，升浓度乙醇中脱水，石蜡包埋。制作6um切片。H&E染色每个移植物中随机选取的4个横断面。此外，甲苯胺蓝和番红O染色观察其新生成的软骨外基质粘多糖。然后用Image-J软件计算每个切片中随机5个区域的阳性着色面积及其占总面积百分比。
步骤11.免疫组化和免疫荧光染色
在植入材料3周后处死小鼠，按照上述方法取材，进行免疫组化试验。切片脱蜡后洗涤干净，用3％H2O2/methanol浸泡15分钟以灭活非特异性内生过氧化氢酶。然后一抗孵育1小时(200-300倍稀释率)。然后使用抗BMP4和抗FGF-2进行免疫组化染色，并配合苏木素复染。
选取植入后8周的样本进行免疫荧光染色，先用3％H2O2处理然后用封闭剂封闭抗原(1％BSAand 0.25％TritonX-100inPBS)。然后用鼠抗兔二型胶原抗体和SOX9抗体在100倍稀释率下孵育，然后用AlexaFluor荧光二抗孵育，并配合DAPI复染。
步骤12.数据分析
独立双尾student’s t检验或方差分析处理数据，数值均用均值+标准差表示。
结果分析：
1.牙源性间充质干细胞的体外特征
CFU-F实验用于评估新提取干细胞的克隆形成能力。结果显示PDLSCs和GMSCs较hBMMSCs有显著更多的单克隆细胞群。然后，流式细胞分析用于检测提取的细胞是否为干细胞，结果表明，人PDLSCs和GMSCs均表达间充质干细胞特异性标记物如CD73，CD105，CD146和CD166，而且不表达造血干细胞特异性标记物比如CD34和CD45。证明上述三种牙源性间充质干细胞均有干细胞特性。
2.藻酸盐微球载体能保持间充质干细胞活性
本实验开发的藻酸盐微胶囊系统能诱导PDLSCs和GMSCs的成软骨分化，并使用hBMMSCs作为阳性对照。现今研究中，RGD耦合藻酸盐微胶囊中包被的干细胞平均直径为327um，显微成像显示其有统一的微球大小和细胞分布。在发挥功能的时间段内，两种材料释放的TGF-β1没有明显差异，且两种释放都属于一级药动曲线型。
细胞活性试验显示在体外培养4周后，微球中的间充质干细胞仍具有较高的存活率。而且，定量检测细胞毒性和活性的MTT试验也显示了微球中的间充质干细胞有较高的MTT吸收率，证明这些干细胞在2周的常规介质中培养后仍有较高的代谢率和细胞活性。这些结果显示了我们的生物可降解藻酸盐微球能很好地维持上述三种细胞的活性。而且，在有RGD耦合的材料中，常规介质培养14天后，比没有RGD耦合的材料，干细胞有更高的活性。
3.牙源性间充质干细胞的体内成软骨分化
4周成软骨诱导后，番红O和甲苯胺蓝染色能检测到上述三种细胞外蛋白多糖的沉积。符合预期的是，有RGD耦合的材料中能看到更多的蛋白多糖沉积(甲苯胺蓝染色)。此外，与组化染色结果符合的是，免疫荧光染色结果也显示了上述三种干细胞均分泌二型胶原。有趣的是，半定量分析显示PDLSCs相比hBMMSCs和GMSCs有更多的软骨生成，而且在后两种细胞中没有显著差异。
然后，用RT-PCR鉴定和比较成软骨基因(SOX9和二型胶原)的表达水平。SOX9是成软骨分化通路中必需因子，并诱导了COL II基因表达的上调。在增殖的软骨细胞中能看到SOX9基因大量表达。试验结果显示三种干细胞均丰富表达COL II和SOX9。PDLSCs比其余两种干细胞有显著更高的表达，后两种细胞之间的COL II和SOX9表达无统计差异。并且，补充了BMP-4或FGF2后的微球系统能使SOX9和COL II表达轻微上调。
4.源性间充质干细胞对软骨组织再生的作用
本研究的藻酸盐凝胶材料的促间充质干细胞成软骨分化能力是通过在裸鼠皮下植入材料后异位成软骨来评估。甲苯胺蓝和番红O染色证明了此三种间充质干细胞均能成软骨分化。在材料中的这些细胞均表现了典型的软骨细胞样的圆形形态。作为对照，仅有藻酸盐凝胶的材料无任何成软骨阳性特征。移植后8周，COL II和SOX9免疫荧光染色显示了软骨组织大量产生和沉积。PDLSCs材料组中COL II的产量更多，GMSCs和hBMMSCs较少且无差异。H&E染色结果显示，在有间充质干细胞的材料中，人软骨细胞形态的圆形细胞群存在，而在无细胞的材料中未发现。后期为了更加深入地鉴定间充质干细胞介导的成软骨，采用了免疫荧光技术，结果显示在早期成软骨分化时期(移植后3周)生长因子BMP-4和FGF2阳性表达，意味着TGF-β1在软骨形成中扮演着重要的角色。

Claims (3)

1.牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：
步骤a.祖细胞提取和培养
选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18-25岁的健康男性成人，无牙周病史；
为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*106个细胞并培养14天，再用甲苯胺蓝染色，将超过50个细胞数的克隆作为一个阳性CFU-F。实验组选用第四代细胞，人骨髓间充质干细胞作为阳性对照组；
步骤b.细胞流式分析
选取数量约为5*105个第四代细胞，用PE或者FITC鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgGs作为同型对照；
步骤c.生物材料的制备
采用高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β1混合；
步骤d.细胞的包被
选取PDLSC和GMSC以及作为阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中以形成微球。
2.根据权利要求1所述的牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：所述步骤c中的生物材料的制备还包括以下分步骤：
分步骤1：选取高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐；
分步骤2：为提高上述藻酸盐的生物降解性，将其进行纯化处理，以及部分氧化(2％)处理；
分步骤3：将上述经过处理后的藻酸盐与TGF-β1(500ug/ml)充分搅拌混合，浓缩、真空冻干。
3.根据权利要求1所述的牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：所述步骤d中的细胞包被还包括以下分步骤：
分步骤1：将PDLSC和GMSC以及阳性对照的hBMMSC以2*106cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中；
分步骤2：采用注射器将藻酸盐(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流体装置，藻酸盐被大豆油分离成液滴；
分步骤3：将上述液滴逐滴滴入装有100mM CaCl2溶液的petri盘中进而形成微球；
分步骤4：将上述微球置于37℃环境下孵育45分钟从而完成交联；
分步骤5：采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。
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