KR20060010847A - 분리된 전분화능 성체줄기세포 및 그의 분리 및 배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전분화능 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법뿐만 아니라 외분비 선상조직으로부터 얻어진 분리된 전분화능 성체줄기세포에 관한 것이다.

성체줄기세포, 전분화능, 외분비 선상조직, 배아줄기세포, 배양

Description

분리된 전분화능 성체줄기세포 및 그의 분리 및 배양 방법{ISOLATED PLURIPOTENT ADULT STEM CELLS AND METHODS FOR ISOLATING AND CULTIVATING THE SAME}

본 발명은 성체 전분화능 줄기세포와 그것을 분리하고 배양하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 무한한 범위까지 분열하는 능력과 다른 유형의 세포를 형성하기 위해 적합한 환경 하에서 그리고/또는 적합한 자극을 통해 분화하는 능력을 가지는 세포이다. 줄기세포는 특징적인 형상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가진다.

다른 유형의 세포로 분화하기 위한 줄기세포들의 다른 잠재력 때문에, 지금까지 배아줄기세포와 성체줄기세포 사이에 구분이 있어 왔다. 수정란세포로부터 배아단계로, 성체 유기체로 발달하면서 줄기세포의 잠재력이 줄어든다는 것이 일반적으로 일치된 의견이다. 이러한 성질에 따라, 수정란세포는 만능(totipotent)이라 일컬어지고, 배아줄기세포는 전분화능(pluripotent)이라 일컬어지고, 성체줄기세포 는 다능성(multipotent)이라 일컬어진다.

만능 세포는 완전한 유기체로 발달할 수 있는 세포이다. 만능세포는 수정란세포와 함께 초기 배아단계의 세포들을 포함한다. 전분화능은 전형적으로 분열된 배반포의 내세포덩이(internal cell mass)로부터 얻어지는 배아줄기세포가 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세 가지 배엽 세포 모두로 분화할 수 있다는 사실을 말한다고 이해된다.

그러나 지금까지 알려진 견해에 따르면 성체줄기세포는 단지 다능성인 것으로, 즉 그것들은 단지 적은 범위까지 분화할 수 있는 것이다. 따라서 조직특이 줄기세포는 단지 같은 조직유형의 세포로만 분화할 수 있는 것이다. 근년에, 이러한 견해는 예를 들면 골수로부터(WO 02/064748) 또는 재생조직으로부터(WO 02/057430) 얻어진 성체줄기세포를 이용한 연구가 특정한 조건 하에서, 예를 들면, 타겟 조직으로의 이식, 피더세포(feeder cell)층 위에서의 배양 및/또는 특정 성장인자의 존재하에서 배양과 같은 조건 하에서, 다른 배엽의 세포유형을 형성하기 위해 각각의 줄기세포의 분화도 일어날 수 있다는 것을 증명했기 때문에 적어도 부분적으로 수정되어야만 했다. 그러나 이러한 성체줄기세포는 여전히 자가 재생 능력과 분화 잠재력 면에서 배아줄기세포와 동등하지 않다. 특히 장기간 배양에서 이러한 세포선(cell line)의 안정성은 보장되지 않으며, 세포는 자발적으로 분화하는 경향이 있고 어떤 환경에서는 종양세포로 발전하는 악성 경향까지 있다. 더욱이 분열 증식의 속도는 배양이 길어질수록 상당히 감소한다.

따라서 배아줄기세포에 대한 윤리적 반대 관점에서 볼 때, 가장 큰 분화 가 능 잠재력 및 배아줄기세포와 동등한 성질을 가진 새로운 성체줄기세포에 대한 커다란 관심이 여전히 남아있다.

그러므로 본 발명의 목적은 더 이상 배아줄기세포와 비교하여 자가 재생 능력과 분화 잠재력 면에서 중대한 차이를 지니지 않으며 사실상 전분화능이라 일컬어질 수 있는 새로운 성체줄기세포를 제공하는 것이다. 또 다른 연관된 목적은 성체 전분화능 줄기세포와 그것으로부터 얻어지는 분화된 세포를 분리하고 배양하는 새롭고 특히 간단한 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 연관된 목적은 전분화능 줄기세포를 사용한 새로운 약학적 조성물과 다양한 질병 상태를 치유하는 방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적들은 본 발명에 따라 줄기세포와 그것들로부터 얻어진 분화된 세포를 분리하고 배양하는 방법뿐만 아니라 외분비 선상조직으로부터 유래된 분리된 전분화능 성체 줄기세포를 제공함으로써, 그리고 본 발명의 줄기세포 및/또는 그것들로부터 얻어진 분화된 세포를 이용한 약학적 조성물과 치유 방법을 제공함으로써 달성된다.

분화에 대한 다양한 잠재력을 지닌 성체줄기세포는 이미 다수의 조직에서 발견되었다. 줄기세포로 추정되는 것은 이미 췌장의 내분비 인슐린-생산 선상조직으로부터 분리되었지만, 줄기세포라 특징지어질 수 있는 세포는 이전에 어떠한 외분비 선상조직으로부터도 분리되지 않았다.

그러므로 본 발명이 특히 간단한 방법으로 외분비 선상조직으로부터 성체줄기세포를 생산하는 것을 처음으로 가능케 했다는 것은 매우 놀라운데, 그 성체줄기세포는 더 이상 자가 재생 능력과 분화 잠재력 면에서 배아줄기세포와 특별한 차이를 가지지 않으며 이는 전분화능이라 불릴 수 있는 것이다.

원료물질로 쓰이는 외분비 선상조직은 바람직하게는 척추동물, 예를 들면 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유류, 더욱 바람직하게는 영장류 특히 사람으로부터 얻는다.

본 발명에서 사용된 외분비 선상조직은 성체 유기체, 미성숙 유기체, 비인간 태아 유기체, 바람직하게는 생후 유기체로부터 유래될 수 있다. 따라서 본 특허 명세서에서 사용된 "성체"라는 용어는 조직이 생기는 공여 유기체의 발달단계가 아니고 선원 조직(source tissue)의 발달단계를 일컫는다. "성체"줄기세포는 비배아줄기세포이다.

외분비 선상조직은 바람직하게는 침샘, 눈물샘, 피지선, 한선, 전립선을 포함하는 생식기의 선(샘), 췌장을 포함하는 위장조직의 샘, 또는 간의 분비조직으로부터 얻는다. 가장 바람직한 실시 예는 샘꽈리조직이다. 샘꽈리조직은 특히 바람직하게는 췌장, 귀밑샘 또는 큰턱샘으로부터 얻는다.

본 발명에 따른 방법으로 제공된 줄기세포는 피더세포층이나 특별한 첨가제 없이 쉽게 분리되고 안정된 배지에서 장기간 미분화 상태로 유지된다. 본 발명에서 쓰인 피더세포라는 용어는 성장인자를 방출함으로써 그리고/또는 세포외기질(extracellular matrix)을 제공함으로써 그리고/또는 줄기세포 배지의 분화를 막음으로써 사실상 배양되는 세포들의 성장을 촉진하는 모든 세포들을 일컫는다.

본 발명의 줄기세포 배지에서, 세포들은 1년의 기간 동안 25회를 훨씬 초과하는 계대 후에 자가 재생 능력과 무한한 분열 능력을 유지하고, 배지는 여전히 안정적이다. 줄기세포의 매우 작은 부분(대략 3%)만이 자발적인 분화를 거치고 배지를 교체할 때 아무 문제없이 기존의 배지와 함께 분리된다.

게다가, 이러한 방식으로 생산된 줄기세포는 액체 질소 온도에서 동결 상태로 저장될 수 있고 분화능력과 생명력(vitality)을 변함없이 유지한다.

본 발명의 성체줄기세포는 어떤 특정한 성장인자나 분화인자를 가하는 일 없이 분화하도록 쉽게 자극될 수 있다; 이는 세포들의 삼차원적 접촉을 확보하는 공간조건 하에서 그것들을 배양함으로써 이루어진다. 바람직한 실시 예에서, 이러한 조건들은 배아줄기세포를 가지고 시작하여 이미 서술한 방법과 같이 현적(hanging drop)에서 배양하는 것을 포함한다(Wobus et al., Biomed. Biochim. Acta 47:965-973, 1988). 이 방법은 아래의 실시 예에서 매우 상세하게 설명된다. 그러나, 원하는 세포들의 삼차원적 접촉을 확보하는 대안적 배양 방법 그리고 그 분야에 능숙한 자들에게 공지되어 있고 이용 가능한 대안적 배양 방법 또한 사용될 수 있다는 것은 자명하다. 이러한 대안적 방법의 예는 움직이는 현탁 배지(suspension culture)에서 배양하는 것, 전자기장 케이지에서 배양하는 것 또는 레이저 핀셋 방법으로 배양하는 것 또는 세포들이 부착력을 약간 가지거나 또는 전혀 가지지 않는 표면 위에서 배양하는 것을 포함한다. 이러한 표면들은 예를 들면, 유리, 폴리스티렌 또는 반부착(anti-adhesion)층으로 처리된 표면, 예를 들면 PTFE 코팅된 표면 또는 폴리헤마(poly-HEMA) 코팅된 표면일 수 있다.

이러한 조건 하에서, 삼차원적 세포구조 또는 세포집합체는 자발적으로 발달한다; 이것들은 본 발명자에 의해 배아줄기세포에 이미 사용되는 "배상체(embryoid bodies)"라는 용어에 근거해 "오르가노이드체(organoid bodies)"라고 기술되었다. 이러한 오르가노이드체는 현탁 배지 또는 흡착 배지 그리고 또 다른 배지로 옮겨질 수 있다. 만약 적당한 영양 공급이 있다면, 이러한 오르가노이드체는 계속 자라서 수 밀리미터 또는 그 이상의 직경에 달할지도 모른다. 이러한 커다란 오르가노이드체는 조직과 유사한 구조를 가지고 있고 이 단계에서는 역시 단순한 세포집합체와 구별하기 위해 "조직체"라고 일컫는다.

오르가노이드체가 표면 배지(surface culture)로 다시 도입되면, 세포 단층이 과성장(out-growing)하는 단세포로부터 형성되고, 그리고 일차 오르가노이드체의 특성에 상당하는 특성을 가지는 이차 오르가노이드체가 자발적으로 형성되면서 다층 영역으로 된다. 본 발명의 오르가노이드체는 생존 능력, 재생산 능력, 성장 능력 또는 분화 능력을 잃는 일 없이 동결 상태로, 예를 들면 액체 질소 온도에서 저장될 수 있다.

오르가노이드체로부터 자라거나 분리된 세포들은 세 가지 배엽의 다양한 세포유형으로 분화할 수 있다. 분화를 위해, 어떠한 분화인자도 필요하지 않고 또한 세포들은 분화하기 위해 이식될 필요도 없다. 그러나, 다량의 특정 세포유형을 제어된 방식으로 생산하기 위해 이러한 분화인자를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 이러한 분화인자는 최고 수준의 이 기술 분야에서 알려져 있으며 예를 들면, 심장세포와 섬유아세포의 생산 증가를 위한 bFGF("basic fibroblast growth factor")("기초 섬유아세포 성장인자"), VEGF("vascular endothelial growth factor")("맥관내피 성장인자"), DMSO와 이소프로테레놀, 섬유아세포 성장인자 4(FGF4), 심장세포와 간세포의 생산 증가를 위한 간세포 성장인자(HGF), 심장세포의 생산 증가를 위한 TGF-betal("transforming growth factor betal")("변형 성장요인 베탈"), 진피세포와 심장세포의 생산 증가를 위한 EGF("epidermal growth factor")("표피 성장인자"), 케라티노사이트를 형성하기 위한 KGF("keratinocyte growth factor")("케라티노사이트 성장인자")(때때로 코르티손와 함께), 신경세포, 심장세포 및 신장세포 생산 증가를 위한 레티노이드산, 뇌세포, 간세포, 췌장세포및 신장세포의 생산 증가를 위한 beta-NGF("beta nerve growth factor")("베타 신경 성장인자"), 일반 중배엽세포를 형성하기 위한 BMP-4("bone morphogenic protein 4")("골 형태발생 단백질 4") 및 엑티빈 A를 포함하지만, 본 발명이 이들 세포유형으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 전분화능 줄기세포로부터 얻어질 수 있는 분화된 세포는 골세포(골아세포와 파골세포), 연골세포, 지방세포, 섬유아세포(예를 들면, 피부 및 힘줄 섬유아세포), 근세포, 내피세포, 상피세포, 조혈세포, 감각세포, 내분비 및 외분비 선상세포, 신경교(질)세포, 신경세포, 희소돌기아교세포, 혈구, 창자세포, 심장, 폐, 간, 신장 또는 췌장 세포를 포함하지만 이러한 세포들로 한정되는 것은 아니다.

결과적으로 분화된 세포유형은 조직학, 면역 세포 화학 그리고 전자 현미경의 기술로 밝혀지고 특징지어질 수 있다.

본 발명의 성체 전분화능 줄기세포 및/또는 분화된 세포 그리고 그것으로부터 유래된 오르가노이드체는 의학적 그리고 비의학적 분야에서 넓은 범위의 적용가능성을 가진다. 예를 들면, 그 세포들은 상처나 질병 상태를 치유하기 위해 동물이나 사람 환자에게 투여될 수 있다.

치유되는 질병 상태는 줄기세포를 가지고 성공적으로 치유될 수 있다고 기대되는 모든 질병 상태이다. 이러한 질병 상태는 예를 들면, 종양, 폐질환, 간질환, 신장질환, 결합조직질환, 심장혈관질환, 신진대사질환, 신경변성질환, 자기면역질환, 빈혈증, 혈우병, 당뇨병, 허혈, 염증, 전염병, 유전결함 또는 이식거부와 노화과정도 포함될 수 있다.

투여된 세포들은 바람직하게는 자가 조직, 즉 거부반응을 피하기 위해 치료 대상 환자로부터 비롯된 것이다. 치료는 예를 들면 투여된 세포가 환자의 몸에서 손상되었거나 잃은 기관 또는 조직의 기능을 나타내기 위해 인비보(in vivo) 분화한다는 사실을 구성할 수 있다. 기관이나 조직은 예를 들면, 골수, 혈액, 비장, 폐, 신장, 방광, 창자, 뇌, 지방조직, 결합조직, 근육조직, 심장, 혈관, 췌장, CNS(중추신경계), 말초 신경계, 피부 그리고 특히 점막으로부터 선택될 수 있다.

바람직한 실시 예에서, 치료는 환자의 면역 시스템을 강화하거나 복원시킨다. 또 다른 실시 예에서, 치료는 예를 들어 체액으로부터 독소를 제거하거나 그렇지 않으면 그것을 치료법 또는 진단처리에 이용하기 위해 환자의 몸 밖으로 줄기세포 또는 그것으로부터 유래된 세포, 예를 들면 간 또는 신장세포와 접촉하고 있는 환자의 혈액이나 다른 체액을 가져오는 것으로 구성되고, 그리고 나서 체액은 환자의 몸으로 되돌려진다.

치료법에서 이런 식으로 투여된 본 발명의 줄기세포는 또한 치료제의 안전한 부형제로도 사용될 수 있다. 치료제는 예를 들면 DNA, RNA, 단백질 또는 펩티드 또는 저분자 약제가 될 수 있다.

특히 줄기세포는 특정한 성질을 가지게 유전자 조작될 수도 있고, 그런 후 유전자 치료를 위해 사용될 수도 있다. 이러한 성질들은 예를 들면, 감소된 항원, 원하는 DNA, RNA, 단백질의 생산, 원하지 않은 DNA, RNA, 단백질 생산의 결여 등을 포함할 수 있다.

그 세포는 최고 수준의 이 기술 분야에 알려져 있고 이 목적에 적합한 모든 방법으로 투여될 수 있다. 적합한 방법은 국소 주입, 전신 주입, 비경구 투여, 경구 투여 또는 태아(embryo)에 자궁 내 주입하는 것을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

대개 치료를 위해 쓰이는 줄기세포 또는 그것으로부터 얻어진 분화된 세포는 약학적 조성물에 존재할 것이다. 이러한 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 메트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제(vehicle)를 포함할 수 있다. 메트릭스 및/또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 다른 것들에 의존할 것이다. 적합한 메트릭스 및/또는 부형제는 최고 수준의 이 기술 분야에 알려져 있다.

더욱이 약학적 조성물은 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.

또 다른 가능한 이용은 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따르는 줄기세포, 제 10항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따르는 줄기세포 배지, 제 15항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 따르는 오르가노이드체, 또는 그것으로부터 얻어진 분화된 세포를 인비트로(in vitro)에서 조직-유사 또는 기관-유사 다세포계(multicellular systems)의 발달을 위해 이용하는 것이다. 바람직한 실시 예에서, 다세포계는 다른 유형의 세포를 포함한다. 이 다세포계는 그 후에 예를 들면, 이식되거나, 또는 예를 들면 혈액 투석을 위해 또는 원하는 물질의 생산을 위해 체외에서 사용될 수 있다.

또 다른 가능한 이용은 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따르는 줄기세포, 제 10항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따르는 줄기세포 배지, 제 15항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 따르는 오르가노이드체 또는 그것으로부터 얻어진 분화된 세포 또는 다세포계를 인비트로 시스템으로서 화학물질을 시험하기 위해, 특히 약제나 화장품을 선별하기 위해 그리고/또는 특정 세포에서 알려졌거나 또는 활동할 가능성이 있는 인자 또는 독소 또는 돌연변이 유발요인의 효과를 분석하기 위해 이용하는 것이다. 이 효과는 예를 들면 세포의 분열증식능력, 분화능력 또는 생존 능력에서의 변화일 수 있다.

또 다른 가능한 이용은 세포 상호작용의 분석을 위한 복합세포시스템(complex cellular systems)을 제공하는 것이다.

또 다른 가능한 응용은 인비트로에서 원하는 물질을 생산하기 위해 줄기세포로부터 얻어진 분화된 세포를 이용하는 것이다.

비인간 줄기세포에 대한 특별한 응용은 성체줄기세포 또는 그것으로부터 얻어진 분화된 세포를 치료 또는 재생산 복제를 위해 사용하는 것이다. 예를 들면 성체줄기세포 또는 그것으로부터 유래된 분화된 세포 또는 그것으로부터 분리된 세포핵을 세포핵을 빼낸 비인간 난모세포로 도입하고 그 난모세포를 배반포의 발달을 이끄는 조건 하에서 배양한다. 그러면 이 배반포로부터 배아줄기세포를 얻고 나서 공지된 방법(치료 복제법)에 의하여 원하는 세포유형으로 분화하도록 유도할 수 있고, 또는 배반포가 암컷에 이식될 수 있는 배아로 발달하게 만들 수 있고, 그런 후 상응하는 잉태기간(재생산 복제) 후에 자연적으로 출생할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서, 줄기세포 또는 그것으로부터 얻어진 오르가노이드체 또는 분화된 세포들은 키트(kit)의 형태로 활용가능하게 만들어질 수 있다. 이러한 키트는 이러한 세포들 또는 상기 정의된 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 게다가, 상기 키트는 또한 다른 물질, 예를 들면, 세포나 시약을 투여하기 위해 예를 들면, 세포나 진단시약을 배양하기 위한 시약을 포함할 수 있다.

도 1은 오르가노이드체를 형성하고 배양하는 것뿐만 아니라 표면 배지와 현적에서 줄기세포를 배양하는 것을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 2는 쥐의 췌장에서 본 발명의 줄기세포로부터 생산된 내배엽성인 상피세포와 선상세포의 면역 조직학적 검출을 보여주는 것이다. 이 세포들은 사이토케라 틴과 아밀라아제에 항체로 염색되었다. 또한 세포핵들은 DAPI로 염색되었다.

도 3은 래트의 췌장에서 본 발명의 줄기세포로부터 생산된 외배엽 성질을 가지는 중배엽 및 신경세포를 가지는 분화된 근세포의 면역 조직학적 검출을 보여주는 것이다. 이 세포들은 알파평활근액틴(SMA)과 신경필라멘트(NF)에 항체로 염색되었다. 또한 세포핵들은 DAPI로 염색되었다.

도 4는 아밀라아제와 인슐린뿐만 아니라 신경, 신경교(질), 평활근 세포의 표지자의 발현을 나타낸 것이다.

a, b: PGP 9.5-표지된 신경세포는 수많은 정맥류(varicosities)를 나타내는 다극성 돌기를 보여준다. c, d: 신경필라멘트 기구(apparatus)(밝은 화살표, 원래 사진에서 녹색으로 표시됨)는 주위핵(pericaryon)을 통해 세포질 돌기 내로 확장한다. GFAP-면역 반응성 신경교(질)세포(어두운 화살표, 원래 사진에서 빨간색으로 표시됨)는 아주 근접하여 있다. e, f: α-SMA-표지된 세포(어두운 화살표, 원래는 빨간색임)와 NF-표지된 신경세포(밝은 화살표, 원래는 녹색임)는 상당히 먼 거리에 걸쳐 형성된 접촉(f)을 이용해서 초기 신경근 망(network)(e)을 형성한다. g: 신경세포와 신경교(질)세포가 응집되어 있는 3주 된 오르가노이드체에서 GFAP(어두운 화살표, 원래는 빨간색)와 NF(밝은 화살표, 원래는 녹색)를 면역 염색한 것이다. h: 신경근 망의 형성이 더욱 진행된 단계에서 3주 된 오르가노이드체에서 α-SMA(어두운 화살표, 원래는 빨간색임)와 NF(밝은 화살표, 원래는 녹색임)를 면역 염색한 것이다. i, j: 8주 된 오르가노이드체의 단면에서, 본래의 조직에서의 경우와 마찬가지로, NF에 대한 면역 반응성 세포가 α-SMA에 대해 면역 반응성이었던 세포 와 바로 근접하는 곳에서 발견되었다. k: 세포들의 작은 부분은 아밀라아제에 대해 양성염색을 나타낸다(밝은 화살표, 원래는 녹색). 아밀라아제를 포함하는 세포는 그들의 핵의 토포그래피 배열에 근거하여 보이는 것처럼 둥글게 모여있고, 그것들은 선단(apical) 세포극 내에 외분비물을 저장하기 때문에 외분비 췌장 샘꽈리의 형태학적 특성을 입증한다. l: 또 다른 세포의 일부분은 인슐린에 대해 면역 반응성이 있는 입상 소포를 함유한다. 내분비 생산물은 균질하게 분포되지는 않았지만 극 패턴으로 저장된다. 핵은 DAPI(원래는 파란색)로 대조염색(counterstain)된다.

도 5는 세포외기질 성분과 사이토케라틴의 발현을 나타낸 것이다.

a, b: 원생 글리칸의 구형침전물(a) 및 소섬유침전물(b)은 알시안블루(Alcian blue)로 염색함으로써 밝혀졌다. c-e: 구형영역(c) 및 소섬유영역(d)은 연골 바탕질(cartilage matrix) 단백질 콜라겐 Ⅱ에 대해 면역 반응성이다. 밀집되게 분포된 세포들은 발달하는 세포외바탕질에 인접하여 관찰되었다. 두 개의 개별 세포들(e)은 콜라겐 Ⅱ를 표지한 세포질을 가지고 있다. f: 사이토케라틴에 대해 면역 반응성이 있는 세포들은 덩어리(cluster)로 배열된다. g: 오르가노이드체(OB)의 현미경검사를 검토하는 공초점 레이저. 콜라겐 Ⅱ 면역 반응성(어두운 화살표, 원래는 빨간색으로 마크됨)은 오르가노이드체(OB)의 중심을 향해 증가한다. 비질린(vigilin)-면역 반응성 세포(밝은 화살표, 원래는 녹색으로 표시됨)는 오르가노이드체의 바깥 경계에 주로 위치하는데, 이는 그것들의 높은 이동 활동성을 나타낸다. 핵은 DAPI로 대조염색된다.

도 6은 분화된 오르가노이드체를 투과성 전자 현미경으로 검사한 것을 나타 낸 것이다.

a-c: 근필라멘트를 가진 평활근세포이다. 근필라멘트 기구는 침투된 관속(bundle)(a)에서 세포질을 통해서 확장하고 전형적인 밀집체(화살표)(b)를 나타낸다. 근아세포는 연결 망(c)을 형성하는 방사상의 세포 돌기를 가지고 있다. d: 다수의 작은 크기의 소포가 축적된 세포 돌기로 대부분이 신경섬유 정맥류에 해당한다. e: 콜라겐과 망상 섬유. 콜라겐 섬유의 전형적인 줄무늬 패턴(주기적 밴드)은 소섬유의 세로 단면에서 식별할 수 있다. f-h: 전자 밀집 소포를 나타내는 분비세포. 소포들은 세포질 전체를 차지하지는 않지만 대신 하나의 세포극(f)에 저장된다. 분비세포들은 소핵과 유사한 구조(g)를 형성하기 위해 서로 자주 접촉한다. 분비세포의 작은 부분은 외분비 입상(h), 예를 들면 인슐린 생산 세포의 β-입상의 초미세 구조 형상에 해당하는 소포(화살표)를 함유한다. i: 8주령 오르가노이드체에서 상피 표면(화살표)의 형성 시작. j: 케라티노사이트와 데즈모섬(화살표) 사이에서 전형적인 세포 접촉이 있음.

도 7은 성체줄기세포의 분리와 배양 그리고 오르가노이드체의 생산을 위한 본 발명 방법의 주된 단계와 그들로부터 분화된 세포의 광역 스펙트럼을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 8은 성체줄기세포의 분리와 배양 그리고 오르가노이드체의 생산을 위한 본 발명 방법의 다양한 개별 단계를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 9는 성체줄기세포의 분리와 배양 그리고 오르가노이드체의 생산을 위한 본 발명 방법의 다양한 개별 단계 후의 줄기세포와 오르가노이드체의 현미경 사진 을 나타낸 것이다.

본 발명의 특히 바람직한 실시 예에서, 성체줄기세포는 샘꽈리조직으로부터 얻는다.

도 1에 나타낸 다이어그램에 따라, 세포를 얻기 위해서, 바람직하게 귀밑샘선이나 췌장으로부터 얻은 샘꽈리조직을 기계적으로 그리고 효소에 의해 분해시켜 배양한다(도 1의 스텝 10). Bachem et al., Gastroenterol. 115:421-432(1998) 및 Grosfils et al., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 79:99-115(1993)에 의한 보고서와 대조적으로, 세포로부터 어떠한 조직덩어리도 성장하거나 배양되지 않았으나 대신 조직은 샘꽈리 세포구조가 대부분 손상되지 않은 채로 남아 있는 조건 하에서 더욱 세밀하게 나누어진다.

몇 주 동안 이들 세포와 세포구조를 배양 용기에서 배양하였다. 2 내지 3일마다 배지를 교체하고, 그때 모든 분화된 세포들을 제거한다. 배지에 남아있는 세포들은 무한한 분열 가능성을 지닌 미분화세포들이다.

유사한 세포들이 같은 조건 하에서 췌장으로부터 분리되었고 근원섬유세포(myofibroblast) 또는 췌장 별세포(pancreatic stellate cell)의 유형으로 기술되었다(Bachem et al., 1998). 그러나 본 발명에 따른 세포와 대조적으로, 무한한 분열 능력은 발견될 수 없었다. 게다가, 이러한 세포들은 생명력을 잃는 일 없이 무제한의 회수로 계대에 노출될 수 없었다.

두 번째 단계[12]에서 약 400 내지 800개의 세포를 각각 20μL의 배지에 있는 현적에서 배양한다. 그렇게 하기 위해 방울들을 세균 배양용 접시의 커버 표면에 놓고, 방울들이 늘어지도록 배지로 채워진 배양 접시 위에 뒤집어 놓는다.

이런 유형의 배양 때문에, 오르가노이드체라고 일컬은 세포 집합체(cell aggregate)[14]들은 48시간 이내에 성장하여 약 6일 동안 현탁 배지로 전이된다[16]. 도 1 [18]에 있는 부분도는 이러한 오르가노이드체의 현미경 사진을 나타낸 것이다.

현탁 배지에서 성장하는 오르가노이드체는 단세포들로부터도 새로운 오르가노이드체의 형성을 유도하는 새로운 오르가노이드체를 형성한다. 그 세포들은 오르가노이드체 혹은 단세포들처럼 동결될 수 있고 동결되었을 때 생명력과 분화 잠재력을 유지한다.

도 2 내지 도 6은 이러한 오르가노이드체로부터 얻어진 분화된 세포의 현미경사진과 전자 현미경사진을 나타낸 것이다.

예를 들면 신경근 망의 형성이 관찰될 수 있었다: 오르가노이드체로부터 얻어진 세포들은 α-SMA(평활근액틴)를 강하게 발현했다(도 4e-f). 세포질을 통해 확장하는 근필라멘트의 광범위한 다발의 존재는 전자 현미경으로 확인되었다(도 6a-c). 게다가, 팬-뉴런 표지자(pan-neuron marker) PGP 9.5와 신경필라멘트(NF)에 대해 면역 반응성이었던 세포들 또한 확인되었다. 신경미세섬유 기관은 주위핵으로부터 방사상의 세포질 돌기 내로 확장하였다(도 4c, d). PGP 9.5-면역 반응성 세포는 그것들의 분지 돌기를 따라 다수의 정맥류를 나타내었고(도 4a, b, 6d), 따라서 자 발적인 신경섬유의 전형적인 형태학상 특성을 닮았다. GFAP(glial fibrillary acidic protein)(신경교(질) 소섬유 산성 단백질)에 면역 반응성이 있었던 세포들은 신경 표지자를 나타내는 세포들에 아주 근접하여 있었다(도 4c, d). 종종 필라멘트 단백질은 세포질 전체에 걸쳐 확장하지 않았고 대신 신경세포 옆에 있는 영역에 제한되었다. 게다가, 평활근세포와 신경세포는 무작위로 흩어지지 않고 접합으로 망이 연결된 형태가 쉽게 식별될 수 있었다(도 4e, f). 신경섬유 돌기는 그것들이 추정하는 타겟으로서의 평활근세포와 인접하여 접촉하면서 상당한 거리로 확장했다. 그래서 두 가지 세포유형은 그것들의 토포그래피 배열에 근거한 원시 신경근 망의 특성을 보여주었다. 3주령 오르가노이드체에서, 조직-유사 구조의 초기 형성이 관찰되었다(도 4 g-j). 섬유질 신경세포의 덩어리(cluster)는 신경교(질)세포와 접촉하고 있는 곳(도 4g)에서 발견되었거나 더 나아가 8주령 오르가노이드체(도 4i, j)의 단면에서 확인된 3차원 신경근 망(도 4h)으로 발달하였다.

발현 외분비 및 내분비 췌장 단백질의 검출:

면역조직화학 염색은 세포의 부분들이 아밀라아제에 대해 양성이라는 것을 보여주었다(도 4k). 면역반응 신호는 선단 세포질 내에서 분명하게 식별가능한 소포로 제한되었다. 게다가, 아밀라아제에 대해 면역 반응성인 대부분의 세포 덩어리들은 중심을 향하는 형태로 분비소포와 함께 원형으로 배열되었고, 이것은 외분비 췌장 샘꽈리의 형태학적 배치와 유사한 배치이다. 다른 세포 부분들은 인슐린에 대해 면역 반응성을 나타내었다(도 4l). 아밀라아제-양성 세포 덩어리들처럼, 분비 생산물은 세포극에 집중되어 있는 소포로 이루어진 구조에 저장되었다. 분비세포의 존재는 전자 현미경 검사로 확인되었는데, 그것은 외분비 또는 내분비 기능이 있는 분비세포들의 특징과 같이 빽빽하게 분포된 전자밀집 입자들을 나타내었다(도 6f-h).

연골발생세포와 상피세포로의 분화 또한 관찰되었다. 2개월의 성장기간 후에 오르가노이드체는 연골발생 특성을 나타내었다. 알시안블루 염색은 구형 침전물(도 5a) 또는 소섬유 침전물(도 5b)로 나타나는 고농도의 단백질글리칸(황산콘드로이틴)을 가지는 영역을 나타내었다. 연골바탕질 단백질 콜라겐 Ⅱ에 대항하는 항체로 면역조직화학적 염색을 하는 것은 이들 구형 영역(도 5c)과 소섬유 영역(도 5d) 내에서의 연골발생 활동성을 추가로 증명하였다. 면역 반응성은 성장하는 세포외 연골바탕질의 영역에 가장 유력하게 해당되는 세포 집합체의 중앙에서 가장 높았다. 이 관찰결과는 공초점 현미경 검사로 확인되었다(도 5g): 반면에 콜라겐 침전물의 양은 세포 집합체의 중심을 향해 증가했고, 경계 영역은 비질린의 높은 발현에 의해 증명된 것처럼, 연골 유도 동안 활성 이동 기관(machinery)을, 예를 들면 콜라겐-합성 연골세포 또는 섬유아세포를 가지는 세포에서 주로 발견되는 활동적으로 이동하는 세포들에 의해 특징지어졌다. 또한, 전형적인 개별 콜라겐 Ⅱ-이동 연골세포가 콜라겐 Ⅱ를 함유하고 개별 세포를 둘러싸는 메트릭스를 생산하는 오르가노이드체의 성장-세포에서 관찰되었다(도 5e). 이 영역들의 초미세 구조 조사는 망상 섬유와 콜라겐 섬유의 망을 명확하게 밝혔는데, 후자는 그들의 특정 밴드 패턴으로 확인되었다(도 6e). 또한 몇몇 세포들은 중간엽 표지자에 더해 그들의 상피 세포로의 분화 잠재력을 나타내는 다수의 사이토케라틴을 발현하였다. 그러나, 사이토케 라틴에 면역 반응성인 세포들은 평활근세포 및 뉴런의 표지자를 발현하는 세포들보다 적은 빈도로 발견되었다. 그것들은 오르가노이드체 내에서 산재된 덩어리로 전형적으로 배열되었다.(도 5f) 전자 현미경 검사로, 케라티노사이트들 사이에서 전형적 세포 접촉이 발견되었고(도 6j), 8주령 오르가노이드체에서 상피세포가 세포 배양 배지로부터 생긴 표면에서 그리고 번져 있는 것이 발견되었다.

일반적으로 예를 들면, 특정 세포에 대한 다음의 표지자들은 지금까지 양성으로 판정되었다: 신경세포에 대한 PGP 9.5와 NF, 신경교(질)세포에 대한 S 100과 GFAP, 근세포(그리고/또는 근원섬유세포)에 대한 SMA, 연골세포에 대한 콜라겐 타입 Ⅱ, 외분비 선상 세포에 대한 아밀라아제와 트립신, 내분비 선상 세포에 대한 인슐린, 강하게 이동하는 세포에 대한 비질린과 상피세포에 대한 사이토케라틴. 광학현미경 조사에 더해, 전자 현미경 조사도 다양한 세포유형을 형태학상으로 특징짓기 위해 실행되었고 세포-세포 접촉들이 세포 상호작용의 징후로서 발견되었다.

지금까지 평활근세포, 뉴런, 신경교(질)세포, 상피세포, 지방세포, 심장세포, 신장세포, 섬유아세포(예를 들면, 피부 및 힘줄 섬유아세포), 연골세포, 내분비 및 외분비 선상세포, 그러므로 모든 세 가지 배엽의 세포유형들이 검출되었다.

다음의 한정되지 않는 실시 예에서, 본 발명이 더욱 상세히 설명될 것이다.

동물세포 특히 포유동물세포를 배양하는 방법에서 전형적으로 사용되는 일반적인 작업 절차를 살펴볼 것이다. 절차를 실시하기 위해 절차실시 중 무균환경이 어느 경우에도 유지되어야 한다 - 이에 대해 더 이상의 설명이 없더라도. 다음의 완충제와 배지가 사용되었다:

HEPES 원액 (pH 7.6)	재증류수 100mL에 2.383g의 HEPES
HEPES 이글 배지(Eagle medium)(pH 7.4)	90mL 변형 이글 배지(modified Eagle medium)(MEM) 10mL HEPES 원액
분리 배지 (pH 7.4) 소화 배지 (pH 7.4)	32mL HEPES 이글 배지 재증류수에 5% BSA 8mL 0.1M CaCl2 300μL 트라시롤(200,000 KIU) 100μL 20mL 분리 배지 4mL 콜라게나아제 (Serva제조 콜라게나아제 NB 8)
인큐베이션 배지	둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium)(DMEM)
배양 배지	둘베코 변형 이글 배지(DMEM) DMEM + 4500mg/L 포도당 + L-글루타민 + 피루베이트 =20% FCS(소태아혈청)(비활성화됨)+ 1mL/100mL 페니실린/스트렙토마이신 (10,000U/10,000㎍/mL) 또는 DMEM + 10% 자가조직 혈장 + 1mL/100mL 페니실린/스트렙토마이신 사용 전 37℃까지 가열
분화 배지	380mL DMEM 30분 동안 54℃에서 비활성화된 FCS 95mL 5mL 글루타민(Gibco BRL) 5mL (5mL PBS에 3.5μL β-멜캅토에탄올) 5mL 비필수 아미노산(Gibco BRL) 5mL 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco BRL)(10,000U/10,000㎍/mL)

배양 배지와 분화 배지에서 소태아혈청(FCS) 대신에, 자가조직 혈장, 또는 덜 바람직하지만, 조직 공여자의 자가조직 혈청도 또한 사용될 수 있다. 이는 조직 공여자가 줄기세포 또는 그것에서 유래한 분화된 세포의 그 후 수용자와 동일할 때 특히 중요하다. 이러한 자가조직 처리는 일어날 수 있는 거부반응을 방지하기 위해 바람직하다.

또 배양 배지는 DMEM 배지 대신에, 분화된 세포가 죽고 원하는 줄기세포가 분열 증식하는 진핵세포, 특히 포유동물세포를 배양하는 데 적합한 또 다른 기초 배지를 포함할 수도 있다. 분리 배지, 인큐베이션 배지 및 분화 배지는 또한 다른 일반적이고 적합한 기초 배지를 포함할 수 있다.

다음의 실시 예 1과 2는 췌장의 샘꽈리조직으로부터 성체 전분화능 줄기세포의 분리와 배양을 위한 두 가지 작용 프로토콜을 상세히 설명한다. 실시 예 3은 침샘의 샘꽈리조직과 관상조직으로부터 분리하는 데 해당하는 프로토콜을 설명한다.

실시 예 1

1. 조직의 준비와 세포의 분리

주사기와 무딘 캐뉼러(cannula)를 사용하여, 10mL의 소화 배지를 2년 내지 3년령 래트의 체관 안으로 서서히 기포 없이 주입하였다. 췌장 전체가 이 과정에 의해 팽창되고 따라서, 더욱 쉽게 떼어내어져 준비될 수 있다. 그리고 나서 췌장을 유리 비커로 이동시키고 또 다른 5mL의 소화 배지를 추가한다. 지방조직과 림프절을 떼어낸 후, 조직을 예리한 가위를 사용하여 유리 비커에서 매우 세밀하게 나누고, 상단에 떠 있는 지방조직을 흡입하여 제거하고 또한 그런 후 현탁액(suspension)을 1분 동안(필요하다면 반복하여) 카보젠(carbogen)으로 가스처리하고 분당 200회 회전하는 교반기에서 알루미늄호일에 싸서 20분간 37℃에서 인큐베이션한다. 그리고 나서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 조직은 가위를 사용하여 다시 나누고 조직 단편들을 10mL의 분리 배지로 각각 2회 세척하고 그 후 5mL 의 소화 배지를 다시 조직에 추가한다.

다시 카보젠으로 약 1분간 가스처리하고 분당 200회 회전하는 교반기에서 15분간 37℃에서 인큐베이션한 후, 조직 단편들을 연속적으로 10mL, 5mL, 2mL 및 1mL 유리 피펫 속으로 뽑아 넣어 나누고 한 겹의 필터 헝겁을 통해 압축한다. 그리고 나서 이런 식으로 분리한 세포들을 인큐베이션 배지(37℃)에서 5회 세척하고, 카보젠으로 가스처리하고 매번 90g에서 5분간 원심분리한다. 마지막에 얻어진 펠렛(pellet)을 인큐베이션 배지에서 재현탁하고, 가스처리하고, 조직배양 접시에 분배했다.

2. 세포의 배양

분리된 세포가 있는 조직배양 접시를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한다. 배지는 2 내지 3일마다 교체하고, 그때마다 모든 분화된 세포들을 제거한다.

배양 7일째 되는 날, 세포들을 2mL의 PBS, 1mL의 트립신, 2mL의 인큐베이션 배지로 이루어진 용액을 사용하여 계대한다. 이 과정에서 세포들이 배양 접시의 바닥으로부터 떨어진다. 세포 현탁액을 5분간 원심분리하고, 부유물은 흡입하여 제거하고 또 세포들을 2mL의 인큐베이션 배지에 재현탁하고, 중간 크기의 세포 배지 플라스크로 이동시키고 10mL의 인큐베이션 배지를 추가한다. 배지는 3일마다 교체한다.

배양 14일째 되는 날, 세포들을 다시 계대하는데, 이번에는 6mL의 PBS, 3mL의 트립신, 6mL의 인큐베이션 배지로 계대한다. 세포 현탁액을 5분간 원심분리하 고, 부유물은 흡입하여 제거하고 또 세포들을 6mL의 인큐베이션 배지에 재현탁하고, 세 개의 중간 크기의 세포 배지 플라스크로 이동시키고 각각에 10mL의 인큐베이션 배지를 추가한다.

세포들을 그들이 반융합 내지 융합 상태에 도달할 때까지 더 배양하고 계대하고 시드(seed)한다.

실시예 2

췌장샘꽈리는 수컷 스프라크 도리(Sprague-Dawley) 래트(20 내지 300g)를 마취시키고(CO₂) 등쪽 대동맥을 통해 사혈하여 얻었다. 케뉼러를 십이지장을 가로질러서 췌장관으로 도입하였고 HEPES 이글 배지(pH 7.4), 0.1mM의 HEPES 완충제(pH 7.6), 70%(v/v)의 변형 이글 배지, 0.5%(v/v)의 트라시롤(Trasylol)(Bayer AG, Leverkusen, Germany), 1%(w/v)의 소혈청알부민, 2.4mM의 CaCl₂ 및 콜라게나아제(0.63 P/mg, Serva, Heidelberg, Germany)를 포함하는 10mL의 소화 배지를 췌장으로 뒤따라 주입하였다.

췌장을 떼어내기 전에, 부착해 있는 지방조직, 림프절, 혈관을 부분적으로 제거하였다. 그리고나서 건강한 췌장조직은 소화 배지(20℃에서, 더 낮은 대사)에 두고, 췌장조직을 가위로 매우 세밀하게 나누고, 상단에 떠 있는 지방조직은 흡입하여 제거하고 조직 현탁액은 노즐을 세포가 있는 배지로 넣지 않고 카보젠(Messer, Krefeld, Germany)으로 가스처리하였으며(물리적 압력을 감소시키며), pH는 이런 식으로 7.4로 조절하였다. 그런 후 현탁액을 25mL의 삼각플라스크 (Erlenmeyer flask)(알루미늄호일에 싸인) 안의 37℃, 10mL의 소화 배지에서 계속해서 교반하면서(분당 150 내지 200회) 인큐베이션하였다. 15 내지 20분 후, 상단에 떠 있는 지방 그리고 배지는 흡입하여 제거하고 조직을 다시 나누고 콜라게나아제가 없는 배지로 린스하고(적어도 2회 그 과정을 반복, 바람직하게는 세포 단편이 투명해질 때까지), 그 후에 소화 배지를 추가하고 혼합물을 다시 약 1분간 카보젠으로 가스처리하였다. 같은 완충제를 사용하여 교반기에서 15분간 37℃에서 콜라게나아제로 다시 소화시켰다. 소화 후에, 샘꽈리를 좁은 통로를 가진 10mL, 5mL 및 2mL의 유리 피펫을 통해 연속적으로 잡아당겨 꺼내어 분리하고, 약 250㎛의 망을 가진 단층 나이론 망(Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zurich, Switzerland)을 통해 여과하였다. 샘꽈리를 원심분리하고(약 50 내지 100g에 상응하는 Beckman GPR 원심분리기에서 37℃, 600 내지 800rpm으로) 24.5mM의 HEPES(pH 7.5), 96mM의 NaCl, 6mM의 KCl, 1mM의 MgCl₂, 2.5mM의 NaH₂PO₄, 0.5mM의 CaCl₂, 11.5mM의 포도당, 5mM의 피루베이트산나트륨(sodium pyruvate), 5mM의 글루타민산나트륨(sodium glutamate), 5mM의 푸마르산나트륨(sodium fumarate), 1%(v/v)의 변형 이글 배지, 1%(w/v)의 소혈청알부민을 포함하는 인큐베이션 배지에서 세척하여 더욱 정제하고, 카보젠으로 평형을 유지하고 pH를 7.4로 조정하였다. 세척 과정(원심분리, 흡입 제거, 재현탁)은 5회 반복하였다. 특별한 언급이 없는 한, 상기 설명한 분리 과정은 약 20℃에서 행했다.

샘꽈리를 인큐베이션 배지에 재현탁하고 5%의 CO₂를 함유하는 습한 분위기, 37℃에서 배양했다. 샘꽈리조직은 이러한 조건 하에서 빠르게 죽었고(2일 이내) 죽어가는 분화된 세포들이 인접한 세포들을 손상시키는 일 없이(부드러운 분리) 인접하는 세포들로부터 떨어져 나가는 동안 죽어가지 않는 줄기세포들은 바닥으로 가라앉아 서로 달라붙었다. 분화된 샘꽈리세포들은 이렇게 할 수 없다. 자유롭게 떠다니는 대부분의 샘꽈리 및 샘꽈리세포들을 제거하는 것과 함께, 인큐베이션 배지를 시드 후 2일째 또는 3일째 되는 날 처음으로 교체하였다. 이 시점에서 처음의 줄기세포나 그들의 전구체들이 바닥에 서로 달라붙었고 그리고 나누어지기 시작했다. 그리고 나서 배지를 3일마다 다시 교체하였고, 분화된 샘꽈리췌장세포들을 배지를 교체할 때마다 제거하였다.

배양 7일째 되는 날, 세포들을 2mL의 PBS, 1mL의 트립신(+0.05%의 EDTA), 2mL의 인큐베이션 배지로 구성된 용액으로 계대하였고, 그 결과 세포들이 배지 접시의 바닥으로부터 떨어졌다. 세포 현탁액을 5분간 약 1000rpm(Beckmann GPR 원심분리기)으로 원심분리하였고, 상층액은 흡입하여 제거하고 세포들을 2mL의 인큐베이션 배지에 재현탁하고, 중간 크기의 세포 배지 플라스크로 이동시키고 10mL의 인큐베이션 배지를 추가했다.

배양 14일째 되는 날, 세포들을 다시 계대하였는데, 이번에는 6mL의 PBS, 3mL의 트립신/EDTA 및 6mL의 인큐베이션 배지로 구성된 용액으로 계대하였다. 세포 현탁액은 5분간 1000rpm으로 원심분리하였고, 상층액은 흡입하여 제거하였고 또한 세포들을 6mL의 인큐베이션 배지에 재현탁하고, 세 개의 중간 크기의 세포 배지 플라스크로 이동시키고 각각에 10mL의 인큐베이션 배지를 추가하였다.

17일째 되는 날, 총 6개의 중간 크기 세포 배지 플라스크로 세 번째 계대하였고, 24일째 되는 날, 총 12개의 중간 크기 세포 배지 플라스크로 네 번째 계대하였다. 이제 최종적으로 줄기세포를 제외하고 모든 일차세포들을 세포 배지로부터 제거하였다.

계대 및 시드를 원하는 만큼 자주 행하면서 줄기세포를 더 배양할 수도 있다. 시드는 바람직하게는 인큐베이션 배지에서 2×10⁵ 내지 4×10⁵ 세포수(cells)/cm²의 밀도로 실시한다.

실시예 3

귀밑샘선의 외분비조직으로부터의 분리와 배양은 다음의 경우를 제외하고는 췌장 프로토콜과 유사하게 실시하였다:

1. 귀밑샘선의 외분비조직은 샘꽈리조직과 관상조직의 혼합이었다.

2. 침샘이 췌장보다 프로테아제와 아밀라아제를 적게 포함하기 때문에, 조직을 지나치게 손상시키는 일 없이 정밀검사(workup) 전에 약 4℃에서 냉장 하에 잠시동안 침샘조직을 저장하는 것이 가능하다. 구체적인 예로, 저장시간은 15시간이었고 원하는 줄기세포의 분리와 관련하여 어떠한 부정적인 영향도 없었다.

아래의 실시예 4와 5는 오르가노이드체와 분화된 세포를 생산하기 위한 두 가지 프로토콜을 상세히 설명한다.

실시예 4

미분화세포들을 10mL의 PBS, 4mL의 트립신 및 8mL의 분화 배지로 이루어진 용액으로 트립신처리하고 나서 5분 동안 원심분리하였다. 결과적으로 얻어진 펠렛을 100μL 배지 당 3000개의 세포들의 희석을 위해 분화 배지에 재현탁하였다. 그런 후 세포들을 3mL 피펫으로 다시 잘 현탁하였다.

커버를 플레이트마다 15mL의 PBS(37℃)로 미리 코팅한 세균 배양용 페트리 접시로부터 제거하고 커버를 뒤집는다. 자동 피펫을 사용하여, 대략 50개의 20μL 방울들을 각각의 커버에 놓는다. 그리고 나서 커버를 빠르게 뒤집고 분화 배지로 채워진 페트리 접시 위에 두어 방울들을 전한다. 그리고 나서 페트리 접시들을 인큐베이터에 조심스럽게 놓고 48시간 동안 인큐베이션한다.

다음으로 여기에서는 오르가노이드체(OB)로 일컫는 현적에 모인 세포들을 네 개의 커버로부터 각각 20%의 FCS를 포함하는 5mL의 인큐베이션 배지를 가진 세균 배양용 페트리 접시로 이동시키고 다시 96시간 동안 배양한다.

그리고 나서 오르가노이드체들을 피펫으로 조심스럽게 모아 분화 배지를 담고 있고 0.1%의 젤라틴으로 코팅된 세포 배양 용기로 옮겼다. 이 방법의 특히 바람직한 실시예에서, 0.1%의 젤라틴으로 코팅된 6cm의 페트리 접시를 배양 용기로 사용한다; 4mL의 분화 배지를 미리 각각에 두고 그리고 나서 그것들에 각각 6개의 오르가노이드체를 주었다. 3mL의 분화 배지를 가지는 0.1%의 젤라틴으로 코팅된 챔버 슬라이드로 구성된 또 다른 바람직한 배양 용기를 각각 두고 그리고 나서 각각에 3개 내지 8개의 오르가노이드체를 주었다. 게다가, 1.5mL의 분화 배지를 가지고 0.1%의 젤라틴으로 코팅된 24-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트를 각각의 웰(well)에 두고 그리고 나서 각각에 네 개의 오르가노이드체가 주어진 웰도 또한 사용될 수 있다.

이런 식으로 배양될 때, 세포가 오르가노이드체로 분화하는 능력은 활성화되고 세포들은 세 가지 배엽인 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포들로 분화한다. 세포들은 오르가노이드체 또는 개별 세포 모두로 저장되고 배양될 수 있으며, 그들은 그들의 전분화능을 유지한다.

실시예 5

분화 유도를 위해, 바람직하게는 배양 42일 후의 줄기세포가 사용되었다. 세 번째 또는 네 번째 계대 후 줄기 세포들 또는 액체 질소의 온도에서 12 내지 18개월 동안 저장된 세포들을 아무 문제없이 사용하는 것 또한 가능하다.

우선 세포들을 상기한 합성물을 갖는 분화 배지로 이동시키고, 예를 들면, 배양 배지에서 줄기세포 배지의 트립신 처리, 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하는 것, 분화 배지에서 펠렛을 재현탁하는 것, 필요한 만큼 희석하는 것에 의해 약 3×10⁴ 세포수/mL의 밀도로 조정하였다.

그리고 나서 20μL의 피펫을 사용하여, 약 50개의 20μL 방울(600세포수/20μL)들을 세균 배양용 페트리 접시(스토퍼 팁)의 커버의 안쪽에 두고 커버들을 PBS로 채워진 페트리 접시 위에서 방울들이 늘어지도록 조심스럽게 뒤집었다. 새로운 팁은 각각의 커버에 사용했다. 그리고 나서 페트리 접시들을 조심스럽게 인큐베이터에 두고 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다.

다음으로 현적에 모인 세포들, 즉 오르가노이드체(OB)들을 네 개의 커버로부터 각각 20%의 FCS를 포함하는 5mL의 인큐베이션 배지를 가진 세균 배양용 페트리 접시로 각각 옮겼고(커버를 비스듬하게 붙잡고 약 2.5mL의 배양 배지로 오르가노이드체를 린스함) 그리고 나서 5일 내지 9일, 바람직하게는 96시간 동안 배양하였다.

그리고 나서 오르가노이드체들을 피펫을 사용하여 조심스럽게 모아 0.1%의 젤라틴으로 코팅되고 분화 배지를 포함하는 세포 배양 용기로 옮겼다. 그리고 나서 오르가노이드체들은 증식하고 부분적으로 분리되는 세포 콜로니들로 자라고, 그런 후 세포 콜로니들은 더 증식하고 분리되고, 다시 증식할 수 있었다. 이 방법의 특히 바람직한 실시예에서, 0.1%의 젤라틴으로 코팅되고 4mL의 분화 배지가 이미 놓여있는 6cm의 페트리 접시를 배양 용기로 사용하였는데, 각각의 페트리 접시에는 6개의 오르가노이드체를 두었다. 또 다른 바람직한 배양 용기는 0.1%의 젤라틴으로 코팅하고, 3mL의 분화 배지를 놓은 후 각각에 3 내지 8개의 오르가노이드체를 둔 챔버 슬라이드, 그리고 전자 현미경 조사를 위한 서마녹스 플레이트(Thermanox plate)(Nalge Nonc International, USA)였다. 또 다른 대체물은 0.1%의 젤라틴으로 코팅하고 각각의 웰에 1.5mL의 분화 배지를 두고 나서 각각에 네 개의 오르가노이드체를 둔 24-웰 마이크로타이터 플레이트였다.

이 방법의 바람직한 실시예에서, 오르가노이드체를 젤라틴으로 코팅된 6cm의 페트리 접시에서 7주간 배양하였고 그리고 나서 개별 오르가노이드체를 제조업자의 지침에 따라 마이크로디섹터(Microdissector)(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 잘라내었고 그리고 나서 예를 들면, 새로운 6cm의 페트리 접시, 챔버 슬라이드 또는 서마녹스 플레이트로 옮겼다.

실시예 6

인간 성체줄기세포의 분리와 배양을 위해, 성인 환자로부터 인체조직을 수술 절차 직후에 얻어 곧바로 정밀검사하였다. 건강한 조직은 외과적으로 절제된 조직, 예를 들면, 췌장 또는 침샘조직으로부터 분리해서 소화 배지에 놓았다. 그리고 나서이 조직을 래트에 대해 설명한 프로토콜에 따라 정밀검사하였고 줄기세포들을 유사한 방법으로 분리하고 배양하였다.

만약 줄기세포들이 치료상의 목적으로 나중에 사용된다면, 치료될 환자에게 일어날 수 있는 위험을 배제하기 위해 안전 조치로서의 다양한 조건을 만족하여야만 하는데, 특히:

- FCS 대신에 사람 혈청, 바람직하게는 환자로부터의 자가조직 혈장, 필요하다면 혈청 및/또한 혈장을 정제하여 사용.

- 다른 배지 부가물에 대한 모든 동물원(animal source) 배제.

- 극히 높은 순도의 모든 물질, 무균상태의 장비 및 환경.

- 줄기세포의 반복되는 계대동안 줄기세포 배지의 무균상태와 순도 그리고 미코플라즈마와 다른 마이크로유기체(microorganism)에 의한 오염의 관찰.

- 종양유발성에 대해 근원 조직과 줄기세포를 조심스럽게 관찰.

실시예 7

분화된 세포들의 특성화

1. 면역 조직 화학

챔버 슬라이드 상에서 최소 3주간 배양된 오르가노이드체 및 "장기(long-term)" 오르가노이드체의 단면을 PBS로 두 번 린스하고, -20℃에서 1g/mL의 DAPI(Roche, Switzerland)를 함유하는 메탄올:아세톤(7:3)으로 5분간 고정하고 PBS로 3회 세척하였다. 실온에서 15분간 10%의 정상 염소 혈청에서 인큐베이션한 후에, 샘플들을 습한 챔버내 4℃에서 일차 항체와 함께 밤새 인큐베이션했다. 일차 항체들이 단백질 유전자 생산물 9.5(PGP 9.5, 다클론성 토끼 항체, 1:400, 초미세클론, 와이트 섬), 신경필라멘트(NF-Pan cocktail, 다클론성 토끼 항체, 1:200, Biotrend, 독일), α-평활근액틴(α-SMA, 단일클론 마우스 항체, 1:100, DAKO, 덴마크), 신경교(질) 소섬유 단백질산(GFAP, 단일클론 마우스 항체, 1:100, DAKO, 덴마크), 콜라겐 Ⅱ(단일클론 마우스 항체 Ⅱ-Ⅱ-6B3, 1:20, 발생 연구 Hybridoma Bank, 아이오아 대학교, 미국), 비질린 FP3(1:200, Kugler et al., 1996), 사이토케라틴(팬(pan) 사이토케라틴, 단일클론 마우스 항체, 1:100, 시그마, 미국), α-아밀라아제(다클론성 토끼 항체 1:100, calbiochem, Germany), 인슐린(단일클론 마우스 항체, 0.5g/mL, Dianova, 독일)에 대항하여 유도되었다. PBS로 세 번 린스한 후에, 현미경 슬라이드를 각각 1:200으로 희석된 Cy3-표지된 항-마우스 IgG 또는 FITC-표지된 항-토끼 IgG(Dianova)로 45분 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 현미경 슬라이드를 PBS로 세 번 세척하고, 벡타쉴드 마운팅 (Vectashield Mounting) 배지(vector, 미국)로 코팅하고, 형광 현미경(Axiosop Zeiss, 독일) 또는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 510, Zeiss, 독일)으로 분석했다. 알시안블루 염색은 표준 방법으로 실시했다.

2. 투과성 전자 현미경

오르가노이드체들을 서마녹스 플레이트(Nalge Nonc International, 미국)에서 최소 삼 주간 배양했다. 서마녹스 플레이트에 부착되어 있는 샘플들을 2.5%의 글루타르알데히드와 2%의 파라포름알데히드를 포함하는 0.1M의 카코딜산염 완충제에 담구어서 pH 7.4에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 1%의 OsO₄에서 다시 고정시킨 후, 2%의 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 "한 덩어리로(en bloc)" 염색 그리고 순수알코올에서 탈수소 반응이 실시되었고, 그리고 나서 샘플들을 애럴다이트(araldite)에 묻었다. 서마녹스 플레이트를 치운 후, 묻힌 세포 배지로 준초박절편(semithin section)을 비스듬하게 또는 수직으로 만들고 그리고 나서 메틸렌블루와 아즐(azure) Ⅱ로 염색했다. 초박절편(ultrathin section)들을 관심 영역에서 잘라내고, 구연산납으로 염색하고 투과성 전자 현미경을 사용하여 관찰했다(Phillips, EM 109).

본 발명의 목적은 더 이상 배아줄기세포와 비교하여 자가 재생 능력과 분화 잠재력 면에서 중대한 차이를 지니지 않고 사실상 전분화능이라 일컬어질 수 있는 새로운 성체줄기세포를 제공하는 것이다. 하나의 연관된 목적은 성체 전분화능 줄기세포와 그것으로부터 얻어지는 분화된 세포를 분리하고 배양하는 새롭고 특히 간단한 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 연관된 목적은 전분화능 줄기세포를 사용한 새로운 약제 성분과 다양한 질병 상태를 치유하는 방법을 제공하는 것이다.

Claims (47)

1. 외분비 선상조직으로부터 얻어진 분리된 전분화능 성체줄기세포.
2. 제 1항에 있어서, 상기 외분비 선상조직이 포유동물을 포함하는 척추동물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 전분화능 성체줄기세포.
3. 제 2항에 있어서, 상기 외분비 선상조직이 인간을 포함하는 영장류로부터 유래된 것을 특징으로 하는 전분화능 성체줄기세포.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 외분비 선상조직이 침샘, 눈물샘, 한선, 피지선, 또는 췌장을 포함하는 위장조직으로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 전분화능 성체줄기세포.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 외분비 선상조직이 샘꽈리조직인 것을 특징으로 하는 전분화능 성체줄기세포.
6. 제 5항에 있어서, 상기 샘꽈리조직이 췌장, 귀밑샘 또는 큰턱샘으로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 전분화능 성체줄기세포.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 오르가노이드체를 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 전분화능 성체줄기세포.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포들의 삼차원적 접촉을 확보하는 공간조건 하에서 배양된 후에 어떠한 추가적인 성장인자나 분화인자도 포함하지 않는 배양 배지에서 모든 세 가지 배엽의 세포유형으로 분화할 수 있는 것을 특징으로 하는 전분화능 성체줄기세포.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 동결/동결보존 후에도 세포들이 자가 재생 능력 및 무한한 분열 능력을 유지하고 그리고 분화하지 않는 것을 특징으로 하는 전분화능 성체줄기세포.
10. 본질적으로 분화 없이 세포들의 안정적인 유지 및 증식을 할 수 있게 하는 배양 배지에 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포를 포함하는 줄기세포 배지.
11. 제 10항에 있어서, 상기 배양 배지가 어떠한 피더세포층도 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배지.
12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 25회를 초과하는 계대 동안 세포들이 자가 재생 능력 및 무한한 분열 능력을 유지하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배지.
13. 제 12항에 있어서, 50회 혹은 100회를 초과하는 계대 동안 세포들이 자가 재생 능력 및 무한한 분열 능력을 유지하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 배지.
14. 배지에 존재하는 살아있는 세포들의 대다수가 미분화 전분화능 성체줄기세포 인 것을 특징으로 하는 외분비 선상조직으로부터 얻어진 일차 줄기세포 배지.
15. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들로부터 형성되고 세포들의 삼차원적 접촉을 확보하는 공간조건 하에서 상기 줄기세포들을 배양함으로써 얻어지는 오르가노이드체.
16. 제 15항에 있어서, 현적, 움직이는 현탁 배지 혹은 세포들이 부착력을 약간 가지거나 또는 가지지 않는 표면의 표면 배지에서 줄기세포들을 배양함으로써 얻어지는 오르가노이드체.
17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 오르가노이드체의 세포들이 동결/동결보존 후에 생명력과 분화 능력을 본질적으로 유지하는 것을 특징으로 하는 오르가노이드체.
18. 제한된 표면 부착이 없는 표면의 표면 배지에서 자발적인 성장에 의해 제 15항 내지 제 17항 중 어느 하나의 항에 따른 오르가노이드체로부터 얻어지는 이차 오르가노이드체.
19. 외분비 선상조직을 떼어내고, 떼어낸 조직을 나누고, 나눈 조직을 배양하고, 배지에 남아있는 세포들을 배양하는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 성체 전분화능 줄기세포의 생산방법.
20. 제 19항에 있어서, 결과로 얻어지는 조직 단편의 세포 구조가 대체로 보존되는 부드러운 방식으로 상기 조직이 나누어지고, 상기 나누어진 조직이 먼저 조직 배양 용기에서 적합한 조건 하에 배양되고, 그로 인해 분화된 세포들 대부분이 수일 동안에 급속히 죽어 줄기세포로부터 떨어지게 되고, 그 때문에 줄기세포들이 조직 배양 용기 바닥에 부착하고, 상기 남아 있는 조직과 부착되지 않은 분화된 세포들이 배지의 첫 번째 교체에 의해 대부분 분리되고, 남아 있는 부착되지 않은 세포들이 2일 내지 3일 혹은 수일의 간격으로 배지의 추가 교체에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 성체 전분화능 줄기세포의 생산방법.
21. 미분화 줄기세포들은 세포들의 삼차원적 접촉을 확보하는 공간조건 하에서 오르가노이드체들이 형성될 때까지 더 배양되고, 그리고 나서 상기 오르가노이드체 들은 그것들이 더 배양되는 현탁 배지로 옮겨지는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들로부터 분화된 세포를 생산하는 방법.
22. 미분화 줄기세포들은 분화 배지로 옮겨지고 세포들의 삼차원적 접촉을 확보하는 공간조건 하에서 표면 배지로 옮겨지는 오르가노이드체를 형성할 때까지 더 배양되고, 그 후 일차 오르가노이드체와 같은 특성을 가지는 이차 오르가노이드체가 그리고 나서 더 배양될 수 있는 이들 오르가노이드체의 과성장하는 개별 세포들로부터 표면 배지에 형성되는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들로부터 분화된 세포를 생산하는 방법.
23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 배양이 세포들의 삼차원적 접촉을 확보하는 공간조건 하에서, 현적에서, 움직이는 현탁 배지 또는 세포들이 부착력을 약간 가지거나 또는 전혀 가지지 않는 표면의 표면 배지에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들로부터 얻어지는 분화된 세포.
25. 제 24항에 있어서, 상기 분화된 세포들은 골아세포, 파골세포 같은 골세포, 연골세포, 지방세포, 피부 및 힘줄 섬유아세포 같은 섬유아세포, 근세포, 내피세포, 상피세포, 조혈세포, 감각세포, 내분비 및 외분비 선상세포, 신경교(질)세포, 신경세포, 희소돌기아교세포, 혈구, 창자세포, 심장, 폐, 간, 신장 또는 췌장 세포인 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
26. 제 24항 또는 제 25항에 따른 분화된 세포 및/또는 제 15항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 따른 오르가노이드체를 분화 배지 내에 포함하는 분화 배지.
27. 제 26항에 있어서, 상기 분화 배지가 어떠한 추가적인 성장인자나 분화인자도 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 분화 배지.
28. 개체 또는 체외 개체를 개체의 체액을 이용하여 줄기세포들 또는 그것들로부터 유래된 분화된 세포들에 접촉시키고 난 후 체액을 개체로 되돌려보내도록 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들 또는 제 24항 또는 제 25항 에 따른 분화된 세포들의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
29. 제 28항에 있어서, 상기 줄기세포들이 개체의 자가조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병을 치료하는 방법.
30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 줄기세포들이 잃은 혹은 손상된 기관, 조직유형 또는 세포유형의 기능을 맡기 위해 인비보 분화하는 개체 몸체로 도입되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
31. 제 28항 내지 제 30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 치료가 개체의 면역 체계를 복원하거나 강화하는 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
32. 제 28항 내지 제 31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 줄기세포들이 치료 제를 위한 부형제로 사용되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
33. 제 32항에 있어서, 상기 치료제가 DNA, RNA, 단백질, 펩티드 또는 저분자 약제인 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
34. 제 28항 내지 제 33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법이 유전자 치료 방법인 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
35. 제 28항 내지 제 34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 줄기세포들이 특정한 특성을 가지도록 유전자 조작된 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
36. 제 28항 내지 제 35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 줄기세포들이 생리학적으로 허용가능한 메트릭스 또는 생리학적으로 허용가능한 부형제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
37. 제 28항 내지 제 36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 줄기세포들이 국부 주입, 전신 주입, 비경구 투여, 경구 투여 또는 태아에게 자궁 내 주입에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
38. 제 28항 내지 제 37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 치료될 질병 상태가 종양, 간질환, 결합조직질환, 심장혈관질환, 신경변성질환, 신진대사질환, 자기면역질환, 빈혈증, 혈우병, 당뇨병, 허혈, 염증, 전염병, 노화과정, 유전결함 또는 이식거부인 것을 특징으로 하는 상처 또는 질병 상태를 치료하는 방법.
39. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포, 제 10항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포 배지, 제 15항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 따른 오르가노이드체 또는 그것들로부터 얻어진 분화된 세포들을 인비트로에서 조직-유사 혹은 기관-유사 다세포계의 발달을 위해 사용.
40. 제 39항에 있어서, 상기 다세포계가 여러 유형의 세포들을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
41. 비인간 유기체의 재생산 복제를 위해 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들 또는 그것으로부터 얻어진 분화된 세포들의 사용.
42. 인비트로 시스템으로 화학물질을 시험하기 위해, 특히 약제를 선별하기 위해 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들, 제 10항 내지 제 13항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포 배지들 또는 제 15항 내지 제 18항 중 어느 하나의 항에 따른 오르가노이드체들 또는 그것들로부터 얻어진 분화된 세포들의 사용.
43. 인비트로에서 원하는 물질의 생산을 위해 제 24항 또는 제 25항에 따른 분화된 세포들, 또는 제 26항 또는 제 27항에 따른 분화 배지, 또는 그것으로부터 얻어진 다세포계의 사용.
44. 생리학적으로 허용가능한 메트릭스 또는 생리학적으로 허용가능한 부형제뿐만 아니라 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들 또는 그것으 로부터 얻어진 분화된 세포들을 포함하는 약학적 조성물.
45. 제 44항에 있어서, 추가적인 첨가물 또는 활성 성분도 포함하는 약학적 조성물.
46. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 하나의 항에 따른 줄기세포들 또는 그것으로부터 얻어진 분화된 세포들 또는 제 44항 또는 제 45항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트.
47. 제 46항에 있어서, 추가적인 첨가물 또는 세포들을 배양하기 위한 시약이나 진단 시약 같은 시약을 포함하는 키트.

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