KR102460969B1 - 세포 배양 인서트 - Google Patents

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KR102460969B1
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그레고리 로저 마틴
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    • C12M23/12—Well or multiwell plates

Abstract

회전 타원체의 형성을 촉진하도록 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 인서트 및 이 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 사용하는 방법. 상기 세포 배양 인서트는 다공성 막 및 세포에 비-부착성이고, 및 상기 인서트 내에 세포들이 서로 연합하게 하여 회전 타원체를 형성하는 하나 이상의 측벽을 포함한다.

Description

세포 배양 인서트 {CELL CULTURE INSERT}
본 출원은 2014년 10월 29일자로 출원된 미국 가 특허출원 제62/069,996호의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 여기에 참조로서 혼입된다.
본 개시는 세포를 배양하는 장치, 시스템 및 방법에 관한 것이다.
본 개시는 일반적으로 회전 타원체의 형성을 촉진하도록 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 인서트 (cell culture inserts) 및 이 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 사용하는 방법에 관한 것이다. 회전 타원체는 2-차원 (2D) 세포 배양 시스템에서 단층으로 배양된 세포보다 세포에 더 많은 생체 내 기능성을 제공할 수 있는 3-차원 (3D) 세포 클러스터 (cell clusters)이다. 특정 세포 타입, 예를 들어, 간세포의 경우, 회전 타원체는 2D 배양된 구획보다 더 우수한 생체 내 기능성을 달성하고 보유할 수 있다.
본 개시의 다양한 구체 예에 따르면, 회전 타원체의 형성을 촉진하도록 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 인서트 및 이 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 사용하는 방법은 개시된다. 몇몇 구체 예에서, 여기에 기재된 바와 같은 세포 배양 인서트는 다른 세포 배양 인서트에 중첩될 (nested) 수 있거나 또는 다른 세포 배양 인서트는 여기에 기재된 바와 같은 세포 배양 인서트에 중첩될 수 있다.
다양한 구체 예에서, 본 개시는 본체 (body) 및 다공성 막 (porous membrane)을 갖는 세포 배양 인서트를 기재한다. 상기 본체는 제1 개방 단부, 100㎛ 내지 1000㎛ 범위 (예를 들어, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 및 이들 사이의 모든 값 및 범위; 예를 들어, 200 내지 500, 200 내지 700, 400 내지 600, 등)의 직경 치수를 갖는 개구를 한정하는 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽을 갖는다. 하나 이상의 측벽, 또는 이의 일부는 경사진다 (예를 들어, 제1 또는 제2 단부에 대해 수직으로부터 5도 초과; 예를 들어, >10o, >20o, >30o, >40o, >50o, 등). 경사진 경우, 측벽은 바람직하게는 제2 단부에서의 직경이 제1 개방 단부에서의 직경보다 작도록 경사진다. 다공성 막은 제2 단부의 개구 위에 배치된다.
다양한 구체 예에서, 본 개시는 본체 및 다공성 막을 갖는 세포 배양 인서트를 기재한다. 상기 본체는 제1 개방 단부, 개구를 한정하는 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽을 갖는다. 하나 이상의 측벽, 또는 이의 일부는 경사진다. 상기 다공성 막은 제2 단부의 개구 위에 배치되고, 세포에 비-부착성이다.
다양한 구체 예에서, 본 개시는 세포 배양 장치의 저장조에 적어도 부분적으로 삽입되도록 구성된 투과성 지지 장치를 기재한다. 상기 투과성 지지 장치는 테이퍼 형상을 갖는 제1 웰 및 제1 투과성 지지체에 의해 적어도 부분적으로 한정된 하부를 포함한다.
다양한 구체 예에서, 본 개시는 세포 배양 인서트를 기재한다. 상기 인서트는 제1 개방 단부, 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽을 갖는 본체를 포함한다. 상기 제2 단부는 하부에 다공성 막을 갖는 웰을 한정하는 마이크로웰 (microwell)의 어레이 (array)를 갖는 기판을 포함하며, 여기서 웰을 한정하는 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판의 적어도 일부는 경사진다.
다양한 구체 예에서, 본 개시는 테이퍼 형상을 갖는 제1 웰 및 제1 투과성 지지체에 의해 적어도 부분적으로 한정된 하부 부분을 포함하는 중첩된 투과성 지지 장치, 및 상기 제1 웰 아래에 위치된 하부를 갖는 저장조를 기재한다. 구체 예에서, 상기 저장조는 가스 투과성 물질로 제조되거나 또는 마이크로웰의 어레이를 갖거나 또는 둘 모두이다.
다양한 구체 예에서, 본 개시는 제1 웰, 제2 웰 및 제3 웰을 포함하는 중첩된 투과성 지지 장치를 기재한다. 상기 제1 웰은 하부를 가지며, 여기서 상기 하부의 적어도 일부는 제1 다공성 막에 의해 형성된다. 상기 제2 웰은 하부를 가지며, 여기서 상기 하부의 적어도 일부는 제2 다공성 막에 의해 형성된다. 제1 또는 제2 투과성 지지체의 일부는 아치 형태를 포함할 수 있다. 상기 제2 웰 및 제2 투과성 지지체는 제1 웰 및 제1 투과성 지지체 아래에 위치된다. 상기 제3 웰은 제2 웰 및 제2 투과성 지지체 아래에 위치된 비-액체 투과성의, 기체 투과성 하부 부를 갖는다.
다른 구체 예에서, 본 개시는 제1 웰, 제2 웰 및 제3 웰을 포함하는 중첩된 투과성 지지 장치를 기재한다. 상기 제1 웰은 마이크로웰 어레이를 형성하는 기판을 갖고, 이의 하부는 다공성 막이다. 상기 제2 웰은 마이크로웰 어레이를 형성하는 기판을 갖고, 이의 하부는 다공성 막이다. 상기 제3 웰은 마이크로웰 어레이를 형성하는 기판을 가지며, 이의 하부는 비-액체 투과성의, 기체 투과성 지지체이다. 상기 다공성 막 하부를 갖는 마이크로웰 어레이 기판을 갖는 제2 웰은 제1 다공성 막 하부를 갖는 마이크로웰 어레이 기판을 갖는 제1 웰 아래 및 비-액체 투과성의, 기체 투과성 하부를 갖는 마이크로웰 어레이 기판을 갖는 제3 웰 위에 위치된다.
본 개시의 주제의 부가적인 특색 (features) 및 이점은, 이하의 상세한 설명에서 서술될 것이고, 부분적으로는 그 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이며, 또는 이하 상세한 설명, 청구 범위뿐만 아니라 첨부된 도면을 포함하는, 여기에 기재된 바와 같은 본 개시의 주제를 실시함으로써 인식될 것이다.
전술한 배경기술 및 하기 상세한 설명은 본 개시의 주제의 구체 예를 제시하고, 및 청구된 바와 같은 본 개시의 주제의 본질 및 특성을 이해하기 위한 개요 또는 틀거리를 제공하도록 의도된 것으로 이해될 것이다. 수반되는 도면은 본 개시의 주제의 또 다른 이해를 제공하기 위해 포함되며, 본 명세서에 혼입되고, 본 명세서의 일부를 구성한다. 도면은 본 개시의 주제의 다양한 구체 예를 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 개시의 주제의 원리 및 작동을 설명하는 역할을 한다. 부가적으로, 도면 및 상세한 설명은 단지 예시적인 것을 의미하며, 어떠한 방식으로도 청구 범위의 범주를 한정하는 것은 아니다.
본 개시의 특정 구체 예의 하기 상세한 설명은, 유사한 구조가 동일한 참조 번호로 표시되는, 하기 도면들과 관련하여 판독하는 경우 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1a-c는 세포가 회전 타원체를 형성하도록 배양될 수 있는 세포 배양 인서트의 구체 예의 개략도이다.
도 2a 및 2b는 세포가 회전 타원체를 형성하도록 배양될 수 있는 세포 배양 인서트의 일부의 구체 예의 개략도이다.
도 3에서, 도 3a는 세포가 배양되어 하나 이상의 회전 타원체를 형성할 수 있는 세포 배양 인서트의 구체 예의 개략도 (측면도)를 나타내고; 도 3b는 세포 배양 인서트의 제2 단부에 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판의 구체 예이며; 도 3c는 세포가 배양되어 하나 이상의 회전 타원체를 형성할 수 있는 세포 배양 인서트의 제2 단부의 개략도 (평면도)이고; 도 3d는 세포가 배양되어 하나 이상의 회전 타원체를 형성할 수 있는 세포 배양 인서트의 제2 단부를 형성하는 다공성 막을 갖는 하부를 갖는 기판상에 마이크로웰의 어레이의 개략도 (확대 측면도)이다.
도 4a-b는 세포가 배양되어 하나 이상의 회전 타원체를 형성할 수 있는 중첩된 세포 배양 인서트의 몇몇 구체 예의 개략도이다.
도 5a-b는 웰 하부를 형성하는 임의의 또는 모든 세포 배양 기판상에 하나 이상의 회전 타원체를 형성하도록 세포가 배양될 수 있는 중첩된 세포 배양 인서트의 몇몇 구체 예의 개략도이다.
언급은 본 개시의 주제의 다양한 구체 예에 대해 더 상세하게 이루어질 것이며, 이의 몇몇 구체 예는 수반되는 도면에 예시된다. 도면에서 사용된 유사한 번호는 유사한 구성요소, 단계 및 이와 유사한 것을 나타낸다. 그러나, 주어진 도면에서 구성요소를 나타내기 위한 번호의 사용은 동일한 번호로 표지된 다른 도면에서 구성요소를 제한하려는 의도가 아니라는 것을 이해할 것이다. 부가적으로, 구성요소를 나타내기 위한 다른 수의 사용은, 다른 번호의 구성요소가 다른 번호의 구성요소와 동일하거나 또는 유사할 수 없음을 나타내도록 의도된 것은 아니다.
본 개시는, 여러 중에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 및 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 사용하는 방법을 기재한다. 몇몇 구체 예에서, 상기 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는 세포 배양 장치에 함유될 것이다. 몇몇 구체 예에서, 상기 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는, 또 다른 세포 배양 인서트 또는 또 다른 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트에 놓일 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 상기 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는, 또 다른 세포 배양 인서트 또는 또 다른 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 함유할 수 있다. 다양한 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 사용하는 방법은 새로운 화학적 엔티티 (NCE) 또는 새로운 생물학적 엔티티 (NBE)를 시험하기 위한 실험을 수행하는 단계를 포함한다.
중첩된 투과성 지지 장치를 포함하는 세포 배양 기구 또는 장치는, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 갖도록 개조될 수 있다. 이러한 세포 배양 기구 또는 장치의 예로는 TRANSWELL® 투과성 지지체 (Corning, Inc.) 및 MILLICELL® 세포 배양 인서트 (EMD Millipore)뿐만 아니라 미국 특허 제8,163,537호에 기재된 세포 배양 제품 및 방법을 포함하며, 이들은, 여기에 제시된 내용과 상충되지 않는 범위 내에서 그 전체가 참조로서 혼입된다.
이하, 도 1a-c를 참조하면, 세포 배양 장치 (500)의 구체 예의 개략적인 측면도는 도시된다. 장치 (500)는 인서트 (100) 내의 세포가 서로 결합되고 회전 타원체 (200)를 형성하도록 세포에 비-부착성인 하나 이상의 측벽 (110)을 갖는 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)를 포함한다. 구체 예에서, 상기 인서트는 멀티웰 (multiwell) 세포 배양 플레이트의 저장조 또는 웰 (150) 내부에 끼워진다. 몇몇 구체 예에서, 하나 이상의 측벽 (110)은 벽을 세포에 비-부착성으로 만들기 위해 초-저 결합 물질로 코팅될 수 있다. 비-부착성 물질의 예로는 퍼플루오르화 중합체, 올레핀, 또는 이와 유사한 중합체 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 예로는 아가로스, 폴리아크릴아미드와 같은 비-이온성 히드로겔, 또는 폴리에틸렌옥사이드와 같은 폴리에테르 또는 폴리비닐알코올과 같은 폴리올 또는 이와 유사한 물질 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
회전 타원-촉진 세포 배양 인서트 (100)의 하나 이상의 측벽 (110)은 경사져 있는 부분 (115)을 포함한다. 몇몇 구체 예에서, 하나 이상의 측벽은 전체 길이를 따라 경사질 수 있다. 다른 구체 예에서, 하나 이상의 측벽의 일부만이 경사진다.
하나 이상의 측벽 (110) 및 회전 타원-촉진 세포 배양 인서트 (100)의 다른 구성요소 (components)는 임의의 적합한 물질로 형성될 수 있다. 바람직하게는, 세포 또는 배양 배지와 접촉하도록 의도된 물질은 세포 및 배지와 양립할 수 있다. 통상적으로, 세포 배양 구성요소는 중합체 물질로 형성된다. 적합한 중합체 물질의 예로는 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리스티렌 공중합체, 플루오로중합체, 폴리 에스테르, 폴리아미드, 폴리스티렌 부타디엔 공중합체, 완전 수소화 스티렌 중합체, 폴리카보네이트 PDMS 공중합체, 및 폴리올레핀, 예컨대, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메틸펜텐, 폴리프로필렌 공중합체 및 환상 올레핀 공중합체, 및 이와 유사한 것을 포함한다.
상기 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)는, 제1 개방 단부 (101) 및 제2 단부 (102)를 갖는 본체를 포함하며, 여기서 상기 단부 (102)는 개구를 한정한다. 다공성 막 (120)은 제2 단부의 개구를 피복할 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 상기 다공성 막 (120)은 세포에 부착성일 수 있다. 다른 구체 예에서, 상기 다공성 막 (120), 또는 이의 일부는 세포 (200)에 비-부착성일 수 있다.
이하, 도 2a 및 도 2b을 참조하면, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)의 본체의 제2 단부 (102)의 개구는 다양한 형상을 가질 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 상기 개구는 원형 또는 타원형을 형성한다. 다른 구체 예에서, 상기 개구는 직사각형 또는 다른 사변형을 한정한다. 몇몇 구체 예에서, 제2 단부의 개구는 100㎛ 내지 1000㎛의 범위에서 정사각형 또는 직사각형, 또는 이와 유사한 것의 직경, 폭, 대각선 등과 같은 직경 치수 (d1)를 갖는다. 구체적으로, 제2 단부의 개구부는, 100㎛, 150㎛, 200㎛, 250㎛, 300㎛, 350㎛, 400㎛, 450㎛, 500㎛, 550㎛, 600㎛, 650㎛, 700㎛, 750㎛, 800㎛, 850㎛, 900㎛, 950㎛ 또는 1000㎛, 및 100㎛ 내지 1000㎛의 범위 내에 포괄된 임의의 치수의 직경 치수 (d1)을 가질 수 있다.
다공성 막 (120)은 다양한 형상을 가질 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 다공성 막 (120)은 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)의 본체의 제2 단부의 개구를 완전히 피복한다. 몇몇 구체 예에서, 상기 다공성 막은 아치 형태 또는 곡면 형태일 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체 촉진 세포 배양 인서트의 본체의 제2 단부는 하부를 형성하는 다공성 막을 갖는 마이크로웰 어레이로 구성된다.
상기 다공성 막은 트랙-에칭된 막 (track-etched membrane) 또는 직조 또는 비-직조된 다공성 물질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다양한 다른 물질로 제조될 수 있다. 상기 다공성 막의 물질은 세포에 좀 더 부착성 또는 비-부착성이도록 처리되거나 또는 코팅될 수 있다. 처리는 플라스마 방전 (plasma discharge), 코로나 방전, 가스 플라스마 방전, 이온 폭격, 이온화 방사선 및 고강도 UV 광을 포함하는 당 업계에 공지된 임의의 수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 코팅은 인쇄, 분무, 응축, 복사 에너지, 이온화 기술 또는 딥핑 (dipping)를 포함하는 당 업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 도입될 수 있다. 상기 코팅은 그 다음 공유 또는 비-공유 부착 부위를 제공할 수 있다. 이러한 부위는, 세포 배양 성분 (예를 들어, 성장 또는 부착을 촉진하는 단백질)과 같은, 모이어티 (moieties)를 부착시키는데 사용될 수 있다. 더욱이, 상기 코팅은 또한 세포 (예를 들어, 폴리라이신)의 부착을 향상시키는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 전술한 바와 같은 세포 비-부착성 코팅은 세포 결합을 방지 또는 억제하기 위해 사용될 수 있다.
구체 예에서, 다공성 막은 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판일 수 있다.
몇몇 구체 예에서, 세포 (200)에 의해 형성된 회전 타원체는 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트의 다공성 막 (120)을 패색시킨다 (occludes) (예를 들어, 도 1a 참조). 몇몇 관점에서, 이 폐색 (occlusion)은 단백질, 작은 분자, 및/또는 배지가 회전 타원체를 돌아 통과하는 것을 방지한다.
예를 들어, 비-부착성 측벽, 기하학 구조 및 중력의 조합은, 인서트에서 배양된 세포의 성장이 제한되는 제한 부피 (confinement volume)를 한정할 수 있다. 구체 예에서, 이러한 조합은 인서트에서 배양된 세포에 의해 회전 타원체의 형성을 촉진시킬 수 있다. 상기 제한 부피는 제2 단부에 근접한 하나 이상의 측벽 부분 및 제2 개구의 폭 또는 대각선에 의해 한정될 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 제2 단부에 근접한 하나 이상의 측벽의 부분 (d2)은 500㎛, 450㎛, 400㎛, 350㎛, 300㎛, 250㎛, 200㎛, 150㎛ 또는 100㎛ 또는 이들 사이의 임의의 길이이다. 몇몇 구체 예에서, 제한 부피는 제2 개구의 하부를 형성하는 다공성 막을 갖는 마이크로웰 어레이 기판의 웰에 의해 한정된다. 이 경우, 상기 제2 개구는 상기 제1 개구의 크기를 상기 제한 부피를 포함하는 마이크로웰 어레이 기판의 웰에 가깝게 하고, 및 500㎛, 450㎛, 400㎛, 350㎛, 300㎛, 250㎛, 200㎛, 150㎛ 또는 100㎛ 또는 이들 사이의 임의의 길이의 직경 (d1)를 갖는다.
다시, 도 1c을 참조하면, 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는 제1 개방 단부의 둘레 주위로 연장되는 릿지 (130)를 더욱 포함할 수 있으며, 여기서 상기 릿지 (130)는, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)가 저장소 (150) 내부에 위치되는 경우, 이를 지지하도록 크기가 정해진다. 몇몇 구체 예에서, 저장소 (150)의 적어도 일부는 가스 투과성이다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 회전 타원체 (200)는 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)에서 성장할 수 있고, 이의 일부는 다공성 막 (120)을 포함할 수 있다. 상기 다공성 막 (120) 및 하부 측벽 (110) 중 하나 또는 모두는 세포에 비-부착성일 수 있다. 측벽 (110)의 기울기는 접종된 세포 (seeded cells: 200)가 다공성 막 (120) 상에 응집되도록 돕는다. 중력, 초-저 결합 물질, 세포 배양 인서트의 측벽 기하학, 및 다공성 막의 아치 형태 중 하나 이상은 회전 타원체의 형성을 용이하게 한다. 부가적으로, 구체 예에서, 상기 다공성 막은, 구조화되고 배열된 마이크로웰의 어레이를 함유할 수 있어 회전 타원체를 형성한다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 회전 타원체는 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)에서 성장할 수 있으며, 이의 일부는 다공성 막 (120)이다. 상기 다공성 막 (120) 및 하부 측벽 (110)은 세포에 비-부착성일 수 있다. 상기 측벽 (110)의 기울기는, 접종된 세포가 다공성 막 (120) 상에 응집되거나 또는 폐색되도록 돕는다. 중력, 초-저 결합 물질, 세포 배양 인서트의 측벽 기하학, 및 다공성 막 (120) 주변의 제한 부피 중 하나 이상은, 회전 타원체의 형성을 용이하게 할 수 있다. 상기 회전 타원체의 크기는 제한 부피에 의해 제한될 수 있다. 구체 예에서, 인서트의 제2 단부는, 회전 타원체 형성을 촉진하는 제한 부피인, 회전 타원체 제한 부피를 제공하는 형상을 가질 수 있다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)은 제1 개방 단부 (101) 및 제2 단부 (102), 및 상기 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽 (110)을 가질 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 상기 측벽은 경사져 있다. 하나의 관점에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)의 제2 단부는 다수의 회전 타원체-촉진 웰 (400)을 함유하며, 여기서 각 회전 타원체-촉진 웰은 측벽 (410)을 가질 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 상기 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)는 세포에 비-부착성인 하나 이상의 측벽 (110)을 가질 수 있다.
몇몇 구체 예에서, 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판은, 육방 밀집 웰 구조 (hexagonal close-packed well structures)로 구성된다. 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 이러한 기판의 구체 예의 이미지는, 육각형 모양의 웰 (400)을 나타내는, 도 3b에 나타낸다. 도 3c는 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판의 구체 예의 평면도를 나타내는 개략도이다. 몇몇 바람직한 구체 예에서, 각 웰 (400) 내에서 배양된 세포는 단일 회전 타원체 (200)를 형성한다.
도 3d에 나타낸 바와 같이, 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)의 웰 (400)은 상부 개구 및 천저 (nadir), 또는 저점 또는 표면을 한정하는 내부 표면을 갖는다. 상기 상부 개구에서, 웰은 100㎛ 내지 1000㎛ 범위에서 정사각형 또는 직사각형, 또는 이와 유사한 것의 직경, 폭, 대각선 등과 같은, 직경 치수 (d3)를 갖는다. 구체적으로, 웰은 100㎛, 150㎛, 200㎛, 250㎛, 300㎛, 350㎛, 400㎛, 450㎛, 500㎛, 550㎛, 600㎛, 650㎛, 700㎛, 750㎛, 800㎛, 850㎛, 900㎛, 950㎛ 또는 1000㎛, 및 100㎛ 내지 1000㎛ 범위 내에 포괄된 임의의 치수의 직경 치수 (d3)을 가질 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 상기 웰 (400)의 깊이 (d4)는 1000㎛, 500㎛, 450㎛, 400㎛, 350㎛, 300㎛, 250㎛, 200㎛, 150㎛ 또는 100㎛, 또는 100㎛ 내지 1000㎛ 범위 내에 포괄된 임의의 치수이다.
몇몇 구체 예에서, 마이크로웰 (410)의 하부를 형성하는 다공성 지지체를 갖는 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판은 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)의 제2 단부를 피복한다. 몇몇 구체 예에서, 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판의 적어도 일부는, 세포에 비-부착성이다. 몇몇 구체 예에서, 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판의 적어도 일부는 세포에 부착성이다. 몇몇 구체 예에서, 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판의 일부는 다공성이다. 또 다른 구체 예에서, 웰 (400)을 형성하는 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판의 일부는은 개구를 포함한다. 몇몇 구체 예에서, 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판은 다공성 막 (420)에 점착되거나, 다공성 막에 부착되거나, 또는 다공성 막과 병치될 수 있다. 하나의 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)의 제2 단부는 다공성 막 (420)에 의해 피복되고, 상기 다공성 막은 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판을 한정한다.
몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)의 웰 (400)을 형성하는 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판의 적어도 일부는, 경사져 있다. 몇몇 구체 예에서, 웰 (400)을 형성하는 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판은 웰의 전체 깊이를 따라 경사질 수 있다.
여기에 기재된 바와 같은 구조화된 하부 표면은, 임의의 적절한 방식으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 기판은 마이크로웰의 어레이 (410)를 갖는 기판을 형성하기 위해 주조 (coined), 사출 성형 또는 엠보싱될 수 있다. 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판을 형성하기 위해 다공성 물질 또는 가스 투과성 물질은 주조, 사출 성형 또는 엠보싱될 수 있다.
이하, 도 4a-b를 참조하면, 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)는 중첩된 투과성 지지 장치 (600)에 사용될 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)는 또 다른 세포 배양 인서트 또는 장치 또는 또 다른 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트에 놓일 수 있다. 하나의 관점에서, 둘 또는 셋 이상의 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)는 중첩될 수 있다. 또 다른 관점에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (100)는, 또 다른 세포 배양 인서트에 놓일 수 있거나 또는 그 안에 놓인 또 다른 세포 배양 인서트를 가질 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는, 제1 개방 단부의 둘레 주위로 연장되는 릿지를 더욱 포함할 수 있으며, 여기서 상기 릿지는, 저장조 또는 또 다른 세포 배양 인서트 내에 위치되는 경우, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를지지하도록 크기가 결정된다. 세포 배양 분야의 당업자는 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 및 다른 세포 배양 인서트의 임의의 조합이 구성될 수 있음을 인식할 것이다. 각 세포 배양 인서트는 다공성 막 (120)을 가질 수 있거나 또는 기체 투과성 일 수 있다. 하나의 구체 예에서, 최하층 세포 배양 인서트 또는 저장조는 가스-투과성이며, 최상층 세포 인서트는 다공성 막 (120)을 갖는다.
예를 들어, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 중첩된 장치는, 상부 (100) 및 중간 (101) 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 포함할 수 있다. 상기 상부 (100) 및 중간 (101) 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는 천저에 다공성 막 (120)을 가질 수 있다. 구체 예에서, 다공성 막은 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판이다. 상기 중첩된 장치는 투과성 지지체를 갖지 않는 회전 타원체-촉진 세포 배양 저장조 (102)를 더욱 포함할 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 상기 회전 타원체-촉진 세포 배양 저장소 (102)는 가스 투과성 물질로 제조되거나 또는 그 일부를 포함할 수 있다. 구체 예에서, 상기 가스 투과성 물질은 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판이다.
도 4b에 나타낸 구체 예에 나타낸 바와 같이, 오직 중간 세포 배양 인서트 (101)가 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트일 수 있지만, 최상층 세포 배양 인서트 (300) 및 중간 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (101)는 모두 다공성 막 (120)을 갖는다. 최하층 장치는 저장조 (151)일 수 있다. 하나의 구체 예에서, 상기 저장조 (151)는 기체-투과성일 수 있다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 중간 세포 배양 인서트는, 다중 회전 타원체-촉진 다공성 웰 (400)을 함유하는 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)일 수 있다. 최상층 세포 배양 인서트 (300)은 다공성 막 (120)을 가질 수 있다. 상기 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)는, 저장조 (151)에 삽입되거나 또는 중첩될 수 있다. 하나의 구체 예에서, 저장조 (151)는 기체-투과성일 수 있다. 다수의 회전 타원체-촉진 웰 (400)을 함유하는 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트 (105)의 사용은, (도 4a 및 b에 도시된 것들과 같은) 2D 세포 시트을 배양하고, 및 또한 신호 증폭을 위한 더 많은 회전 타원체 및 세포 처리 속도를 제공할 수 있어, 시험 시스템의 병목현상을 방지하는, 평평한 하부 인서트로 더 기밀하게 중첩되는 것을 가능하게 한다. 도 5b는 비-액체 투과성의, 기체 투과성 하부를 갖는 회전 타원체-촉진 저장조 (151)에 다공성 막 하부 (120)을 갖는 제1 (105) 및 제2 (106) 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트를 갖는 장치의 구체 예를 나타낸다. 더 큰 신호 증폭을 제공하는 것 외에도, 회전 타원체의 더 많은 생리학적 기능성은 동물 시험을 대체에 더 가까워 질 수 있다. 기술분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 회전 타원체 촉진을 위한 마이크로웰의 어레이를 가지거나 또는 갖지 않는, 또는 가스 투과성이거나 또는 투과성이 아닌, 기판을 갖는, 다공성 막을 갖거나 또는 갖지 않는, 세포 배양 지지체의 임의의 조합은, 원하는 세포 배양 환경에 의존하여 가능하다.
몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는, NCE로 알려진 화합물 또는 분자가 원하는 생물학적 활성을 갖는지 여부를 결정하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제8,163,537호에 기재되어 있다. 이러한 방법은 종종 NCE의 흡수, 분포, 대사, 배설, 및 독성 (ADME-Tox)을 검사할뿐만 아니라 약동학적 (pharmacokinetic) 파라미터를 포함하는 표적 치료 지표에 대한 유효성의 NCE의 수준을 결정하는데 수반된다. 하나의 타입의 평가는 "1차 통과 효과 (first pass effect)"를 검사한다. 이 평가는 NCE가 소화관을 통해 흡수된 후, 그 다음 간에서 대사되는 NCE의 생체이용률 (bioavailability)에 대한 실험적 결정을 포함한다. 일반적으로, "1차 통과 효과"의 평가는, 장 투과성 및 간장 신진대사를 결정하기 위해, 2가지 개별의 시험 관내 분석을 수행하고 데이터를 조합해야 한다. 원하는 경우, 표적 선택성, 효능 및 투여량을 결정하기 위해 부가적인 연구는 수행될 수 있다 (Lau et al., Drug Metabolism and Disposition, Vol.32, No.9, pp.937-942, 2004).
NCE의 장 흡수를 검사하기 위해 오늘날 사용되는 잘 알려진 방법은, Transwell™이라는 상표명으로 판매되고 코닝사 (Corning Inc.)에 의해 제조된 것과 같은 투과성 지지체상에서 통상적으로 수행된 Caco 2 세포-기반 분석으로 알려져 있다. ("Transwell® Permeable Supports: Including Snapwell™ and Netwell™ Inserts―Instructions for Use" Corning Inc., September 2007.) Transwell™ 투과성 지지체의 디자인은, Caco 2 세포 분극 (cell polarization)의 개발이 용이하여 생체 내에 가까운 시험 조건을 생성한다. Schering-Plough Research Institute의 연구원은 Transwell™ 투과성 지지체를 수신하는 Transwell™ 리시버 플레이트 (receiver plate)에 영양 배지에 간세포를 첨가하여 Caco 2 세포-기반 분석의 유용성을 확장한다. 이 방식으로, 연구원은 NCE의 경구 생체이용률을 좀 더 정확히 예측할 수 있었다. 그러나, 3시간 배양기간 동안 이러한 조건하에서 간세포 생존율은, 이 방법의 가능성을 제한하는, 단지 50-70%이다 (Lau 등의, Drug Metabolism and Disposition, Vol.32, No. 9, pp.937 -942, 2004). 도쿄 대학교 (Tokyo University)의 또 다른 연구자의 그룹은 Transwell™ 리시버 플레이트의 내부 표면에서 성장하는 Hep G2 세포의 단층으로 Transwell™ 투과성 지지체 상에서 Caco-2 세포를 공동 배양했다. 일부 분석에 유용하지만, Hep G2 세포는 생체 내 간세포를 대표하는 기능을 유지하지 못한다 (Choi 등, Toxicology in Vitro, 18 권, 393-402 페이지).
1차 통과 분석과 같은 약물 상호작용 연구에 관한 현재 미국 식품의약국 (Food and Drug Administration) 지침에서는, 종 특이적 반응 (species specific responses)으로 인해 신선하거나 또는 냉동보존된 인간 간세포로 시험관 내 분석의 사용을 권장한다. (U.S. Department of Health and Human Services et al. "Guidance for Industry: Drug Interaction Studies-Study, Design, Data Analysis, and Implications for Dosing and Labeling", Clinical Pharmacology, September 2006.) 그러나, 이것은 주된 간세포가 조직 배양 처리된 폴리스티렌에 대한 표준 세포 배양 조건에서 빠르게 분화된 기능을 느슨하게 하는 것으로 잘 알려져 있다. 정상 분화된 간세포 기능의 상실은 생체 내 유사 조건을 감소시키고, 및 그러므로 또한 ADME-Tox 및 약동학적 시험 관내 분석에서 실험 데이터의 관련성 또한 감소시킨다.
여기에 개시된 방법의 몇몇 구체 예에서, Caco 2 세포-기반 분석에 사용된 간세포 또는 Hep G2 세포는 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트에서 배양된다.
몇몇 구체 예에서, 본 개시는 중첩된 투과성 지지 장치 및 상기 중첩된 투과성 지지 장치를 새로운 치료 화합물, NBEs 또는 NCEs를 시험하기 위한 다양한 실험을 수행하기 위해 사용하는 방법에 관한 것이다.
몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는 시스템-유사 통신 정보를 평가하는데 사용될 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체-촉진 세포 배양 인서트는 일련의 인간 장기를 수직 배향으로 나타내는 세포 모델을 생성하는데 사용될 수 있다.
하나의 관점에서, 상기 중첩된 투과성 지지 장치는 소화관으로부터의 흡수 및 간에 의한 대사 후에 NCE 또는 NBE의 생체이용률을 결정하기 위한 1차 통과 분석을 형성하는데 사용된다.
하나의 구체 예에서, 중첩된 투과성 지지 장치 (600)는 소화관을 통한 흡수 및 간에 의한 대사 후에 NCE의 생체이용률을 결정하기 위한 1차 통과 분석을 수행하는데 사용될 수 있다. 또 다른 구체 예에서, 상기 중첩된 투과성 지지 장치 (600)는 소화관을 통한 흡수 및 간에 의한 대사 후에 NBE의 생체이용률을 결정하기 위한 1차 통과 분석을 수행하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 도 5a에 나타낸 구체 예를 사용하는 연구원은, 성장하고 있는 저장소 (growing reservoir)에 배지를 놓은 다음, 성장하고 있는 저장소에 최상층 인서트 (300)를 놓을 수 있다. 상기 최상층 인서트 (300)는 그 다음 배지 내에 다량의 Caco 2 세포로 채워진다. 최상층 인서트 (300) 및 성장하고 있는 저장조는, 최상층 인서트 (300)의 투과성 지지체를 가로질러 Caco 2 세포의 융합성 단층 (confluent monolayer)이 형성될 때까지 연통한다. 통상 Caco 2 세포가 최상층 인서트 (300)의 투과성 지지체를 가로 질러 형성되기까지 약 한 달이 소요된다. Caco 2 세포는 전기적으로 시험되어 상피통과 전기 저항 (Trans Epithelial Electrical Resistance: TEER) 시험을 수행하여 Caco 2 세포가 또 다른 세포에 얼마나 단단하게 부착되었는지를 결정할 수 있고, 여기서 프로브 (probe)는 최상층 인서트 (300)에 삽입되고, 그 다음 프로브는 투과성 지지체 아래의 성장하고 있는 저장조에 위치된 또 다른 프로브에 의해 검출된 펄스를 시작한다. 수행될 수 있는 또 다른 시험은, Caco 2 세포 단층 내에 틈새를 통해 통과할 수 있는, 루시퍼 엘로우 (Lucifer yellow)라고 불리는 염료를 사용한다. 최상층 인서트 (300)에 도입된 후에 성장하고 있는 저장소에 나타나는 루시퍼 엘로우가 많을수록 Caco 2 세포의 단층은 덜 성숙 (또는 융합)한 것이다. 이와 같은 시험은 Caco 2 세포 배양이 예상대로 작용하는지 확인하기 위해 수행될 수 있다.
이와 동시에, 연구원은 또 다른 성장하고 있는 저장고에 배지를 놓은 다음, 이 성장하고 있는 저장고에 중간 인서트 (105)를 놓을 수 있다. 상기 중간 인서트 (105)는 그 다음 배지에 다량의 간세포로 채워진다. 상기 중간 인서트 (105) 및 저장조는 간세포의 회전 타원체가 제2 투과성 지지체를 가로질러 형성될 때까지 연통한다. 간세포가 적절하게 작용하는지를 확인하기 위해 시험은 또한 수행될 수 있다. 선택적으로, Caco 2 세포 및 간세포를 성장시키기 위해 최상층 인서트 (300) 및 중간 인서트 (105)는 저장소 (151)에 놓일 수 있다.
Caco 2 세포와 간세포가 배양되면, 최상층 및 중간 인서트 (300 및 105)는 이들의 각각의 성장하고 있는 저장고의 밖으로 들어 올려질 것이다. 상기 중간 인서트 (105)는 배지를 함유하는 저장조 (151)에 배치 (중첩)될 것이다. 약간의 배지는, 그 다음, 중간 인서트 (105) 내에 위치된 간세포 층 위에 놓일 것이다. 그 다음, 최상층 인서트 (300)는 중간 인서트 (105)에 놓일 (중첩된) 것이다. NCE/NBE 및 배지는 상기 최상층 인서트 (300) 내에 위치된 Caco 2 세포들의 층 위에 분배될 것이다. 배양의 기간 후에, NCE/NBE가 장 상피 (Caco 2 세포)를 통해 통과하였는지 여부를 결정하기 위해, 최상층 인서트 (300)는 제거될 수 있고, 중간 인서트 (105) 내에 배지는 시험될 수 있다 (즉, LS/MS). NCE/NBE가 Caco 2 세포를 통해 통과한 경우, 그 다음 중간 인서트 (105)는 제거될 수 있고, 저장조 (151) 내에 배지는 시험될 수 있어 (즉, LC/MS), NCE의 생체이용률을 확인하고 및/또는 NCE/NBE가 간 (간세포)에 의해 대사되어 대사 산물을 어떻게 형성하는지를 확인한다. 간세포는 또한 NCE/NBE가 적용된 투여량에서 독성인지를 보여줄 수 있다. 저장조 (151)의 하부에 표적 세포 (또는 분자)가 있는 경우, 그 다음 이들은 검사될 수 있어 (즉, LC/MS), 현미경으로, 또는 인서트 (300 및 105)를 뽑아서 간세포 및 Caco 2 세포와 별개인 분석을 사용하여, 약물 효과를 결정한다. 선택적으로, 예를 들어, 미국 특허 제8,163,537호에 개시된 바와 같은 기능 및 생존력을 평가하기 위해 질의 시스템 (interrogation system)을 사용하여 저장조 (151)의 하부 상에 표적 세포 (또는 분자)는 검사될 수 있다. 이와 같은 분석은, 1) NCE/NBE가 장 상피를 통해 통과할 수 있는지 여부, 2) 간이 대사하거나 또는 NCE/NBE에 의해 손상되었는지 여부; 및 3) 비변형된 또는 간-대사된 NCE/NBE의 표적 세포에 대한 영향의 이해를 가능하게 할 것이다.
또 다른 구체 예에서, 중첩된 투과성 지지 장치 (100)는 소화관을 통해 통과하지 않고, 대신에 흡입을 통해 신체로 들어가는 NCE를 시험하는데 사용될 수 있으며, 이 경우 Caco 2 세포는, 비강 점막 세포, 기관지 세포 또는 폐 상피 세포 등으로 대체될 것이다. 실제로, 연구원은 중첩된 투과성 지지 장치 (600)에 사용되는 실제 세포를 통상적으로 선택한다.
몇몇 구체 예에서, 특히 다수의 웰이 제2 단부에 제공되거나 또는 중첩된 지지체가 사용되는 경우, 다수의 회전 타원체는 성장될 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체는 모두 동일하다. 다른 구체 예에서, 둘 이상의 다른 타입의 회전 타원체는 사용된다 (예를 들어, 기관의 다세포 기능성을 모의 실험하거나 또는 재구성하기 위한 공동-배양 시스템). 세포가 이미지화되거나 또는 세포로부터 생성된 신호가 검출되는 경우, 복수의 세포로부터의 응답은 동시에 분석될 수 있거나, 또는 세포의 그룹 또는 개별 세포로부터의 결과는, 원하는 대로, 공유된다.
회전 타원체와 같은 3-차원으로 배양된 세포는, 단층의 2차원으로 배양된 이들의 대조군보다 오히려 생체 내에 가까운 기능성을 나타낼 수 있다. 2차원 세포 배양 시스템에서, 세포는 이들이 배양되는 기판에 부착될 수 있다. 그러나, 세포가 회전 타원체와 같은, 3-차원으로 성장하는 경우, 세포는 기판에 부착하는 것이 아니라 서로 상호 작용한다. 3-차원으로 배양된 세포는 세포 간 통신 및 세포 외 매트릭스 (matrices)의 발달의 측면에서 생체 내 조직과 좀 더 유사하다. 따라서, 회전 타원체는 세포 이동, 분화, 생존 및 성장을 위한 우수한 모델을 제공하며, 따라서 연구, 진단, 및 약물 효능, 약리학, 및 독성 시험을 위한 더 우수한 시스템을 제공한다.
몇몇 구체 예에서, 상기 장치는 장치에서 배양된 세포가 회전 타원체를 형성하도록 구성된다. 예를 들어, 세포가 성장한 웰은 웰 내에 세포가 서로 결합하여 구체를 형성하도록 세포에 비-부착성일 수 있다. 회전 타원체는 웰의 기하학에 의해 부과된 제한으로 크기를 변경하도록 확장된다. 몇몇 구체 예에서, 웰은 웰을 세포에 비-부착성으로 만드는 초-저 결합 물질로 코팅된다.
비-부착성 물질의 예로는 퍼플루오르화 중합체, 올레핀, 또는 이와 유사한 중합체 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 예로는 아가로스, 폴리아크릴아미드와 같은 비-이온성 하이드로겔, 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 폴리에테르 및 폴리비닐알코올과 같은 폴리올, 또는 이와 유사한 물질 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 비-부착성 웰, 웰 기하학 (예를 들어, 크기 및 형상), 및/또는 중력의 조합은, 웰에서 배양된 세포가 회전 타원체로 자기-조립 (self-assemble)되도록 유도한다. 몇몇 회전 타원체는, 단층에서 성장한 세포와 비교하여, 오히려 생체 내에 가까운 반응을 나타내는 분화된 세포 기능을 유지한다. 간엽 간질 세포 (mesenchymal stromal cells)와 같은, 다른 세포 타입은, 회전 타원체로 배양된 경우, 그들의 전분화능 (pluripotency)을 보유한다.
몇몇 구체 예에서, 여기에서의 시스템, 장치 및 방법은, 하나 이상의 세포를 포함한다. 몇몇 구체 예에서, 상기 세포는 냉동보존된다. 몇몇 구체 예에서, 세포는 3-차원 배양액이다. 몇몇 이러한 구체 예에서, 시스템, 장치 및 방법은, 하나 이상의 회전 타원체를 포함한다. 몇몇 구체 예에서, 하나 이상의 세포는 활동적으로 분열한다. 몇몇 구체 예에서, 시스템, 장치 및 방법은, 배양 배지 (예를 들어, 영양소 (예를 들어, 단백질, 펩타이드, 아미노산), 에너지 (예를 들어, 탄수화물), 필수 금속 및 무기물 (예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 철, 인산염, 황산염), 완충제 (예를 들어, 인산염, 초산염), pH 변화에 대한 표시기 (예를 들어, 페놀 레드, 브로모-크레졸 퍼플), 선택 제제 (예를 들어, 화학제, 항균제), 등)를 포함한다. 몇몇 구체 예에서, 하나 이상의 시험 화합물 (예를 들어, 약물)은 시스템, 장치 및 방법에 포함된다.
다양한 종류의 세포는 배양될 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체는 단일 세포 타입을 함유한다. 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체는 하나 이상의 세포 타입을 함유한다. 하나 이상의 회전 타원체가 성장되는 몇몇 구체 예에서, 각 회전 타원체는 동일한 타입이지만, 다른 구체 예에서, 둘 이상의 다른 타입의 회전 타원체는 성장된다. 회전 타원체에서 성장한 세포는 천연 세포 또는 변경된 세포 (예를 들어, 하나 이상의 변성 유전자 변경을 포함하는 세포)일 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 세포는 체세포이다. 몇몇 구체 예에서, 세포는 임의의 원하는 분화 상태 (예를 들어, 전분화능, 다-분화능 (multi-potent), 운명 결정 (fate determined), 불멸화 (immortalized), 등)의 줄기세포 또는 전구 세포 (예를 들어, 배아 줄기세포, 유도된 전분화능 줄기세포)이다. 몇몇 구체 예에서, 세포는 질병 세포 또는 질병 모델 세포 (disease model cell)이다. 예를 들어, 몇몇 구체 예에서, 회전 타원체는 과-증식 상태 (예를 들어, 형질전환된 세포)로 유도될 수 있는, 하나 이상의 타입의 암세포 또는 세포들을 포함한다. 세포는, 부신, 방광, 혈관, 뼈, 골수, 뇌, 연골, 자궁 경부, 각막, 자궁 내막, 식도, 위장관, 면역계 (예를 들어, T 림프구, B 림프구, 백혈구, 대식세포 및 수지상 세포), 간, 폐, 임파선, 근육 (예를 들어, 심장 근육), 신경, 난소, 췌장 (예를 들어, 섬 세포), 뇌하수체, 전립선, 신장, 타액, 피부, 힘줄, 고환 및 갑상선을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 임의의 원하는 조직 또는 기관 타입으로부터 유래 또는 형성될 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 세포는 포유류 세포 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 닭, 염소, 말, 등)이다.
배양된 세포는 다양한 연구, 진단, 약물 스크린 및 시험, 치료, 및 산업적 적용에서 사용된다.
몇몇 구체 예에서, 세포는 단백질 또는 바이러스의 생산을 위해 사용된다. 병렬로 다수의 회전 타원체를 배양하는 시스템, 장치 및 방법은, 단백질 생산에 특히 효과적이다. 3-차원 배양은 증가된 세포 밀도, 및 세포 성장 표면적의 제곱 센티미터당 더 높은 단백질 수율을 가능하게 한다. 백신 생산을 위한 임의의 원하는 단백질 또는 바이러스는, 세포에서 성장될 수 있고, 원하는 대로 사용하기 위해 분리되거나 정제될 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 단백질은 세포에 대한 비변성 단백질 (native protein)이다. 몇몇 구체 예에서, 단백질은 변성-단백질이다. 몇몇 구체 예에서, 단백질은 재조합으로 발현된다. 바람직하게는, 단백질은 변성-프로모터 (non-native promoter)를 사용하여 과발현된다. 단백질은 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 몇몇 구체 예에서, 정제 또는 검출 태그 (detection tag)는 이의 정제 및/또는 검출을 용이하게 하기 위해 관심의 단백질에 대한 융합 파트너 (fusion partner)로서 발현된다. 몇몇 구체 예에서, 융합체 (fusions)는 정제 이후에 융합 파트너의 분리를 가능하게 하기 위해 절단 가능한 링커 (cleavable linker)로 발현된다.
몇몇 구체 예에서, 단백질은 치료용 단백질이다. 이러한 단백질은, 결핍되거나 비정상적인 단백질 (예를 들어, 인슐린)을 대체하거나, 기존 경로 (예를 들어, 억제제 또는 작용제 (agonists))를 증가시키거나, 새로운 기능 또는 활성을 제공하거나, 분자 또는 유기체를 방해하거나, 또는 다른 화합물 또는 단백질 (예를 들어, 방사성 핵종, 세포독성 약물, 이펙터 단백질 (effector proteins), 등)을 전달하는, 단백질 및 펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 구체 예에서, 단백질은 임의의 타입 (예를 들어, 인간화, 이중-특이적, 다중-특이적, 등)의 항체 (예를 들어, 단일클론 항체)와 같은 면역글로불린이다. 치료적 단백질 카테고리는, 항체-기반 약물, Fc 융합 단백질, 항응고제, 항원, 혈액 요소, 뼈 형성 단백질 (bone morphogenetic proteins), 유전자 조작된 단백질 비계 (engineered protein scaffolds), 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터루킨, 및 혈전용해제를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료용 단백질은 암, 면역 장애, 대사 장애, 유전 질환, 감염, 및 기타 질병 및 질환을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
몇몇 구체 예에서, 단백질은 진단 단백질이다. 진단 단백질은, 항체, 친화성 결합 파트너 (예를 들어, 수용체-결합 리간드), 억제제, 길항제, 및 이와 유사한 것을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 구체 예에서, 진단 단백질은, 검출 가능한 모이어티 (moiety) (예를 들어, 형광 모이어티, 발광 모이어티 (예를 들어, 루시퍼라제), 비색 모이어티 (colorimetric moiety), 등)이거나 또는 발현된다.
몇몇 구체 예에서, 단백질은 산업용 단백질이다. 산업용 단백질은 식품 성분, 산업 효소, 농업 단백질, 분석 효소, 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
몇몇 구체 예에서, 세포는 약물 발견, 특성화 (characterization), 효능 시험, 및 독성 시험에 사용된다. 이러한 시험에는 약리학적 효과 평가, 발암성 평가, 의학 이미징 제제 특성 평가, 반감기 평가, 방사선 안전성 평가, 유전독성 시험, 면역독성 시험, 생식 및 발달 시험, 약물 상호작용 평가, 선량 평가, 흡착 평가, 소인 평가 (disposition assessment), 신진 대사 평가, 제거 연구 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 세포 타입은, 특별한 시험 (예를 들어, 간 독성에 대한 간세포, 신장독성에 대한 신장 근위 세뇨관 상피 세포, 혈관 독성에 대한 혈관 내피세포, 신경독성에 대한 신경 및 신경교 세포들 (glial cells), 심장독성에 대한 심근세포, 횡문근 융해에 대한 골격근 세포, 등)을 위해 사용될 수 있다. 처리된 세포는, 막 무결성 (membrane integrity), 세포 대사 산물 함량, 미토콘드리아 기능, 리소좀 기능, 세포사멸, 유전적 변경, 유전자 발현 차이, 및 이와 유사한 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 임의의 수의 원하는 매개변수에 대해 평가될 수 있다.
몇몇 구체 예에서, 세포 배양 장치는 더 큰 시스템의 구성요소이다. 몇몇 구체 예에서, 시스템은 복수의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000 등) 이러한 세포 배양 장치를 포함한다. 몇몇 구체 예에서, 상기 시스템은 최적 배양 조건 (예를 들어, 온도, 분위기, 습도, 등)에서 배양 장치를 유지시키기 위한 인큐베이터 (incubator)를 포함한다. 몇몇 구체 예에서, 상기 시스템은 세포를 이미징하거나 또는 그렇지 않으면 분석하기 위한 검출기를 포함한다. 이러한 검출기에는 형광측정기, 조도계, 카메라, 현미경, 플레이트 판독기 (예를 들어, PERKIN ELMER ENVISION 플레이트 판독기, PERKIN ELMER VIEWLUX 플레이트 판독기), 세포 분석기 (GE IN Cell Analyzer 2000 및 2200, THERMO/CELLOMICS CELLNSIGHT High Content Screening Platform) 및 공초점 이미징 시스템 (예를 들어, PERKIN ELMER OPERAPHENIX 고효율 컨텐츠 스크리닝 시스템, GE INCELL 6000 Cell Imaging System)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 구체 예에서, 시스템은, 배양된 세포에 배양 배지 또는 다른 구성요소를 공급, 재-공급 및 순환시키기 위한 관류 시스템 (perfusion systems) 또는 다른 구성요소를 포함한다. 몇몇 구체 예에서, 상기 시스템은, 배양 장치의 취급, 사용, 및/또는 분석을 자동화하기 위한 로봇 구성요소 (예를 들어, 피펫, 아암, 플레이트 이동장치, 등)을 포함한다.
인서트, 방법 및 어셈블리의 여러 관점들은 여기에 개시된다. 몇몇 선택된 관점의 요약은 아래에 제시된다. 제1 관점에서, 세포 배양 인서트는, (i) 제1 개방 단부, 100㎛ 내지 1000㎛ 범위에서 직경 치수를 갖는 개구를 한정하는 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 상기 제2 단부까지 연장하는 하나 이상의 측벽을 갖는 본체; 여기서 상기 하나 이상의 측벽은 경사지며; 및 (ii) 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 포함한다.
제2 관점은, 제1 관점에 따른 세포 배양 인서트에서, 하나 이상의 측벽 중 적어도 일부는 세포에 비-부착성이다.
제3 관점은 제1 관점 또는 제2 관점에 따른 세포 배양 인서트에서, 상기 다공성 막의 적어도 일부는 세포에 비-부착성이다.
제4 관점은 제1 관점 내지 제3 관점 중 어느 하나에 따른 세포 배양 인서트에서, 상기 다공성 막의 적어도 일부는 세포에 부착성이다.
제5 관점은 제1 관점 내지 제4 관점 중 어느 하나에 따른 세포 배양 인서트에서, 제2 단부에 근접한 하나 이상의 측벽의 일부는 세포 제한 부피를 적어도 부분적으로 한정한다.
제6 관점은 제5 관점에 따른 세포 배양 인서트에서, 상기 제한 부피의 깊이는 100㎛ 내지 1000㎛ 범위이다.
제7 관점은, 관점 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 세포 배양 인서트에서, 상기 인서트는, 인서트 내에 배양된 세포가 회전 타원체를 형성하도록 구성된다.
제8 관점은 (i) 관점 7에 따른 세포 배양 인서트를 하부를 갖는 저류조에 배치하는 단계, 여기서, 인서트는 인서트의 본체의 제2 단부가 인서트의 하부 위에 위치되도록 저장조에 배치되며; (ii) 상기 인서트에 세포를 도입하는 단계; (iii) 상기 인서트에 세포 배양 배지를 도입하는 단계; 및 (iv) 회전 타원체를 형성하도록 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
제9 관점은, 세포 배양 어셈블리에서, (i) 내부를 한정하고 하부를 갖는 저장조; 및 (ii) 본체의 제2 단부가 상기 하부 또는 상기 저장조의 위에 있도록 상기 저장조의 내부에 위치되도록 구성된 관점 1 내지 7중 어느 하나에 따른 제1 세포 배양 인서트를 포함하고, 여기서 제1 인서트의 본체는 제1 인서트의 내부를 한정한다.
제10 관점은, 제9 관점에 따른 세포 배양 어셈블리에서, 상기 제1 인서트의 내부는, 제1 인서트가 저장조의 내부에 위치되는 경우, 제1 인서트의 본체의 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 통해서만 저장조 내부와 유체 연통한다.
제11 관점은, 제9 관점 또는 제10 관점에 따른 세포 배양 어셈블리에서, 내부를 한정하는 본체를 갖는 제2 인서트를 더욱 포함하며, 상기 본체는 제1 개방 단부, 개구를 한정하는 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 상기 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽을 포함하며, 여기서, 상기 제2 인서트는 제1 인서트의 본체의 제2 단부 위에 제2 인서트의 본체의 제2 단부를 보유하기 위해 제1 인서트의 내부에 위치되도록 구성된다.
제12 관점은, 제11 관점에 따른 세포 배양 어셈블리에서, 상기 제2 인서트의 내부는, 상기 제2 인서트가 제1 인서트의 내부에 위치되는 경우, 제2 인서트의 본체의 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 통해서만 상기 제1 인서트의 내부와 유체 연통한다.
제13 관점은: (ⅰ) 관점 12에 따른 세포 배양 어셈블리의 저장조의 내부에 표적 세포 및 세포 배양 배지를 도입하여 상기 표적 세포를 상기 저장조의 하부에서 성장시키는, 도입 단계; (ii) 상기 저장소의 내부에 관점 12에 따른 제1 세포 배양 인서트를 위치시키는 단계; (iii) 복수의 제1 타입의 세포 및 세포 배양 배지를 제1 세포 배양 인서트의 내부로 도입하여 제1 인서트의 다공성 막에 근접하여 회전 타원체로서 제1 타입의 세포를 성장시키는, 도입 단계; (iv) 제1 인서트의 내부에 제12 관점에 따른 제2 세포 배양 인서트를 위치시키는 단계; 및 (v) 복수의 제2 타입의 세포 및 세포 배양 배지를 제2 세포 배양 인서트의 내부로 도입하여 제2 인서트의 다공성 막에 근접하게 제2 타입의 세포를 성장시키는 도입 단계를 포함하는 방법이다.
제14 관점은, 제13 관점에 따른 방법에서, 상기 제2 타입의 세포는 상기 제2 인서트의 내부로부터 상기 제1 인서트의 내부로 이동하는 화합물 또는 이의 대사 유도체가 상기 제2 타입의 세포를 통해 통과하도록 상기 제2 인서트의 다공성 막을 피복한다.
제15 관점은, 제14 관점에 따른 방법에서, 상기 제1 타입의 세포는, 제1 인서트의 내부로부터 저장조의 내부로 이동하는 화합물 또는 이의 대사 유도체가 제1 타입의 세포를 통해 통과하도록 제1 인서트의 다공성 막에 부착된다.
제16 관점은, 제15 관점에 따른 방법에서, (i) 상기 제2 인서트의 내부에 시험 화합물을 도입하는 단계; 및 (ii) 표적 세포에 대해 시험 화합물 또는 이의 대사 유도체의 효과를 확인하는 단계를 더욱 포함한다.
제17 관점은, 제13 관점 내지 제16 관점 중 어느 하나에 따른 방법에서, 제1 타입의 세포는 간세포이다.
제18 관점은, 관점 13 내지 17중 어느 하나에 따른 방법에서, 제2 타입의 세포는 Caco 2 세포이다.
제19 관점은: (i) 제1 개방 단부, 개구를 한정하는 제2 단부, 및 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽을 갖는 본체; 여기서 상기 하나 이상의 측벽은 경사지며; 및 (ii) 상기 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 포함하며, 여기서 상기 다공성 막은 세포에 비-부착성인 세포 배양 인서트이다.
제20 관점은 세포 배양 장치의 저장조에 적어도 부분적으로 삽입되도록 구성된 투과성 지지 장치이며, 상기 투과성 지지 장치는 테이퍼 형상을 갖는 제1 웰 및 제1 투과성 지지체에 의해 적어도 부분적으로 한정된 하부를 포함한다.
제21 관점은, 관점 20의 투과성 지지 장치에서, 상기 웰은 배양된 세포가 회전 타원체를 형성하도록 구성된다.
제22 관점은, 관점 20 또는 21중 어느 하나의 투과성 지지 장치에서, 제1 웰의 적어도 일부는 초-저 결합 물질로 코팅된다.
제23 관점은, 관점 20 내지 22중 어느 하나의 투과성 지지체 장치에서, 투과성 지지체의 적어도 일부는 제1 웰에서 배양된 세포에 부착되도록 구성된다.
제24 관점은, 제20 관점 내지 제23 관점 중 어느 하나에 따른 투과성 지지 장치에서, 상기 제1 웰의 적어도 일부는 아치 형태를 포함한다.
제25 관점은 관점 20 내지 24중 어느 하나에 따른 투과성 지지 장치에서, 상기 제1 웰의 적어도 일부는 원뿔 형태를 포함한다.
제26 관점은, 관점 20 내지 25중 어느 하나의 투과성 지지 장치에서, 웰의 일부는 제한 부피를 한정한다.
제27 관점은, 관점 26의 투과성 지지 장치에서, 상기 제한 부피의 직경 치수는 200㎛ 내지 500㎛의 범위이다.
제28 관점은, 관점 26 또는 27의 투자성 지지 장치에서, 상기 제한 부피의 깊이는 100㎛ 내지 500㎛의 범위이다.
제29 관점은, 관점 20 내지 28중 어느 하나의 투과성 지지 장치에서, 상기 제1 웰은 하부를 갖는 제2 웰을 수용하도록 크기가 정해지고 구성되며, 여기서 상기 제2 웰은 제1 웰 위에 위치된다.
제30 관점은: (i) 테이퍼 형상을 갖는 제1 웰 및 제1 투과성 지지체에 의해 적어도 부분적으로 한정된 하부 부분; 및 (ii) 상기 제1 웰 아래에 위치된 하부를 갖는 저장조를 포함하는, 중첩된 (nested) 투과성 지지 장치이다.
제31 관점은, 관점 30의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 웰은 배양된 세포가 회전 타원체를 형성하도록 구성된다.
제32 관점은, 관점 30 또는 31중 어느 하나의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 제1 웰의 적어도 일부는 초-저 결합 물질로 코팅된다.
제33 관점은, 관점 29 내지 32중 어느 하나에 따른 중첩된 지지체 장치에서, 상기 투과성 지지체의 적어도 일부는 제1 웰에서 배양된 세포에 부착되도록 구성된다.
제34 관점은, 관점 30 내지 33중 어느 하나에 따른 중첩된 지지체 장치에서, 상기 제1 웰의 적어도 일부는 아치 형태를 포함한다.
제35 관점은, 관점 30 내지 34중 어느 하나에 따른 중첩된 투과성 지지 장치에서, 상기 제1 웰의 적어도 일부는 원뿔 형태를 포함한다.
제36 관점은, 관점 30 내지 35중 어느 하나의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 웰의 일부는 제한 부피를 한정한다.
제37 관점은, 관점 36의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 상기 제한 부피의 직경 치수는 100㎛ 내지 1000㎛, 예를 들어 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000㎛, 이들 사이의 임의의 범위를 포함하는 범위이다.
제38 관점은, 관점 36 또는 37중 어느 하나의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 제한 부피의 깊이는 100㎛ 내지 1000㎛, 예를 들어 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000㎛, 이들 사이의 임의의 범위를 포함하는 범위이다.
제39 관점은, 관점 36 또는 38중 어느 하나의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 제2 투과성 지지체에 의해 적어도 부분적으로 한정된 하부를 갖는 제2 웰을 더욱 포함하고, 여기서 상기 제1 웰 및 제1 투과성 지지체는 제2 웰 및 제2 투과성 지지체 아래에 위치된다.
제40 관점은, 관점 39의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 제2 웰은 테이퍼 형상을 포함한다.
제41 관점은, 관점 36 또는 40중 어느 하나의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 상기 저장조의 하부는 가스 투과성 물질을 포함한다.
제42 관점은: (i) 하부를 갖는 제1 웰; 여기서 상기 하부의 적어도 일부는 제1 투과성 지지체에 의해 형성됨; (ii) 하부를 갖는 제2 웰, 여기서 상기 제2 웰의 하부는 아치 형태를 포함하고, 상기 하부의 적어도 일부는 제2 투과성 지지체에 의해 형성되고, 및 여기서 상기 제2 웰 및 상기 제2 투과성 지지체는 제1 웰 및 제1 투과성 지지체 아래에 위치됨; 및 (iii) 상기 제2 웰 및 상기 제2 투과성 지지체 아래에 위치된 하부를 갖는 제3 웰을 포함하는, 중첩된 투과성 지지 장치이다.
제43 관점은, 관점 42의 중첩된 투과성 지지 장치에서, 제2 웰의 적어도 일부는 초-저 결합 물질로 코팅된다.
제44 관점은 제1 개방 단부, 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽을 갖는 본체를 포함하는 세포 배양 인서트이고; 여기서 상기 제2 단부는 웰을 한정하는 마이크로웰들의 어레이를 갖는 기판을 포함하며, 여기서 웰을 한정하는 마이크로웰들의 어레이를 갖는 기판의 적어도 일부는 경사진다.
제45 관점은, 관점 44의 세포 배양 인서트에서, 상기 측벽은 경사진다.
제46 관점은, 관점 44 또는 45중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 상기 측벽은 세포에 비-부착성이다.
제47 관점은, 관점 44 내지 46중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 마이크로웰들의 어레이를 갖는 기판의 적어도 일부는 세포에 비-부착성이다.
제48 관점은, 관점 44 내지 47중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 상기 웰은 상부 개구를 한정하는 내부 표면을 가지며, 및 상기 웰은 100㎛ 내지 1000㎛의 범위의 상부 개구에서 직경 치수를 갖는다.
제49 관점은, 관점 44 내지 48중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 상기 웰은 100㎛ 내지 100㎛ 범위에서 깊이를 갖는다.
제50 관점은, 관점 44 내지 49중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판의 적어도 일부는 세포에 비-부착성이다.
제51 관점은, 관점 44 내지 49중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 마이크로웰들의 어레이를 갖는 기판의 적어도 일부는 세포에 부착성이다.
제52 관점은, 관점 44 내지 51중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판의 적어도 일부는 다공성이다.
제53 관점은, 관점 44 내지 52중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판은 개구를 포함한다.
제54 관점은, 관점 44 내지 53중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판은 다공성 막에 점착되거나, 다공성 막에 부착되거나, 또는 다공성 막과 병치된다.
제55 관점은, 관점 44 내지 54중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 제2 단부는 다공성 막으로 피복된다.
제56 관점은, 관점 44 내지 55중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판은 경사진 표면을 포함한다.
제57 관점은, 관점 44 내지 56중 어느 하나의 세포 배양 인서트에서, 마이크로웰의 어레이를 갖는 기판은 육각형 구조의 어레이를 포함한다.
제58 관점은 (i) 내부를 한정하고 하부를 갖는 저장조; 및 (ii) 상기 저장조의 하부 위에 본체의 제2 단부가 있도록 상기 저장조의 내부에 위치되도록 구성된 관점 44-57중 어느 하나에 따른 제1 세포 배양 인서트를 포함하며, 여기서 상기 제1 인서트의 본체는 제1 인서트의 내부를 한정하는 세포 배양 어셈블리이다.
제59 관점은, 관점 58에 따른 세포 배양 어셈블리에서, 상기 제1 인서트의 내부는, 상기 제1 인서트가 저장소의 내부에 위치된 경우, 제1 인서트의 본체의 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 통해서만 상기 저장소의 내부와 유체 연통한다.
제60 관점은, 관점 58 또는 59에 따른 세포 배양 어셈블리에서, 내부를 한정하는 본체를 갖는 제2 인서트를 더욱 포함하고, 상기 본체는 제1 개방 단부, 개구를 한정하는 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽을 포함하며, 여기서, 상기 제2 인서트는 제1 인서트의 본체의 제2 단부 위에 제2 인서트의 본체의 제2 단부를 보유하기 위해 제1 인서트의 내부에 위치되도록 구성된다.
관점 61은, 관점 60에 따른 세포 배양 어셈블리에서, 상기 제2 인서트의 내부는, 상기 제2 인서트가 제1 인서트의 내부에 위치되는 경우, 제2 인서트의 본체의 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 통해서만 상기 제1 인서트의 내부와 유체 연통한다.
제62 관점은: 세포 배양 장치의 저장조에 삽입하기 위한 크기의 본체를 포함하며, 상기 본체는 제1 개방 단부, 다공성 막을 갖는 제2 단부, 및 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장되는 하나 이상의 측벽을 가지며; 여기서 상기 하나 이상의 측벽은 경사지고; 및 여기서 상기 제2 단부는 회전 타원체 성장을 위해 크기가 정해진 다수의 마이크로웰을 한정하는 상부 표면을 갖는, 세포 배양 인서트이다.
제63 관점은, 관점 62의 세포 배양 인서트에서, 상기 마이크로웰은 각각 100㎛ 내지 1000㎛ 범위에서 직경을 갖는다.
별도로 명확히 언급되지 않는 한, 여기에 서술된 임의의 방법은 그 단계가 특정 순서로 수행될 것을 요구하는 것으로서 해석되는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 방법 청구항이 그 단계들에 뒤따라야 할 순서를 실제로 나열하지 않거나 또는 단계들이 특정 순서로 제한되어야 한다는 것이 청구항들 또는 상세한 설명들에 별도로 구체적으로 언급되지 않는 경우, 임의의 특정 순서로 유추되는 것으로 의도되지 않는다. 임의의 하나의 청구항에서 나열된 단일 또는 다수의 특색 또는 관점은, 임의의 다른 청구항 또는 청구항들에서 나열된 다른 특색 또는 관점과 결합되거나 치환될 수 있다.
여기에서 열거는 특정 방식으로 기능하도록 "구성" 또는 "개조"된 구성요소를 의미한다는 점에 또한 주목된다. 이와 관련하여, 이러한 구성요소는 특정 방식으로 특정 특성 또는 기능을 구현하도록 "구성" 또는 "개조"되며, 여기서, 이러한 열거는 의도된 용도의 열거와 반대로 구조적인 열거이다. 좀 더 구체적으로, 구성요소가 "구성" 또는 "개조"되는 방식에 대한 여기에서 언급은, 구성요소의 현존하는 물리적 조건을 나타내며, 이로써, 구성요소의 구조적 특징의 명확한 열거로 간주되어야 한다.
특정 구체 예의 다양한 특색, 요소 또는 단계가 전환 문구 "포함하는"을 사용하여 개시될 수 있는 경우, 전환 문구 "이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지는"을 사용하여 기판될 수 있는 것을 포함하는, 선택적 구체 예가 함축되어 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 예를 들어, 본체와 다공성 막을 포함하는 세포 배양 인서트에 대하여 함축된 선택적인 구체 예는, 본체와 다공성 막으로 이루어진 세포 배양 인서트의 구체 예 및 본체와 다공성 막으로 필수적으로 이루어진 세포 배양 인서트의 구체 예를 포함한다.
기술분야의 당업자에게 본 개시의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 본 발명의 기술에 대해 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음은 명백할 것이다. 본 발명 기술의 사상 및 물질을 혼입하는 개시된 구체 예의 변형, 조합, 서브-조합 및 변화가 기술분야의 당업자에게 발생할 수 있으므로, 본 발명의 기술은 첨부된 청구 범위의 범주 내에 있는 모든 것 및 이의 균등물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 출원의 개시와 여기에 혼입된 임의의 문헌의 개시 사이에 불일치가 존재하는 경우, 본 출원의 개시가 우선한다. 전술한 상세한 설명 및 실시 예는 단지 이해의 명확성을 위해 제공된다. 그로부터 불필요한 제한이 없는 것으로 이해될 수 없다. 구체 예들은 도시되고 기재된 정확한 세부 사항들로 제한되지 않으며, 당업자에게 자명한 변화들은 청구항에 의해 한정된 구체 예들 내에 포함될 것이다.
별도로 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구 범위에서 사용되는 성분의 양, 분자량, 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"으로 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 별도로 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구 범위에 서술된 수치 파라미터는 얻고자 하는 원하는 특성에 의존하여 변할 수 있는 근사치이다. 최소한, 청구항의 범주에 대한 균등물을 제한하려는 시도는 아니며, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수와 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
수치 범위와 파라미터가 근사값임에도 불구하고, 특정 실시 예에 서술된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 모든 수치 값은, 본질적으로 이들의 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 결과하는 범위를 포함한다.
여기에서 "상", "하", "좌측", "우측", "상부", "하부", "위", "아래" 및 다른 방향 및 배향과 같은 임의의 방향은, 도면을 참조하여 명료성을 위해 여기에서 기판되며 및 실제 장치 또는 시스템, 또는 장치 또는 시스템의 사용을 제한하는 것은 아니다. 여기에 기재된 많은 장치, 제품 또는 시스템은, 다수의 방향 및 배향으로 사용될 수 있다. 세포 배양 장치와 관련하여 여기서 사용된 방향성의 기술어 (descriptors)는, 종종 장치가 장치 내의 세포를 배양할 목적을 위해 배향될 때의 방향과 관련된다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게"는, 특정 상황하에서 특정 이익을 제공할 수 있는 본 개시의 구현 예를 나타낸다. 그러나, 동일 또는 다른 상황하에서, 다른 구체 예가 또한 바람직할 수 있다. 더군다나, 하나 이상의 바람직한 구체 예들의 나열은 다른 구체 예들이 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 다른 구체 예들을 본 발명의 기술 범주로부터 배제하도록 의도된 것은 아니다.
여기에 사용된 바와 같은, "가지는", "갖는", "가지고 있는", "포함하는", "포함하며", "포함하고", "포함", "포함한다.", 또는 이와 유사한 용어는, 개방적인 포괄적인 의미로 사용되고, 일반적으로 "포함하지만 이에 제한되지 않는", "포함하지만 이에 국한되지 않는" 또는 "포함하지만 이에 한정되지 않는"을 의미한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 나중에 기재된 사건, 상황 또는 구성요소가, 발생할 수 있거나 또는 발생할 수 없는 것을 나타내며, 설명이 사건, 상황 또는 구성요소가 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함하는 것을 나타낸다.
별도로 명시되지 않는 한, 여기에 사용된 용어의 "단수 형태"는 문맥이 별도로 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
또한 여기에서, 말단점에 의한 수치 범위의 나열은 그 범위 내에 포괄된 모든 숫자를 포함한다. (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함 함). 범위는 여기에서 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 다른 특정 값으로부터 표시될 수 있다. 이러한 범위가 표시된 경우, 실시 예는 하나의 특정 값 및/또는 다른 특정 값을 포함한다. 유사하게, 값이 근사 값으로 표시된 경우, 선행사 "약"의 사용에 의해, 특정 값이 또 다른 관점을 형성하는 것으로 이해될 것이다. 범위 각각의 말단점은 다른 말단점과 관련하여 및 다른 말단점과는 독립적으로 의미가 있는 것으로 더욱 이해될 것이다.
별개의 단계를 포함하는 여기에 개시된 임의의 방법에 대해, 단계는 임의의 가능한 순서로 수행될 수 있다. 그리고, 적절하게는, 둘 이상의 단계의 임의의 조합은 동시에 수행될 수 있다.
다수의 약어들은 여기에서 사용된다. 몇몇의 약어 및 그 의미의 목록은 이하 제시된다:
ADME-Tox - 흡수, 분포, 대사, 배설 및 독성
NBE - 새로운 생물학적 엔티티 (Biological Entity)
NCE - 새로운 화학적 엔티티
TEER - 상피통과 전기 저항 (Trans Epithelial Electrical Resistance)
모든 표제는 독자의 편의를 위한 것이며, 별도의 언급이 없는 한, 표제를 따르는 텍스트의 의미를 제한하는 것으로 사용되지 않는다.

Claims (41)

  1. 회전 타원체(spheroid) 촉진 세포 배양 인서트로서:
    세포 배양 장치의 저장조로 삽입하기 위한 크기의 본체, 상기 본체는 제1 개방 단부, 개구를 한정하는 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 상기 제2 단부까지 연장하는 일 이상의 측벽을 가지며; 여기서 상기 일 이상의 측벽은 경사지며; 및
    상기 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 포함하며,
    여기서 상기 다공성 막은 마이크로웰 내에 회전 타원체를 형성하도록 구조화되고 배열된 마이크로웰의 어레이를 포함하며, 여기서 각 마이크로웰은 상부 개구(top aperture), 측벽, 및 아치 형태 표면을 포함하는 다공성 막 하부를 포함하고, 여기서 다공성 막 하부의 적어도 일부는 아치 형태 표면 내 또는 아치 형태 표면 상의 세포에 비-부착성인, 세포 배양 인서트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 단부의 개구는 100㎛ 내지 1000㎛ 범위의 직경 치수를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 제2 단부의 개구는 200㎛ 내지 750㎛ 범위의 직경 치수를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 일 이상의 측벽의 적어도 일부는 세포에 비-부착성인 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 다공성 막의 적어도 일부는 세포에 비-부착성인 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 다공성 막의 적어도 일부는 세포에 부착성인 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 단부에 근접한 일 이상의 측벽의 일부는 회전 타원체 제한 부피를 적어도 부분적으로 한정하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 제한 부피의 깊이는 100㎛ 내지 500㎛의 범위인 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포 배양 인서트는 저장조를 더욱 포함하며, 여기서 제1 세포 배양 인서트는 상기 저장조의 하부(bottom) 위에 제1 세포 배양 인서트의 제2 단부를 보유하기 위해 상기 저장조의 내부에 위치되도록 배열(configure)되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 제1 세포 배양 인서트의 내부는, 상기 제1 세포 배양 인서트가 저장소의 내부에 위치된 경우, 제1 세포 배양 인서트의 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 통해서만 상기 저장소의 내부와 유체 연통하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 세포 배양 인서트는 제1 개방 단부, 개구를 한정하는 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 제2 단부까지 연장하는 일 이상의 측벽을 포함하는 제2 인서트를 더욱 포함하며,
    여기서 상기 제2 인서트는 제1 세포 배양 인서트의 제2 단부 위에 제2 인서트의 제2 단부를 보유하기 위해 제1 세포 배양 인서트의 내부에 위치되도록 배열되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 제2 인서트의 내부는, 상기 제2 인서트가 제1 세포 배양 인서트의 내부에 위치되는 경우, 제2 인서트의 제2 단부의 개구 위에 배치된 다공성 막을 통해서만 상기 제1 세포 배양 인서트의 내부와 유체 연통하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  13. 청구항 9 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 저장조의 적어도 일부는 가스 투과성인 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  14. 회전 타원체를 배양하기 위한 방법으로서:
    청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 인서트를 저장소에 위치시키는 단계, 상기 저장소는 하부를 가지며, 여기서 인서트는 상기 인서트의 제2 단부가 상기 저장소의 하부 위에 위치되도록 상기 저장소 내에 위치되며;
    세포를 상기 인서트로 도입하는 단계;
    세포 배양 배지를 도입하는 단계; 및
    상기 회전 타원체를 형성하기 위해 세포를 인서트 내의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 회전 타원체를 배양하기 위한 방법.
  15. 회전 타원체를 배양하기 위한 방법으로서:
    세포를 청구항 12에 따른 제1 세포 배양 인서트 또는 제2 인서트 또는 제1 세포 배양 인서트 및 제2 인서트 모두에 도입하는 단계;
    세포 배양 배지를 도입하는 단계; 및
    상기 회전 타원체를 형성하기 위해 상기 세포를 인서트 내의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 회전 타원체를 배양하기 위한 방법.
  16. 세포 배양 인서트로서:
    제1 개방 단부, 개구를 한정하는 제2 단부, 및 상기 제1 개방 단부로부터 상기 제2 단부까지 연장하는 일 이상의 측벽을 갖는 본체, 여기서 상기 일 이상의 측벽은 경사지며; 및
    마이크로웰 내에 회전 타원체를 형성하도록 구조화되고 배열된 마이크로웰의 어레이를 포함하는 다공성 막을 포함하며, 여기서 각 마이크로웰은 상부 개구, 측벽, 및 아치 형태 표면을 포함하는 다공성 막 하부를 포함하고, 여기서 다공성 막은 상기 제2 단부의 개구 위에 배치되며, 여기서 상기 다공성 막 하부는 아치 형태 표면 내 또는 아치 형태 표면 상의 세포에 비-부착성인, 세포 배양 인서트.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 마이크로웰의 어레이 내의 마이크로웰의 적어도 일부는 초-저 결합 물질로 코팅되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  18. 청구항 16 또는 17에 있어서,
    다공성 막의 적어도 일부는 마이크로웰의 어레이에서 배양된 세포에 부착되도록 배열되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  19. 삭제
  20. 청구항 16 또는 17에 있어서,
    마이크로웰의 적어도 일부는 원뿔 형태인 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  21. 청구항 16 또는 17에 있어서,
    상기 마이크로웰의 적어도 일부는 제한 부피를 한정하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 제한 부피의 직경 치수는 200㎛ 내지 500㎛의 범위인 것을 특징으로 하는 세포 배양 인서트.
  23. 회전 타원체를 배양하는 방법으로서:
    청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 회전 타원체 세포 배양 인서트를 저장조에 위치시키는 단계, 상기 저장조는 하부를 갖고, 여기서 인서트는 인서트의 제2 단부가 저장조의 하부 위에 위치되도록 저장조 내에 위치되며;
    세포를 인서트 내로 도입하는 단계;
    세포 배양 배지를 도입하는 단계; 및
    회전 타원체를 형성하기 위해 세포를 인서트 내의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 회전 타원체를 배양하는 방법.
  24. 회전 타원체를 배양하는 방법으로서:
    세포를 청구항 11 또는 12에 따른 제1 세포 배양 인서트, 또는 제2 인서트, 또는 제1 세포 배양 인서트 및 제2 인서트 모두 내로 도입하는 단계;
    세포 배양 배지를 도입하는 단계; 및
    회전 타원체를 형성하기 위해 세포를 인서트 내의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 회전 타원체를 배양하는 방법.
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