JP2019106962A - サンプル処理方法およびサンプル培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞を内包する媒質溶液をゲル化または固体化させてなるサンプルにおいて、細胞の回収や培地交換、継続的な培養を容易に行う。【解決手段】観察対象物Ｓを内包しつつハンギングドロップ形成器具１により支持されている媒質溶液Ａがゲル化してなるハンギングドロップＤに媒質溶液Ａを液化させる液体Ｃを作用させて、媒質溶液Ａを観察対象物Ｓを内包しつつハンギングドロップ形成器具１により支持されている状態を維持させたまま液化するサンプル処理方法を提供する。【選択図】図７

Description

本発明は、サンプル処理方法およびサンプル培養方法に関するものである。

近年、スフェロイドやオルガノイドなど３次元的に培養した細胞凝集塊の顕微鏡観察が注目されている。細胞凝集塊の作製としては、例えばシャーレの蓋の内面に培養液とともに細胞を液滴として分注し、この液滴を反転させてハンギングドロップを形成させ、ハンギングドロップの曲面に沿う方向に、重力の分力による助けを借りてハンギングドロップ内部で細胞凝集を引き起こさせる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、この方法は、ハンギングドロップの正確なアレイ配列がなされないので、細胞凝集塊の作製の自動化に適さないのは明らかである。

特許文献１の技術を改善し、自動化に適するハンギングドロップを形成可能なマルチウエルプレートの構造が知られている（例えば、特許文献２参照。）。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、分注器から排出される液を受ける窪み部と、ハンギングドロップが形成されて保持されるハンギングドロップ形成区画と、これらに通じる導管との組がアレイ状に配列されて構成されている。特許文献２に記載のマルチウエルプレートは、特許文献１に記載の方法のように液滴を反転させる必要が無く、細胞や培養液等の分注をアレイ配列フォーマットに従ってマルチウエルプレートの上方から行うだけでハンギングドロップを形成可能としたことで、ハンギングドロップでの細胞凝集塊の作製の自動化を容易にしている。しかしながら、特許文献２は、顕微鏡での高精細の観察方法については特許文献１と同様になんら言及していない。

特許文献２の技術を発展させ、顕微鏡による精細な観察や撮像を行えるようにした技術が知られている（例えば、特許文献３参照。）。特許文献３に記載の技術は、作製したハンギングドロップ内の細胞凝集塊をハンギングドロップとともに、底面が平面で透明なマルチウエルプレートのウエルに落下させ、細胞凝集塊が発する光をウエルの底面を介して倒立型顕微鏡の対物レンズで集光して観察や撮像を行っている。しかしながら、特許文献３の技術では、細胞凝集塊がウエルの側面に接するように位置する場合は、ウエルの底面と側面との境界である稜線部分が対物レンズで受光されるべき光束に干渉し、顕微鏡が本来有する光学性能を発揮できない。特にライトシート顕微鏡による観察では、細胞凝集塊に対して側面から励起光を照射するため、細胞凝集塊がウエルの側面に接している部分の観察が非常に困難である。

特許文献３の技術を更に発展させ、ウエルの底面と細胞凝集塊とが接しないように固定可能な技術が知られている（例えば、特許文献４参照。）。特許文献４に記載の技術は、遠沈管中の塩化カルシウム溶液に細胞／アルギン酸混和液を滴下することにより、遠沈管内でアルギン酸がゲル化して溶液中でビーズを形成し、アルギン酸ビーズ状ゲル中に培養細胞が内包されたサンプルを作製している。また、特許文献４に記載の技術では、アルギン酸ビーズ状ゲルをキレート剤の水溶液に浸して水溶液中で溶解し、培養細胞を回収して再培養を行なっている。

独国特許発明第１０３６２００２号明細書 特許第５４９０８０３号公報 国際公開第２０１７／００１６８０号 特開平１０−２４８５５７号公報

ところで、細胞塊を用いた実験スキームでは、ハンギングドロップを用いて分化培養したサンプルを顕微鏡観察およびスクリーニングを実施した後、所望のサンプルのみを終末培養するニーズがあるが、細胞を内包した状態で基材により支持されたゲル状のハンギングドロップを基材から取り外さずに液化させる方法は無い。特許文献４に記載の技術のように、アルギン酸ビーズ状ゲルをキレート剤の水溶液に浸して水溶液中で溶解するのでは、細胞が基材から離れるため、培地交換などの作業をすることができなくなるという不都合がある。また、基材から離れた細胞がキレート剤水溶液の容器の底面に接触し、細胞が容器の底面に接着したり細胞の形態が変化したりするという不都合もある。さらに、キレート剤の水溶液内で液化したアルギン酸溶液がキレート剤の水溶液と混ざり合い、細胞が高濃度のキレート剤に晒されるという不都合もある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞を内包する媒質溶液をゲル化または固体化させてなるサンプルにおいて、細胞の回収や培地交換、継続的な培養を容易に行うことができるサンプル処理方法およびサンプル培養方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、観察対象物を内包しつつ基材により支持されている媒質溶液がゲル化または固体化してなるサンプルに前記媒質溶液を液化させる液体を作用させて、前記媒質溶液を前記観察対象物を内包しつつ前記基材により支持されている状態を維持させたまま液化するサンプル処理方法である。

本態様によれば、媒質溶液の液化後も、媒質溶液が観察対象物を内包しつつ基材により支持されている状態が維持される。これにより、同じ基材上で培地交換や継続培養などの作業をすることができる。また、観察対象物が露出して、媒質溶液を液化する液体に観察対象物が晒されるのを防ぐとともに、観察対象物が液体を収容する容器の底面に接触して、観察対象物が底面に接着したり観察対象物の形態が変化したりするのも防ぐことができる。したがって、観察対象物を内包する媒質溶液をゲル化または固体化させてなるサンプルにおいて、観察対象物の回収や培地交換、継続的な培養を容易に行うことができる。

上記態様においては、前記媒質溶液の表面に前記液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させることとしてもよい。
このように構成することで、媒質溶液が液体に混ざって散るのを防ぐことができる。また、観察対象物を内包させた媒質溶液の表面に液体を接触させるだけの簡易な作業なので、サンプルの媒質溶液を液化する処理を自動化することができる。

上記態様においては、超音波の照射または加圧により前記液体を霧化させることとしてもよい。
このように構成することで、一般的な方法で液体を簡易に霧状にすることができる。

上記態様においては、前記媒質溶液に前記液体を添加または塗布し、または、前記液体に前記媒質溶液を浸漬させることとしてもよい。
このように構成することで、媒質溶液に液体を添加する場合は、サンプルの表面はゲル状または固体状のままでサンプルの内部を液化させて、薬剤や培養液の追加が可能になる。また、液体に媒質溶液を浸漬させる場合は、液体を容器に貯留しておくだけでよく、装置を簡略化することができる。

上記態様においては、前記液体が、架橋剤によって２つ以上の分子が連結している前記サンプルの架橋を分解する酸化分解反応、２価陽イオンによって２つ以上の分子が連結している前記サンプルから２価陽イオンを取り除くことによって分子の連結を解消するキレート反応、または、粘弾性を与えているペプチド、繊維、糖質または脂質を、酵素的または化学的に分解する反応により、前記媒質溶液を液化することとしてもよい。

上記態様においては、前記液体がキレート剤であってもよい。
このように構成することで、キレート剤により、ゲル状または固体状の媒質溶液を容易に溶解することができる。
この場合、前記キレート剤が、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）およびＢＡＰＴＡ（Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸）の少なくとも１つからなることとしてもよい。

上記態様においては、前記液体が、アルギン酸リアーゼ活性を有する酵素を含むこととしてもよい。

上記態様においては、前記基材が、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有することとしてもよい。

上記態様においては、前記基材により該基材の表面に前記観察対象物を内包した前記媒質溶液を水滴状に付着させた状態に支持させることとしてもよい。
このように構成することで、簡易な形状の基材を用いて、表面張力を利用して媒質溶液を維持することができる。

上記態様においては、前記基材により前記観察対象物を内包した前記媒質溶液の液滴を吊り下げた状態に支持させることとしてもよい。
このように構成することで、媒質溶液の液滴をウエル等から離間させた状態に維持しつつ、重力によって媒質溶液の液滴内で観察対象物の位置を安定させることができる。

上記態様においては、前記サンプルが、アルギン酸ハイドロゲルにより粘弾性を有することとしてもよい。

上記態様においては、前記観察対象物が、細胞、細胞凝集塊、細胞組織、スフェロイドまたはオルガノイドからなる生物由来材料であってもよいし、前記観察対象物が、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料であってもよい。

本発明の第２態様は、ゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液を基材により支持して観察対象物を内包させた状態でゲル化または固体化させる工程と、前記基材により支持されているゲル状または固体状の前記媒質溶液に内包されている前記観察対象物を観察する工程と、観察後に、前記媒質溶液を液化させる液体を前記媒質溶液に作用させて、該媒質溶液を前記観察対象物を内包しつつ前記基材により支持されている状態を維持させたまま液化する工程とを含むサンプル培養方法である。

本態様によれば、基材により媒質溶液を支持して観察対象物を内包させた状態でゲル化または固体化させることで、基材により支持されたゲル状の媒質溶液内で観察対象物を成長させたり培地を交換したりすることができる。そして、この状態で観察対象物を観察することで、媒質溶液が液体状の場合よりも、媒質溶液の屈折率の影響等を抑制した高精細な観察が可能になる。

さらに、観察後は、媒質溶液を観察対象物を内包しつつ基材により支持されている状態を維持させたまま液化することで、同じ基材上で培地交換や継続培養などの作業をすることができる。また、観察対象物が露出して媒質溶液を液化する液体に晒されるのを防ぐとともに、観察対象物が液体を収容する容器の底面に接触して、底面に接着したり観察対象物の形態が変化したりするのも防ぐことができる。

本発明に係るサンプル処理方法およびサンプル培養方法によれば、細胞を内包する媒質溶液をゲル化または固体化させてなるサンプルにおいて、細胞の回収や培地交換、継続的な培養を容易に行うことができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るサンプル培養方法を説明するフローチャートである。 図１のサンプル培養方法で用いるハンギングドロップ形成器具の縦断面図である。 図１のサンプル培養方法で用いるサンプル処理装置の一例を示す側面図である。 図２のハンギングドロップ形成器具により形成された液状のハンギングドロップの一例を示す縦断面図である。 図４の液状のハンギングドロップにこれをゲル化させる液体を霧状で接触させてゲル状にし、分化培養する様子を示す縦断面図である。 図５のゲル状のハンギングドロップに内包されている観察対象物に励起光を照射して蛍光を発生させる様子を示す縦断面図である。 図６のゲル状のハンギングドロップにこれを液化させる液体を霧状で接触させる様子を示す縦断面図である。 （ａ）は液化したハンギングドロップを明視野観察して得られた画像の一例を示す図であり、（ｂ）は液化したハンギングドロップを蛍光観察して得られた画像の一例を示す図である。 終末培養を経たハンギングドロップ内の観察対象物をピペットにより回収する様子を示す縦断面図である。 図４のゲル状のハンギングドロップにこれを液化させる液体を添加する様子を示す縦断面図である。 図４のゲル状のハンギングドロップの表面にこれを液化させる液体を塗布する様子を示す縦断面図である。 図４のゲル状のハンギングドロップをこれを液化させる液体に浸漬させる様子を示す縦断面図である。 （ａ）はスライドグラスに水滴状に付着させてゲル化させた媒質溶液の一例を示す斜視図であり、（ｂ）は（ａ）の媒質溶液の水滴にこれを液化させる液体を霧状で接触させる様子を示す斜視図であり、（ｃ）は（ｂ）の露出する媒質溶液の水滴の表面を液化させた様子を示す斜視図である。

本発明の一実施形態に係るサンプル処理方法およびサンプル培養方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るサンプル培養方法は、図１のフローチャートおよび図２に示すように、媒質溶液Ａの液滴Ａ´を観察対象物（生物由来材料）Ｓを内包させてハンギングドロップ形成器具１により吊り下げた状態からなるハンギングドロップＤを形成する工程Ｓ１と、液状のハンギングドロップＤをゲル化させる工程Ｓ２と、ゲル化されたハンギングドロップＤに内包されている観察対象物Ｓを観察する工程Ｓ３と、観察後に、ハンギングドロップＤを観察対象物Ｓを内包しつつハンギングドロップ形成器具１により支持されている状態を維持させたまま液化する工程（サンプル処理方法）Ｓ４とを含んでいる。

ハンギングドロップ形成器具１は、例えば、図２に示すように、媒質溶液Ａが注入される窪み部３と、窪み部３に注入された媒質溶液Ａの液滴Ａ´を観察対象物Ｓを内包させつつ吊り下げた状態に支持するハンギングドロップ形成区画５と、これら窪み部３とハンギングドロップ形成区画５とを繋ぐ細い導管７とを備えている。

窪み部３は、導管７とは反対側に開口する開口部３ａを有し、開口部３ａからテーパ状に細くなって導管７に繋がる略円錐形状を有している。
ハンギングドロップ形成区画５は、導管７から次第に径方向外方に拡がる略円錐形状を有している。このハンギングドロップ形成区画５は、媒質溶液Ａの液滴Ａ´をその下部の表面を露出させて支持するようになっている。
導管７は、窪み部３からハンギングドロップ形成区画５に貫通する貫通孔７ａを有している。

このハンギングドロップ形成器具１は、窪み部３が鉛直上方でハンギングドロップ形成区画５が鉛直下方となる向きで使用するようになっている。以下、鉛直方向をＺ方向とし、Ｚ方向に直交しかつ互いに直交する方向をＸ方向およびＹ方向とする。

液状のハンギングドロップＤをゲル化させる工程Ｓ２においては、液状の媒質溶液Ａを化学反応によりゲル化させる液体Ｂを液滴Ａ´に作用させるようになっている。
ゲル化したハンギングドロップＤを液化させる工程Ｓ４においては、ゲル状の媒質溶液Ａを化学反応により液化させる液体Ｃを液滴Ａ´に作用させるようになっている。

これらハンギングドロップＤをゲル化させる工程Ｓ２およびゲル化したハンギングドロップＤを液化させる工程Ｓ４においては、例えば、図３に示すように、ハンギングドロップ形成器具１を支持する支持具９と、液体Ｂや液体Ｃを貯留する容器１１と、ハンギングドロップＤに液体Ｂや液体Ｃを作用させる超音波霧化装置１３とを備えるサンプル処理装置１５を用いて行うようになっている。

支持具９は、ハンギングドロップ形成器具１を把持する器具ばさみ１９と、鉛直方向に沿って延びるスタンド２１と、スタンド２１から鉛直方向に交差する方向に延び器具ばさみ１９を把持するクランプ２３とを備えている。

超音波霧化装置１３は、容器１１の液体Ｂや液体Ｃ内に配置され、超音波を発生して液体Ｂや液体Ｃを微細な霧状にし、発生した霧状の液体Ｂや液体Ｃを容器１１内に充満させることができるようになっている。

媒質溶液Ａとしては、例えば、アルギン酸ナトリウムを含む生物由来材料を育成可能な培地が用いられる。媒質溶液Ａはゲル化時に透明である。アルギン酸塩であればナトリウム塩に限られない。また、アルギン酸ナトリウムは重量％で０．５％以上を含むことが好ましいが、これに限定されるものではない。この媒質溶液Ａは比重が１であり、細胞やスフェロイドの比重よりも小さい。

液体Ｂとしては、例えば、２価の金属イオン（カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム等）を含む水溶液である塩化カルシウム水溶液等が用いられる。塩化カルシウムはモル濃度で１００ｍＭ以上が好ましいが、これに限定されるものではない。

液体Ｃとしては、ゲル化した液滴Ａ´が、アルギン酸ナトリウムを含む媒質溶液Ａに２価の金属イオンを含む液体Ｂを作用させて生成されたアルギン酸ハイドロゲルである場合は、２価の金属イオンと結合して錯体を形成する（キレートする）物質を含むキレート剤が用いられる。液体Ｂの２価の陽イオンによって２つ以上の分子が連結しているゲル状の液滴Ａ´から、キレート剤によりその２価の陽イオンを取り除くことによって分子の連結を解消することで（キレート反応）、ゲル状の液滴Ａ´を液化することができる。キレート剤は、例えば、EDTA，EGTAおよびBAPTAの少なくとも１つを含んでいる溶液であってもよい。また、液体Ｃは、キレート剤以外にも、アルギン酸分解酵素などアルギン酸リアーゼ活性を有する酵素であってもよい。

このように構成されたサンプル処理方法およびサンプル培養方法の作用について説明する。
本実施形態に係るサンプル培養方法およびサンプル培養方法は、例えば、未分化培養、分化培養、顕微鏡観察およびスクリーニング（篩い分け）、終末培養、移植といった実験ストラテジーで利用される。

まず、図４に示すように、ピペット２５を用いてハンギングドロップ形成器具１の窪み部３に上方から観察対象物Ｓとしての複数の細胞と共に培地Ｅを分注する。窪み部３に分注された培地Ｅは、重力によって観察対象物Ｓと共に導管７の貫通孔７ａを通って下方に移動し、ハンギングドロップ形成区画５によりその液滴Ａ´が吊り下げられた状態に支持される。これにより、観察対象物Ｓを内包しつつ媒質溶液Ａの液滴Ａ´が吊り下げられた状態からなるハンギングドロップＤが形成される（工程Ｓ１）。

ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液Ａは細胞やスフェロイドよりも比重が小さいので、観察対象物Ｓは、重力によりハンギングドロップＤの界面に沿って移動してハンギングドロップＤの最下点近傍に落ち着く。したがって、窪み部３に分注する媒質溶液Ａの量を決めておくことにより、ハンギングドロップＤ内での観察対象物ＳのＸ，Ｙ方向の位置だけでなくＺ方向の位置も一定にすることができる。また、ハンギングドロップ形成器具１を用いることで、ハンギングドロップＤを形成するために媒質溶液Ａの液滴Ａ´を反転させる必要もない。

続いて、ピペット２５を用いてハンギングドロップ形成器具１の上方から窪み部３を介して培地交換を行い、観察対象物Ｓとして、複数の細胞が集合してなるスフェロイドを形成させる（未分化培養）。ハンギングドロップＤ内で細胞を培養してスフェロイドを形成させることで、観察対象物Ｓとしてのスフェロイドを移し替える必要がなく、スループットを向上することができる。

次いで、ピペット２５を用いてハンギングドロップ形成器具１の上方から窪み部３を介して培地Ｅをアルギン酸ナトリウムを含む分化用培地としての媒質溶液Ａに交換する。そして、図３に示すサンプル処理装置１５を用いて、ハンギングドロップ形成器具１により支持されている液状のハンギングドロップＤに液体Ｂを作用させて、ハンギングドロップＤをゲル化させる。

具体的には、図３に示すように、容器１１に液体Ｂを貯留し、ハンギングドロップＤを形成したハンギングドロップ形成器具１を支持具９により支持して容器１１内の液体Ｂの上方に配置する。そして、超音波霧化装置１３を作動させて液体Ｂを霧化させ、容器１１内に霧状の液体Ｂを充満させて、ハンギングドロップＤの表面に液体Ｂを霧状で接触させる。

そして、そのまま霧状の液体Ｂ内にハンギングドロップＤを３０分静置させ、ハンギングドロップＤの露出する表面から内部に液体Ｂを浸透させて、観察対象物Ｓの周辺近傍までハンギングドロップＤをゲル化させる（工程Ｓ２）。これにより、略透明なハンギングドロップＤ内で観察対象物Ｓが最下部の位置に固定されたサンプルが作製される。なお、ハンギングドロップＤは必要に応じて表面のみをゲル化させることとしてもよい。

続いて、図５に示すように、観察対象物Ｓの増殖や分化に必要な環境を整えるためのフィーダー細胞Ｆが敷き詰められ培地Ｇが貯留された容器２７を用意し、ハンギングドロップ形成器具１により支持されているゲル状のハンギングドロップＤを容器２７内の培地Ｇに浸漬させて、自然拡散による培地交換を行う（分化培養）。

観察対象物ＳをハンギングドロップＤに内包させているので、観察対象物Ｓとフィーダー細胞Ｆとを分けて培養することができ、さらに、ハンギングドロップＤをゲル化させているので、ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液Ａが培地Ｇに混ざって散ってしまうことを防ぐことができる。

次いで、図６に示すように、ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液Ａと同等の屈折率を有する溶液Ｈが貯留されている透明な容器２９を用意する。そして、ハンギングドロップＤを溶液Ｈに浸漬させた状態で、ハンギングドロップＤに内包されている観察対象物Ｓをライトシート顕微鏡（図示略）により観察しながらスクリーニングする（工程Ｓ３）。

この場合、鉛直方向（Ｚ方向）に直交する平面に沿う平面状に集光させた励起光をハンギングドロップＤの側方から入射させて観察対象物Ｓに照射することとすればよい。そして、観察対象物Ｓにおいて発生した蛍光の内、ハンギングドロップＤの下部から鉛直方向下方に放射される蛍光を対物レンズ（図示略）により集光して検出することとすればよい。この場合において、観察対象物Ｓにおける励起光の焦点位置と検出光軸とを一致させるとともに、励起光の入射平面に対物レンズの焦点面を一致させることにより、対物レンズの焦点面に沿う広い範囲において発生する蛍光を対物レンズにより１度に集光して、観察対象物Ｓにおける観察部位の鮮明な蛍光画像を容易に取得することができる。

次いで、本実施形態に係るサンプル処理方法により、ゲル状のハンギングドロップＤを再び液化する（工程Ｓ４）。具体的には、まず、図３に示すように、容器１１に液体Ｃを貯留し、ゲル状のハンギングドロップＤが支持されたハンギングドロップ形成器具１を支持具９により支持して容器１１内の液体Ｃの上方に配置する。そして、超音波霧化装置１３を作動させて液体Ｃを霧化させ、容器１１内に霧状の液体Ｃを充満させて、図７に示すように、ゲル状のハンギングドロップＤの表面に液体Ｃを霧状で接触させる。

そのまま霧状の液体Ｃ内にハンギングドロップＤを１時間静置させ、ハンギングドロップＤの露出する下部の表面から内部に液体Ｃを浸透させて、観察対象物Ｓの周辺近傍までハンギングドロップＤを液化させる。これにより、例えば、図８（ａ），（ｂ）に示すように、観察対象物Ｓを内包しつつハンギングドロップ形成器具１により支持されている状態を維持したままハンギングドロップＤが液化される。

ハンギングドロップＤを液化することで、ハンギングドロップ形成器具１の上方から窪み部３を介して培地交換が可能になる。図８（ａ）は、液化したハンギングドロップＤを明視野観察して得られた画像の一例であり、観察対象物Ｓの周辺にゲル状の媒質溶液Ａが残っているのが分かる。図８（ｂ）は、液化したハンギングドロップＤを蛍光観察して得られた画像の一例であり、ハンギングドロップＤに内包されている観察対象物Ｓを視認できる。

次いで、最終の終末培養を経て、図９に示すように、液状のハンギングドロップＤ中で観察対象物Ｓの培養を継続したり、液状のハンギングドロップＤから観察対象物Ｓを回収して、マウス等に移植したりする。

以上説明したように、本実施形態に係るサンプル処理方法およびサンプル培養方法によれば、媒質溶液Ａの液化後も、媒質溶液Ａが観察対象物Ｓを内包しつつハンギングドロップ形成器具１により支持されている状態が維持されることで、同じハンギングドロップ形成器具１上で培地交換や継続培養などの作業をすることができる。また、観察対象物Ｓが露出して、媒質溶液Ａを液化する液体Ｃに観察対象物Ｓが晒されるのを防ぐとともに、観察対象物Ｓが液体Ｃを収容する容器１１の底面に接触して、観察対象物Ｓが底面に接着したり観察対象物Ｓの形態が変化したりことも防ぐことができる。さらに、ハンギングドロップＤをハンギングドロップ形成器具１から外して液化する場合と比較して、作業工程数や資材を削減することができる。したがって、観察対象物Ｓを内包する媒質溶液Ａをゲル化させてなるサンプルにおいて、観察対象物Ｓの回収や培地交換、継続的な培養を容易に行うことができる。

本実施形態においては、ゲル状のハンギングドロップＤに液体Ｃを霧状で接触させることとしたが、この方法に限定されることなく、ゲル状の媒質溶液Ａに液体Ｃを作用させることで、媒質溶液Ａを観察対象物Ｓを内包しつつハンギングドロップ形成器具１等の基材により支持されている状態を維持させたまま液化することができればよい。

また、本実施形態においては、観察対象物Ｓの周辺近傍までハンギングドロップＤを液化させることとしたが、目的に応じて、ハンギングドロップＤの表面はゲル状のままで内部のみを液化させることとしてもよいし、ハンギングドロップＤの周辺はゲル状のままで表面のみを液化させることとしてもよい。

例えば、超音波霧化装置１３に代えて、超音波や加圧により液体Ｃを霧化させるネブライザー装置等、液体Ｃを霧化できる他の装置を採用することとしてもよい。また、液体Ｃを霧化させることに代えて、例えば、液体Ｃを泡状やスプレーのように媒質溶液Ａの液滴Ａ´よりも小さな体積の液滴状にして媒質溶液Ａの液滴Ａ´の表面に接触させることとしてもよい。この場合、例えば、液体接触手段として、スプレー装置、スパッタリング装置またはポンプ等を採用することとしてもよい。液体Ｂを霧化等して液状の媒質溶液Ａに作用させる装置についても同様である。

また、例えば、図１０に示すように、ハンギングドロップ形成器具１によりハンギングドロップＤを支持した状態で、ピペット等により窪み部３を介してハンギングドロップＤに液体Ｃを添加することとしてもよい。この場合、媒質溶液ＡのハンギングドロップＤの表面はゲル状のままでも、ハンギングドロップＤの液化した内部にハンギングドロップ形成器具１の上方から窪み部３を介して薬剤や培養液を追加することができる。

また、例えば、図１１に示すように、ハンギングドロップ形成器具１によりハンギングドロップＤを支持した状態で、ハンギングドロップ形成区画５から露出するハンギングドロップＤの表面にスポンジ等を用いて液体Ｃを塗布することとしてもよい。

また、図１２に示すように、容器２９に液体Ｃを貯留させておき、ハンギングドロップ形成器具１により支持したハンギングドロップＤを液体Ｃに浸漬させることとしてもよい。この場合、液化したハンギングドロップＤが液体Ｃに混ざって散ってしまうことを防ぐため、例えば、ゲル状のハンギングドロップＤを液体Ｃに浸漬させたら表面が液化する前にハンギングドロップＤを液体Ｃから取り出し、ハンギングドロップＤの表面に付着した液体Ｃを内部に浸透させていくことによりハンギングドロップＤを液化させることとすればよい。

また、本実施形態においては、媒質溶液Ａを液化させる液体としてキレート剤からなる液体Ｃを例示して説明したが、これに限定されるものではない。例えば、ハンギングドロップＤを構成するゲル状の液滴が架橋剤によって２つ以上の分子が連結してなるものである場合は、その架橋を分解する酸化分解反応により液滴を液化する液体を採用することとしてもよい。また、ハンギングドロップＤを構成するゲル状の液滴がペプチド、繊維、糖質または脂質により粘弾性が与えられてなるものである場合は、そのペプチド、繊維、糖質または脂質を酵素的または化学的に分解する反応により液滴を液化する液体を採用することとしてもよい。

また、本実施形態においては、観察対象物として、スフェロイドを例示して説明したが、これに代えて、例えば、細胞、細胞凝集塊、細胞組織またはオルガノイド等からなる生物由来材料を採用してもよい。細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコなど脊椎動物由来の細胞、ショウジョウバエ、カイコなど無脊椎動物由来の細胞、酵母、大腸菌など菌類、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞等の幹細胞などが挙げられる。また、観察対象物として、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料を採用してもよい。

本実施形態においては、基材として、窪み部３、ハンギングドロップ形成区画５および導管７の組が１つからなる単体のハンギングドロップ形成器具１を例示して説明したが、これら窪み部３、ハンギングドロップ形成区画５および導管７の組がアレイ状に配列されて構成されるマルチウエルプレートを採用することとしてもよい。このようなマルチウエルプレートを採用することにより、自動分注が容易であり、スクリーニングを目的とした大量のスフェロイドの撮像を高スループットで行うことができる。また、複数のハンギングドロップＤを１度に液化することができ、ロボット化への対応を容易にすることができる。

また、本実施形態においては、ハンギングドロップ形成器具１によりハンギングドロップＤを形成した場合を例示して説明したが、基材により媒質溶液Ａを支持して液体Ｃを作用させることができればよく、媒質溶液Ａは吊り下げられた状態に支持されていなくてもよい。また、基材は、液体Ｃを接触させる媒質溶液Ａの表面を露出させて媒質溶液Ａを支持することができるものであればよく、例えば、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有するものであってもよい。特に、媒質溶液Ａを付着させて支持し易いよう表面加工されているものが好ましい。

例えば、図１３（ａ）〜（ｃ）に示すように、基材として、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状のスライドグラス（疎水性コートが望ましい。）３１を採用することとしてもよい。この場合、図１３（ａ）に示すように、スライドグラス３１の一表面に媒質溶液Ａを滴下して水滴状に付着させ、観察対象物Ｓを内包させるとともに水滴の表面を露出させてゲル化させたものをサンプルとしてもよい。

この場合、図１３（ｂ）に示すように、スライドグラス３１上のゲル状の媒質溶液Ａの水滴に霧状の液体Ｃを吹き付け、媒質溶液Ａの水滴の露出している表面に液体Ｃを霧状で接触させて、図１３（ｃ）に示すように、媒質溶液Ａの水滴を液化させることとすればよい。

また、図１３（ａ）に示すようなスライドグラス３１上で媒質溶液Ａの水滴をゲル化させたものをスライドグラス３１ごとひっくり返すことにより、スライドグラス３１の下面により支持したサンプルについても、そのゲル状の媒質溶液Ａの水滴に液体Ｃを霧状で接触させて液化させることとしてもよい。

なお、基材は、例えば、ガラス等を含む無機物質、または、合成ゴム、ジメチルシロキサン、シリコーン樹脂、天然ゴム、フッ素化ポリマー、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリシロキサン系ポリマー、ポリメチルアクリレート、ポリメチルハイドロゲンシロキサン、ポリメチルメタクリレート、メチルハイドロジェンシロキサンなど類似物質、誘導体、フレンドなどを含む有機物質によって製作されるものとすればよい。これらの原料を単一もしくは複数使用して作製されるものでもよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、例えば、ゲル状の媒質溶液Ａを例示して説明したが、観察対象物Ｓを内包しつつハンギングドロップ形成器具１により支持されている媒質溶液が固体状であってもよい。その場合、液体Ｃとして、固体状の媒質溶液に添加したり、媒質溶液の表面に噴霧や塗布して接触させたり、固体状の媒質溶液を浸漬させたりすることにより、観察対象物Ｓを内包しつつハンギングドロップ形成器具１により支持されている状態を維持させたまま液化させることができる液体を採用することとすればよい。

１ ハンギングドロップ形成器具（基材）
３１ スライドグラス（基材）
Ａ 媒質溶液
Ｃ 液体
Ｓ 観察対象物（生物由来材料）

Claims (15)

1. 観察対象物を内包しつつ基材により支持されている媒質溶液がゲル化または固体化してなるサンプルに前記媒質溶液を液化させる液体を作用させて、前記媒質溶液を前記観察対象物を内包しつつ前記基材により支持されている状態を維持させたまま液化するサンプル処理方法。
2. 前記媒質溶液の表面に前記液体を霧状、泡状または前記媒質溶液よりも小さな体積の液滴状で接触させる請求項１に記載のサンプル処理方法。
3. 超音波の照射または加圧により前記液体を霧化させる請求項２に記載のサンプル処理方法。
4. 前記媒質溶液に前記液体を添加または塗布し、または、前記液体に前記媒質溶液を浸漬させる請求項１に記載のサンプル処理方法。
5. 前記液体が、架橋剤によって２つ以上の分子が連結している前記サンプルの架橋を分解する酸化分解反応、２価陽イオンによって２つ以上の分子が連結している前記サンプルから２価陽イオンを取り除くことによって分子の連結を解消するキレート反応、または、粘弾性を与えているペプチド、繊維、糖質または脂質を、酵素的または化学的に分解する反応により、前記媒質溶液を液化する請求項１から請求項４のいずれかに記載のサンプル処理方法。
6. 前記液体がキレート剤である請求項５に記載のサンプル処理方法。
7. 前記キレート剤が、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）およびＢＡＰＴＡ（Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸）の少なくとも１つからなる請求項６に記載のサンプル処理方法。
8. 前記液体が、アルギン酸リアーゼ活性を有する酵素を含む請求項５に記載のサンプル処理方法。
9. 前記基材が、棒状、カップ状、ウエル状、リング状、綿棒状、平坦もしくは表面に凹凸を有する板状、スポンジ状、または、多孔質状の形態を有する請求項１から請求項８のいずれかに記載のサンプル処理方法。
10. 前記基材により該基材の表面に前記観察対象物を内包した前記媒質溶液を水滴状に付着させた状態に支持させる請求項１から請求項８のいずれかに記載のサンプル処理方法。
11. 前記基材により前記観察対象物を内包した前記媒質溶液の液滴を吊り下げた状態に支持させる請求項１から請求項８のいずれかに記載のサンプル処理方法。
12. 前記サンプルが、アルギン酸ハイドロゲルにより粘弾性を有する請求項１から請求項１１のいずれかに記載のサンプル処理方法。
13. 前記観察対象物が、細胞、細胞凝集塊、細胞組織、スフェロイドまたはオルガノイドからなる生物由来材料である請求項１から請求項１２のいずれかに記載のサンプル処理方法。
14. 前記観察対象物が、蛍光、発光、りん光または色素を有する非生物由来材料である請求項１から請求項１２のいずれかに記載のサンプル処理方法。
15. ゲル化時または固体化時に略透明である媒質溶液を基材により支持して観察対象物を内包させた状態でゲル化または固体化させる工程と、
    前記基材により支持されているゲル状または固体状の前記媒質溶液に内包されている前記観察対象物を観察する工程と、
    観察後に、前記媒質溶液を液化させる液体を前記媒質溶液に作用させて、該媒質溶液を前記観察対象物を内包しつつ前記基材により支持されている状態を維持させたまま液化する工程とを含むサンプル培養方法。