JP2003135056A - 移植用組織等価物の製造方法及びその製造用器具 - Google Patents
移植用組織等価物の製造方法及びその製造用器具Info
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- JP2003135056A JP2003135056A JP2001333362A JP2001333362A JP2003135056A JP 2003135056 A JP2003135056 A JP 2003135056A JP 2001333362 A JP2001333362 A JP 2001333362A JP 2001333362 A JP2001333362 A JP 2001333362A JP 2003135056 A JP2003135056 A JP 2003135056A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞培養担体の略全周又は略全域にわたって
細胞増殖させることができる。 【解決手段】 軟骨細胞を含む細胞懸濁液と３％アテロ
コラーゲンインプラントとが１：４の割合になるように
混合（包埋）し、有底筒体１０のメンブレンフィルタ１
４にドーム状となるようにマウントし、このマウントし
た混合液をゲル化させることにより細胞を包埋した細胞
培養担体２を得た。続いて培養容器２０に液体培地４を
注入し、メンブレンフィルタ１４及び細胞培養担体２を
液体培地４に浸漬した。その後、所定条件下で３週間培
養を行った。なお、培養期間中、攪拌子２４により液体
培地４を攪拌した。３週間の包埋培養後、略全周にわた
って細胞層が形成された移植用組織等価物６が得られ
た。
細胞増殖させることができる。 【解決手段】 軟骨細胞を含む細胞懸濁液と３％アテロ
コラーゲンインプラントとが１：４の割合になるように
混合（包埋）し、有底筒体１０のメンブレンフィルタ１
４にドーム状となるようにマウントし、このマウントし
た混合液をゲル化させることにより細胞を包埋した細胞
培養担体２を得た。続いて培養容器２０に液体培地４を
注入し、メンブレンフィルタ１４及び細胞培養担体２を
液体培地４に浸漬した。その後、所定条件下で３週間培
養を行った。なお、培養期間中、攪拌子２４により液体
培地４を攪拌した。３週間の包埋培養後、略全周にわた
って細胞層が形成された移植用組織等価物６が得られ
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、所定の移植対象部
位へ移植可能な移植用組織等価物を製造する製造方法及
び製造用器具に関する。
位へ移植可能な移植用組織等価物を製造する製造方法及
び製造用器具に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞を生体外（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ）で培養して組織（移植用組織等価物）を再構築し、
培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されて
いる。この場合、細胞は単独で培養されるばかりでな
く、細胞増殖の足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）となる担体に
播種され、培養される場合が多い。殊に、厚みや高さを
持たせた三次元形状の組織を作製するためには、担体は
重要な役割を担うことになる。また、組織再生の足場と
なる担体を移植用材料（インプラント材料）として単独
又は成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）とともに
埋植し、患者本人の自己治癒能力により生体内（ｉｎ
ｖｉｖｏ）で組織を再生させる技術も確立されつつあ
る。これらの技術は、再生医療又は組織工学（Ｔｉｓｓ
ｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）と称され、注目を浴び
ている。
ｏ）で培養して組織（移植用組織等価物）を再構築し、
培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されて
いる。この場合、細胞は単独で培養されるばかりでな
く、細胞増殖の足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）となる担体に
播種され、培養される場合が多い。殊に、厚みや高さを
持たせた三次元形状の組織を作製するためには、担体は
重要な役割を担うことになる。また、組織再生の足場と
なる担体を移植用材料（インプラント材料）として単独
又は成長因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）とともに
埋植し、患者本人の自己治癒能力により生体内（ｉｎ
ｖｉｖｏ）で組織を再生させる技術も確立されつつあ
る。これらの技術は、再生医療又は組織工学（Ｔｉｓｓ
ｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）と称され、注目を浴び
ている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】このような移植用組織
等価物としては、例えばコラーゲンに軟骨細胞を包埋し
た後、培養容器の底面にドーム状にマウントしたあとゲ
ル化させ、液体培地を加えて培養を行うことにより得る
ことのできるコラーゲンゲル包埋型の培養軟骨組織が挙
げられる。
等価物としては、例えばコラーゲンに軟骨細胞を包埋し
た後、培養容器の底面にドーム状にマウントしたあとゲ
ル化させ、液体培地を加えて培養を行うことにより得る
ことのできるコラーゲンゲル包埋型の培養軟骨組織が挙
げられる。
【０００４】しかしながら、このようにして製造したゲ
ル包埋型の移植用組織等価物は、培養容器の底面と接触
している部分には液体培地が十分に浸透せず、この部分
の細胞増殖があまりみられなかった。また、ゲル形態よ
りも培地の浸透性の良いスポンジ（多孔体）形態を有す
る担体を使用した場合であっても、孔径が大きい場合、
培地の浸透が良好な半面、播種時に細胞が脱落し易く、
逆に孔径が小さい場合には、播種時に細胞が保持され易
い半面、培地の浸透が不十分になり易い、という相反す
る問題を有している。さらに、サイズの大きな移植用組
織等価物を作製する際には、培地を担体に浸透させるこ
との有意性がより顕著に求められる。
ル包埋型の移植用組織等価物は、培養容器の底面と接触
している部分には液体培地が十分に浸透せず、この部分
の細胞増殖があまりみられなかった。また、ゲル形態よ
りも培地の浸透性の良いスポンジ（多孔体）形態を有す
る担体を使用した場合であっても、孔径が大きい場合、
培地の浸透が良好な半面、播種時に細胞が脱落し易く、
逆に孔径が小さい場合には、播種時に細胞が保持され易
い半面、培地の浸透が不十分になり易い、という相反す
る問題を有している。さらに、サイズの大きな移植用組
織等価物を作製する際には、培地を担体に浸透させるこ
との有意性がより顕著に求められる。
【０００５】本発明は上記従来技術の問題点に鑑みなさ
れたものであり、細胞培養担体の略全周又は略全域にわ
たって細胞増殖させることのできる移植用組織等価物の
製造方法を提供することを目的とする。また、そのよう
な移植用組織等価物の製造方法に適する製造用器具を提
供することを別の目的とする。
れたものであり、細胞培養担体の略全周又は略全域にわ
たって細胞増殖させることのできる移植用組織等価物の
製造方法を提供することを目的とする。また、そのよう
な移植用組織等価物の製造方法に適する製造用器具を提
供することを別の目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段、発明の実施の形態及び発
明の効果】上記課題を解決するため、本発明の第１は、
所定の移植対象部位へ移植可能な移植用組織等価物を製
造する方法であって、前記移植対象部位に応じた移植対
象細胞を播種した細胞培養担体を、培養容器の底面から
離れた状態で支持し、前記培養容器に液体培地を供給し
て前記細胞培養担体を前記液体培地に浸漬させて前記細
胞を培養することを特徴とする。
明の効果】上記課題を解決するため、本発明の第１は、
所定の移植対象部位へ移植可能な移植用組織等価物を製
造する方法であって、前記移植対象部位に応じた移植対
象細胞を播種した細胞培養担体を、培養容器の底面から
離れた状態で支持し、前記培養容器に液体培地を供給し
て前記細胞培養担体を前記液体培地に浸漬させて前記細
胞を培養することを特徴とする。
【０００７】本発明の製造方法では、移植対象細胞を播
種した細胞培養担体は、培養容器の底面から離れた状態
で支持され、その状態で液体培地に浸漬されているた
め、細胞培養担体の全周囲より液体培地の栄養分が供給
される。したがって、この製造方法によれば、細胞培養
担体の略全周又は略全域にわたって細胞増殖が起こり、
細胞培養担体の略全周又は略全域にわたって移植対象細
胞を含む細胞群が形成された移植用組織等価物を得るこ
とができる。なお、このようにして得られた移植用組織
等価物は、細胞培養担体の少なくとも略全周にわたって
細胞群が形成されており、その細胞群から多くの細胞外
基質（細胞外マトリクス）が産生されているため、生体
に移植したあと比較的短期間で生着する。
種した細胞培養担体は、培養容器の底面から離れた状態
で支持され、その状態で液体培地に浸漬されているた
め、細胞培養担体の全周囲より液体培地の栄養分が供給
される。したがって、この製造方法によれば、細胞培養
担体の略全周又は略全域にわたって細胞増殖が起こり、
細胞培養担体の略全周又は略全域にわたって移植対象細
胞を含む細胞群が形成された移植用組織等価物を得るこ
とができる。なお、このようにして得られた移植用組織
等価物は、細胞培養担体の少なくとも略全周にわたって
細胞群が形成されており、その細胞群から多くの細胞外
基質（細胞外マトリクス）が産生されているため、生体
に移植したあと比較的短期間で生着する。
【０００８】本発明の製造方法において、移植対象細胞
を細胞培養担体に播種する際の移植対象細胞の播種密度
（包埋密度）は、予定される培養期間や細胞培養担体の
種類や培地の種類に依存するが、一般に、１×１０4〜
１×１０8個／ｍｌが適切であり、２×１０4〜２×１０
7個／ｍｌが好ましく、２×１０5〜２×１０6個／ｍｌ
が更に好ましい。また、液体培地は、移植対象細胞の通
常の培養に用いられるものであればどのようなものでも
使用可能であり、例えばダルベッコ変法イーグル最小培
地（ＤＭＥＭ）などが挙げられる。また、細胞を培養す
るに際しては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの所定種類
の血清や、増殖因子（Growth Factor）等を、移植対象
細胞の種類に応じて適宜選択し、液体培地に添加しても
よい。
を細胞培養担体に播種する際の移植対象細胞の播種密度
（包埋密度）は、予定される培養期間や細胞培養担体の
種類や培地の種類に依存するが、一般に、１×１０4〜
１×１０8個／ｍｌが適切であり、２×１０4〜２×１０
7個／ｍｌが好ましく、２×１０5〜２×１０6個／ｍｌ
が更に好ましい。また、液体培地は、移植対象細胞の通
常の培養に用いられるものであればどのようなものでも
使用可能であり、例えばダルベッコ変法イーグル最小培
地（ＤＭＥＭ）などが挙げられる。また、細胞を培養す
るに際しては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの所定種類
の血清や、増殖因子（Growth Factor）等を、移植対象
細胞の種類に応じて適宜選択し、液体培地に添加しても
よい。
【０００９】本発明の製造方法において、前記細胞培養
担体は、前記培養容器の底面から離れた状態で支持され
た前記液体培地を透過可能なフィルタ上に載せられてい
てもよい。この場合、細胞培養担体及びフィルタは液体
培地に浸漬されているため、細胞培養担体のうちフィル
タと接触していない部分に対して液体培地の栄養分が供
給されるのは勿論のこと、フィルタと接触している部分
に対してもフィルタを介して液体培地の栄養分が供給さ
れるため、細胞培養担体の略全周又は略全域にわたって
細胞増殖が起こり、細胞培養担体の少なくとも略全周に
わたって移植対象細胞を含む細胞群が形成された移植用
組織等価物を得ることができる。なお、「液体培地を透
過可能なフィルタ」とは、液体培地を通過させる性質を
持ったフィルタを意味する。
担体は、前記培養容器の底面から離れた状態で支持され
た前記液体培地を透過可能なフィルタ上に載せられてい
てもよい。この場合、細胞培養担体及びフィルタは液体
培地に浸漬されているため、細胞培養担体のうちフィル
タと接触していない部分に対して液体培地の栄養分が供
給されるのは勿論のこと、フィルタと接触している部分
に対してもフィルタを介して液体培地の栄養分が供給さ
れるため、細胞培養担体の略全周又は略全域にわたって
細胞増殖が起こり、細胞培養担体の少なくとも略全周に
わたって移植対象細胞を含む細胞群が形成された移植用
組織等価物を得ることができる。なお、「液体培地を透
過可能なフィルタ」とは、液体培地を通過させる性質を
持ったフィルタを意味する。
【００１０】ここで、前記フィルタは、前記培養容器の
縁に引っ掛けられた引っ掛け部材により前記培養容器の
底面から離れた状態で支持されていてもよい。あるい
は、前記フィルタは、前記培養容器の底面に立てられた
支持脚部材により前記培養容器の底面から離れた状態で
支持されていてもよい。いずれの場合も、比較的簡単な
構成でフィルタを培養容器の底面から離れた状態で支持
できる。
縁に引っ掛けられた引っ掛け部材により前記培養容器の
底面から離れた状態で支持されていてもよい。あるい
は、前記フィルタは、前記培養容器の底面に立てられた
支持脚部材により前記培養容器の底面から離れた状態で
支持されていてもよい。いずれの場合も、比較的簡単な
構成でフィルタを培養容器の底面から離れた状態で支持
できる。
【００１１】また、前記フィルタは、ポアサイズが０．
１〜２０μｍ、特に０．３〜１０μｍであることが好ま
しい。ポアサイズが下限値を下回ると、液体培地が透過
しにくくなり栄養の供給が十分でなくなるおそれがあ
る。また、上限値は使用する担体等の種類や条件によっ
て異なるので、前記サイズに限定されるものではない
が、ポアサイズが大きすぎると、細胞培養担体の形状を
保持できなくなるおそれがある。
１〜２０μｍ、特に０．３〜１０μｍであることが好ま
しい。ポアサイズが下限値を下回ると、液体培地が透過
しにくくなり栄養の供給が十分でなくなるおそれがあ
る。また、上限値は使用する担体等の種類や条件によっ
て異なるので、前記サイズに限定されるものではない
が、ポアサイズが大きすぎると、細胞培養担体の形状を
保持できなくなるおそれがある。
【００１２】本発明の製造方法において、前記培養は、
前記液体培地を常に又は適時撹拌しながら行うことが好
ましい。この場合、液体培地の濃度差ができにくいた
め、栄養分が比較的均一に供給され、細胞培養担体の略
全周又は略全域にわたって細胞群が形成されやすい。撹
拌は、どのような器具や装置を用いて行ってもよいが、
例えば培養容器の底面に攪拌子を配置し、これをマグネ
ティックスターラを用いて回転させることで攪拌を行
う。なお、本発明の製造方法では、細胞培養担体を培養
容器の底面から離して支持しているため、細胞培養担体
と培養容器底面との間にスペースが生じ、このスペース
を利用して攪拌子を配置し、この攪拌子を回転させるこ
とにより液体培地を撹拌することができる。
前記液体培地を常に又は適時撹拌しながら行うことが好
ましい。この場合、液体培地の濃度差ができにくいた
め、栄養分が比較的均一に供給され、細胞培養担体の略
全周又は略全域にわたって細胞群が形成されやすい。撹
拌は、どのような器具や装置を用いて行ってもよいが、
例えば培養容器の底面に攪拌子を配置し、これをマグネ
ティックスターラを用いて回転させることで攪拌を行
う。なお、本発明の製造方法では、細胞培養担体を培養
容器の底面から離して支持しているため、細胞培養担体
と培養容器底面との間にスペースが生じ、このスペース
を利用して攪拌子を配置し、この攪拌子を回転させるこ
とにより液体培地を撹拌することができる。
【００１３】本発明の製造方法において、前記細胞培養
担体は、前記培養容器１つに対して複数個配置してもよ
い。この場合、複数の細胞培養担体に対して同条件で培
養することができる。
担体は、前記培養容器１つに対して複数個配置してもよ
い。この場合、複数の細胞培養担体に対して同条件で培
養することができる。
【００１４】本発明の製造方法において、前記細胞培養
担体は、三次元形状であることが好ましい。三次元形状
とは例えば円柱、多角柱、円錐、多角錐、円錐台、多角
錐台、球などの立体形状のほか、耳殻などの移植対象部
位の形状などが挙げられる。
担体は、三次元形状であることが好ましい。三次元形状
とは例えば円柱、多角柱、円錐、多角錐、円錐台、多角
錐台、球などの立体形状のほか、耳殻などの移植対象部
位の形状などが挙げられる。
【００１５】本発明の製造方法において、前記細胞培養
担体は、ゲルの形態を有し、前記移植対象細胞が包埋さ
れていることが好ましい。この場合、適当な培地で所定
期間培養して細胞数を増加あるいは分化させた後、移植
対象細胞を細胞培養担体に包埋してもよい。
担体は、ゲルの形態を有し、前記移植対象細胞が包埋さ
れていることが好ましい。この場合、適当な培地で所定
期間培養して細胞数を増加あるいは分化させた後、移植
対象細胞を細胞培養担体に包埋してもよい。
【００１６】本発明の製造方法において、前記細胞培養
担体は、生体吸収性材料又は生体親和性材料であること
が好ましい。この場合、移植先の生体組織が移植用組織
等価物を異物とみなすことが少ないため、組織再生に適
している。特に生体吸収性材料を用いた場合には、移植
後に分解吸収されるため、組織再生に特に適している。
このような生体吸収性材料又は生体親和性材料として
は、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリロタキサ
ン、ゼラチン、フィブロネクチン、ヘパリン、キチン、
キトサン、ラミニン、アルギン酸カルシウムなどが挙げ
られる。このうち、コラーゲン、ヒアルロン酸及びポリ
ロタキサンの少なくとも１種以上であることが好まし
い。
担体は、生体吸収性材料又は生体親和性材料であること
が好ましい。この場合、移植先の生体組織が移植用組織
等価物を異物とみなすことが少ないため、組織再生に適
している。特に生体吸収性材料を用いた場合には、移植
後に分解吸収されるため、組織再生に特に適している。
このような生体吸収性材料又は生体親和性材料として
は、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリロタキサ
ン、ゼラチン、フィブロネクチン、ヘパリン、キチン、
キトサン、ラミニン、アルギン酸カルシウムなどが挙げ
られる。このうち、コラーゲン、ヒアルロン酸及びポリ
ロタキサンの少なくとも１種以上であることが好まし
い。
【００１７】本発明の製造方法において、前記細胞培養
担体は、略全周にわたって前記移植対象細胞を含む細胞
層を形成することが好ましい。この場合、移植部位と接
する部分に細胞が十分に存在するので、移植先における
生着や治療等が促進される。
担体は、略全周にわたって前記移植対象細胞を含む細胞
層を形成することが好ましい。この場合、移植部位と接
する部分に細胞が十分に存在するので、移植先における
生着や治療等が促進される。
【００１８】本発明の製造方法において、前記細胞層
は、前記移植対象細胞から産生された細胞基質を含んで
なることが好ましい。この場合、移植先で産生されてい
る細胞基質と同等のものを有していることになり、移植
先における生着や治療等が促進される。
は、前記移植対象細胞から産生された細胞基質を含んで
なることが好ましい。この場合、移植先で産生されてい
る細胞基質と同等のものを有していることになり、移植
先における生着や治療等が促進される。
【００１９】本発明の製造方法において、前記細胞層
は、特にどの程度の厚さであってもよいが、２０〜５０
０μｍが好ましく、１００〜２００μｍが特に好まし
い。厚さが下限値を下回ると、移植用組織等価物として
十分な機能を発揮できないおそれがあり、上限値を上回
ると、移植先の形状に応じてフレキシブルに変化するこ
とが困難な場合があり、生着に時間がかかる可能性があ
る。
は、特にどの程度の厚さであってもよいが、２０〜５０
０μｍが好ましく、１００〜２００μｍが特に好まし
い。厚さが下限値を下回ると、移植用組織等価物として
十分な機能を発揮できないおそれがあり、上限値を上回
ると、移植先の形状に応じてフレキシブルに変化するこ
とが困難な場合があり、生着に時間がかかる可能性があ
る。
【００２０】本発明の製造方法において、前記細胞は、
移植用組織等価物の移植先に応じて適宜選択することが
でき、生体への移植が可能な細胞であれば特に限定され
ないが、移植用組織等価物の三次元形状によって効率的
に増殖可能な細胞が好ましく、軟骨細胞、骨芽細胞、線
維芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞又はこれ
らの前駆細胞や、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細
胞）が挙げられる。これらの細胞は移植対象部位に応じ
て単独で用いてもよいし２種以上を用いてもよい。これ
らの細胞は、細胞種に応じた公知の採取方法によって生
体から採取すればよく、また、採取された細胞をそのま
ま使用してもよいし、適当な培地で所定期間培養するこ
とで増殖または分化させたあとに細胞培養担体に播種し
てもよい。
移植用組織等価物の移植先に応じて適宜選択することが
でき、生体への移植が可能な細胞であれば特に限定され
ないが、移植用組織等価物の三次元形状によって効率的
に増殖可能な細胞が好ましく、軟骨細胞、骨芽細胞、線
維芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞又はこれ
らの前駆細胞や、間葉系幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細
胞）が挙げられる。これらの細胞は移植対象部位に応じ
て単独で用いてもよいし２種以上を用いてもよい。これ
らの細胞は、細胞種に応じた公知の採取方法によって生
体から採取すればよく、また、採取された細胞をそのま
ま使用してもよいし、適当な培地で所定期間培養するこ
とで増殖または分化させたあとに細胞培養担体に播種し
てもよい。
【００２１】本発明の第２は、液体培地を透過可能なフ
ィルタと、培養容器の縁に引っ掛けられ、前記培養容器
の底面から離れた状態で前記フィルタを支持する引っ掛
け部材とを備えた移植用組織等価物の製造用器具に関す
る。
ィルタと、培養容器の縁に引っ掛けられ、前記培養容器
の底面から離れた状態で前記フィルタを支持する引っ掛
け部材とを備えた移植用組織等価物の製造用器具に関す
る。
【００２２】この製造用器具では、引っ掛け部材を培養
容器の縁に引っ掛けるとフィルタが培養容器の底面から
離れた状態で支持されるため、細胞が播種された細胞培
養担体をこのフィルタ上に載せ、細胞培養担体とフィル
タとを液体培地に浸漬して細胞を培養すれば、細胞培養
担体のうちフィルタと接触していない部分に対して液体
培地の栄養分が供給されるのは勿論のこと、フィルタと
接触している部分に対してもフィルタを介して液体培地
の栄養分が供給される。このため、細胞培養担体の略全
周又は略全域にわたって細胞増殖が起こり、細胞培養担
体の少なくとも略全周にわたって移植対象細胞を含む細
胞群が形成された移植用組織等価物を得ることができ
る。
容器の縁に引っ掛けるとフィルタが培養容器の底面から
離れた状態で支持されるため、細胞が播種された細胞培
養担体をこのフィルタ上に載せ、細胞培養担体とフィル
タとを液体培地に浸漬して細胞を培養すれば、細胞培養
担体のうちフィルタと接触していない部分に対して液体
培地の栄養分が供給されるのは勿論のこと、フィルタと
接触している部分に対してもフィルタを介して液体培地
の栄養分が供給される。このため、細胞培養担体の略全
周又は略全域にわたって細胞増殖が起こり、細胞培養担
体の少なくとも略全周にわたって移植対象細胞を含む細
胞群が形成された移植用組織等価物を得ることができ
る。
【００２３】本発明の第３は、液体培地を透過可能なフ
ィルタと、培養容器の底面に立てられ前記培養容器の底
面から離れた状態で前記フィルタを支持する支持脚部材
を備えた移植用組織等価物の製造用器具に関する。
ィルタと、培養容器の底面に立てられ前記培養容器の底
面から離れた状態で前記フィルタを支持する支持脚部材
を備えた移植用組織等価物の製造用器具に関する。
【００２４】この製造用器具では、支持脚部材を培養容
器の底面に立てるとフィルタが培養容器の底面から離れ
た状態で支持されるため、細胞が播種された細胞培養担
体をこのフィルタ上に載せ、細胞培養担体とフィルタと
を液体培地に浸漬して細胞を培養すれば、細胞培養担体
のうちフィルタと接触していない部分に対して液体培地
の栄養分が供給されるのは勿論のこと、フィルタと接触
している部分に対してもフィルタを介して液体培地の栄
養分が供給される。このため、細胞培養担体の略全周又
は略全域にわたって細胞増殖が起こり、細胞培養担体の
少なくとも略全周にわたって移植対象細胞を含む細胞群
が形成された移植用組織等価物を得ることができる。
器の底面に立てるとフィルタが培養容器の底面から離れ
た状態で支持されるため、細胞が播種された細胞培養担
体をこのフィルタ上に載せ、細胞培養担体とフィルタと
を液体培地に浸漬して細胞を培養すれば、細胞培養担体
のうちフィルタと接触していない部分に対して液体培地
の栄養分が供給されるのは勿論のこと、フィルタと接触
している部分に対してもフィルタを介して液体培地の栄
養分が供給される。このため、細胞培養担体の略全周又
は略全域にわたって細胞増殖が起こり、細胞培養担体の
少なくとも略全周にわたって移植対象細胞を含む細胞群
が形成された移植用組織等価物を得ることができる。
【００２５】本発明の第２又は第３の製造用器具におい
て、前記フィルタは、ポアサイズが０．１〜２０μｍ、
特に０．３〜１０μｍであることが好ましい。ポアサイ
ズが下限値を下回ると、液体培地が透過しにくくなり栄
養の供給が十分でなくなるおそれがある。また、上限値
は使用する担体等の種類や条件によって異なるので、前
記サイズに限定されるものではないが、ポアサイズが大
きすぎると、細胞培養担体の形状を保持できなくなるお
それがある。
て、前記フィルタは、ポアサイズが０．１〜２０μｍ、
特に０．３〜１０μｍであることが好ましい。ポアサイ
ズが下限値を下回ると、液体培地が透過しにくくなり栄
養の供給が十分でなくなるおそれがある。また、上限値
は使用する担体等の種類や条件によって異なるので、前
記サイズに限定されるものではないが、ポアサイズが大
きすぎると、細胞培養担体の形状を保持できなくなるお
それがある。
【００２６】
【実施例】［実施例１］図１は本実施例の移植用組織等
価物の製造工程概略図である。本実施例では、ウサギ由
来の軟骨細胞によるコラーゲン包埋型の培養軟骨組織の
製造工程を例に挙げ、説明する。移植用組織等価物を製
造するにあたり、まず、移植用組織等価物の製造用器具
として図２に示す有底筒体１０を用意した。この有底筒
体１０は、側面１２がプラスチック製で底面がポアサイ
ズ０．４μｍのメンブレンフィルタ１４であり、開口縁
に鍔状の引っ掛け部１６，１６を有するものを用意し、
この引っ掛け部１６，１６を培養容器２０の縁に引っ掛
け、有底筒体１０のメンブレンフィルタ１４を培養容器
２０の底面２２から離した状態で支持させた。この培養
容器２０の底面２２とメンブレンフィルタ１４との間に
はスペースが空いているため、底面２２に攪拌子２４を
配置した。なお、培養容器２０の下には図示しないマグ
ネティックスターラがセットされ、このマグネティック
スターラを駆動させると、攪拌子２４が回転する。
価物の製造工程概略図である。本実施例では、ウサギ由
来の軟骨細胞によるコラーゲン包埋型の培養軟骨組織の
製造工程を例に挙げ、説明する。移植用組織等価物を製
造するにあたり、まず、移植用組織等価物の製造用器具
として図２に示す有底筒体１０を用意した。この有底筒
体１０は、側面１２がプラスチック製で底面がポアサイ
ズ０．４μｍのメンブレンフィルタ１４であり、開口縁
に鍔状の引っ掛け部１６，１６を有するものを用意し、
この引っ掛け部１６，１６を培養容器２０の縁に引っ掛
け、有底筒体１０のメンブレンフィルタ１４を培養容器
２０の底面２２から離した状態で支持させた。この培養
容器２０の底面２２とメンブレンフィルタ１４との間に
はスペースが空いているため、底面２２に攪拌子２４を
配置した。なお、培養容器２０の下には図示しないマグ
ネティックスターラがセットされ、このマグネティック
スターラを駆動させると、攪拌子２４が回転する。
【００２７】一方、日本白色家兎の膝、股、肩関節から
肩軟骨を採取し、トリプシンＥＤＴＡ溶液及びコラゲナ
ーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収し
た。得られた軟骨細胞を洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭ
ＥＭ培地を加え、細胞密度が１×１０7個／ｍｌとなる
ように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液と３％ア
テロコラーゲンインプラント（高研社製）とが１：４の
割合になるように混合（包埋）し、有底筒体１０のメン
ブレンフィルタ１４にドーム状となるように１００μｌ
をマウントした。この混合工程によって細胞密度は希釈
されるので、細胞懸濁液を１×１０7個／ｍｌの濃度で
調製した場合、コラーゲンに包埋したときの濃度は２×
１０6個／ｍｌ（２×１０5個／１００μｌ担体）とな
る。マウントした混合液を５％ＣＯ2、３７℃の条件下
で０．５〜１時間静置してゲル化することにより、細胞
を包埋した細胞培養担体２となった。
肩軟骨を採取し、トリプシンＥＤＴＡ溶液及びコラゲナ
ーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収し
た。得られた軟骨細胞を洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭ
ＥＭ培地を加え、細胞密度が１×１０7個／ｍｌとなる
ように細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液と３％ア
テロコラーゲンインプラント（高研社製）とが１：４の
割合になるように混合（包埋）し、有底筒体１０のメン
ブレンフィルタ１４にドーム状となるように１００μｌ
をマウントした。この混合工程によって細胞密度は希釈
されるので、細胞懸濁液を１×１０7個／ｍｌの濃度で
調製した場合、コラーゲンに包埋したときの濃度は２×
１０6個／ｍｌ（２×１０5個／１００μｌ担体）とな
る。マウントした混合液を５％ＣＯ2、３７℃の条件下
で０．５〜１時間静置してゲル化することにより、細胞
を包埋した細胞培養担体２となった。
【００２８】続いて、液体培地４として５０μｇ／ｍｌ
アスコルビン酸及び１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含
むように調製した１０ｖ／ｖ％ＦＢ含有ＤＭＥＭを培養
容器２０に注入した。このとき、有底筒体１０の側面１
２と培養容器２０との隙間から液体培地４を注入した。
注入するにつれ、液体培地４はメンブレンフィルタ１４
を透過して液位を上げていき、メンブレンフィルタ１４
及び細胞培養担体２は液体培地４に浸漬された。その
後、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３週間培養を行っ
た。なお、培養期間中、攪拌子２４の回転により液体培
地４を攪拌して濃度の均一化を図った。また、適宜培地
交換を行った。
アスコルビン酸及び１００μｇ／ｍｌヒアルロン酸を含
むように調製した１０ｖ／ｖ％ＦＢ含有ＤＭＥＭを培養
容器２０に注入した。このとき、有底筒体１０の側面１
２と培養容器２０との隙間から液体培地４を注入した。
注入するにつれ、液体培地４はメンブレンフィルタ１４
を透過して液位を上げていき、メンブレンフィルタ１４
及び細胞培養担体２は液体培地４に浸漬された。その
後、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３週間培養を行っ
た。なお、培養期間中、攪拌子２４の回転により液体培
地４を攪拌して濃度の均一化を図った。また、適宜培地
交換を行った。
【００２９】３週間の包埋培養後に、直径が約１０ｍ
ｍ、厚みが約３ｍｍの移植用組織等価物６が得られた。
この移植用組織等価物６の形態を確認するために、軟骨
細胞の産生基質である産生ムコ多糖類に対してアルシア
ンブルー染色を、細胞核に対してケルンエヒトロート染
色を常法で行ったあと、断面を顕微鏡で検査したとこ
ろ、略全周にわたって細胞層が形成され、その細胞層は
産生された酸性ムコ多糖類と増殖した軟骨細胞とから形
成されていることが確認された。
ｍ、厚みが約３ｍｍの移植用組織等価物６が得られた。
この移植用組織等価物６の形態を確認するために、軟骨
細胞の産生基質である産生ムコ多糖類に対してアルシア
ンブルー染色を、細胞核に対してケルンエヒトロート染
色を常法で行ったあと、断面を顕微鏡で検査したとこ
ろ、略全周にわたって細胞層が形成され、その細胞層は
産生された酸性ムコ多糖類と増殖した軟骨細胞とから形
成されていることが確認された。
【００３０】［実施例２］図３は本実施例の移植用組織
等価物の製造工程概略図である。まず、移植用組織等価
物の製造用器具として、実施例１と同様の有底筒体１０
を二個用意した。また、この有底筒体１０よりも大きな
径を持ち周面に多数の孔３２を有する外筒体３０を二個
用意した。この外筒体３０の上側開口の縁に有底筒体１
０の引っ掛け部１６，１６を引っ掛け、有底筒体１０の
メンブレンフィルタ１４を外筒体３０に宙づりに支持し
た。更に、培養容器４０に、この有底筒体１０と一体化
した外筒体３０を二個収納した。培養容器４０の底面中
央には攪拌子２４を配置した。
等価物の製造工程概略図である。まず、移植用組織等価
物の製造用器具として、実施例１と同様の有底筒体１０
を二個用意した。また、この有底筒体１０よりも大きな
径を持ち周面に多数の孔３２を有する外筒体３０を二個
用意した。この外筒体３０の上側開口の縁に有底筒体１
０の引っ掛け部１６，１６を引っ掛け、有底筒体１０の
メンブレンフィルタ１４を外筒体３０に宙づりに支持し
た。更に、培養容器４０に、この有底筒体１０と一体化
した外筒体３０を二個収納した。培養容器４０の底面中
央には攪拌子２４を配置した。
【００３１】続いて実施例１と同様の細胞懸濁液を調製
し、この細胞懸濁液と３％アテロコラーゲンインプラン
ト（高研社製）が１：４の割合になるように混合（包
埋）し、各有底筒体１０のメンブレンフィルタ１４にド
ーム状となるように１００μｌをマウントした。マウン
トした混合液は、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で０．５
〜１時間静置してゲル化させることにより、細胞を包埋
した細胞培養担体２とした。
し、この細胞懸濁液と３％アテロコラーゲンインプラン
ト（高研社製）が１：４の割合になるように混合（包
埋）し、各有底筒体１０のメンブレンフィルタ１４にド
ーム状となるように１００μｌをマウントした。マウン
トした混合液は、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で０．５
〜１時間静置してゲル化させることにより、細胞を包埋
した細胞培養担体２とした。
【００３２】続いて、実施例１と同様の液体培地４を培
養容器４０に注入した。注入していくにつれ、液体培地
４はメンブレンフィルタ１４を透過して液位を上げてい
き、メンブレンフィルタ１４及び細胞培養担体２は液体
培地４に浸漬された。その後、実施例１と同様にして培
養を行ったところ、実施例１と同様の移植用組織等価物
が二個得られた。
養容器４０に注入した。注入していくにつれ、液体培地
４はメンブレンフィルタ１４を透過して液位を上げてい
き、メンブレンフィルタ１４及び細胞培養担体２は液体
培地４に浸漬された。その後、実施例１と同様にして培
養を行ったところ、実施例１と同様の移植用組織等価物
が二個得られた。
【００３３】なお、本発明は上記実施例に何ら限定され
るものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り、種
々の態様で実施できることはいうまでもない。例えば、
製造用器具として有底筒体１０を用いたが、図４に示す
円錐台体５０を用いてもよい。この円錐台体５０は、多
数の孔５３を持つプラスチック製の側面５２と、ポアサ
イズ０．４μｍのメンブレンフィルタ５４である上面と
からなる。この円錐台体５０は、側面５２が支持脚部材
として機能することにより、メンブレンフィルタ５４を
培養容器２０の底面２２から離した状態で支持するもの
である。さらに、メンブレンフィルタ５４上に載置され
る細胞を播種した細胞培養担体に対して、多数の孔５３
及びメンブレンフィルタ５４を介して培地を供給するも
のである。この円錐台体５０を有底筒体１０の代わりに
用いたときにも、上記実施例と同様の移植用組織等価物
が得られる。
るものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り、種
々の態様で実施できることはいうまでもない。例えば、
製造用器具として有底筒体１０を用いたが、図４に示す
円錐台体５０を用いてもよい。この円錐台体５０は、多
数の孔５３を持つプラスチック製の側面５２と、ポアサ
イズ０．４μｍのメンブレンフィルタ５４である上面と
からなる。この円錐台体５０は、側面５２が支持脚部材
として機能することにより、メンブレンフィルタ５４を
培養容器２０の底面２２から離した状態で支持するもの
である。さらに、メンブレンフィルタ５４上に載置され
る細胞を播種した細胞培養担体に対して、多数の孔５３
及びメンブレンフィルタ５４を介して培地を供給するも
のである。この円錐台体５０を有底筒体１０の代わりに
用いたときにも、上記実施例と同様の移植用組織等価物
が得られる。
【図１】実施例１の移植用組織等価物の製造工程を表す
概略断面図である。
概略断面図である。
【図２】実施例１の移植用組織等価物の製造用器具であ
る。
る。
【図３】実施例３の移植用組織等価物の製造途中を表す
概略断面図である。
概略断面図である。
【図４】他の移植用組織等価物の製造用器具である。
２…細胞培養担体、４…液体培地、６…移植用組織等価
物、１０…有底筒体、１２…側面、１４…メンブレンフ
ィルタ、１６…引っ掛け部、２０…培養容器、２２…底
面、２４…マグネティックスターラ。
物、１０…有底筒体、１２…側面、１４…メンブレンフ
ィルタ、１６…引っ掛け部、２０…培養容器、２２…底
面、２４…マグネティックスターラ。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 梶谷 健一
島根県出雲市天神町861−２ ダックスタ
ウン208号
(72)発明者 菅原 桂
島根県出雲市白枝町562−７ アドニス101
Ｆターム(参考） 4B029 AA02 BB11 CC11 DA10 DB08
DF09 DF10
4B065 AA93X BC18 BC21 BC46
CA44
Claims (18)
- 【請求項１】 所定の移植対象部位へ移植可能な移植用
組織等価物を製造する方法であって、 前記移植対象部位に応じた移植対象細胞を播種した細胞
培養担体を、培養容器の底面から離れた状態で支持し、
前記培養容器に液体培地を供給して前記細胞培養担体を
前記液体培地に浸漬させて前記細胞を培養する移植用組
織等価物の製造方法。 - 【請求項２】 前記細胞培養担体は、前記培養容器の底
面から離れた状態で支持された前記液体培地を透過可能
なフィルタ上に載せられている請求項１記載の移植用組
織等価物の製造方法。 - 【請求項３】 前記フィルタは、前記培養容器の縁に引
っ掛けられた引っ掛け部材により前記培養容器の底面か
ら離れた状態で支持されている請求項２記載の移植用組
織等価物の製造方法。 - 【請求項４】 前記フィルタは、前記培養容器の底面に
立てられた支持脚部材により前記培養容器の底面から離
れた状態で支持されている請求項２記載の移植用組織等
価物の製造方法。 - 【請求項５】 前記フィルタは、ポアサイズが０．１〜
２０μｍである請求項２〜４のいずれかに記載の移植用
組織等価物の製造方法。 - 【請求項６】 前記培養は、前記液体培地を常に又は適
時撹拌しながら行う請求項１〜５のいずれかに記載の移
植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項７】 前記細胞培養担体は、前記培養容器１つ
に対して複数個配置する請求項１〜６のいずれかに記載
の移植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項８】 前記細胞培養担体は、三次元形状である
請求項１〜７のいずれかに記載の移植用組織等価物の製
造方法。 - 【請求項９】 前記細胞培養担体は、ゲルの形態を有
し、前記移植対象細胞が包埋されている請求項１〜８の
いずれかに記載の移植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項１０】 前記細胞培養担体は、生体吸収性材料
又は生体親和性材料である請求項１〜９のいずれかに記
載の移植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項１１】 前記細胞培養担体は、コラーゲン、ヒ
アルロン酸及びポリロタキサンの少なくとも１種以上で
構成されている請求項１〜１０のいずれかに記載の移植
用組織等価物の製造方法。 - 【請求項１２】 前記細胞培養担体は、前記培養工程に
より略全周にわたって前記移植対象細胞を含む細胞層を
形成する請求項１〜１１のいずれかに記載の移植用組織
等価物の製造方法。 - 【請求項１３】 前記細胞層は、前記移植対象細胞から
産生された細胞基質を含んでなる請求項１２に記載の移
植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項１４】 前記細胞層は、厚さが２０〜５００μ
ｍである請求項１２又は１３に記載の移植用組織等価物
の製造方法。 - 【請求項１５】 前記細胞は、軟骨細胞、骨芽細胞、線
維芽細胞又はこれらの前駆細胞である請求項１〜１４の
いずれかに記載の移植用組織等価物の製造方法。 - 【請求項１６】 液体培地を透過可能なフィルタと、 培養容器の縁に引っ掛けられ、前記培養容器の底面から
離れた状態で前記フィルタを支持する引っ掛け部材とを
備えた移植用組織等価物の製造用器具。 - 【請求項１７】 液体培地を透過可能なフィルタと、 培養容器の底面に立てられ、前記培養容器の底面から離
れた状態で前記フィルタを支持する支持脚部材とを備え
た移植用組織等価物の製造用器具。 - 【請求項１８】 前記フィルタは、ポアサイズが０．１
〜２０μｍである請求項１６又は１７に記載の移植用組
織等価物の製造用器具。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001333362A JP2003135056A (ja) | 2001-10-30 | 2001-10-30 | 移植用組織等価物の製造方法及びその製造用器具 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001333362A JP2003135056A (ja) | 2001-10-30 | 2001-10-30 | 移植用組織等価物の製造方法及びその製造用器具 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003135056A true JP2003135056A (ja) | 2003-05-13 |
Family
ID=19148632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001333362A Pending JP2003135056A (ja) | 2001-10-30 | 2001-10-30 | 移植用組織等価物の製造方法及びその製造用器具 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003135056A (ja) |
Cited By (17)
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| JP2005095152A (ja) * | 2003-08-29 | 2005-04-14 | Japan Tissue Engineering:Kk | 培養組織の保存方法 |
| WO2005095577A1 (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Japan Tissue Engineering Co., Ltd. | 培養容器、軟骨細胞培養方法および軟骨細胞評価方法 |
| WO2012147878A1 (ja) * | 2011-04-27 | 2012-11-01 | 株式会社メニコン | 細胞培養器 |
| CN107109340A (zh) * | 2014-10-29 | 2017-08-29 | 康宁股份有限公司 | 球状体捕获插入件 |
| KR20180027387A (ko) * | 2016-09-06 | 2018-03-14 | 한국화학연구원 | 세포 배양 용기 |
| CN108251305A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-07-06 | 常州市武进人民医院 | 原代细胞培养用组织龛笼 |
| US11345880B2 (en) | 2017-07-14 | 2022-05-31 | Corning Incorporated | 3D cell culture vessels for manual or automatic media exchange |
| US11441121B2 (en) | 2013-04-30 | 2022-09-13 | Corning Incorporated | Spheroid cell culture article and methods thereof |
| US11584906B2 (en) | 2017-07-14 | 2023-02-21 | Corning Incorporated | Cell culture vessel for 3D culture and methods of culturing 3D cells |
| US11613722B2 (en) | 2014-10-29 | 2023-03-28 | Corning Incorporated | Perfusion bioreactor platform |
| US11661574B2 (en) | 2018-07-13 | 2023-05-30 | Corning Incorporated | Fluidic devices including microplates with interconnected wells |
| US11732227B2 (en) | 2018-07-13 | 2023-08-22 | Corning Incorporated | Cell culture vessels with stabilizer devices |
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| US11976263B2 (en) | 2014-10-29 | 2024-05-07 | Corning Incorporated | Cell culture insert |
-
2001
- 2001-10-30 JP JP2001333362A patent/JP2003135056A/ja active Pending
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPWO2012147878A1 (ja) * | 2011-04-27 | 2014-07-28 | 株式会社メニコン | 細胞培養器 |
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| KR101956304B1 (ko) * | 2016-09-06 | 2019-03-11 | 한국화학연구원 | 세포 배양 용기 |
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