CN107748260B - 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法 - Google Patents
一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107748260B CN107748260B CN201710757400.0A CN201710757400A CN107748260B CN 107748260 B CN107748260 B CN 107748260B CN 201710757400 A CN201710757400 A CN 201710757400A CN 107748260 B CN107748260 B CN 107748260B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- cells
- umbilical cord
- days
- mesenchymal stem
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 title claims abstract description 55
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 46
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 38
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 31
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 39
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 claims description 39
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 28
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 27
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 25
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 22
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 21
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 claims description 20
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims description 19
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 17
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 14
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 claims description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 12
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 11
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 10
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 10
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 8
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 8
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims description 7
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000016 photochemical curing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 6
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 6
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims description 6
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 claims description 5
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 5
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 claims description 5
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 4
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012613 in situ experiment Methods 0.000 claims description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 238000004804 winding Methods 0.000 claims description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 claims description 3
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 3
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 3
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 claims description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 claims description 3
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 3
- RZUBARUFLYGOGC-MTHOTQAESA-L acid fuchsin Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)C1=C(N)C(C)=CC(C(=C\2C=C(C(=[NH2+])C=C/2)S([O-])(=O)=O)\C=2C=C(C(N)=CC=2)S([O-])(=O)=O)=C1 RZUBARUFLYGOGC-MTHOTQAESA-L 0.000 claims description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 claims description 3
- 210000000648 angioblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 claims description 3
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XTLNYNMNUCLWEZ-UHFFFAOYSA-N ethanol;propan-2-one Chemical compound CCO.CC(C)=O XTLNYNMNUCLWEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 claims description 3
- 238000012353 t test Methods 0.000 claims description 3
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 3
- 210000001644 umbilical artery Anatomy 0.000 claims description 3
- XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L water blue Chemical compound CC1=CC(/C(\C(C=C2)=CC=C2NC(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=C(\C=C2)/C=C/C\2=N\C(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1N.[Na+].[Na+] XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L 0.000 claims description 3
- 239000001993 wax Substances 0.000 claims description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims 2
- 238000010603 microCT Methods 0.000 claims 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 8
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- -1 CD31 Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003651 pro-proliferative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，该方法通过二维共培养不同比例血管内皮细胞和脐带间充质干细胞，研究脐带间充质干细胞促进血管内皮细胞增殖和成血管分化的规律。此外，通过高温熔融的单糖制作微米级网状微血管支架，溶解于水凝胶构建三维水凝胶阴模的连续微孔道培养体系，通过灌注并悬浮培养上述两种细胞，评价其体外构建的微血管网结构以及基于此结构的工程化骨组织体内移植的效果，并阐明其参与并促进微血管网构建的机制。本发明为工程化组织、器官的体外预管化提供新的解决方案以及实验基础。
Description
技术领域
本发明属于医学技术领域，涉及一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法。
背景技术
体外预血管化对于工程化组织、器官体内移植的成功至关重要。基于血管内皮细胞和生物支架材料的血管再生取得了一定进展，但如何在体外构建连续稳定的三维网状微血管系统仍不清楚。近来，研究发现脐带间充质干细胞具有多向分化潜能并能分泌多种促增殖和分化的细胞因子。我们前期的工作表明，脐带间充质干细胞能够参与并促进血管内皮细胞的增殖以及成血管分化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，该方法通过二维共培养不同比例血管内皮细胞和脐带间充质干细胞，研究脐带间充质干细胞促进血管内皮细胞增殖和成血管分化的规律。此外，通过高温熔融的单糖制作微米级网状微血管支架，溶解于水凝胶构建三维水凝胶阴模的连续微孔道培养体系，通过灌注并悬浮培养上述两种细胞，评价其体外构建的微血管网结构以及基于此结构的工程化骨组织体内移植的效果，并阐明其参与并促进微血管网构建的机制。本发明为工程化组织、器官的体外预管化提供新的解决方案以及实验基础。
利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，制成微米级单糖血管网，而后溶解于半固态水凝胶，形成三维微血管网阴模。在水凝胶体系内悬浮共培养脐带间充质干细胞和血管内皮细胞，同时，在阴模孔道体系灌注共培养上述两种种细胞，通过水凝胶阴模体系构建成血管物理微环境，脐带间充质干细胞构建成血管生物微环境，在体外构建微血管三维网状结构。最后，在动物体内验证这一预成血管化结构对工程化组织移植的促进作用。
其具体技术方案为：
一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，包括以下步骤：
1.脐带间充质干细胞对血管再生微环境影响的实验
1.1人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞增殖的影响
1.2人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞成血管分化的影响
1.2.1 Transwell间接共培养
将hUVECs以1*105个/孔接种于六孔板内，待细胞增殖至80％，实验组和对照组分别在Transwell小室以5*105个/孔接种hUCMSCs和hUVECs。经过3天、7天、14天后根据不同实验要求进行不同检测。
1.2.2 Western Blot检测ERK1/2和p-ERK1/2
将间接共培养后的hUVECs用冷的PBS洗两次后，加入裂解液+蛋白酶抑制剂(99:1)并用细胞刮收集，进行7.5％SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上。将膜5％脱脂牛奶封闭2小时，加入兔抗ERK1/2和p-ERK1/2一抗，抗小鼠HRP二抗，ECL发光试剂检测。
1.3二维直接共培养观察两种细胞形成的组织结构不同比例直接共培养两种细胞
2.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建微血管网状结构的体外应用研究 2.1水凝胶三维连续微孔道网状阴模培养体系的构建
利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，缠绕形成微米级单糖细丝网结构，将水凝胶液态双组分剂按照1:1的比例混合后，将单糖细丝网浸没于液态组分中，光固化使水凝胶成为半固态。将这一体系置于40℃水域，将单糖细丝溶解，从而形成半固态水凝胶三维连续微孔道网阴模体系。
2.2两种细胞不同比例悬浮灌注共培养构建体外微血管网
将上述三维培养体系置于灌注培养发生器，将hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，进行灌注培养，流速为5ml/s。4小时更换含有不同比例细胞的培养液，经过3天、7天、14天后4％多聚甲醛固定，组织学切片后根据不同实验要求进行不同检测。
2.3 H&E染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水，苏木素染色5分钟后冲洗，盐酸酒精分化30秒。伊红染色2分钟后冲洗。通过75％、95％、100％乙醇梯度脱水至蜡。二甲苯透明后中性树胶封固片。
2.4 Masson三色染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水。weigert铁苏木素(weigert铁苏木素A、B液等比例混和)染5-10分，流水稍洗。1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分。丽春红酸性品红染液染5-10分，流水稍冲洗。磷钼酸溶液处理约5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝人染液复染5分钟。1％冰醋酸处理1分钟，95％酒精脱水多次。无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。
2.5免疫荧光染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水后，根据1.3.2实验步骤进行CD-31、Ⅷ因子和Col-Ⅵ的免疫荧光检测。
3.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建的微血管网状结构促进工程化组织再生的体内应用研究
3.1水凝胶三维微血管网阴模复合工程化骨支架材料的构建
利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，缠绕形成微米级单糖细丝网结构，将水凝胶液态双组分剂按照1:1的比例混合后，加入HA/TCP粉末，充分混合均匀。将单糖细丝网浸没于液态组分中，光固化使水凝胶成为半固态。将这一体系置于40℃水域，将单糖细丝溶解，从而形成复合骨支架材料的水凝胶三维连续微孔道阴模体系。
3.2悬浮灌注共培养构建体外微血管网
将hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，在实验3.1所述培养体系进行灌注培养，流速为5ml/s。4小时更换含有不同比例细胞的培养液，经过3天、7天、14天后，4％多聚甲醛固定，组织学切片后根据不同实验要求进行不同检测。
3.3裸鼠皮下异位实验
选取6周龄雄性裸鼠，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠。将实验3.2中得到的优化策略后的体系作为实验组，实验3.1得到的体系作为对照组分别植入裸鼠皮下，在不同时间点 (4w，8w，12w)取材固定，进行组织切片，后根据不同实验要求进行不同检测。
3.4兔颅骨极限缺损修复原位实验
3.5形态学观察
根据实验2.3、2.4和2.5的步骤分别对实验3.3和3.4取得的组织学切片进行H&E染色、Masson三色染色和免疫荧光染色，观察形态学，成血管指标CD-31、Ⅷ因子和Col-Ⅵ以及成骨情况的表达。
3.6 Micro-CT检测骨缺损修复
将实验3.3和3.4得到的样本于4℃使用4％多聚甲醛固定24小时。Micro-CT(SIEMEMS) 扫描取材样本并使用图形软件(MIMICS)三维重建分析颅骨缺损的修复情况。t检验进行统计分析。
进一步，所述人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞增殖的影响包括：
1.1.1人脐带间充质干细胞的分离培养以及鉴定
取体健适龄产妇的脐带，剪成长约1.0cm的小段，洗净残留血液，去除脐动静脉，取Wharton胶剪碎至直径0.5cm大小的组织块，置于培养皿底贴壁，加入少量含10％胎牛血清的α-MEM培养液，4h后添加5mL培养液。
取第三代hUCMSCs，PBS液清洗冲悬。分装至EP管内，向每个EP管中加入2μL (1：500)的相关抗体CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD105抗体，4℃孵育一个小时，离心冲洗掉多余抗体，3％FBS的PBS液离心冲悬至200μL，使用流式细胞仪检测其表面标志物的表达情况。
1.1.2人脐带静脉内皮细胞的分离培养以及鉴定
取体健适龄产妇的脐带，PBS冲洗，将注射器插入脐静脉，用粗丝线扎牢；注入PBS液灌净洗脐静脉；将脐带一端用止血钳夹闭，从另一端用注射器向脐静脉注入预热37℃的0.25％胰蛋白酶至血管充盈；37℃水浴中消化8-10min；收集消化液并终止消化，离心后接种于培养瓶，加入含10％胎牛血清的α-MEM培养液，置37℃、5％CO2孵育箱中静止培养。
在6孔培养板按传代方法进行细胞接种，待细胞生长至近融合用PBS冲洗，放入乙醇- 丙酮混合液(1:1)中固定10min；分别滴加兔抗人CD-31抗原多抗工作液，37℃孵育60min； PBS冲洗浸泡10min；加入羊抗兔荧光抗体，37℃孵育30min；PBS冲洗浸泡15min；缓冲甘油封片；置于荧光显微镜下观察。
1.1.3 MTT检测hUVECs增殖
将第二代hUVECs接种细胞于96孔培养板的7排孔中。每孔加入等体积10％FBS的α-MEM培养基，实验组加入等体积hUCMSCs上清液，对照组加入等体积hUVECs上清液，培养7天。每天将一整排培养液吸出，PBS清洗两遍，给一排的前4孔每孔加入噻唑蓝溶液 (5μg/mL)20μL，37℃孵育4小时，每孔加入DMSO150μL，避光震荡10分钟，然后在酶联免疫检测仪中590nm波长下检测吸光光度值。每天检测一排4个实验孔2个对照孔，检测7天。
再进一步，所述二维直接共培养观察两种细胞形成的组织结构不同比例直接共培养两种细胞包括：
1.3.1以hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例，混合接种于六孔板的每个孔，每孔细胞总数维持在1*105个左右，每组重复三次。经过3天、7天、14天后4％多聚甲醛固定。
1.3.2免疫荧光染色
以免疫荧光检测CD-31表达为例，孔板或切片加入兔抗人CD-31孵育过夜。二抗用Alexa594(红色)驴抗兔，孵育4小时。Hoechst 33342衬染细胞核(蓝色)20秒。激光共聚焦显微镜下观察，CD-31(红色)，细胞核(蓝色)，以及二者之间的关系。相同方法检测Ⅷ因子和Col-Ⅵ。
再进一步，所述兔颅骨极限缺损修复原位实验包括：
3.4.1兔脐带间充质干细胞和兔脐带静脉内皮细胞的分离、培养和鉴定
参照实验1.1.1和1.1.2人脐带间充质干细胞和人脐带静脉内皮细胞的分离、培养和鉴定的方法，选取相关兔的一抗进行实验。
3.4.2兔颅骨极限缺损修复
选取6月龄雄性新西兰大白兔，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后制备直径2.0cm颅骨极限缺损。将实验3.2中得到的优化策略后的体系作为实验组，实验3.1得到的体系作为对照组分别植入兔颅骨极限缺损处，在不同时间点(4w，8w，12w)取材固定，后根据不同实验要求进行不同检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)首次证明脐带间充质干细胞参与并促进血管内皮细胞成血管化。
(2)体外构建连续贯通的三维微血管网状结构。
(3)证实体外构建的三维微血管网状结构的再生组织植入体内的优越性，为工程化组织再生的预血管化提供新的途径。
附图说明
图1是脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法的流程图；
图2是脐带间充质干细胞的倒置相差显微镜照片；
图3是脐带静脉内皮细胞的倒置相差显微镜照片；
图4是hUCMSCs是CD-29表达率100％；
图5是hUCMSCs是CD-31表达率0.9％；
图6是hUCMSCs是CD-34表达率0.8％；
图7是hUCMSCs是CD-90表达率99.7％；
图8是hUCMSCs是CD-105表达率91.6％；
图9是hUCMSCs是CD-45表达率0.6％；
图10是hUCMSCs是CD-106表达率14.5％；
图11是hUCMSCs成骨诱导28天茜素红染色；
图12是hUCMSCs成脂诱导21天油红O染色；
图13是hUCMSCs是接种1000细胞培养7天后甲苯胺蓝染色；
图14是hUCMSCs是CD-31染色倒置荧光显微镜照片；
图15是hUCMSCs是VEGF染色倒置荧光显微镜照片；
图16是hUCMSCs是Ⅷ因子染色倒置荧光显微镜照片；
图17是实验组与对照组OD值检测。*号代表组间显著差异，P﹤0.05；
图18是实验组与对照组VEGF通路相关指标的Western是Blot检测的荧光条带；
图19是实验组与对照组VEGF通路相关指标的Western是Blot检测计量条状图，*号代表组间显著差异，P﹤0.05；
图20是hUVECs:hUCMSCs为1:1时在水凝胶上二维形成管腔的荧光显微镜照片(低倍)；
图21是hUVECs:hUCMSCs为1:1时在水凝胶上二维形成管腔的荧光显微镜照片(高倍)；
图22是hUVECs:hUCMSCs为1:3时在水凝胶上二维形成管腔的荧光显微镜照片(低倍)；
图23是hUVECs:hUCMSCs为1:3时在水凝胶上二维形成管腔的荧光显微镜照片(高倍)；
图24是hUVECs:hUCMSCs为1:5时在水凝胶上二维形成管腔的荧光显微镜照片(低倍)；
图25是hUVECs:hUCMSCs为1:5时在水凝胶上二维形成管腔的荧光显微镜照片(高倍)；
图26是hUVECs:hUCMSCs为1:1时在三维悬浮灌注共培养构建体外微血管网倒置荧光显微镜照片；
图27是hUVECs:hUCMSCs为1:3时在三维悬浮灌注共培养构建体外微血管网倒置荧光显微镜照片；
图28是hUVECs:hUCMSCs为1:5时在三维悬浮灌注共培养构建体外微血管网倒置荧光显微镜照片；
图29是hUVECs:hUCMSCs为1:1时直接构建体外血管网与骨支架移植与裸鼠皮下8周后 Masson三色染色；
图30是hUVECs:hUCMSCs为1:1时直接构建体外血管网与骨支架移植与裸鼠皮下8周后 H&E染色；
图31是hUVECs:hUCMSCs为1:3时直接构建体外血管网与骨支架移植与裸鼠皮下8周后 Masson三色染色；
图32是hUVECs:hUCMSCs为1:1时直接构建体外血管网与骨支架移植与裸鼠皮下8周后 H&E染色；
图33是hUVECs:hUCMSCs为1:5时直接构建体外血管网与骨支架移植与裸鼠皮下8周后 Masson三色染色；
图34是hUVECs:hUCMSCs为1:5时直接构建体外血管网与骨支架移植与裸鼠皮下8周后 H&E染色。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
参照图1，一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，包括以下步骤：
1.脐带间充质干细胞对血管再生微环境影响的实验研究
1.1人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞增殖的影响
1.1.1人脐带间充质干细胞的分离培养以及鉴定
取体健适龄产妇的脐带，剪成长约1.0cm的小段，洗净残留血液，去除脐动静脉，取Wharton胶剪碎至直径0.5cm大小的组织块，置于培养皿底贴壁，加入少量含10％胎牛血清的α-MEM培养液，4h后添加5mL培养液。
取第三代hUCMSCs，PBS液清洗冲悬。分装至EP管内，向每个EP管中加入2μL(1：500)的相关抗体CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD105抗体，4℃孵育一个小时，离心冲洗掉多余抗体，3％FBS的PBS液离心冲悬至200μL，使用流式细胞仪检测其表面标志物的表达情况。
1.1.2人脐带静脉内皮细胞的分离培养以及鉴定
取体健适龄产妇的脐带，PBS冲洗，将注射器插入脐静脉，用粗丝线扎牢；注入PBS液灌净洗脐静脉；将脐带一端用止血钳夹闭，从另一端用注射器向脐静脉注入预热37℃的0.25％胰蛋白酶至血管充盈；37℃水浴中消化8-10min；收集消化液并终止消化，离心后接种于培养瓶，加入含10％胎牛血清的α-MEM培养液，置37℃、5％CO2孵育箱中静止培养。
在6孔培养板按传代方法进行细胞接种，待细胞生长至近融合用PBS冲洗，放入乙醇- 丙酮混合液(1:1)中固定10min；分别滴加兔抗人CD-31抗原多抗工作液，37℃孵育60min； PBS冲洗浸泡10min；加入羊抗兔荧光抗体，37℃孵育30min；PBS冲洗浸泡15min；缓冲甘油封片；置于荧光显微镜下观察。
1.1.3 MTT检测hUVECs增殖
将第二代hUVECs接种细胞于96孔培养板的7排孔中。每孔加入等体积10％FBS的α-MEM 培养基，实验组加入等体积hUCMSCs上清液，对照组加入等体积hUVECs上清液，培养7天。每天将一整排培养液吸出，PBS清洗两遍，给一排的前4孔每孔加入噻唑蓝溶液(5μg/mL)20μL，37℃孵育4小时，每孔加入DMSO150μL，避光震荡10分钟，然后在酶联免疫检测仪中590nm波长下检测吸光光度值。每天检测一排4个实验孔2个对照孔，检测7天。
1.2人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞成血管分化的影响
1.2.1 Transwell间接共培养
将hUVECs以1*105个/孔接种于六孔板内，待细胞增殖至80％，实验组和对照组分别在 Transwell小室以5*105个/孔接种hUCMSCs和hUVECs。经过3天、7天、14天后根据不同实验要求进行不同检测。
1.2.2 Western Blot检测ERK1/2和p-ERK1/2
将间接共培养后的hUVECs用冷的PBS洗两次后，加入裂解液+蛋白酶抑制剂(99:1)并用细胞刮收集，进行7.5％SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上。将膜5％脱脂牛奶封闭2小时，加入兔抗ERK1/2和p-ERK1/2一抗，抗小鼠HRP二抗，ECL发光试剂检测。
1.3二维直接共培养观察两种细胞形成的组织结构
1.3.1不同比例直接共培养两种细胞
以hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例，混合接种于六孔板的每个孔，每孔细胞总数维持在1*105个左右，每组重复三次。经过3天、7天、14天后4％多聚甲醛固定。
1.3.2免疫荧光染色
以免疫荧光检测CD-31表达为例，孔板或切片加入兔抗人CD-31孵育过夜。二抗用Alexa594(红色)驴抗兔，孵育4小时。Hoechst 33342衬染细胞核(蓝色)20秒。激光共聚焦显微镜下观察，CD-31(红色)，细胞核(蓝色)，以及二者之间的关系。相同方法检测Ⅷ因子和Col-Ⅵ。
2.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建微血管网状结构的体外应用研究 2.1水凝胶三维连续微孔道网状阴模培养体系的构建
利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，缠绕形成微米级单糖细丝网结构，将水凝胶液态双组分剂按照1:1的比例混合后，将单糖细丝网浸没于液态组分中，光固化使水凝胶成为半固态。将这一体系置于40℃水域，将单糖细丝溶解，从而形成半固态水凝胶三维连续微孔道网阴模体系。
2.2两种细胞不同比例悬浮灌注共培养构建体外微血管网
将上述三维培养体系置于灌注培养发生器，将hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，进行灌注培养，流速为5ml/s。4小时更换含有不同比例细胞的培养液，经过3天、7天、14天后4％多聚甲醛固定，组织学切片后根据不同实验要求进行不同检测。
2.3 H&E染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水，苏木素染色5分钟后冲洗，盐酸酒精分化30秒。伊红染色2分钟后冲洗。通过75％、95％、100％乙醇梯度脱水至蜡。二甲苯透明后中性树胶封固片。
2.4 Masson三色染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水。weigert铁苏木素(weigert 铁苏木素A、B液等比例混和)染5-10分，流水稍洗。1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分。丽春红酸性品红染液染5-10分，流水稍冲洗。磷钼酸溶液处理约5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝人染液复染5分钟。1％冰醋酸处理1分钟，95％酒精脱水多次。无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固。
2.5免疫荧光染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水后，根据1.3.2实验步骤进行CD-31、Ⅷ因子和Col-Ⅵ的免疫荧光检测。
3.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建的微血管网状结构促进工程化组织再生的体内应用研究
3.1水凝胶三维微血管网阴模复合工程化骨支架材料的构建
利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，缠绕形成微米级单糖细丝网结构，将水凝胶液态双组分剂按照1:1的比例混合后，加入HA/TCP粉末，充分混合均匀。将单糖细丝网浸没于液态组分中，光固化使水凝胶成为半固态。将这一体系置于40℃水域，将单糖细丝溶解，从而形成复合骨支架材料的水凝胶三维连续微孔道阴模体系。
3.2悬浮灌注共培养构建体外微血管网
将hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，在实验3.1所述培养体系进行灌注培养，流速为5ml/s。4小时更换含有不同比例细胞的培养液，经过3天、7天、14天后，4％多聚甲醛固定，组织学切片后根据不同实验要求进行不同检测。
3.3裸鼠皮下异位实验
选取6周龄雄性裸鼠，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠。将实验3.2中得到的优化策略后的体系作为实验组，实验3.1得到的体系作为对照组分别植入裸鼠皮下，在不同时间点 (4w，8w，12w)取材固定，进行组织切片，后根据不同实验要求进行不同检测。
1.4兔颅骨极限缺损修复原位实验
3.4.1兔脐带间充质干细胞和兔脐带静脉内皮细胞的分离、培养和鉴定
参照实验1.1.1和1.1.2人脐带间充质干细胞和人脐带静脉内皮细胞的分离、培养和鉴定的方法，选取相关兔的一抗进行实验。
3.4.2兔颅骨极限缺损修复
选取6月龄雄性新西兰大白兔，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后制备直径2.0cm颅骨极限缺损。将实验3.2中得到的优化策略后的体系作为实验组，实验3.1得到的体系作为对照组分别植入兔颅骨极限缺损处，在不同时间点(4w，8w，12w)取材固定，后根据不同实验要求进行不同检测。
3.5形态学观察
根据实验2.3、2.4和2.5的步骤分别对实验3.3和3.4取得的组织学切片进行H&E染色、Masson三色染色和免疫荧光染色，观察形态学，成血管指标CD-31、Ⅷ因子和Col- Ⅵ以及成骨情况的表达。
3.6 Micro-CT检测骨缺损修复
将实验3.3和3.4得到的样本于4℃使用4％多聚甲醛固定24小时。Micro-CT(SIEMEMS)扫描取材样本并使用图形软件(MIMICS)三维重建分析颅骨缺损的修复情况。t检验进行统计分析。
实施例
1.脐带间充质干细胞的原代细胞培养。如图2所示。
2.脐带静脉内皮细胞原代培养。如图3所示。
3.脐带间充质干细胞表面标志物检测。如图4-图10所示。
4.脐带间充质干细胞成骨分化检测。如图11所示。
5.脐带间充质干细胞成脂分化检测。如图12所示。
6.脐带间充质干细胞克隆形成率染色。如图13所示。
7.脐带静脉内皮细胞阳性表达CD-31。如图14所示。
8.脐带静脉内皮细胞阳性表达VEGF。如图15所示。
9.脐带静脉内皮细胞阳性表达Ⅷ因子。如图16所示。
10.hUCMSCs促进hUVECs增殖。
图17所示，通过实验组hUCMSCs上清液和对照组hUVECs上清液间接培养hUVECs 7天。如图5，前3天，两组脐带静脉内皮细胞的OD值没有显著差异。从第4天至第7天hUCMSCs上清液诱导的hUVECs吸光光度值明显高于对照组，说明hUCMSCs显著促进hUVECs增殖。如图18-图19所示。通过Transwell间接共培养7天，实验组是hUCMSCs和hUVECs，对照组是hUVECs和hUVECs。提取hUVEC的蛋白进行VEGF信号通路的ERK1/2和p-ERK1/2的 Western Blot检测，如图7，结果实验组的ERK1/2和p-ERK1/2均显著高于对照组，其中实验组高于对照组将近两倍，表明hUVECS的VEGF通路的MAPK通路被激活，结果证实hUCMSCs 促进了hUVECs的成血管分化。
11.hUCMSCs促进hUVECs在体外二维界面上成管腔能力
如图20-图25所示，结果显示，当hUVECs:hUCMSCs为1:5时，在水凝胶二维体系中，形成的微管腔结构数量最多，形态结构最完整，最符合微血管再生需要。
12.hUCMSCs促进hUVECs在体外三维界面上成管腔能力
如图26-图28所示，结果显示，当hUVECs:hUCMSCs为1:5时，在三维悬浮灌注共培养构建体外微血管网中，静脉内皮细胞对管腔内壁的贴附最佳，细胞数量最多。
13.hUCMSCs促进hUVECs体内成血管进而促进异位骨再生。如图29-图34所示，结果显示，在三维悬浮灌注共培养构建体外微血管网与骨支架材料混合后植入裸鼠皮下8周后，在 hUCMSCs:hUVECs为5:1时实验组中裸鼠皮下异位成骨最佳。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.脐带间充质干细胞对血管再生微环境影响的实验
1.1人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞增殖的影响
1.2人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞成血管分化的影响
1.2.1Transwell间接共培养
将hUVECs以1*105个/孔接种于六孔板内，待细胞增殖至80％，实验组和对照组分别在Transwell小室以5*105个/孔接种hUCMSCs和hUVECs；经过3天、7天、14天后根据不同实验要求进行不同检测；
1.2.2Western Blot检测ERK1/2和p-ERK1/2
将间接共培养后的hUVECs用冷的PBS洗两次后，加入裂解液+蛋白酶抑制剂并用细胞刮收集，进行7.5％SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上；将膜5％脱脂牛奶封闭2小时，加入小鼠抗ERK1/2和p-ERK1/2一抗，抗小鼠HRP二抗，ECL发光试剂检测；
1.3二维直接共培养观察两种细胞形成的组织结构，不同比例直接共培养两种细胞
步骤2.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建微血管网状结构的体外应用研究
2.1水凝胶三维连续微孔道网状阴模培养体系的构建
利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，缠绕形成微米级单糖细丝网结构，将水凝胶液态双组分剂按照1:1的比例混合后，将单糖细丝网浸没于液态组分中，光固化使水凝胶成为半固态；将这一体系置于40℃水域，将单糖细丝溶解，从而形成半固态水凝胶三维连续微孔道网阴模体系；
2.2两种细胞不同比例悬浮灌注共培养构建体外微血管网
将步骤2.1获得三维培养体系置于灌注培养发生器，将hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，进行灌注培养，流速为5ml/s；4小时更换含有不同比例细胞的培养液，经过3天、7天、14天后4％多聚甲醛固定，组织学切片后根据不同实验要求进行不同检测；
2.3H&E染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水，苏木素染色5分钟后冲洗，盐酸酒精分化30秒；伊红染色2分钟后冲洗；通过75％、95％、100％乙醇梯度脱水至蜡；二甲苯透明后中性树胶封固片；
2.4Masson三色染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水；weigert铁苏木素染5-10分，流水稍洗；1％盐酸酒精分化，流水冲洗数分；丽春红酸性品红染液染5-10分，流水稍冲洗；磷钼酸溶液处理5分钟，不用水洗，直接用苯胺蓝染液复染5分钟；1％冰醋酸处理1分钟，95％酒精脱水多次；无水酒精脱水、二甲苯透明，中性树胶封固；
2.5免疫荧光染色
组织石蜡切片通过100％、95％、75％乙醇梯度脱蜡至水后，进行CD-31、Ⅷ因子和Col-Ⅵ的免疫荧光检测；
步骤3.脐带间充质干细胞和脐带静脉内皮细胞共培养构建的微血管网状结构促进工程化组织再生的体内应用研究
3.1水凝胶三维微血管网阴模复合工程化骨支架材料的构建
利用棉花糖机将融化的单糖喷射出的细丝，缠绕形成微米级单糖细丝网结构，将水凝胶液态双组分剂按照1:1的比例混合后，加入HA/TCP粉末，充分混合均匀；将单糖细丝网浸没于液态组分中，光固化使水凝胶成为半固态；将这一体系置于40℃水域，将单糖细丝溶解，从而形成复合骨支架材料的水凝胶三维连续微孔道阴模体系；
3.2悬浮灌注共培养构建体外微血管网
将hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例悬浮于含10％胎牛血清的α-MEM培养液，在实验3.1所述培养体系进行灌注培养，流速为5ml/s；4小时更换含有不同比例细胞的培养液，经过3天、7天、14天后，4％多聚甲醛固定，组织学切片后根据不同实验要求进行不同检测；
3.3裸鼠皮下异位实验
选取6周龄雄性裸鼠，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉裸鼠；将实验3.2中得到的优化策略后的体系作为实验组，实验3.1得到的体系作为对照组分别植入裸鼠皮下，在不同时间点4w，8w，12w取材固定，进行组织切片，后根据不同实验要求进行不同检测；
3.4兔颅骨极限缺损修复原位实验
3.5形态学观察
根据实验2.3、2.4和2.5的步骤分别对实验3.3和3.4取得的组织学切片进行H&E染色、Masson三色染色和免疫荧光染色，观察形态学，成血管指标CD-31、Ⅷ因子和Col-Ⅵ以及成骨情况的表达；
3.6Micro-CT检测骨缺损修复
将实验3.4得到的样本于4℃使用4％多聚甲醛固定24小时；Micro-CT扫描取材样本并使用图形软件三维重建分析颅骨缺损的修复情况；t检验进行统计分析。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞对人脐带静脉内皮细胞增殖的影响包括：
1.1.1人脐带间充质干细胞的分离培养以及鉴定
取体健适龄产妇的脐带，剪成长约1.0cm的小段，洗净残留血液，去除脐动静脉，取Wharton胶剪碎至直径0.5cm大小的组织块，置于培养皿底贴壁，加入少量含10％胎牛血清的α-MEM培养液，4h后添加5mL培养液；
取第三代hUCMSCs，PBS液清洗重悬；分装至EP管内，向每个EP管中加入2μL的抗CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD105抗体，4℃孵育一个小时，离心冲洗掉多余抗体，3％FBS的PBS液离心重悬至200μL，使用流式细胞仪检测其表面标志物的表达情况；
1.1.2人脐带静脉内皮细胞的分离培养以及鉴定
取体健适龄产妇的脐带，PBS冲洗，将注射器插入脐静脉，用粗丝线扎牢；注入PBS液灌洗净脐静脉；将脐带一端用止血钳夹闭，从另一端用注射器向脐静脉注入预热37℃的0.25％胰蛋白酶至血管充盈；37℃水浴中消化8-10min；收集消化液并终止消化，离心后接种于培养瓶，加入含10％胎牛血清的α-MEM培养液，置37℃、5％CO2孵育箱中静置培养；
在6孔培养板按传代方法进行细胞接种，待细胞生长至近融合用PBS冲洗，放入乙醇-丙酮混合液中固定10min；分别滴加兔抗人CD-31抗原多抗工作液，37℃孵育60min；PBS冲洗浸泡10min；加入羊抗兔荧光抗体，37℃孵育30min；PBS冲洗浸泡15min；缓冲甘油封片；置于荧光显微镜下观察；
1.1.3MTT检测hUVECs增殖
将第二代hUVECs细胞接种于96孔培养板的7排孔中；每孔加入等体积10％FBS的α-MEM培养基，实验组加入等体积hUCMSCs上清液，对照组加入等体积hUVECs上清液，培养7天；每天将一整排培养液吸出，PBS清洗两遍，给一排的前4孔每孔加入噻唑蓝溶液20μL，37℃孵育4小时，每孔加入DMSO150μL，避光震荡10分钟，然后在酶联免疫检测仪中590nm波长下检测吸光光度值；每天检测一排4个实验孔2个对照孔，检测7天。
3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法，其特征在于，所述二维直接共培养观察两种细胞形成的组织结构，不同比例直接共培养两种细胞包括：
1.3.1以hUVECs：hUCMSCs＝1:1、3:1、5:1的比例，混合接种于六孔板的每个孔，每孔细胞总数维持在1*105个左右，每组重复三次；经过3天、7天、14天后4％多聚甲醛固定；
1.3.2免疫荧光染色
以免疫荧光检测CD-31表达为例，孔板或切片加入兔抗人CD-31孵育过夜；二抗用Alexa594驴抗兔，孵育4小时；Hoechst 33342衬染细胞核20秒；激光共聚焦显微镜下观察，CD-31，细胞核，以及二者之间的关系；相同方法检测Ⅷ因子和Col-Ⅵ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710757400.0A CN107748260B (zh) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710757400.0A CN107748260B (zh) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107748260A CN107748260A (zh) | 2018-03-02 |
| CN107748260B true CN107748260B (zh) | 2020-05-15 |
Family
ID=61254851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710757400.0A Expired - Fee Related CN107748260B (zh) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107748260B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111494423B (zh) * | 2020-04-22 | 2022-01-25 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | 一种干细胞组合物及其应用和干细胞滴液 |
| CN111544453B (zh) * | 2020-04-27 | 2021-01-22 | 高连如 | 一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法 |
| CN113577394B (zh) * | 2021-07-08 | 2022-09-09 | 中国人民解放军西藏军区总医院 | 一种脐带间充质干细胞制备生物凝胶-细胞聚合体体系的方法及低氧条件的应用 |
| CN117363565B (zh) * | 2023-09-28 | 2024-05-17 | 南方医科大学口腔医院 | 一种用于骨再生的血管化干细胞球的构建方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105378064A (zh) * | 2013-07-23 | 2016-03-02 | 公立大学法人横滨市立大学 | 向生物学组织赋予血管系统的方法 |
| CN105463058A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-04-06 | 北京汉氏联合生物技术股份有限公司 | Msc促进血管新生能力的定量方法 |
| CN105779381A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-07-20 | 王凌仪 | 临床治疗级细胞治疗用人脐带来源（WJ-MSCs）规模化细胞外基质筛选三维附着制备方法 |
| CN106701668A (zh) * | 2015-07-22 | 2017-05-24 | 中国医药大学 | 间质干细胞、其纯株化扩张的方法、其分离方法及其应用 |
-
2017
- 2017-08-29 CN CN201710757400.0A patent/CN107748260B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105378064A (zh) * | 2013-07-23 | 2016-03-02 | 公立大学法人横滨市立大学 | 向生物学组织赋予血管系统的方法 |
| CN106701668A (zh) * | 2015-07-22 | 2017-05-24 | 中国医药大学 | 间质干细胞、其纯株化扩张的方法、其分离方法及其应用 |
| CN105463058A (zh) * | 2016-01-06 | 2016-04-06 | 北京汉氏联合生物技术股份有限公司 | Msc促进血管新生能力的定量方法 |
| CN105779381A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-07-20 | 王凌仪 | 临床治疗级细胞治疗用人脐带来源（WJ-MSCs）规模化细胞外基质筛选三维附着制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Angiogenic and osteogenic regeneration in rats via calcium phosphate scaffold and endothelial cell co-culture with human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs), human umbilical cord MSCs, human induced pluripotent stem cell-derived MSCs and human embryo;Wenchuan Chen, et al.;《JOURNAL OF TISSUE ENGINEERING AND REGENERATIVE MEDICINE》;20170613;第12卷(第1期);第191-203页 * |
| Role of VEGF-A in angiogenesis promoted by umbilical cord-derived mesenchymal stromal/stem cells: in vitro study.;Irina Arutyunyan, et al.;《Stem Cell Research & Therapy》;20160322;第7卷(第46期);第1-13页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107748260A (zh) | 2018-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107748260B (zh) | 一种脐带间充质干细胞促进组织工程预血管化的实验方法 | |
| Wang et al. | Functional engineered human cardiac patches prepared from nature's platform improve heart function after acute myocardial infarction | |
| Mishra et al. | Effect of prevascularization on in vivo vascularization of poly (propylene fumarate)/fibrin scaffolds | |
| CN102861359B (zh) | 器官和组织的脱细胞化和再细胞化 | |
| Fuchs et al. | Contribution of outgrowth endothelial cells from human peripheral blood on in vivo vascularization of bone tissue engineered constructs based on starch polycaprolactone scaffolds | |
| CN101148656B (zh) | 一种组织工程化肝单元的构建方法 | |
| WO2019018737A1 (en) | METHODS FOR PRODUCING MULTILAYER TUBULAR TISSUE CONSTRUCTIONS | |
| Liang et al. | Gelatin methacryloyl-alginate core-shell microcapsules as efficient delivery platforms for prevascularized microtissues in endodontic regeneration | |
| JP2005521402A (ja) | ヒト胚性幹細胞に由来する内皮細胞 | |
| JP6292557B2 (ja) | 網膜色素上皮細胞シートの製造方法 | |
| CN104411816A (zh) | 经生物工程改造的同种异体血管 | |
| KR20120023626A (ko) | 기관 및 조직의 탈세포화 및 재세포화 | |
| CN113318274B (zh) | 一种水凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN106362211A (zh) | 生物基质支架 | |
| Ma et al. | Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into multi-layered epidermis-like cells in 3D organotypic coculture | |
| KR20060010847A (ko) | 분리된 전분화능 성체줄기세포 및 그의 분리 및 배양 방법 | |
| Marí-Buyé et al. | Development of a three-dimensional bone-like construct in a soft self-assembling peptide matrix | |
| Markou et al. | Tissue engineering using vascular organoids from human pluripotent stem cell derived mural cell phenotypes | |
| WO2003093433A2 (en) | Fibrin-based biomatrix | |
| Li et al. | Vessel graft fabricated by the on-site differentiation of human mesenchymal stem cells towards vascular cells on vascular extracellular matrix scaffold under mechanical stimulation in a rotary bioreactor | |
| WO2008049281A1 (fr) | Procédé de construction d'une construction de génie tissulaire hépatique et construction de génie tissulaire hépatique | |
| KR102286779B1 (ko) | 자궁내막 손상의 치료용 자궁내막복합체, 상기 자궁내막복합체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자궁내막복합체 | |
| Iyer et al. | Spatiotemporal tracking of cells in tissue‐engineered cardiac organoids | |
| AU2010300871B2 (en) | Mammary artery derived cells and methods of use in tissue repair and regeneration | |
| WO2017077985A1 (ja) | 積層化細胞シート組成物を製造する方法、それにより製造される積層化細胞シート組成物及びその製造装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200515 Termination date: 20200829 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |