JP2009050194A - 細胞凝集塊形成培養用容器 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞凝集塊を形成し培養するウェルを有する培養用容器であって、
前記ウェルの最下部面に細胞低接着性の表面を有するくぼみが少なくとも一つ内設されていることを特徴とする細胞凝集塊形成培養用容器であり、前記くぼみの容量は1.0×10−8mL以上、5.0×10−2mL以下であることが好ましい。
【選択図】 図1
Description
その様な機能を発現させる為に三次元培養と呼ばれる、細胞をより生体内に近い凝集塊(スフェロイド)の状態にして培養する方法が知られている。
機能を発現させた細胞は、細胞産生物の抽出や、薬効評価等の創薬スクリーニング等の幅広い目的に利用する事が出来る。
また、胚性幹細胞(embryonic stem cell:ES細胞)においては、スフェロイド状態から胚様体(embryoid body:EB体)と呼ばれる擬似的な胚を形成する事ではじめて様々な組織への分化・誘導のステップに進むことが出来る。
例えば、懸垂培養(ハンギングドロップ培養)と呼ばれる方法がある(例えば、非特許文献1、2参照)。ハンギングドロップ培養はその名のとおり、水滴状に垂れ下げた培養液の中で細胞を培養する方法である。すなわち、マルチウェルプレートの穴(ウェル)に、ミネラルオイルと緩衝液を添加し、マルチウェルプレートの蓋の各ウェル上に重なる位置に細胞を含む培養懸濁液を液滴となるようにスポッティングし、マルチウェルプレートにかぶせて培養する。
更に、形成した凝集塊の刺激応答研究において、薬効評価のための候補試薬や分化誘導研究のための因子を添加する場合にも同様の事が言える。
(1)細胞凝集塊を形成し培養するウェルを有する培養用容器であって、
前記ウェルの最下部面に細胞低接着性の表面を有するくぼみが少なくとも一つ内設されていることを特徴とする細胞凝集塊形成培養用容器。
(2)前記くぼみの容量は1.0×10−8mL以上、5.0×10−2mL以下である(1)に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
(3)前記くぼみの断面形状が略U字形状である(1)又は(2)に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
(4)前記細胞低接着性の表面が親水性樹脂の層を含む(1)ないし(3)のいずれかに記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
(5)前記細胞凝集塊を形成し培養するウェルの数が1個以上、96個以下である(1)に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
(6)前記ウェルの断面形状が略U字形状である(1)又は(5)に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
(7)前記ウェルの容量は0.1mL以上、1.5mL以下である(1)、(5)又は(6)に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
培地に懸濁した状態で播種した細胞は、くぼみ部分に集まり細胞同士の相互作用により細胞凝集塊を形成する。この際、基材を細胞低接着性としない場合、基材と細胞の間に相互作用が発生しやすくなり、凝集塊の形成速度が低下し、基材に接着した不完全な状態の凝集塊になる。更に、基材と細胞の間の相互作用が細胞同士の相互作用を上回った場合には、凝集塊は形成されにくくなる。
一方、くぼみの表面(基材)を細胞低接着性とすると、基材と細胞の間の相互作用を極力少なくすることができるため、細胞凝集塊の形成性は向上し、形成された細胞凝集塊の形態も生体内におけるものに近づけることができるものと推測される。
被覆層の厚みを上記下限値以上にする事により細胞が基材から受ける物理的な刺激をより抑える事ができ、厚みを上記上限値以下とする事により被覆層に取り込まれる蛋白質の量を少なくし、蛋白質を介した細胞の接着を抑えることが出来るため細胞凝集塊形成率をより向上させることができる。
上記樹脂材料としては、例えば、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、エチレン-プロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂または環状ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン系樹脂等のポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂等のメタクリル系樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルサルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、ポリアクリロニトリル等のアクリル系樹脂、プロピオネート樹脂等の繊維素系樹脂等が挙げられる。これらの中でも容器に求められる成形性、透明性、放射線耐性の点においてポリスチレン樹脂が特に好ましい。
上記樹脂材料には成形性向上、耐候性向上を目的として、本発明の目的を損なわない範囲で、例えば、炭化水素系、脂肪酸アミド系の滑剤やフェノール系、アミン系の酸化防止剤等の添加剤を添加することができる。
本発明の培養用容器の形態は限定されないが、多数個の細胞凝集塊を同時に形成することが出来るマルチウェルプレートの形状が好ましく、ウェルの数が96個以下であれば、細胞播種や培地交換の際にディスペンサーチップの操作性や作業時の視認性に優れるため特に好ましい。
放射線の吸収線量については特に限定するものではないが、吸収線量が低すぎると滅菌性は確保されず、高すぎると細胞容器および被覆層が劣化してしまう場合がある。
本発明の容器における放射線の吸収線量としては、1kGy以上、50kGy以下が好ましく、5kGy以上、30kGy以下が特に好ましい。これによって本発明の容器の特性を充分に保持したまま滅菌性を付与する事ができる。
樹脂材料としてポリスチレン樹脂(PSジャパン社製 HF77)を用いて、射出成形により96ウェルマルチウェルプレートを成形した。得られたプレートにプラズマ処理装置(BRANSON/IPC社製 SERIES7000)を用いてプラズマ処理(酸素プラズマ5分間)を行い、前処理としてプレート表面に親水性を付与した。
得られたプレートには、直径8.4mm、高さ11mmの半球状の底面を持つウェルが96個形成されており、それぞれのウェル底面の中心部には、2.62×10-4mLのくぼみが形成されていた。
次に、水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール(東洋合成工業社製 AWP、水溶性樹脂の平均重合度1600、感光基の導入率0.65mol%)をアルミ箔で遮光をしたガラス容器中で、20容量%エタノール水溶液に溶解し、1.0重量%の溶液を調整した。
上述のプレートを前記アルミ箔で遮光したガラス容器に1分間、浸漬した後、取り出し、プレートを裏返して溶液を充分廃棄し、40℃で60分間一次乾燥した後、UVランプで250nmのUV光を0.1mW/cm2×3分間照射して水溶性樹脂を硬化した後、純水で3回繰り返し洗浄し、乾燥後、γ線を吸収線量10kGyで照射(ラジエ工業株式会社)して、本発明の培養容器(プレート)を得た。
樹脂材料としてポリスチレン樹脂(PSジャパン社製 HF77)を用いて、射出成形により96ウェルマルチウェルプレートを成形した。得られたプレートにプラズマ処理装置(BRANSON/IPC社製 SERIES7000)を用いてプラズマ処理(酸素プラズマ5分間)を行い、前処理としてプレート表面に親水性を付与した。
得られたプレートには、直径8.4mm、高さ11mmの半球状の底面を持つウェルが96個形成されており、それぞれのウェル底面の中心部には、2.09×10-3mLのくぼみが形成されていた。
次に、水溶性樹脂として側鎖にアジド基を有するポリビニルアルコール(東洋合成工業社製 AWP、水溶性樹脂の平均重合度1600、感光基の導入率0.65mol%)をアルミ箔で遮光をしたガラス容器中で、20容量%エタノール水溶液に溶解し、1.0重量%の溶液を調整した。
上述のプレートを前記アルミ箔で遮光したガラス容器に1分間、浸漬した後、取り出し、プレートを裏返して溶液を充分廃棄し、40℃で60分間一次乾燥した後、UVランプで250nmのUV光を0.1mW/cm2×3分間照射して水溶性樹脂を硬化した後、純水で3回繰り返し洗浄し、乾燥後、γ線を吸収線量10kGyで照射(ラジエ工業株式会社)して、本発明の培養容器(プレート)を得た。
実施例1の工程におけるプラズマ処理により親水性を付与する工程から水溶性樹脂への浸漬、及び水溶性樹脂への浸漬、硬化、洗浄、乾燥までの工程を除いた以外は実施例1と同様にして培養容器(プレート)を得た。
プレート成形品を、直径8.4mm、高さ11mmの半球状の底面を持つウェルが96個形成されているがそれぞれのウェルにはくぼみが形成されていない形状とし、それ以外は実施例1と同様にして培養容器(プレート)を得た。
HepG2細胞を1×104個/mLの濃度で培地(ダルベッコ改変イーグルMEM+ウシ胎児血清10%)に懸濁し、100μL/ウェルの濃度で播種し、1、3、10日後の凝集塊の形態と形成率を倒立型顕微鏡(オリンパス社製 BX51)下100倍及び40倍の倍率で観察した。
尚、培地交換は2日ごとに培地190μLを8連マルチディスペンサーで吸い取り、200μL添加することによりおこなった。
一方本発明の容器を用いなかった比較例1、2は凝集塊の形態に関しては、凝集塊自体が形成されなかったり、歪な形状の凝集塊となってしまった。また、形成率も培養日数が経つにつれて低下した。
また、実施例に於いては、培地交換による凝集塊の吸い取りも大幅に改善されている事が確認された。すなわち本発明の容器を用いることで均一なサイズのスフェロイドを数多く容易に得ることが出来、更に凝集塊を吸い取ることなく容易に培地交換をおこなうことが出来る事が確認された。
2 くぼみ
Claims (7)
- 細胞凝集塊を形成し培養するウェルを有する培養用容器であって、
前記ウェルの最下部面に細胞低接着性の表面を有するくぼみが少なくとも一つ内設されていることを特徴とする細胞凝集塊形成培養用容器。 - 前記くぼみの容量は1.0×10−8mL以上、5.0×10−2mL以下である請求項1に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
- 前記くぼみの断面形状が略U字形状である請求項1又は2に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
- 前記細胞低接着性の表面が親水性樹脂の層を含む請求項1ないし3のいずれかに記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
- 前記細胞凝集塊を形成し培養するウェルの数が1個以上、96個以下である請求項1に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
- 前記ウェルの断面形状が略U字形状である請求項1又は5に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
- 前記ウェルの容量は0.1mL以上、1.5mL以下である請求項1、5又は6に記載の細胞凝集塊形成培養用容器。
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