CN107109340B - 球状体捕获插入件 - Google Patents

Abstract

一种细胞培养孔插入件，其包含确定第一开口端部、第二开口端部和至少一个在它们之间延伸的支承件的框体。细胞培养孔插入件还可包含与框体偶联且横跨第二开口端部设置的流体可穿透的筛网。筛网可确定平均孔径在10微米～100微米范围内的筛孔。

Description

球状体捕获插入件

优先权声明

本申请要求2014年10月29日提交的美国临时申请系列号62/072094的优先权，其通过引用纳入本文。

技术领域

本公开涉及用于培养细胞的设备、系统和方法。

技术背景

三维培养的细胞(例如球状体)可展现出相比于在作为单层的二维培养中更类似活体内的功能性。在二维细胞培养系统中，细胞可附着于培养细胞的基材。然而，当细胞在三维方向上生长(例如球状体)时，细胞会彼此相互作用，而不是附着于基材。因此，将细胞培养成悬浮且可移动的球状体的培养系统的细胞培养介质交换可存在挑战。

发明概述

根据本公开的各种实施方式，描述了配置成允许在含有球状体的孔中进行培养介质的交换而不会吸出或损伤球状体的细胞培养插入件。细胞培养插入件可包含具有第一开口端部、第二开口端部和至少一个在第一开口端部与第二开口端部之间延伸的支承件的框体。插入件还包含与框体偶联且横跨所述第二端部的开口的流体可穿透的筛网。筛网确定平均孔径在10微米～200微米、例如10、20、50、100或200微米(包括任意上述数值之间的范围)范围内的孔。在一些实施方式中，对筛孔的尺寸进行调整以允许单个细胞横穿或穿过筛网，但防止球状体细胞簇通过。

在一些实施方式中，提供了细胞培养孔插入件，其包含：具有第一开口端部、确定开口的第二端部、和至少一个在第一开口端部和第二端部之间延伸的支承件的框体，其中，第二端部的开口具有9mm～0.25mm(例如9……5……3……2……0.75……0.25mm)的直径；以及与框体偶联且横跨第二端部的开口设置的流体可穿透的筛网，所述筛网确定平均孔径在10微米～200微米(例如10……35……75……200微米)范围内的筛孔。在一些实施方式中，框体配置成至少部分插入细胞培养制品的孔中，以使：i)筛网被安置在孔中与孔的最低点一定距离处；ii)当存在于所述孔中时，球状体在孔中被捕获。

在一些实施方式中，提供了一些装置，所述装置包含：孔插入件，所述孔插入件具有第一开口端部、具有开口的第二端部，其中，所述第一开口端部和所述第二端部确定位于它们之间的空腔，且第二端部的开口具有9mm～0.25mm的直径；和流体可穿透的筛网，所述筛网横跨第二端部的开口设置，且确定平均孔径在10微米～200微米范围内的筛孔，其中，所述孔插入件配置成至少部分插入细胞培养制品的孔中，以使：i)筛网被安置在孔中与孔的最低点一定距离处；ii)当存在于所述孔中时，球状体在孔中被捕获。在某些实施方式中，孔插入件是整体成型的装置。

在一些具体的实施方式中，框体包含多个从第一端部向第二端部延伸的支承件。在另一些实施方式中，筛网从框体的第一开口端部向第二端部延伸并在框体内确定空腔。在另一些实施方式中，框体的至少一个支承件包含从第一开口端部向第二端部延伸且确定框体内部的封闭侧壁。在一些实施方式中，框体的至少一个支承件包含从第一开口端部向第二端部延伸且确定框体内部的侧壁。在另一些实施方式中，框体还包含一个或多个从第一开口端径向延伸凸缘。在一些附加的实施方式中，框体配置成至少部分插入细胞培养制品的孔中，以使筛网被安置在孔中与孔的最低点一定距离处。

在一些具体的实施方式中，提供了一些方法，所述方法包括：在孔中培养细胞，所述孔包含如本文所述的细胞培养插入件。在一些具体的实施方式中，细胞在球状体中以及/或者细胞形成球状体。在另一些实施方式中，在插入件上方存在介质，且所述方法还包括从孔中插入件的上方除去介质。

在某些实施方式中，提供了一些细胞培养组件，所述细胞培养组件包含：确定内表面的孔，所述内表面确定最低点；和如本文所述的插入件，其中，插入件配置成至少部分插入孔中，以使流体可穿透的筛网被安置在孔中与最低点一定距离处。在一些实施方式中，孔不粘附细胞。在另一些实施方式中，对孔进行配置，以使在孔中培养的细胞形成球状体。在一些附加的实施方式中，筛网的筛孔尺寸允许单个细胞穿过筛网，并且防止由细胞形成的球状体穿过筛网。

在某些实施方式中，提供了一些细胞培养组件，所述细胞培养组件包含：a)孔，所述孔确定内表面且配置成使在其中培养的细胞形成球状体，其中，内表面确定最低点；和b)插入件，所述插入件包含：i)确定筛孔的流体可穿透的筛网，其中，筛孔确定10微米～200微米范围内的平均孔径，且所述筛网配置成被安置在孔的至少一部分中与最低点一定距离处；和ii)与所述筛网偶联且配置成延伸远离所述最低点的框体。

在某些实施方式中，筛网的孔配置成防止球状体穿过筛网。在另一些实施方式中，框体配置成将筛网安置在与最低点一定距离处。在一些附加的实施方式中，孔还确定上边缘，且框体与上边缘接触以将筛网安置在与最低点一定距离处。在另一些实施方式中，组件还包含支承件，且框体与支承件接触以将筛网安置在与最低点一定距离处。在一些附加的实施方式中，筛网确定筛孔，其中，所述筛孔确定小于或等于40微米(例如40……35……25……15、……或10)的平均孔径。在某些实施方式中，孔还确定与最低点相对的开孔，其中，孔的内表面确定从开孔至最低点的圆锥形状。在一些实施方式中，筛网确定圆形形状或方形形状。

在另一些实施方式中，组件还包含多个孔，且插入件还包含多个流体可穿透的筛网，其中，所述流体可穿透的筛网和多个流体可穿透的筛网中的每一个配置成被安置在多个孔和不同的孔的至少一部分中。在另一些实施方式中，孔的内表面涂覆有超低粘合材料。在另一些实施方式中，筛网确定筛网边缘，框体沿着筛网边缘包围筛网并且延伸远离最低点。在另一些实施方式中，框体包含至少一个与流体可穿透的筛网偶联的支承丝。在一些实施方式中，孔包含至少一个沿着内表面的亚孔(sub-well)。

在一些具体的实施方式中，提供了用于从细胞培养设备的孔中除去培养介质的方法，所述孔确定具有最低点的内表面，所述方法包括：a)将插入件的一端插入孔中，插入件的插入端确定与插入件的空腔流体连通的开口，插入件具有横跨所述开口设置的流体可穿透的筛网，其中，将插入件的插入端设置在孔中，以使筛网被安置在与最低点一定距离处；b)将流体除去装置的尖端插入插入件的空腔中，以使所述尖端与最低点的距离至少与筛网至最低点之间的距离一样远；以及c)通过流体除去装置回收流体来将流体从孔中除去。

在某些实施方式中，提供了细胞培养组件，所述细胞培养组件包含：第一孔，所述第一孔确定内表面，且所述内表面确定最低点；流体可穿透的筛网，所述流体可穿透的筛网确定筛孔，且所述筛孔确定范围在10微米～200微米范围内的平均孔径；框体，所述框体与筛网偶联，且配置成将筛网保持在位于第一孔的至少一部分的上方的位置处。

在一些实施方式中，筛网确定筛孔，且筛孔确定在20微米～200微米范围内的平均孔径。在另一些实施方式中，流体可穿透的筛网具有9mm～0.25mm(例如9……7……4……2……1……0.25mm)的直径。在另一些实施方式中，筛网确定筛孔，且筛孔确定小于或等于40微米的平均孔径。在一些附加的实施方式中，筛网配置成被安置在孔的至少一部分内与最低点一定距离处。在另一些实施方式中，框体配置成延伸远离最低点。在另一些实施方式中，第一孔确定上边缘，且筛网配置成被设置在孔的上边缘的上方。在另一些实施方式中，组件包含第二孔，且筛网配置成被安置在第二孔的上方。在一些具体的实施方式中，筛网确定筛网周界，且框体沿着筛网周界包围筛网。

在一些实施方式中，孔(例如微孔)具有接近正弦波的截面形状。在这些实施方式中，孔的底部是圆形的(例如半球状圆形)，侧壁的半径从孔的底部向顶部增大，且孔之间的边界是圆形的。因此，孔的顶部不以直角终止。在一些实施方式中，孔在底部与顶部的中点具有直径D(也称为D_半高)、在孔的顶部具有直径D_顶部，且从孔的底部至顶部的高度为H。在这些实施方式中，D_顶部大于D。附加的实施方式示于图7，其中，孔的宽度大于连续孔之间的屏障宽度。这种实施方式允许在培养表面的给定区域内存在大量的孔。

在以下的详细描述中提出了本发明内容的附加特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下详细描述、权利要求书以及附图在内的本文所述的本发明内容而被认识。

应理解，前面的一般性描述和以下的详细描述给出了本发明内容的实施方式，用来提供理解要求保护的本发明内容的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本发明的主题的进一步理解，附图并入本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本发明的主题的各种实施方式，并与说明书一起对本发明的主题的原理和操作进行阐述。此外，附图和说明书仅仅是示例性的，并不试图以任意方式限制权利要求的范围。

附图的简要说明

当结合以下附图阅读时，能对本发明下文的具体实施方式的详细描述有最好的理解，附图中相同的结构用相同的附图标记表示，其中：

图1A是具有孔的细胞培养设备的一种实施方式的透视图。

图1B是图1A中所示的设备的一种实施方式的横截面图。

图1C是在结构化表面的一种实施方式的孔中生长成球状体的细胞的示意性俯视图；

图2A是球体陷阱或孔插入件的一个实施方式的透视图；

图2B和2C是图2A的孔插入件的实施方式的俯视图，其图示了两种不同形状的筛网；

图3是多个孔和多个孔插入件的一种实施方式的示意性的横截面图；

图4是孔插入件和包含多个亚孔的孔的一种实施方式的示意性横截面图；

图5是具有多个孔和孔插入件的细胞培养设备的一种实施方式的透视图；以及

图6是具有正弦曲线或抛物线形状的孔阵列的图。

图7是一种实施方式中含有球状体的孔阵列的侧视图。

图8是显示一种本文所述设备的示范性使用方法的示意图。

发明详述

下面将对本发明的主题的各种实施方式进行更详细的描述，其中的一些实施方式例示于附图中。附图中所使用的相同的编号表示相同的组件、步骤等。然而，应当理解的是，使用数字表示给定附图中的组件并非旨在对另一幅附图中标有相同数字的组件进行限制。另外，使用不同数字表示组件并非旨在表示标有不同数字的组件不能与其它编号的组件相同或相似。

本公开除了其它方面以外还描述了具有一个或多个孔的基材的细胞培养设备以及可被安置在一个或多个孔的至少一个中的细胞培养孔插入件。

在一些实施方式中，可对孔进行配置，以使在孔中培养的细胞形成球状体。例如，孔可不粘附细胞，以使孔中细胞彼此相联而形成球状体簇。球状体可膨胀至受到孔的几何构造限制的尺寸。在一些实施方式中，孔可涂覆有超低粘合性材料以使孔不粘附细胞。因为细胞不粘附孔的表面，在不吸出或干扰球状体的条件下进行细胞培养介质的交换可能是困难的。

经过三维培养的细胞(例如球状体)可展现出相比于在作为单层的二维培养中更类似活体内的功能性。在二维细胞培养系统中，细胞可附着于培养细胞的基材。然而，当细胞在三维方向上生长(例如球状体)时，细胞会彼此相互作用，而不是附着于基材。在三维方向上培养的细胞在细胞通信和胞外基质的形成方面与活体组织更加接近。因此，球状体能够提供细胞迁移、分化、存活和生长的优异模型，且因此能够提供更好的用于研究、诊断和药物疗效、药理学和毒性测试的系统。

在一些实施方式中，对装置进行配置，以使在装置中培养的细胞形成球状体。例如，供细胞生长的孔可不粘附细胞，以使孔中细胞彼此相联而形成球状体。球状体膨胀至受到孔的几何构造限制的尺寸。在一些实施方式中，孔可涂覆有超低粘合性材料以使孔不粘附细胞。

非粘附性材料的例子包括全氟化聚合物、烯烃或类似的聚合物或其混合物。其它例子包括琼脂糖、诸如聚丙烯酰胺的非离子型水凝胶、诸如聚环氧乙烷的聚醚、以及诸如聚乙烯醇的多元醇或类似的材料或它们的混合物。例如非粘附性孔、孔的几何构造(例如尺寸和形状)和/或重力的组合诱导孔中培养的细胞自发组成球状体。相对于单层中生长的细胞，一些球状体能够维持分化细胞功能，显示更好的类似活体内的反应。另一些细胞类型，例如间充质干细胞，在作为球状体培养时保持其多能性。

在一些实施方式中，本文所述的系统、装置和方法包含一种或多种细胞。在一些实施方式中，细胞是冷冻保存的。在一些实施方式中，细胞在三维培养物中。在一些这样的实施方式中，系统、装置和方法包含一种或多种球状体。在一些实施方式中，一种或多种细胞在活跃分裂。在一些实施方式中，系统、装置和方法包含培养介质(例如包含营养物(例如蛋白质、肽、氨基酸)、能量(例如碳水化合物)、必需金属和矿物质(例如钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐)、缓冲剂(例如磷酸盐、醋酸盐)、pH变化指示剂(例如酚红、溴甲酚紫)、选择剂(例如化学试剂、抗微生物剂)等)。在一些实施方式中，系统、装置和方法中包含一种或多种测试化合物(例如药物)。

可对多种细胞种类进行培养。在一些实施方式中，球状体含有单一的细胞种类。在一些实施方式中，球状体含有多于一种细胞种类。在一些实施方式中，在培养多于一个球状体的情况下，各球状体由相同种类的细胞形成，而在另一些实施方式中，培养两种或更多种不同种类的球状体。生长成球状体的细胞可以是天然细胞或者经过改变的细胞(例如，包含一种或多种非天然基因改变的细胞)。在一些实施方式中，细胞是体细胞。在一些实施方式中，细胞是处于任何所需的分化状态下(例如多能性、多功能性、决定命运的(fatedetermined)、不死化等)的干细胞或祖细胞(例如，胚胎干细胞、诱导的多能干细胞)。在一些实施方式中，细胞是疾病细胞或疾病模型细胞。例如，在一些实施方式中，球状体包含一种或多种癌细胞或可被诱导进入过度增殖状态的细胞(例如转化细胞)。细胞可来自或衍生自任何所需的组织或器官类型，包括但不限于肾上腺、膀胱、血管、骨、骨髓、脑、软骨、子宫颈、角膜、子宫内膜、食管、胃肠道、免疫系统(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞和树突状细胞)、肝、肺、淋巴、肌肉(例如心肌)、神经、卵巢、胰腺(例如胰岛细胞)、垂体、前列腺、肾、唾液、皮肤、肌腱、睾丸和甲状腺。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、鸡、山羊、马等)。

经过培养的细胞可用于多种研究、诊断、药物筛选以及测试、治疗和工业应用中。

在一些实施方式中，细胞被用于生产蛋白质或病毒。用于同时培养大量球状体的系统、装置和方法在蛋白质生产上特别有效。三维培养实现了每平方厘米细胞生长表面积上提高了的细胞密度和更高的蛋白质产率。用于生产疫苗所需的任何蛋白质或病毒都可在细胞中生长并为了所需的用途而分离或纯化。在一些实施方式中，蛋白质是细胞的天然蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是非天然的。在一些实施方式中，蛋白质被重组表达。优选地，使用非天然的启动子过表达蛋白质。蛋白质可被表达为融合蛋白。在一些实施方式中，纯化或检测标记被表达为感兴趣的蛋白质的融合伙伴(fusion partner)，以帮助其进行纯化和/或检测。在一些实施方式中，融合物与可切割的接头一起表达，以允许在纯化后对融合伙伴进行分离。

在一些实施方式中，蛋白质是治疗性蛋白质。这种蛋白质包括但不限于具有以下作用的蛋白质和肽：替代有缺陷或异常的蛋白质(例如胰岛素)；增强现存通道(例如抑制物或激动剂)；提供新颖的功能或活性；干扰分子或有机体；或者传递其它化合物或蛋白质(例如放射性核素，细胞毒性药物，效应蛋白等)。在一些实施方式中，蛋白质是任意种类(例如人源化，双特异性，多特异性等)的的免疫球蛋白，例如抗体(例如单克隆抗体)。治疗性蛋白质的分类包括但不限于：基于抗体的药物、Fc融合蛋白、抗凝血剂、抗原、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化的蛋白质支架、酶、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素和血栓溶解剂。治疗性蛋白质可用于预防或治疗癌症、免疫失调，代谢紊乱，先天性基因失调，感染以及其它疾病和病况。

在一些实施方式中，蛋白质是诊断性蛋白质。诊断性蛋白质包括但不限于抗体、亲和力结合伴侣(例如与受体结合的配体)、抑制剂、拮抗剂等。在一些实施方式中，诊断性蛋白质可与可检测基团一起表达或者就是可检测基团(例如，荧光基团、发光基团(例如荧光素酶)、发色基团等)。

在一些实施方式中，蛋白质是工业蛋白质。工业蛋白质包括但不限于食品成分、工业酶、农业蛋白质、分析酶等。

在一些实施方式中，细胞被用于药物研发、表征、功效测试和毒性测试。这种测试包括但不限于：药理作用评估，致癌性评估，医学成像剂特性评估，半衰期评估，辐射安全性评估，遗传毒性试验，免疫毒性试验，生殖和发育测试，药物相互作用评估，剂量评估，吸收评估，沉积评估，代谢评估，清除研究等。特定的细胞种类可用于特定的测试(例如肝细胞用于肝毒性测试，肾近曲小管上皮细胞用于肾毒性测试，血管内皮细胞用于血管毒性测试，神经元和神经胶质细胞用于神经毒性测试，心肌细胞用于心脏毒性测试，骨骼肌细胞用于横纹肌溶解测试)。可对经过处理的细胞的任意数量的参数进行评估，包括但不限于：膜的完整性，细胞代谢物含量，线粒体功能，溶酶体功能，凋亡，遗传改变，基因表达差异等。

在一些实施方式中，细胞培养装置是更大的系统中的一个组件。在一些实施方式中，系统包含多个(例如2、3、4、5、……、10、……、20、……、50、……、100、……、1000等)这样的细胞培养装置。在一些实施方式中，系统包含用于将培养装置保持在最佳培养条件(例如温度、气氛、湿度等)下的培养箱。在一些实施方式中，系统包含用于绘制细胞图像或分析细胞的检测器。所述检测器包括但不限于：荧光计，光度计，相机，显微镜，读板机(例如珀金埃尔默公司(PERKIN ELMER)的ENVISION读板机；珀金埃尔默公司的VIEWLUX读板机)、细胞分析仪(例如通用电气公司(GE)的IN Cell分析仪2000和2200；THERMO/CELLOMICSCELLNSIGHT高含量筛选平台(High Content Screening Platform)和共焦成像系统(例如珀金埃尔默公司的OPERAPHENIX高通量成分筛选系统(high througput contentscreening system)；通用电器公司的INCELL 6000细胞成像系统(Cell ImagingSystem))。在一些实施方式中，系统包含灌注系统或其它用于向经过培养的细胞供给、再次供给和循环培养介质或其它组分的组件。在一些实施方式中，系统包含机器人组件(例如移液器、机械臂、板材移动器等)以实现培养装置的操作、使用和/分析的自动化。

在一些实施方式中，可使用的具有本文所述的插入件的细胞培养设备是一种多孔圆底培养板，例如96孔圆底培养板。

细胞培养容器100的一种实施方式示于图1A和1B。图1A所显示的实施方式是具有多个孔115的96孔板。通常，“孔”(well)表示大孔，例如图1A中所示的那些。然而，可提供任意类型的细胞培养容器。例如，可提供皿、6孔板、12孔板、24孔板、96孔板、384孔板或1536孔板。“微孔”通常表示小孔，其被构建成含有单一球状体。可使多个孔115具有多种不同的排布。例如，多个孔115可确定堆叠、六边形紧密排布等的图案。在一些实施方式中，孔115形成于主表面112中。孔115可包含如图1A中所示的有序的孔结构的阵列。多孔细胞培养容器的一种实施方式的侧面横截视图示于图1B，其显示了形成于基材110中的圆底孔。在这种实施方式中，多个孔115中的每一个下陷至细胞培养设备100的主表面112以下，且具有提供位置以形成如本文所述的球状体的圆形底面。

在一些实施方式中，细胞培养容器100可具有如图1A和图1B所示的适合含有如本文所述的插入件的大孔。这些大孔可以是相对较小的，例如，1536孔板中的孔(其通常深5.01mm且顶部直径为1.69mm)，但其仍然比微孔(其可以通常深500μm且宽约500μm)大得多。另外，在一些实施方式中，大孔可具有含有微孔125(参见图4中的125)的细胞培养表面(图4中的126)。这些微孔被构建成适应各微孔中的单一球状体。如本文所述，微孔的尺寸和形状可引发球状体的形成。图1C是显示在结构化表面113的一种实施方式的微孔125(如图4中的125所示)中生长的细胞200的示意图，所述结构化表面113包含六边形紧密排布的微孔阵列。在一些实施方式中，各孔125中的细胞200形成单一球状体，如图1C所示。微孔可采用任何形式或形状或几何构造，包括图1C中显示的那些。

图2A～C显示了细胞培养插入件的实施方式，在一些实施方式中，所述细胞培养插入件可被插入细胞培养容器100的孔115中。这些是大孔插入件。

多个孔115中的每一个都可包含球状体捕获插入件、或孔插入件、或插入件150，如图2A所示。孔插入件150可配置成被安置在孔115的至少一部分中。孔插入件150或其部分可由任意合适的材料制成。优选地，打算与细胞或培养介质接触的材料与细胞和介质兼容。通常，细胞培养组件由聚合物材料制成。合适的聚合物材料的例子包括：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚苯乙烯共聚物、含氟聚合物、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯丁二烯共聚物、完全氢化的苯乙烯聚合物、聚碳酸酯PDMS共聚物、以及聚烯烃，例如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚丙烯共聚物和环烯烃共聚物等。

如图2A所示，孔插入件150可包含框体160。框体160可具有第一端部161、第二端部162和至少一个在第一端部161与第二端部162之间延伸的支承件163。如图所示，第一端部161可确定开孔或开口164。第一端部161的开孔164可与孔的顶部开孔对齐，并且允许孔内部的至少一部分能够被利用。在一些实施方式中，第一端部161可位于孔的外侧，并且远离孔的顶部开孔(参见图4)。框体160的第一端部161可由各种形状确定，例如圆形、正方形、矩形、菱形、六边形等。在一些实施方式中，第一端部161的形状可与孔的顶部开孔的形状匹配。

如图2A所示，可对框体160的第一端部161进行配置，以使框体160被安置在孔的至少一部分中。例如，框体160可从孔的顶部开孔向下延伸进入孔内。在一些实施方式中，第一端部161的形状可帮助将框体160固定在紧邻孔的顶部开孔的位置处。如图2A所示，框体160可包含一个或多个从框体160的第一端部161延伸的凸缘168。一个或多个凸缘168可帮助将框体160安置在孔的至少一部分中。例如，一个或多个凸缘168可与紧邻孔的部分接触，以将框体160安置在孔的至少一部分中。在一些实施方式中，一个或多个凸缘168可与细胞培养设备的其它一些部分接触，以将框体160安置在孔的至少一部分中。

支承件163可以是侧壁。孔插入件150的框体160的支承件163可在孔插入件150的第一和第二端部161、162之间延伸且与第一和第二端部161、162偶联，如图2A～2C所示。如图2B和2C所示，框体160包含四个支承件166。框体160可包含少于四个支承件(例如一个支承件、两个支承件、三个支承件等)、四个支承件、或多于四个支承件(例如五个支承件、六个支承件、八个支承件、十个支承件等)。一个或多个支承件163可包括例如丝、条、棒等。在第一和第二端部161、162之间延伸的一个或多个支承件163可确定基本上开放的框体。换言之，第一和第二端部161、162之间的空间通常是开放的。在一些实施方式中，一个或多个支承件163可包含从第一和第二端部161、162延伸且与第一和第二端部161、162偶联的侧壁。在一些实施方式中，侧壁可完全包围第二端部162的边缘或外周。换言之，侧壁可围住第一和第二端部161、162之间的区域，从而确定框体160的封闭管状结构。侧壁支承件可由各种不同的特性来确定，例如实心的、多孔的、流体可穿透的。

框体160的第二端部162可确定开口165。当框体160被安置在孔的至少一部分中时，第二端部162的开口165可比第一端部161更接近孔的底部。

孔插入件150还包含与框体160偶联且横跨第二端部162的开口165的流体可穿透的筛网170。筛网170可确定筛孔171。筛孔171可确定以下平均孔径，例如，大于或等于约5微米、大于或等于约10微米、大于或等于20微米、大于或等于35微米、大于或等于50微米等，或者小于或等于约200微米、小于或等于约90微米、小于或等于75微米、小于或等于60微米、小于或等于45微米等。在一些实施方式中，筛孔可确定约40微米的平均孔径。筛孔171可被确定为具有防止球状体穿过筛网170的尺寸。或者，筛孔171可被确定为具有允许单个细胞穿过筛网170的尺寸。筛网可由各种不同的材料制成，包括但不限于径迹蚀刻膜或者织造或无纺多孔材料。多孔膜的材料可经过处理或涂覆以使其粘附性更强、更可被润湿、或者更加不粘附细胞。所述处理可通过任意数量的本领域已知的方法来完成，包括等离子体放电、电晕放电、气体等离子体放电、离子轰击、电离辐射以及高强度紫外线。可通过任意合适的本领域已知的方法来引入涂层，包括印刷、喷雾、凝结、辐射能、电离技术或浸渍。在某些实施方式中，涂层可随后提供共价或非共价的附着位点。这些位点可被用于附着诸如细胞培养组分这样的部分(例如促进生长或粘附的蛋白质)。另外，涂层还可用于增强细胞(例如聚赖氨酸)的附着。或者，可使用如本文所述的不粘附细胞的涂层来防止或抑制细胞粘合。在一些实施方式中，筛网包含尼龙或聚酯筛网。

在一些实施方式中，筛网还可设置在第一与第二端部之间。在这些实施方式中，在筛网或侧壁在第一与第二端部之间延伸的情况下，框体的内部空间或空腔可由框体确定。换言之，框体的内部空间或空腔将由横跨第二开口设置的筛网和在第一与第二端部之间延伸的侧壁(例如筛网、固体等)确定。

第二端部162的开口165、进而筛网170可确定为各种形状，例如正方形、矩形、圆形、六边形等。如图2B所示，第二端部162的开口165可确定为一个圆。如图2C所示，第二端部162的开口165可确定为一个正方形。第二端部162的形状可描述成防止当孔插入件150被安置在其中时球状体离开孔。换言之，框体160的第二端部162的形状可对应于孔的形状，以使框体160的第二端部162与孔的一侧之间的任意间隙都不足以大到允许球状体穿过。例如，第二端部162的形状可被确定为与孔的一侧所确定的形状具有相同的尺寸，从而消除两者之间的任何间隙。

在一些实施方式中，如图3所示，细胞培养容器100可包含一个或多个孔115和一个或多个孔插入件150。如图所示，各孔115包含对应的孔插入件150。孔插入件150配置成被安置在孔115的至少一部分内。换言之，孔插入件150可插入孔115的至少一部分，且孔插入件150可从孔115的至少一部分中移除。在一些实施方式中，一个或多个孔插入件150可彼此偶联，以使一个或多个孔插入件150可同时被安置进出一个或多个孔115。一个或多个孔115可通过使用框体160来偶联。在另一些实施方式中，一个或多个孔150中的每一个可配置成单独被安置进出相应的孔115。换言之，在一些实施方式中，一个或多个孔插入件150中的任一个都不互相依附。在另一些实施方式中，基于应用，一个或多个孔插入件可以各种组合彼此偶联。例如，一个或多个孔插入件可以约384个、96个、48个、24个、12个、6个等的小组来偶联。

在一些附加的实施方式中，如图4所示，孔115可在孔的底部具有细胞培养表面126。在一些实施方式中，细胞培养表面至少部分具有结构化表面113，所述结构化表面113具有微孔125的阵列。

如本文所述的细胞培养设备100的结构化表面113可确定任意合适数量的可具有任意合适尺寸或形状的微孔125。微孔125基于它们的尺寸和形状来确定体积。在许多实施方式中，一个或多个或所有孔125能够围绕着纵轴对称地旋转。在一些实施方式中，一个或多个或所有微孔125的纵轴彼此平行。微孔125可被均匀或不均匀地分隔开。优选地，微孔125被均匀隔开。一个或多个或所有微孔125可具有相同的尺寸和形状，或者具有不同的尺寸和形状。

在某些实施方式中，孔115可由确定孔的底部且在主表面112下方延伸的基材110确定。一个或多个孔115中的每一个孔确定内表面120、外表面114和上开孔118。在一些实施方式中，孔115可允许气体穿透基材110。孔115的允许气体穿透基材110至外表面114的穿透性将会部分取决于基材的材料以及基材沿着孔115的厚度。例如，孔的可透气性可如共同受让的美国临时专利申请号62/072088中所述，该临时专利申请在此通过引用全文纳入本文，其与本公开的内容不冲突。

孔的内表面确定最低点116或与上开孔118相对的低点。仍然参考图3，孔115具有由最低点116至上开孔118的高度确定的深度d。孔115还具有横跨由上开孔118确定的孔的直径尺寸w，例如直径、宽度等。孔可具有合适的深度d和直径尺寸w。在一些实施方式中，深度d、直径尺寸w和孔的形状、以及形成孔的材料都起到了确定可供细胞生长的体积的作用。

在一些实施方式中，本文所述的孔115具有在约200微米～约500微米范围内的直径尺寸w。这些直径尺寸能够控制其中生长的球状体130生长的尺寸，以使球状体内部的细胞保持健康状态。在一些实施方式中，孔115具有在约100微米～约500微米范围内的深度d。当然，也可采用其它合适的尺寸，例如不超过3000微米或更大。

在一些实施方式中，孔115的内表面不粘附细胞。孔115可由非粘附性材料形成，或者可涂覆有非粘附性材料以形成非粘附的孔。在一些实施方式中，非粘附性材料可被描述为超低粘合性材料。非粘附性材料的例子包括全氟化的聚合物、烯烃或类似的聚合物或它们的混合物。其它例子包括琼脂糖、诸如聚丙烯酰胺这样的非离子型水凝胶、诸如聚环氧乙烷这样的聚醚、以及诸如聚乙烯醇这样的多元醇或类似的材料或它们的混合物。例如非粘附性孔、孔的几何构造以及重力的组合可引发细胞在孔中的培养，以自组成球状体130。相对于单层中生长的细胞，一些球状体130能够保持表示更好的类似活体内的反馈的分化细胞功能。

从图4中可以看到，内表面120可确定从上开孔118至最低点116之间的多种不同的形状。例如，在一些实施方式中，一个或多个孔115可由拱形表面确定，例如半球形表面或凹陷、具有圆底的圆锥形表面、以及类似的表面几何构型或它们的组合。孔115的最低点116可最终在有助于球形的圆形或弯曲表面上终结、终止或形成底部，所述表面例如浅凹、深坑以及类似的截头圆锥形浮凸表面或它们的组合。可透气的球状体凹陷孔的其它形状和构造在共同受让的美国专利申请号14/087906中有所描述，该申请通过引用全文纳入本文，其与本公开的内容不冲突。

在一些实施方式中，内表面120可以是平坦的或向一点会聚。内表面120可具有任意其它合适的形状或尺寸。

在一些实施方式中，可对筛网170进行配置，以使当细胞被播种入孔115中时单个细胞可穿过筛网170。例如，筛孔171可确定大于单个细胞的平均孔径。然而，在细胞形成为球状体130之后，球状体130可能过于庞大而无法回穿过筛网170。一旦球状体130被安置在内表面120的最低点116和筛网170之间，筛网170的存在还可通过降低出错的可能性来帮助提高使用者的效率。例如，筛网170的存在能够防止移液器与球状体130接触。另外，筛网170可帮助引入的或者从孔115中回收的介质流扩散。这种扩散可帮助防止漩涡扰乱球状体130。

在一些实施方式中，包围孔的基材的厚度和形状配置成对穿入内表面和传出外表面的光线折射进行纠正。例如，形状和厚度可如共同受让的美国临时专利申请号62/072019中所述，该临时专利申请在此通过引用全文纳入本文，其与本公开的内容不冲突。

在一些实施方式中，孔插入件150可包含流体可穿透的筛网170和框体160。如图3所示，孔插入件150配置成至少部分插入孔115，以使筛网170被安置在孔170中与最低点116相距一定距离119处。当孔插入件150被安置在孔115中时，框体160可与筛网170偶联并且延伸远离最低点116。框体160可用于帮助将孔插入件150安置入以及移出孔115。在一些实施方式中，框体160可配置成将筛网170安置在与最低点116相距一定距离119处。例如，框体160可与孔的上边缘121接触，以将筛网170安置在与最低点116相距一定距离119处。在另一个例子中，细胞培养组件100可包含支承件，其与框体160接触以确保筛网170被安置在与最低点116相距所需距离119处。在另一些实施方式中，筛网170可与孔115的内表面120接触，从而对筛网170和最低点116之间的距离119进行控制。

如图4所示，孔115在沿着孔115内表面的细胞培养表面126上可包含至少一个微孔125。在一些实施方式中，多个微孔125沿着孔115的内表面120安置。微孔125可具有与上述孔115相似的特征。或者，细胞培养设备可包含储器，且所述储器可包含多个如本文所述的孔。图4中还显示，孔115可含有位于其中的被安置在孔115的内表面120与孔115的上开孔之间的孔插入件150，这与图3相似。

在一些实施方式中，如图5所示，细胞培养组件500可包含具有孔515、525的阵列的储器521、流体可穿透的筛网570和与筛网570偶联的框体560。框体560可配置成使筛网570保持在位于第一孔515的至少一部分的上方的位置处。在一些实施方式中，筛网570配置成被设置在第一孔515的上边缘520的上方。在一些实施方式中，细胞培养组件500可包含第二孔525，且筛网570配置成被安置在第二孔525的上方。

可用本文所述的孔插入件帮助将球状体容纳在细胞培养容器孔115中，即，防止球状体在进行诸如交换孔115中的细胞培养介质这样的处理过程中离开孔115。在一些实施方式中，当孔插入件150(例如图2A)被安置在孔115的至少一部分中时，可使细胞培养设备100倾斜以除去细胞培养介质。在另一些实施方式中，当孔插入件150被安置在孔115的至少一部分中时，可使用移液器除去细胞培养介质。结合移液器使用孔插入件150可降低移液器影响球状体的风险，例如，移液器无法吸出球状体。

图6显示微孔的阵列601可具有正弦曲线或抛物线形状。这种正弦曲线或抛物线的孔形状具有圆形顶部和圆形孔底部。如图6所示，孔615具有顶部直径为D_顶部的顶部开口、从孔616底部至孔顶部的高度H、以及在孔顶部与孔底部616之间的中点613处的孔的直径D_半高。在一些实施方式中，细胞培养容器的孔的阵列可额外在孔的阵列中具有微孔阵列(所述微孔阵列具有如图6和图7所示的结构)以在细胞被捕获于插入件与细胞培养孔的底表面和最低点之间后诱导球状体的形成。

图7是微孔阵列的示意图。图7显示了以阵列方式排布于结构化表面113中的多个微孔615。图7中还显示，多个球状体500驻留在多个微孔615中。在一些实施方式中，细胞培养容器的最低点或细胞培养表面(例如96孔板的孔底)可以是具有能够引发球状体的形成的微孔阵列的基材。这可被称为结构化底表面。

一种用于从细胞培养设备的孔中除去培养介质的方法800示于图8。孔确定包括最低点的内表面。将插入件的一端设置810入孔中，所述插入件的所述插入端确定与插入件的空腔流体连通的开口。插入件包含横跨开口设置的流体可穿透的筛网，且插入件的插入端被设置在孔中，以使筛网被安置在与最低点一定距离处。将流体除去装置的尖端插入820插入件的空腔中，以使所述尖端与最低点的距离至少与筛网至最低点之间的距离一样远。通过流体除去装置回收流体来将流体从孔中除去630。图8显示本文所述设备的一种实施方式的示例性使用方法800。首先，在810中，该方法将插入件的一端设置入孔中，以使筛网被安置在与最低点一定距离处。第二，820，该方法将流体除去装置的尖端插入插入件的空腔中，以使该尖端与最低点至少相距所述距离。第三，830，该方法通过利用流体除去装置回收流体来将流体从孔中除去。

本文所述的结构化底表面可形成于任意合适的物质中。例如，可对基材进行模塑以形成结构化表面，可对基材膜进行浮雕以形成结构化表面等。

可以任何合适的方式将如上所述的结构化底表面组装入细胞培养设备中。例如，细胞培养设备的结构化底表面和一个或多个其它组件可作为单一部件模塑。在一些实施方式中，结构化底表面或其一部分可焊接(例如热焊接、超生焊接等)、粘结或热成形至细胞培养设备的一个或多个其它组件。

本文所述的细胞培养孔插入件可与细胞培养设备一起使用，在所述细胞培养设备中，例如，介质流过多个具有在球状体顶部上的孔插入件的孔/腔室。在一些实施方式中，细胞培养插入件是整体式的，例如附着于细胞培养设备或形成细胞培养设备的一部分。在某些实施方式中，孔插入件能够防止孔中的球状体离开孔而进入移动通过细胞培养灌注设备的介质流中。在一些具体的实施方式中，如图5所示，采用单一的插入件来覆盖多个孔。这种插入件可被插入细胞培养设备中，或者作为细胞培养设备的一个整体部件。细胞培养设备可采用或不采用氧合器。下面参考图8和9对一种不需要氧合器(例如，孔是可透气的，且在设备中提供了空气通路)的示例性的细胞培养设备进行描述。

除非另外说明，否则本文所使用的所有科学和技术术语的含义具有本领域通用的含义。本文所提供的确定是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本公开的范围构成限制。

除非上下文另外清楚地说明，否则，本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。因此，例如，所述“结构化底表面”包括具有两个或更多个此类“结构化底表面”的例子，除非文中另行明确指明。

如本说明书和所附权利要求书所用，除非文中有明确的相反表示，否则“或”字通常在其包括“和/或”的含义上使用。术语“和/或”表示所列出的要素中的一个或全部或者所列出的要素中的任何两个或多个元素的组合。

如本文所用，“具有”、“含有”、“拥有”、“包括”、“包含”、“含”、等在其开放含义上使用，通常表示“包括但不限于”。

“可选的”或“可选地”表示随后描述的事件、情形或组分可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件、情形或组分发生的实例和所述事件或情形不发生的实例。

术语“优选”和“优选地”是指能够在特定条件下产生某些益处的本公开的实施方式。然而，在相同或其他条件下，其它实施方式也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方式的描述并不意味着其他实施方式不是有用的，并且不旨在将其他实施方式排除在具有创造性的技术的范围之外。

本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，例子包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词”约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成另一方面个。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相结合以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。

另外，在本文中，利用端点所进行的数字范围的描述包括将该范围内的所有数字包括在内(例如1～5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。在数值范围是“大于”一个特定值、“小于”一个特定值等的情况下，该数值包括在该范围之内。

本文所涉及的任意方向，例如“顶部”、“底部”、“左侧”、“右侧”、“上”、“下”、“上方”、“下方”以及其它方向和朝向在本文中都是为了参考附图进行简明描述所用，并非旨在限制实际装置或系统或该装置或系统的使用。本文所述的许多装置、制品或系统可在多种方向和朝向上使用。本文所使用的涉及细胞培养设备的方向描述符号经常是指当为了在设备中培养细胞而调整设备朝向时的方向。

除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面或与任一项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面置换。

还要注意本文中涉及将部件“配置成”或“使其适于”的描述以特定的方式起作用。就这方面而言，使这样一个组件“配置成”或“使其适于”是为了具体表现特定的性质，或者以特定的方式起作用，这样的描述是结构性的描述，而不是对预期应用的描述。更具体而言，本文所述的将组件“配置成”或使其“适于”的方式表示该组分现有的物理条件，因此可以将其看作该组件的结构特征的限定性描述。

虽然会用过渡语“包含”来公开特定实施方式的各种特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代实施方式。因此，例如，插入件的隐含的替代性的实施方式包含框体，且筛网包括插入件由框体和筛网构成的实施方式、和插入件主要由框体和插入件构成的实施方式。

对本领域技术人员显而易见的是，可以在不偏离本文所述的具有创造性的技术的范围和精神的情况下对本公开进行各种修改和变动。因为本领域的技术人员可以想到所述实施方式的融合了本文所述的具有创造性的技术的精神和实质的各种改良组合、子项组合和变化，应认为本文所述的具有创造性的技术包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (26)

1.一种细胞培养组件，其包含：

细胞培养容器，所述细胞培养容器包含至少一个具有开口和最低点的孔，所述至少一个孔包含细胞培养表面，所述细胞培养表面包含具有微孔阵列的基材，所述微孔阵列配置成使得所述至少一个孔中培养的细胞在微孔阵列的微孔中形成球状体，其中每个微孔具有顶部开孔、侧壁、气体穿透底部，其中至少一部分底部不粘附细胞；

插入件，构建所述插入件使其能够被安置在所述细胞培养容器的至少一个孔的内部，所述插入件包含第一开口端部和具有开口的第二端部，且所述第一开口端部与所述第二端部确定位于它们之间的空腔，

其中，所述第二端部包含流体可穿透的筛网，所述第二端部的形状对应于所述孔的形状以使所述第二端部与孔侧之间的间隙不足以大到允许微孔阵列中形成的球状体离开所述孔，所述筛网的筛孔尺寸允许单个细胞穿过所述筛网，并且防止在所述微孔阵列中形成的球状体穿过所述筛网。

2.如权利要求1所述的细胞培养组件，其特征在于，所述筛网包含平均孔径在10微米～200微米范围内的筛孔。

3.如权利要求1或2所述的细胞培养组件，其特征在于，孔插入件还包含从所述第一端部向所述第二端部延伸的侧壁或多个支承件。

4.如权利要求3所述的细胞培养组件，其特征在于，所述侧壁的至少一部分包含所述筛网。

5.如权利要求1或2所述的细胞培养组件，其特征在于，所述孔插入件还包含一个或多个从所述第一开口端部延伸的凸缘。

6.如权利要求1或2所述的细胞培养组件，其特征在于，所述孔还确定上边缘，且所述插入件的所述第一开口端部与所述孔的所述上边缘接触以将所述筛网安置在与所述最低点一定距离处。

7.如权利要求6所述的细胞培养组件，其特征在于，还包含支承件，且所述插入件与所述支承件接触以将所述筛网安置在与所述最低点一定距离处。

8.如权利要求1所述的细胞培养组件，其特征在于，所述筛网具有小于或等于40微米的平均孔径。

9.如权利要求1或2所述的细胞培养组件，其特征在于，所述孔包含从所述孔至所述最低点的圆锥形状。

10.如权利要求1或2所述的细胞培养组件，其特征在于，所述插入件的内表面的至少一部分经过处理或涂覆，以防止细胞粘附于所述插入件的内表面。

11.一种用于在权利要求1或2所述的细胞培养组件中培养球状细胞的方法，所述方法包括：

在孔中安置插入件；

将细胞和介质引入所述插入件的空腔中，

允许细胞穿过所述插入件的所述筛网，从而在所述孔的最低点与所述插入件的所述筛网之间的空间内形成球状体。

12.一种用于从权利要求1或2所述的细胞培养组件中除去介质的方法，所述方法包括：

在孔中安置插入件；

将细胞和介质引入所述插入件的空腔中，

允许细胞穿过所述插入件的所述筛网，从而在所述孔的最低点与所述插入件的所述筛网之间的空间内形成球状体，

从所述孔中所述插入件的上方除去所述介质。

13.一种细胞培养组件，其包含：

孔，所述孔包含开孔、侧壁和最低点，

且所述最低点包含微孔阵列，其中对所述孔进行配置，以使在所述孔中培养的细胞在微孔阵列中形成球状体，其中每个微孔具有顶部开孔、侧壁、气体穿透底部，其中至少一部分底部不粘附细胞；

插入件，其包含：

开孔、框体和流体可穿透的包含筛孔的筛网，

其中，所述流体可穿透的筛网的形状对应于所述孔的形状以使所述流体可穿透的筛网与孔侧之间的间隙不足以大到允许微孔阵列中形成的球状体离开所述孔，

其中，所述筛网的所述筛孔配置成防止球状体穿过所述筛网；其中，所述筛孔包含在10微米～100微米范围内的平均孔径，且所述插入件配置成被安置在所述孔的至少一部分内与所述最低点相距一定距离处。

14.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述孔还确定上边缘，且所述框体与所述上边缘接触以将所述筛网安置在与所述最低点相距一定距离处。

15.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，还包含支承件，且所述框体与所述支承件接触以将所述筛网安置在与所述最低点相距一定距离处。

16.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述筛孔具有小于或等于40微米的平均孔径。

17.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述孔的内表面包含从所述开孔至所述最低点的圆锥形状。

18.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述筛网包含圆形形状。

19.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述筛网确定方形形状。

20.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，还包含多个孔，且所述插入件包含多个插入件，其中，所述插入件中的每一个配置成安置在多个孔中不同的一个孔的至少一部分中。

21.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述孔的内表面不粘附细胞。

22.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述框体的至少一部分包含筛网。

23.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述框体包含至少一个与所述允许流体穿透的筛网偶联的支承丝。

24.如权利要求13所述的细胞培养组件，其特征在于，所述孔包含至少一个沿着孔的内表面的亚孔。

25.一种用于在权利要求13所述的细胞培养组件中培养球状体细胞的方法，所述方法包括：

在孔中安置插入件；

将细胞和介质引入所述插入件的空腔中，

允许细胞穿过所述插入件的所述筛网，从而在所述孔的最低点与所述插入件的所述筛网之间的空间内形成球状体。

26.一种用于从权利要求13所述的细胞培养组件中除去介质的方法，所述方法包括：

在孔中安置插入件；

将细胞和介质引入所述插入件的空腔中，

允许细胞穿过所述插入件的所述筛网，从而在所述孔的最低点与所述插入件的所述筛网之间的空间中形成球状体，

从所述孔中所述插入件的上方除去所述介质。

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