JP2016054655A

JP2016054655A - 培養容器

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Publication number: JP2016054655A
Application number: JP2014181187A
Authority: JP
Inventors: 奈緒子小尾; Naoko Obi; 厚史大西; Atsushi Onishi; 山口　陽一; Yoichi Yamaguchi; 陽一山口; 博美山本; Hiromi Yamamoto; 鉄矢中山; Tetsuya Nakayama
Original assignee: Nissha Printing Co Ltd
Current assignee: Nissha Printing Co Ltd
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2016-04-21
Anticipated expiration: 2034-09-05
Also published as: KR102353140B1; KR20170052524A; JP5731704B1; WO2016035407A1; TWI541345B; US20170051241A1; EP3124591A4; EP3124591A1; EP3124591B1; TW201546269A

Abstract

【課題】培養容器においてスフェロイドを安定的に形成する。【解決手段】培養容器は、容器本体と、膜状部材３１と、を備えている。容器本体は、細胞培養液を収容するための複数のマイクロウェル１７ａが底部１７に形成された凹部を有する。膜状部材３１は、凹部内で複数のマイクロウェル１７ａの上方に配置され、マイクロウェル１７ａ内で成長したスフェロイドＳが当該マイクロウェル１７ａから離脱しないように移動を制限するための部材である。【選択図】図８

Description

本発明は、培養容器、特に、スフェロイドを形成するための培養液を収容する培養容器に関する。

医学及び生物の分野において、細胞や菌の培養が幅広く行われている。
また、目的に合った容器を用いて培養を行うために、様々な形状及びサイズの培養容器が開発されている。

特に、近年、細胞が本来有する機能を十分に発揮させることを目的として、従来の平面的な細胞培養とは異なり、三次元に培養することで作成される細胞スフェロイド（以下、スフェロイドという）が注目されている。スフェロイドは、細胞が有する細胞接着機能を利用して、細胞同士が接着することで形成される三次元の構造体である。
スフェロイドを形成する方法として、複数の凹部を有する培養容器に細胞の懸濁液を注入して、各凹部においてスフェロイドを形成する技術が知られている（例えば、特許文献１を参照）。

特開２０１０−８８３４７号公報

特許文献１に記載の細胞培養容器では、スフェロイドの形成は、細胞が懸濁液内を浮遊している状態で行われている。この方法では、懸濁液の対流によってスフェロイドが凹部から飛び出すことがあった。懸濁液の対流が生じる原因は、例えばスフェロイドの観察を行うために顕微鏡まで容器を運ぶ際の揺れであったり、懸濁液を交換するための懸濁液を出し入れであったりする。凹部から飛び出したスフェロイドは、互いに接着してしまい、そのため、スフェロイドの大きさが不均一なることがある。また、凹部から飛び出したスフェロイドは、懸濁液と共に吸引されてしまうことがある。

本発明の課題は、培養容器においてスフェロイドを安定的に形成することにある。

以下に、課題を解決するための手段として複数の態様を説明する。これら態様は、必要に応じて任意に組み合せることができる。

本発明の一見地に係る培養容器は、容器本体と、膜状部材と、を備えている。容器本体は、培養液を収容するための複数のマイクロウェルが底面に形成された凹部を有する。膜状部材は、凹部内で複数のマイクロウェルの上方に配置され、マイクロウェル内で成長したスフェロイドが当該マイクロウェルから離脱しないように移動を制限するための部材である。
この培養容器では、膜状部材が、凹部内で複数のマイクロウェルの上方に配置され、マイクロウェル内で成長したスフェロイドが当該マイクロウェルから離脱しないように移動を制限している。したがって、培養容器においてスフェロイドが安定的に形成される。

膜状部材は、培養液が通過可能な形状又は性質を有していてもよい。
この場合、複数のマイクロウェル内の培養液を容易に交換できる。

膜状部材は、メッシュ構造を有していてもよい。
この場合、膜状部材のいずれの箇所でも培養液が通過可能であるので、複数のマイクロウェル内の培養液を効率よく交換できる。

膜状部材の下面には細胞非接着処理が施されていてもよい。
この場合、スフェロイドが膜状部材の下面に接着しにくくなっており、その結果、スフェロイドが膜状部材の下面に接着されにくい。

膜状部材は可溶性であってもよい。
この場合、スフェロイドが形成された後に、膜状部材が溶けてなくなる。そのため、膜状部材を取り除く作業が不要になる。つまり、スフェロイドの取り出しが容易になる。

培養容器は、凹部内に挿入可能であり、膜状部材が底部に設けられた筒状部材をさらに備えていてもよい。
この場合、筒状部材を凹部に出し入れすることで、膜状部材の設置及び取り外しができる。その結果、作業性が向上する。

底面と膜状部材の下面との間には隙間が確保されており、それにより培養液が各マイクロウェルの内外で移動可能であってもよい。
この場合、膜状部材に培養液が通過するものを用いていない場合でも、複数のマイクロウェル内の培養液を交換できる。

本発明に係る培養容器では、スフェロイドが安定的に形成される。

細胞培養容器の容器本体の斜視図。細胞培養容器の押さえ部材付き板の斜視図。細胞培養容器の押さえ部材付き板の斜視図。細胞培養容器の断面図。細胞培養容器の断面図。膜状部材の平面図。スフェロイド作成を説明するための模式図。スフェロイド作成を説明するための模式図。スフェロイド作成を説明するための模式図。膜状部材の平面図（第２実施形態）。膜状部材の平面図（第３実施形態）。膜状部材の平面図（第４実施形態）。細胞培養容器の断面図（第５実施形態）。細胞培養器の断面図（第６実施形態）。細胞培養容器の断面図（第７実施形態）。細胞培養容器の断面図。細胞培養容器の断面図。細胞培養容器の断面図。押さえ部材の上面図。押さえ部材の上面図（第８実施形態）。細胞培養容器の断面図（第９実施形態）。細胞培養容器の断面図（第１０実施形態）。細胞培養容器の断面図（第１１実施形態）。細胞培養容器の断面図（第１３実施形態）。細胞培養容器の断面図（第１４実施形態）。細胞培養容器の容器本体の斜視図（第１５実施形態）。

１．第１実施形態
（１）全体構造
図１〜図３を用いて、本発明の一実施形態としての培養容器としての細胞培養容器１を説明する。
図１は、細胞培養容器の容器本体の斜視図である。図２及び図３は、細胞培養容器の押さえ部材付き板の斜視図である。

図に示すように、細胞培養容器１は、容器本体３と、押さえ部材付き板５とを備えている。容器本体３は、平面視で長方形状であり、培養液としての細胞培養液Ｃを収容するための細胞培養セルとしての複数の凹部（ウェル）７を有する。容器本体３は、肉厚は薄く、透明性の部材であり、例えば透明プラスチック製である。容器本体３は、公知のものであり、例えば、一般的なウェルプレートである。

押さえ部材付き板５は、容器本体３に対応する長方形形状であり、凹部７に対応する複数の押さえ部材９を有している。押さえ部材付き板５は、肉厚は薄く、透明性の部材であり、例えば透明プラスチック製である。押さえ部材付き板５は、平板状の本体５ａと、その外周面に形成された枠５ｂとを有している。押さえ部材付き板５の本体５ａには、複数の押さえ部材９が設けられている。押さえ部材９は、凹部７の上側に取り外し可能に嵌め込まれる部材である。
なお、図２に示す押さえ部材付き板５は６×４合計２４個の押さえ部材９を有しており、図３に示す押さえ部材付き板５Ａは６×１合計６個の押さえ部材９を有している。図３に示す押さえ部材付き板５Ａは、図１に示す容器本体３に対しては４個が用いられる。

図４は、細胞培養容器の断面図である。図４に示すように、押さえ部材付き板５が容器本体３に嵌められた状態では、複数の押さえ部材９が複数の凹部７内にそれぞれ入り込んでいる。

なお、図示していないが、細胞培養中には、細胞培養容器１の上方から（つまり、押さえ部材付き板５の上方から）、蓋が被される。蓋は、容器本体３及び押さえ部材付き板５の上部を覆う。これにより、細胞培養液に対するコンタミネーションが防止される。

（２）詳細構造
次に、図５及び図６を用いて、凹部７と押さえ部材９の構造及び両者の関係を詳細に説明する。図５は細胞培養容器の断面図であり、図６は膜状部材の平面図である。

凹部７は、底部１７と、筒状部１９とを有している。筒状部１９の内周面１９ａは、縦断面において概ね鉛直に延びている。この底部１７の上面は細胞非接着性である。細胞非接着性とは、付着性細胞が付着しにくい性質をいう。細胞非接着を実現するためには、例えば、親水性の高い物質として、例えば、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体を用いてもよい。また、底部１７の上面に親水性を付与するために、界面活性剤やリン脂質によってコーティングしてもよいし、又はプラズマ処理などの表面処理を行ってもよい。

底部１７の上面には、複数のマイクロウェル１７ａが形成されている。マイクロウェル１７ａは、スフェロイドを形成するための微小凹部である。マイクロウェル１７ａの径は、例えば３０〜１５００μｍであり、好ましくは５０〜３００μｍである。マイクロウェル１７ａの深さは、例えば、３０〜１５００μｍであり、好ましくは５０〜３００μｍである。

押さえ部材９は、主に、筒状部２５と、膜状部材３１とを有している。筒状部２５は、凹部７の筒状部１９内にわずかな隙間ではまり込んでいる。つまり、筒状部２５の外周面２５ａは、筒状部１９の内周面１９ａに近接した状態で対向している。筒状部２５の下端には、膜状部材３１の外周縁が固定されている。膜状部材３１は筒状部２５に一体成形されていてもよい。

膜状部材３１は、凹部７内で前記のマイクロウェル１７ａの上方に配置され、マイクロウェル１７ａ内で成長したものが当該マイクロウェル１７ａから離脱しないように移動を制限するための部材である。この実施形態では、膜状部材３１は、細胞培養液が通過可能な形状又は性質を有している。具体的には、図６に示すように、膜状部材３１は、円形のメッシュ部材である。膜状部材３１はメッシュ部材であるので、全体にわたって細胞培養液が両側に移動可能である。

この実施形態では、膜状部材３１の下面には、細胞非接着処理が施されている。細胞非接着処理とは、例えば、上述したものと同じである。この処理によって、後述するように、スフェロイドＳは膜状部材３１に接着しにくい。なお、細胞非接着処理は、必ずしも施されていなくてもよい。
この実施形態では、膜状部材３１は可溶性である。膜状部材３１は、例えば、１週間で溶解する。膜状部材３１は、例えば、架橋したゼラチン、デンプン、ＰＶＡである。これによって、後述するようにスフェロイドＳを取り出しやすくなる。なお、膜状部材３１は必ずしも可溶性でなくてもよい。その場合は、膜状部材３１は、例えば、ナイロン、ＰＥ、ＰＰ、カーボン、ＰＥＥＫ、テフロン（登録商標）、ＰＥＴ、金属からなる。

膜状部材３１のメッシュ隙間の寸法は、例えば、３０〜１５００μｍである。膜状部材３１と底部１７の上面との間の寸法は、例えば、５０〜３００μｍである。なお、スフェロイドの寸法は、３０〜１５００μｍであり、そのサイズに合わせてメッシュ隙間の寸法は調整される。
なお、上記施形態ではメッシュ隙間の寸法は、種細胞ｃが通過可能に設定されていたが、種細胞ｃが通過不能に設定されてもよい。この場合は、種細胞ｃは、膜状部材３１の固定前にマイクロウェル１７ａに播種される。

押さえ部材９は、さらにフランジ部２７を有している。この実施形態では説明の便宜のために、フランジ部２７は、押さえ部材付き板５の本体５ａに固定された部材として説明しているが、本体５ａと一体に形成されていてもよい。フランジ部２７は、筒状部２５から外周側に延びており、凹部７の筒状部１９の上面に着座している。このように、押さえ部材９にフランジ部２７が設けられているので、押さえ部材９を凹部７から取り外すことが容易になっている。

（３）スフェロイド作成工程
図７〜図９を用いて、スフェロイドＳを作成する工程を説明する。図７〜図９は、スフェロイド作成を説明するための模式図である。
最初に、種細胞ｃの播種を行う。具体的には、図７に示すように、細胞培養液を凹部７内に注入する。細胞培養液は、液体の培地と、培地に均一に拡散された種細胞ｃとからなる懸濁液である。種細胞ｃは、付着性を有しており、例えば、ヒト骨肉腫細胞などのガン細胞や肝細胞である。培地は、付着性細胞の培養に適した公知のものが用いられる。以上の場合、個々の種細胞ｃが、膜状部材３１の隙間３１ａを通って、マイクロウェル１７ａにまで降下し着床する。

そして、図８に示すように、マイクロウェル１７ａ内で、複数の種細胞ｃが凝集することで、スフェロイドＳを形成する。この細胞培養容器１では、膜状部材３１が、凹部７内で複数のマイクロウェル１７ａの上方に配置され、マイクロウェル１７ａ内で成長したスフェロイドＳが当該マイクロウェル１７ａから離脱しないように移動を制限している。したがって、細胞培養容器１においてスフェロイドＳが安定的に形成される。

図示しない管及びポンプを用いて、凹部７内部へ培地を供給及び排出する装置を設けてもよい。これにより、流入口を通じて新たな培地を凹部７内へ注入し、かつ流出口を通じてスフェロイド培養容器内の培地を排出することができる。つまり、種細胞ｃがマイクロウェル１７ａにおいてスフェロイドＳを形成している際に、凹部７内の培地交換が行われる。
上記の培地交換において、凹部７内において培地の流れが生じるが、このとき、膜状部材３１によってスフェロイドＳを押さえているので、スフェロイドＳがマイクロウェル１７ａから飛び出さない。したがって、スフェロイドＳの流出が防止されている。

前述された培地交換によって、培地循環によって、培養中にも細胞に栄養分及び酸素が供給され、細胞が健康に成長する。その結果、比較的長い培養期間を要する大きなスフェロイドＳを形成することができ、さらに、形成されたスフェロイドＳを長期間保存できる。また、培地交換によって、スフェロイドＳにならなかった細胞ゴミ及び老廃物が取り除かれる。

さらに、図９に示すように、スフェロイドＳが形成された後に、膜状部材３１が溶けることで、スフェロイドＳが露出される。これにより、スフェロイドＳを取り出すことが容易になる。なお、膜状部材３１が可溶性でない場合は、膜状部材を取り除くことで図９の状態を得る。

２．第２実施形態
膜状部材は、細胞培養液が通過可能な形状を有しているものとしては、メッシュ部材に限定されない。
図１０に示すように、膜状部材３１Ａは、複数の微小孔３１ｂが全体に形成された円形のフィルムである。
膜状部材３１Ａは、例えば、ガラス、プラチックフィルム、プラスチック板からなる。複数の微小孔３１ｂは例えばレーザによって形成される。

３．第３実施形態
膜状部材は、細胞培養液が通過可能な形状を有しているものとしては、メッシュ部材に限定されない。
図１１に示すように、膜状部材３１Ｂは、複数の小孔３１ｃが形成された円形の部材である。膜状部材３１Ｂは、膜状部材３１Ａと同じ材料である。この実施形態では、複数の小孔３１ｃは、外周側において、環状に配置されている。孔の形状、位置、個数は特に限定されない。ただし、図１１のように複数の小孔が膜状部材の外周側にのみ形成されている場合は、膜状部材の中心部及び中間部に対応するマイクロウェルにおいてスフェロイドＳの観察精度が向上する。

４．第４実施形態
膜状部材３１は、細胞培養液が通過可能な性質を有しているものとしては、第１実施形態及び第２実施形態のものに限定されない。
図１２に示すように、膜状部材３１Ｃは、ハイドロゲルから構成されている。ハイドロゲルとは、水分を多量に含むことにより膨潤する性質を有する高分子材料である。ハイドロゲルは、例えば、アクリルアミド、シリコーン、アガロース、ゼラチンからなる。これにより、細胞培養液は膜状部材３１Ｃを通過可能である。なお、ハイドロゲルでは、タンパク質（１〜２０ｎｍ程度）の循環が可能な構造であればよい。

この場合、細胞の播種は、膜状部材３１Ｃの設置前に行われる。その理由は、膜状部材３１Ｃは、培地は通過するが、細胞は通過しないからである。
なお、膜状部材として細胞培養液が通過可能な性質を有しているものは、ハイドロゲルに限定されない。

５．第５実施形態
第１〜第４実施形態では膜状部材は細胞培養液が通過可能な形状又は性質を有していたが、膜状部材は、マイクロウェル内で成長したものが当該マイクロウェルから離脱しないように移動を制限さえできればよいので、上記のものに限定されない。例えば、膜状部材は細胞培養液が通過不能な形状又は性質を有していてもよい。
図１３を用いて、上記の内容を説明する。図１３は、細胞培養容器の断面図である。

図に示すように、膜状部材３５は、凹部７の底部１７の上面に近接する位置に配置されている。膜状部材３５は、細胞培養液が通過不能な性質を有している。膜状部材３５の外周縁と、筒状部１９の内周面１９ａの下部との間には、環状の隙間３５ａが確保されている。
膜状部材３５と凹部７の底部１７の上面との隙間は、細胞１個は通過可能であるが、スフェロイドは通過不能な寸法である。例えば、隙間は、１０μｍ以上であり、かつ１００μｍ以下である。なお、スフェロイドの寸法は、３０〜１５００μｍであり、そのサイズに合わせて隙間の寸法は調整される。

膜状部材３５は、複数の固定ピン３７によって、底部１７に固定されている。固定ピン３７は、膜状部材３５の外周部に装着されており、先端が底部１７の取付孔１７ｂに挿入されている。
膜状部材３５は、透明フィルムである。膜状部材３５は、例えば、ナイロン、ＰＥ、ＰＰ、カーボン、ＰＥＥＫ、テフロン（登録商標）、ＰＥＴからなる。

この実施形態では、膜状部材３５の外周部において、細胞培養液が、隙間３５ａを通って、膜状部材３５と底部１７との間の空間（つまり、マイクロウェル１７ａにおいてスフェロイドＳが形成される空間）の内外を相互に移動可能である。つまり、膜状部材３５によってスフェロイドＳを押さえつつ、培地交換が可能である。培地交換によって、培養中にも細胞に栄養分及び酸素が供給され、細胞が健康に成長する。また、培地交換によって、スフェロイドＳにならなかった細胞ゴミ及び老廃物が取り除かれる。

この実施形態では、第１〜第４実施形態と同様の効果が得られる。また、各実施形態の変形例も本実施形態に適宜適用可能である。
さらに、膜状部材３５が透明であるので、スフェロイドＳを顕微鏡で観察可能である。

６．第６実施形態
膜状部材を底部の近傍に取り付ける構造は、第５実施形態のものに限定されない。
図１４を用いて、そのような実施形態を説明する。図１４は、細胞培養器の断面図である。

図に示すように、膜状部材３９は、凹部７の底部１７の上面に近接する位置に配置されている。膜状部材３９は、培養液が通過不能な形状又は性質を有している。
膜状部材３９は、外周縁が筒状部１９の内周面１９ａの下部に固定されている。また、膜状部材３９の外周には、複数の孔３９ａが形成されている。

この実施形態では、膜状部材３５の外周部において、細胞培養液が、複数の孔３９ａを通って、膜状部材３５と底部１７との間の空間（つまり、マイクロウェル１７ａにおいてスフェロイドＳが形成される空間）の内外を相互に移動可能である。

７．第７実施形態
第１〜第６実施形態では底部にマイクロウェルを形成した容器を用いたが、マイクロウェルが形成される部材は上記の構成に限定されない。
図１５〜図１９を用いて、スフェロイド形成用の細胞培養容器を説明する。図１５〜図１９は細胞培養容器の断面図である。図２０は、押さえ部材の上面図である。

図１５は、細胞培養容器の容器本体１０３を示している。容器本体１０３は、上側が開口した凹部１０７を有する容器であり、細胞培養液Ｃを保持している。細胞培養液Ｃは、多数の種細胞ｃを含んでいる。
凹部１０７の底部１１７には、マイクロウェル部材１３１が設置されている。マイクロウェル部材１３１は、複数のマイクロウェル１３１ａを上面に有する部材である。

この実施形態では、マイクロウェル部材１３１は底部１１７の中心に設けられ、その上面は底部１１７から比較的離れた上方に配置されている。そのため、底部１１７においてマイクロウェル部材１３１の外周側にはマイクロウェル部材１３１の上面より低い面となっている。

図１６に示すように、押さえ部材１０９が容器本体１０３の凹部１０７内に挿入される。押さえ部材１０９は、図１６及び図１９に示すように、膜状部材としての円板状の下面部１２３を有している。下面部１２３は、マイクロウェル部材１３１の上面（マイクロウェル１３１ａが形成された部分）に近接して配置される。また、下面部１２３において、マイクロウェル部材１３１よりさらに外周側の部分には複数の気泡放出部１２３ｂが形成されている。つまり、気泡放出部１２３ｂは、底部１１７の複数のマイクロウェル１３１ａが形成されていない部分に対応して設けられている。気泡放出部１２３ｂは、点状の貫通孔である。したがって、下面部１２３より下方の空間（例えば、複数のマイクロウェル１３１ａ、マイクロウェル部材１３１の周囲）における気泡は、容易に外部に排出される。

上記の状態で細胞の培養を行うと、図１７に示すように、マイクロウェル１３１ａ内意において、スフェロイドＳが形成される。ここで下面部１２３はマイクロウェル１３１ａに近接して配置されているので、成長したスフェロイドＳはマイクロウェル１３１ａから外に出て行けない。したがって、安全かつ確実に、スフェロイドＳを形成できる。

図１８に示すように、細胞培養液Ｃを減らして、下面部１２３より上側に細胞培養液Ｃが存在しないようにした上で、容器本体１０３の下方からスフェロイドＳを観察する。このとき、下面部１２３の下面１２３ａが細胞培養液Ｃの上面に当接することで、メニスカスが解消される。この結果、容器本体１０３においてスフェロイドＳを正確に観察できる。

８．第８実施形態
第７実施形態では気泡放出部は複数の孔であったが、気泡放出部の形態はそれに限定されない。
図２０を用いて、押さえ部材の他の実施形態を説明する。図２０は、押さえ部材の上面図である。下面部１２３において、マイクロウェル部材１３１よりさらに外周側の部分には複数の気泡放出部１２３ｃが形成されている。気泡放出部１２３ｃは、円周方向に延びる弧状の貫通溝である。

下面部に形成される気泡放出部としての貫通孔の形状、個数、位置は特に限定されない。
また、気泡放出部は、下面部に形成される貫通孔に限定されない。気泡放出部は、押さえ部材１０９の筒状部１２５と容器本体１０３の筒状部１１９との間に形成された切り欠き、スリット、貫通孔であってもよい。

９．第９実施形態
第７実施形態では押さえ部材の下面部は平坦な形状であったが、下面部の形状は特に限定されない。
図２１を用いて、押さえ部材１０９の他の実施形態を説明する。図２１は、細胞培養容器の断面図である。

図に示すように、押さえ部材１０９は、平坦な下面部１２３Ａと、環状の突出部１２３Ｂとを有している。下面部１２３Ａは、マイクロウェル部材１３１の上面に近接して配置されている。環状の突出部１２３Ｂは、下面部１２３Ａの外周縁に形成され、下方に延びている。つまり、突出部１２３Ｂは、マイクロウェル部材１３１の外周側を囲むように配置されている。突出部１２３Ｂの底面には、複数の気泡放出部１２３ｂが形成されている。気泡放出部１２３ｂの形状は、点状又は弧状の貫通孔又はそれらの組合せである。

１０．第１０実施形態
第１〜第９実施形態では押さえ部材の下面部とその下方の部材との間の寸法を正確に管理することが求められる。しかし、押さえ部材は培養容器の培地に押し込んで使用されるので、浮力で押さえ部材が浮いてしまうという問題が考えられる。
そこで、図２２を用いて、そのような課題を解決するための構造を説明する。図２２は、細胞培養容器の断面図である。

図に示すように、押さえ部材付き板５の上方には、蓋１１が配置されている。蓋１１は、押さえ部材付き板５の上側全体を覆っている。蓋１１は、平坦な本体１１ａと、その外周縁から下方に延びる筒状部１１ｂとを有している。蓋１１の本体１１ａと、押さえ部材付き板５との間には、クッション部材１２が配置されている。クッション部材１２は、バネ、ゴム、スポンジ等の弾性部材である。

クッション部材１２は、押さえ部材付き板５と蓋１１との間で圧縮されることで、弾性力を発生する。これにより、押さえ部材付き板５が浮き上がることが防止され、容器本体３内に固定できる。これにより、例えば、スフェロイドを形成するような場合に、マイクロウェルとメッシュとの間の隙間を正確に確保でき、それによりスフェロイド固定効果が確実に得られる。

１１．第１１実施形態
第１２実施形態では、蓋は自重のみによって弾性部材を圧縮していたが、他の構造によって弾性部材を圧縮してもよい。
そこで、図２３を用いて、そのような課題を解決するための構造を説明する。図２３
は、細胞培養容器の断面図である。

基本的な構造は第１０実施形態と同じである。
この実施形態では、容器本体３の外周部に第１係合部１５が形成され、さらに蓋１１の筒状部１１ｂに第２係合部１６が形成されている。第１係合部１５と第２係合部１６は互いに係合しており、それにより蓋１１が容器本体３から離れないようになっている。

この実施形態では、クッション部材１２は、押さえ部材付き板５と蓋１１との間で圧縮されることで、弾性力を発生する。これにより、押さえ部材付き板５が浮き上がることが防止され、容器本体３内に固定できる。これにより、例えば、スフェロイドを形成するような場合でも、マイクロウェルとメッシュとの間の隙間を十分に短くでき、それによりスフェロイド固定効果が確実に得られる。

１２．第１２実施形態
第１０実施形態及び第１１実施形態では、蓋及びクッション部材を用いることで押さえ部材付き板５の浮き上がりを防止していたが、他の手段によっても浮き上がり防止は可能である。例えば、押さえ部材付き板５の重量を増加することで、浮力による浮きを防止できる。具体的には、金属製材料を一部に使うことで、押さえ部材付き板５自体を重くする。又は、押さえ部材付き板５の一部に錘を付ける。

１３．第１３実施形態
図２４を用いて、筒状部１９に固定された膜状部材３１の位置決めを正確に行うための構造を説明する。図２４は、細胞培養容器の断面図である。
押さえ部材付き板５のフランジ２７部の下面には、ピン部材４１が固定されている。ピン部材４１の下端は、容器本体３の筒状部１９の上面に形成された孔４３内に挿入されている。

このように、ピンと孔によって、押さえ部材９と凹部７との上下方向の位置決めが正確に行われている。したがって、膜状部材３１と底部１７の上面との間の隙間が正確に確保される。
なお、上記のピンと孔による位置決め構造は、個数、形状、位置が特に限定されない。

１４．第１４実施形態
図２５を用いて、筒状部１９に固定された膜状部材３１の位置決めを正確に行うための構造を説明する。図２５は、細胞培養容器の断面図である。
筒状部１９の下端には、複数の突起４５が設けられている。突起４５は、膜状部材３１よりさらに下方に延びている。突起４５の下端は、底部１７の上面に形成された取付孔１７ｂ内に挿入されている。

このように、突起と孔によって、押さえ部材９と凹部７との上下方向の位置決めが正確に行われている。したがって、膜状部材３１と底部１７の上面との間の隙間が正確に確保される。
なお、上記の突起と孔による位置決め構造は、個数、形状、位置が特に限定されない。また、筒状部の下部と底部との間の位置決めは前記実施形態に限定されない。例えば、筒状部の下部が底部に設けられた受け部によって支持されてもよい。

１５．第１５実施形態
複数の押さえ部材が複数の凹部にスムーズに嵌まるように両者に位置決め構造を説明する。

そのような実施形態を、図２６を用いて説明する。図２６は、細胞培養容器の容器本体の斜視図である。
なお、基本的な構造は第１〜第１５実施形態と同じである。以下、異なる点を中心に説明する。

容器本体３の上側の隅には、複数のピン７１が立設されている。具体的には、ピン７１は、容器本体３の凹部７が形成された本体部分の外側部分の四隅に配置されている。
押さえ部材付き板５には、ピン７１に対応する位置に孔７３が形成されている。具体的には、孔７３は、枠５ｂの四隅に形成されている。

押さえ部材付き板５を容器本体３に嵌めるときに、ピン７１と孔７３によって位置決めすることで、複数の押さえ部材９が凹部７にスムーズに嵌まり込む。
なお、ピンと孔の数は前記実施形態に限定されない。さらに、容器本体３と押さえ部材付き板５との位置決め構造は、ピンと孔に限定されない。

１６．実施形態の共通点
第１〜第１５実施形態は下記の点が共通である。
培養容器（例えば、細胞培養容器１）は、容器本体（例えば、容器本体３）と、膜状部材（例えば、膜状部材３１、膜状部材３１Ａ、膜状部材３１Ｂ、膜状部材３１Ｃ、膜状部材３５、膜状部材３９、下面部１２３、下面部１２３Ａ）と、を備えている。容器本体３は、培養液（例えば、細胞培養液Ｃ）を収容するための複数のマイクロウェル（例えば、複数のマイクロウェル１７ａ、マイクロウェル１３１ａ）が底面（例えば、底部１７の上面、マイクロウェル部材１３１の上面）に形成された凹部（例えば、凹部７、凹部１０７）を有する。膜状部材は、凹部内で複数のマイクロウェルの上方に配置され、マイクロウェル内で成長したスフェロイド（例えば、スフェロイドＳ）が当該マイクロウェルから離脱しないように移動を制限するための部材である。
この培養容器では、膜状部材が、凹部内で複数のマイクロウェルの上方に配置され、マイクロウェル内で成長したスフェロイドが当該マイクロウェルから離脱しないように移動を制限している（例えば、図８、図１７参照。）。したがって、培養容器においてスフェロイドが安定的に形成される。

１７．他の実施形態
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。特に、本明細書に書かれた複数の実施形態及び変形例は必要に応じて任意に組み合せ可能である。

前記実施形態ではスフェロイドの培養を説明したが、本発明はそれに限定されない。本発明は、例えば胚葉体の培養にも適用できる。胚様体は、初期胚と似た構造を有する、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などからなる細胞塊である。
前記実施形態ではスフェロイド形成中に培地交換を行っていたが、培地交換は必ずしも行わなくてもよい。
凹部及び押さえ部材の平面視形状、及びそれらの組合せは前記実施形態に限定されない。
凹部及び押さえ部材の個数は、前記実施形態に限定されない。

前記実施形態では、培養容器の一例として細胞培養液を用いた細胞培養容器を説明した。しかし、本発明に係る培養容器では、例えば、動物細胞、植物細胞、菌、細菌も培養可能である。

本発明は、顕微鏡観察に用いられる培養液を収容する培養容器に広く適用できる。

１：細胞培養容器
３：容器本体
５：押さえ部材付き板
５Ａ：押さえ部材付き板
５ａ：本体
５ｂ：枠
７：凹部
９：押さえ部材
１７：底部
１７ａ：マイクロウェル
１７ｂ：取付孔
１９：筒状部
１９ａ：内周面
２５：筒状部
２５ａ：外周面
２７：フランジ部
３１：膜状部材
３１Ａ：膜状部材
３１Ｂ：膜状部材
３１Ｃ：膜状部材
３１ａ：隙間
３１ｂ：微小孔
３１ｃ：小孔
３５：膜状部材
３９：膜状部材
１２３：下面部
１２３Ａ：下面部
１２３ａ：下面
Ｃ：細胞培養液
ｃ：種細胞
Ｓ：スフェロイド

Claims

培養液を収容するための複数のマイクロウェルが底面に形成された凹部を有する容器本体と、
前記凹部内で前記複数のマイクロウェルの上方に配置され、前記マイクロウェル内で成長したものが当該マイクロウェルから離脱しないように移動を制限するための膜状部材と、
を備えた培養容器。
前記膜状部材は、前記培養液が通過可能な形状又は性質を有している、請求項１に記載の培養容器。
前記膜状部材は、メッシュ構造を有している、請求項２に記載の培養容器。
前記膜状部材の下面には細胞非接着処理が施されている、請求項１〜３のいずれかに記載の培養容器。
前記膜状部材は可溶性である、請求項１〜４のいずれかに記載の培養容器。
前記凹部内に挿入可能であり、前記膜状部材が底部に設けられた筒状部材をさらに備えている、請求項１〜５のいずれかに記載の培養容器。
前記底面と前記膜状部材の下面との間には隙間が確保されており、それにより前記培養液が各マイクロウェルの内外で移動可能である、請求項１に記載の培養容器。