KR101934185B1 - 시료 이송용 틀을 이용한 시료 이송 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시료 이송용 틀을 이용한 시료 이송 방법에 관한 것으로서, 3차원 세포 스페로이드를 포함한 시료에서 특정 단백질의 발현 여부 등을 확인하기 위한 관찰을 용이하고 효과적으로 수행할 수 있게 한다.

Description

시료 이송용 틀을 이용한 시료 이송 방법{Method for transferring sample}
본 발명은 시료 이송용 틀을 이용한 시료 이송 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 3차원 세포 스페로이드 등을 이용한 연구에서 시료를 용이하고 효과적으로 관찰하기 위해 이용할 수 있는 시료 이송용 틀을 이용한 시료 이송 방법에 관한 것이다.
인간의 질병을 진단, 예방 또는 치료하기 위해 이용될 수 있는 방법이나 물질을 개발하기 위한 연구에서 동물이나 인간의 세포를 이용한 인 비트로 실험이 수행되고 있다. 그러나, 실제로 체내에서 세포들은 주변의 세포들이나 세포외기질(ECM) 등과의 상호작용을 통해 생명 활동을 유지하므로, 인 비트로 실험을 통해 체내의 생리적 현상을 모사하는 것은 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 체내의 세포 조직들과 매우 유사한 3차원 세포 스페로이드(spheroid)가 활용되고 있다.
3차원 세포 스페로이드를 배양하는 플레이트가 다양하게 개발되어 왔다. 초기에 개발된 스페로이드 배양 플레이트는 좁은 통로를 이용하여 물방울을 맺히게 하여 세포간 간격을 좁혀주는 원리를 이용하는 것으로서, 바닥이 존재하지 않기 때문에 물방울 내부의 세포가 세포끼리 부착되어 세포군집을 이루게 된다. 이러한 형태의 스페로이드 제작법은 배지의 부피가 적은 양이 들어가 약간의 증발에도 세포의 안정성에 영향을 주기 때문에 초기유래세포(primary cell)와 같이 외부 배양이 어려운 세포의 경우에는 적합하지 않다. 따라서, 최근에 안정적으로 스페로이드를 제작 및 배양할 수 있는 스페로이드 배양 플레이트가 새롭게 개발되었다. 이러한 플레이트들은 세포가 바닥으로 부착되지 않도록 하기 위하여 소수성 표면을 이용하며 수백 마이크로 단위의 작은 구덩이를 제작하고 세포가 모여질 수 있도록 하여 세포 스페로이드를 형성시키며, 배지를 안정적으로 공급할 수 있기 때문에 다양한 세포에 적용할 수 있다. 또한, 한국등록특허 제1555239호는 스페로이드 형성방법 및 장치에 관한 것으로서, 초소수성 표면을 이용하여 스페로이드의 생존율 및 기능성을 향상시킨다고 개시한다.
그러나, 스페로이드의 배양을 이용한 방법의 가장 큰 단점은 배양 용기의 굴곡 때문에 스페로이드 관찰이 용이하지 못하다는 점이다. 따라서 대부분의 형광 분석을 위해, 스페로이드를 용기로부터 분리해야 하고, 이때, 크기가 작은 스페로이드의 경우, 형광분석을 위한 항체 염색시 여러 번의 세척 과정에서 스페로이드를 분리하여 세척하기 어렵다. 이에, 본 발명자들은 세포나 세포 스페로이드를 안정적으로 제 위치에 고정하여 용이하게 세포를 염색하고 관찰할 수 있는 방법을 연구하여, 본 발명을 완성하였다.
KR1555239 10 KR1449906 10 KR1091084 10 KR2016-0021352 10
본 발명은 세포 스페로이드와 같은 시료의 이송용 틀을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 세포 스페로이드와 같은 시료의 이송용 틀을 이용하여 시료를 이송하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는
오목부를 갖는 몸체; 및
상기 오목부의 바닥에 부착된 시료의 이탈을 막는 막을 포함하는, 시료 이송용 틀을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료는 세포 배양물, 세포 응집체, 또는 스페로이드일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "이송용 틀"은 시료를 본래 있던 위치를 고정한 상태로 옮기기 위해 이용되는 틀을 의미한다. 예를 들면, 이송용 틀을 이용하여 세포 스페로이드 배양 플레이트 상에 형성된 세포 스페로이드를 배양 플레이트에서의 위치를 유지하면서 경화된 수화겔 상으로 옮긴다. 이송용 틀은 가공이 가능한 플라스틱, 폴리스타일렌(polystylene), 폴리프로필렌, 아크릴 등으로 제조될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "세포 배양물"은 세포를 적절한 배지에서 배양하여 수득된, 배양된 세포를 포함하는 결과물을 의미하며, 배양은 현탁배양, 부착배양, 현적배양(hanging drop) 등일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "세포 응집체"는 인접한 세포들이 응집하여 생성된 세포들의 집합체, 또는 덩어리를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "스페로이드"는 세포 응집체의 일종으로, 다수의 단일 세포들이 모여 3차원 구 형태를 이루는 세포 집합체를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료 이송용 틀은 시료가 담긴 용기의 크기나 형태에 따라 그 크기나 형태가 결정될 수 있다. 상기 이송용 틀은 이송 대상 시료가 담긴 용기를 덮을 수 있는 크기 및 형태를 가질 수 있다. 예를 들면, 이송 대상 시료가 담긴 용기가 스페로필름(SpheroFilm™)인 경우, 시료 이송용 틀은 스페로필름 전체를 뒤덮는 크기일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 오목부의 하부는 이송할 시료와 접촉하고, 상기 오목부의 상부는 시료를 고정된 위치로 이송할 수 있도록 시료와 접촉한 후 수화겔을 포함한, 겔화가능한 물질이 오목부에 채워질 수 있도록 개방된 개구부를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 오목부는 상부의 개구부를 통해 채워진 수화겔을 포함한, 겔화가능한 물질이 하부, 바닥면까지 이동할 수 있게 하는 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 오목부는 상부의 개구부를 통해 부어진 수화겔을 포함한, 겔화가능한 물질의 이동 및 경화를 확인할 수 있도록 투명 또는 반투명한 부분을 갖는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 오목부는 그 전체가 투명 또는 반투명한 구조를 갖는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 오목부의 하부는 이송 대상 시료를 덮을 수 있는 크기 및 형태를 가질 수 있고, 이송 대상 시료의 위치를 한정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 오목부의 하부는 이송 대상 시료의 위치에 정확하게 배치할 수 있도록 표시하거나 촉진하는 구조를 가질 수 있다. 상기 구조는 시료 주변에 탈부착가능한 구조, 예를 들면, 점착 테이프일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 오목부의 상부는 겔화가능한 물질을 오목부에 채운 후에 경화를 촉진하기 위해 덮을 수 있는 덮개를 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 몸체는 복수 개의 오목부를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 스페로이드가 멀티-웰 플레이트에서 배양된 경우, 스페로이드를 이송하기 위해 이용하는 이송용 틀은 각 웰에 상응하는 오목부를 가져서, 각 스페로이드를 플레이트에서의 고정된 위치로 이송할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 몸체는 그의 일 단부 또는 양 단부에 손잡이를 가질 수 있다. 손잡이가 있는 몸체는 시료 이송용 틀을 시료가 담긴 용기로부터 용이하게 분리할 수 있게 한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 이송용 틀의 오목부의 바닥에 부착된 막은 시료가 수화겔을 포함한 겔화가능한 물질과 접촉할 수 있으나, 시료가 빠져나가지 않도록 눌러줄 수 있는 크기의 공극을 갖는 막이며, 시료의 크기에 따라 결정될 수 있다. 이송용 틀의 바닥에 부착된 막이나 메쉬는 시료가 수화겔을 포함한 겔화가능한 물질과 접촉하나 빠져나오지 않아서, 수화겔의 표면 위에 결합될 수 있게 하는 크기의 공극을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 막은 세포 응집체와 같은 시료의 크기보다 작은 50 내지 100 ㎛ 크기의 세공을 갖는 메쉬(mesh)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 메쉬는 금속, 실리콘, 플라스틱 등으로부터 선택된 재질로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료 이송용 틀은 오목부의 하부에 배치된 시료를 오목부의 상부를 통해 오목부에 채워진 수화겔과 같은 겔화가능한 물질과 접촉시키고, 시료가 경화된 겔이나 물질로 이송될 수 있게 한다. 예를 들면, 시료는 경화된 겔에 의해 위치가 고정된 상태로 시료의 용기로부터 시료 이송용 틀로 옮겨진다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료 이송용 틀은 복수 개의 오목부를 갖는 몸체를 포함하고, 각 오목부의 바닥에는 시료의 이탈을 막을 수 있는 공극을 갖는 메쉬가 부착되어 있고, 상기 오목부는 이송 대상 시료와 접촉할 수 있도록 배치되며, 상기 이송용 틀은 이송 대상 시료를 담은 용기를 뒤덮는 크기를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료 이송용 틀은 1회용일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 이송용 틀은 복수 사용 가능하고, 멸균 가능할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 시료 이송 방법으로서,
시료가 담긴 용기에 시료 이송용 틀을 덮는 단계,
상기 이송용 틀에 수화겔을 붓는 단계,
상기 겔을 경화시키는 단계, 및
상기 이송용 틀을 상기 용기로부터 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "수화겔"은 물을 분산매로 하고, 시료의 분석을 위해 필요한 물질, 예를 들면, 형광염색을 위한 항체의 이동이 가능한 크기의 공극을 갖는 겔을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료 이송용 틀은 오목부를 갖는 몸체; 및 상기 오목부의 바닥에 부착된 시료의 이탈을 막는 막을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 이송용 틀에서 오목부의 하부는 이송할 시료와 접촉하고, 상기 오목부의 상부는 수화겔이 오목부에 채워질 수 있도록 개방되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료는 세포 배양물, 세포 응집체, 또는 스페로이드일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료 이송용 틀은 시료가 담긴 용기의 크기나 형태에 따라 그 크기나 형태가 결정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 이송용 틀의 오목부의 바닥에 부착된 막은 시료가 수화겔과 접촉할 수 있으나, 시료가 빠져나기지 않도록 눌러줄 수 있는 크기의 공극을 갖는 막이며, 시료의 크기에 따라 결정될 수 있다. 이송용 틀의 바닥에 부착된 막이나 메쉬는 시료가 수화겔과 접촉하나 빠져나오지 않아서, 수화겔의 표면 위에 결합될 수 있게 하는 크기의 공극을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 시료가 스페로이드인 경우, 상기 막은 50 내지 100 ㎛ 크기의 메쉬일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 몸체는 복수 개의 오목부를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 수화겔은 알지네이트, 아가로오스, 또는 PEG(polyethylene glycol)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 시료를 고정된 위치에 배치하고, 형광 염색 등을 통한 관찰을 가능하게 하는 겔화가능한 물질이 겔로 사용될 수 있다. 예를 들면, 조직 모사의 경우, 내부의 세포까지 염색을 확인할 수 있도록 하기 위해 조직이나 세포 투명화 과정을 거치며, 조직이나 세포 스페로이드의 관찰을 위해 조직투명화 전에 시료의 이송이 이루어지므로, 수화겔은 조직투명화 공정에 영향을 주지 않으며, 형광염색이 가능하도록 항체의 이동이 가능한 크기의 공극을 가져야 한다. 도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송용 틀을 이용한 이송을 포함한, 조직 투명화 공정도를 보여준다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 시료는 스페로이드이고, 상기 용기는 스페로이드 배양 플레이트이며, 상기 시료 이송은 스페로이드를 스페로이드 배양 플레이트로부터 위치를 고정하며 수화겔에 결합시켜 경화된 수화겔로 이동시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 스페로이드 시료의 이송용 틀을 이용한 시료 이송 방법은 고정화된 세포 스페로이드에서 수분을 제거하는 단계, 수분이 제거된 배양 플레이트 위에 이송용 틀을 덮는 단계, 덮어준 이송용 틀 위에 일정량의 수화겔을 붓는 단계, 각각의 수화겔에 알맞은 경화 방법으로 경화시키는 단계, 및 이송용 틀을 배양 플레이트로부터 분리하는 단계로 수행되고, 그에 의해 세포 스페로이드가 수화겔에 결합되어 이송용 틀 위로 이송되게 된다. 도 2a 및 도 2b는 각각 본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송용 틀을 이용한 시료 이송 방법의 모식도 및 공정도를 보여준다.
기존의 3차원 세포 스페로이드 제작 또는 배양 플레이트에서 제작된 스페로이드의 형광 염색 확인 시 플레이트의 굴곡 특성상 초점을 맞추기 어려우며, 대부분의 재질이 PDMS(polydimethylsiloxane)와 같은 폴리머로 구성되어 있는 물질이기 때문에 자발광이 많이 나타나 형광간섭이 심하여 이미지 촬영이 어려운 단점 때문에, 일반적으로 배양 플레이트로부터 스페로이드를 분리하여 확인한다. 이때, 분리된 스페로이드는 너무 작은 크기이므로 항체 염색의 긴 공정에서 용이하게 염색시키기 어려운 단점이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송 방법을 이용하여 스페로이드를 원하는 위치에 고정하여 겔로 이송시킬 경우, 항체염색도 용이하고 효과적으로 수행되고, 조직 모사의 경우 내부의 세포까지 염색을 확인할 수 있도록 하기 위하여 세포 투명화 과정을 거치게 되는데 이러한 세포 투명화 과정에서도 안정적으로 스페로이드 투명화 공정을 진행할 수 있는 장점을 갖는다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 시료 이송용 틀 및 이를 이용한 시료 이송 방법은 세포 스페로이드를 포함한 시료에서 특정 단백질의 발현 여부 등을 확인하기 위한 관찰을 용이하고 효과적으로 수행할 수 있게 하여, 기초 연구로부터 신약 개발 등의 응용 분야에 이르기까지 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른, 단일 오목부를 갖는 시료 이송용 틀(1: 몸체, 2: 오목부, 3: 하부(바닥))의 개략도를 보여주며, 확대도는 시료 이송용 틀의 하부에 있는, 시료의 유출을 막을 수 있는 크기의 공극을 갖는 막을 나타낸다.
도 2a는 본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송용 틀을 이용한 스페로이드 이송 방법의 모식도 및 도 2b는 본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송용 틀을 이용한 스페로이드 이송 방법의 공정도이다.
도 3은 스페로필름(SpheroFilm™)을 이용한 스페로이드의 배양 후, 본 발명의 일 구체예에 따른 이송용 틀을 이용하여 이송후 관찰된 스페로이드를 보여준다:(a) 스페로필름에서 배양된 스페로이드, (b) 이송용 틀이 덮인 스페로필름, 및 (c) 이송용 틀로 이송된 스페로이드.
도 4a는 본 발명의 일 구체예에 따른, 96웰 플레이트의 8웰에 해당하는 스트립으로부터 시료를 이송하기 위한 이송용 틀, 및 도 4b는 상기 이송용 틀을 이용한 스페로이드의 이송 과정을 보여준다.
도 5는 (a) 본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송용 틀을 이용하여 이송된 시료, 및 (b) 이송 후 수득된 겔의 형광 이미지로서, 세포질의 F-액틴 염색과 DAPI에 의한 핵 염색의 결과를 중첩시켜(merged) 시료가 위치의 변동 없이 고정된 위치로 이송되었다는 것을 보여준다.
도 6은 (a) 스페로이드 배양 플레이트 내부에서 염색된 세포 형광 이미지와 (b) 본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송용 틀에 이송된 스페로이드의 형광 이미지를 보여준다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송용 틀을 이용한 이송을 포함한, 조직 투명화 공정도를 보여준다.
실시예. 스페로이드 배양, 이송, 및 관찰
1-1. 스페로이드 제조용 필름(SpheroFilm™)을 이용한 스페로이드 배양 및 이송
스페로필름(SpheroFilm™)에서 배양된 스페로이드를 시료 이송용 틀을 이용하여 이송시켜 관찰하였다. 먼저 스페로필름에서 배양된 세포 스페로이드를 CaCl2를 이용하여 고정화하고, 스페로필름에 알맞은 크기의 이송용 틀을 스페로필름 위에 배치하고, 이송용 틀에 수화겔로 2% 소디움 알지네이트를 붓고 경화시킨 후, 이송용 틀을 스페로필름으로부터 꺼내어, 세포 스페로이드가 고정된 위치에서 잘 이동된 것을 확인할 수 있었다. 도 3은 (a) 스페로필름에서 배양된 스페로이드, (b) 이송용 틀이 덮인 스페로필름, 및 (c) 이송용 틀로 이송된 스페로이드를 보여준다.
1-2. 멀티 웰 플레이트에서의 스페로이드 배양 및 이송
96웰 플레이트 형태의 세포 스페로이드 제작이 많아짐에 따라 96웰 플레이트중 8개의 웰의 스트립 형태의 이송용 틀을 제작하고, 제작된 이송용 틀을 해당하는 8개의 웰을 포함하는 스트립에 배치하고, 이송용 틀에 수화겔을 붓고, 경화시킨 후, 상기 스트립으로부터 이송용 틀을 제거하여, 이송용 틀로 세포 스페로이드가 배양된 위치 그대로 잘 이송되었으며, 기존의 세포 스페로이드 배양 플레이트의 간섭현상 없이 세포 스페로이드의 형광 관찰을 명확하게 할 수 있음을 확인하였다. 도 4a는 96웰 플레이트의 8웰에 해당하는 스트립으로부터 시료를 이송하기 위한 이송용 틀, 및 도 4b는 상기 이송용 틀을 이용한 스페로이드의 이송 과정을 보여준다. 또한, 도 5는 스페로이드가 고정된 위치로 이송되었다는 것을 보여준다.
1-3. 스페로이드의 형광 이미지 관찰
스페로이드를 배양 플레이트에서 배양한 후, 배양 플레이트에서 스페로이드의 형광 이미지를 관찰하고, 그 후, 스페로이드 이송용 틀을 이용하여 스페로이드를 배양 플레이트로부터 이송한 후 형광 이미지를 관찰한 결과 이송 후에 보다 선명한 형광 이미지를 관찰할 수 있었다. 도 6은 결과적으로 수득된 (a) 스페로이드 배양 플레이트 내부에서 염색된 세포 형광 이미지와 (b) 본 발명의 일 구체예에 따른 시료 이송용 틀에 이송된 스페로이드의 형광 이미지를 보여준다.
1: 시료 이송용 틀의 몸체
2: 시료 이송용 틀의 오목부
3: 시료 이송용 틀의 하부(바닥)

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 시료가 담긴 용기에 오목부를 갖는 몸체와 오목부의 바닥에 부착된 막을 포함하는 시료 이송용 틀을 덮는 단계,
    상기 이송용 틀에 수화겔을 붓는 단계,
    상기 수화겔을 상기 막에 통과시키는 단계,
    상기 겔을 경화시키는 단계, 및
    상기 이송용 틀을 상기 용기로부터 분리하는 단계를 포함하는, 시료 이송 방법.
  7. 청구항 6 있어서, 상기 오목부의 하부는 이송할 시료와 접촉하고, 상기 오목부의 상부는 수화겔이 오목부에 채워질 수 있도록 개방되어 있는 것인 시료 이송 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 시료는 세포 배양물, 세포 응집체, 또는 스페로이드인 것인 시료 이송 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 막은 50 내지 100 ㎛ 크기의 메쉬인 것인 시료 이송 방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 몸체는 복수 개의 오목부를 갖는 것인 시료 이송 방법.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 수화겔은 알지네이트, 아가로오스, 또는 PEG(polyethylene glycol)인 것인 시료 이송 방법.
  12. 청구항 6에 있어서, 상기 시료는 스페로이드이고, 상기 용기는 스페로이드 배양 플레이트이며, 상기 시료 이송은 스페로이드를 스페로이드 배양 플레이트 상의 고정된 위치에서 경화된 겔로 이동시키는 것인 시료 이송 방법.
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