WO2012147878A1 - 細胞培養器 - Google Patents

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cell
cells
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永井　祐介
成瀬　恵治
高橋　賢
英二郎 徳山
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株式会社メニコン
国立大学法人岡山大学
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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
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    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture vessel capable of culturing cells with high survival rate in a gel.
  • a gel such as collagen is used as a scaffold material (scaffold)
  • a cell suspension gel is prepared by mixing cells and gel, and the cell suspension gel is immersed in a liquid medium. Done. At that time, the cell suspension gel may be put into the plastic petri dish, and a cell culture may be performed by pouring a liquid medium from above.
  • the cell suspension gel is stretched and placed inside.
  • a cell suspension gel is placed in a three-dimensional incubator (see Patent Document 1) for the purpose of applying mechanical stimulation to cells, and a liquid medium is poured thereon, and if necessary, the three-dimensional incubator is installed. There is a method in which cell culture is performed while stretching.
  • the three-dimensional incubator is required to uniformly apply stress to cells in a gel serving as a cell scaffold. Therefore, there has been proposed a cell culture device that is formed in a rectangular box shape with a deformable material, includes a bottom membrane and a side wall standing from the entire periphery of the bottom membrane, and an inner surface of the side wall is formed to be porous.
  • Patent Document 1 In the above-described prior art cell culture device, a plastic petri dish or an existing three-dimensional culture device (Patent Document 1), only the upper surface of the gel containing cells is in contact with a liquid medium that supplies nutrients to the cells. There is a problem that the cell viability of the cultured cells is low because nutrients are supplied only from one side of the gel exposed to the medium, and nutrients are not sufficiently supplied to cells in the center, lower part, etc. of the gel. .
  • the present invention was made in view of the above-mentioned problems in conventional cell culture vessels, and compared to the prior art, sufficiently supplies nutrients to cells in the center, lower part, etc. of the gel, It is an object of the present invention to provide a cell culture device that can maintain a high cell viability of cultured cells.
  • the present invention An incubator for carrying out cell culture, comprising: a container that can contain a liquid medium; and a cell suspension holding member that is supported by the inner surface of the container and holds the cell suspension, When the incubator is filled with a liquid medium, the cell suspension held by the cell suspension holding member exposes the outer surface facing the liquid medium.
  • the cell viability of the cultured cells can be maintained high compared to the prior art, and the cells in the gel can be easily and efficiently extended to give mechanical stimulation. it can.
  • the culture vessel and the cell suspension holding member can be modified.
  • the outer surfaces of the opposite positions of the cell suspension are the upper surface and the bottom surface of the cell suspension.
  • the outer surface of the opposite position of the cell suspension is a side surface of the cell suspension.
  • the outer surface of the opposite position of the cell suspension is the upper surface, bottom surface and side surface of the cell suspension.
  • the cell suspension is a gel.
  • the cultured cells can be extended from the outside of the cell culture vessel, and mechanical stimulation can be easily and more efficiently given to the cultured cells.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II in FIG. It is a perspective view of the cell culture device of a 2nd embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view taken along line IV-IV in FIG. It is a top view of the cell culture device of a 3rd embodiment of the present invention. It is a perspective view of the cell culture device of 4th Embodiment of this invention.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view taken along line VII-VII in FIG. 6.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view taken along line VIII-VIII in FIG.
  • the cell culture device of the first embodiment includes a culture vessel 2, a gel holding member 4 that holds a gel that is a cell suspension, and a gel 6 that is a cell suspension.
  • the culture vessel 2 is made of a material such as silicon elastomer or PDMS (Polydimethylsiloxane).
  • an incubator STB-CH-04 manufactured by Strex Co., Ltd. can be used as the culture vessel 2.
  • the stress device (not shown) is for applying stress to the culture vessel 2 to deform the culture vessel 2 and a gel holding member 4 described later.
  • the gel holding member 4 was prepared by cutting a foamed silicon sheet (SSP-2.0S, SSP-4.0S) manufactured by AS ONE Corporation.
  • the gel holding member 4 has a width of about 1.5 mm, a height of about 2.0 mm, and a length equal to the length of the liquid medium space 10 and 20 mm.
  • a gel holding hole 20 penetrating vertically with a width of about 1.0 mm is provided in the central portion extending in the length direction of the gel holding member 4.
  • the gel holding member 4 is adhered to the inner side wall of the culture vessel 2 that forms the liquid medium space 10.
  • silicon resin TSE3032 (A) and TSE3032 (B) manufactured by Momentive Performance Material Japan G.K. is used, and the TSE3032 (A) and TSE3032 (B) are mixed at a ratio of 10: 1.
  • the mixed solution is applied to the bonded portion and heated at 60 ° C. for 1 hour.
  • Gel 6 suspends cells three-dimensionally therein, and is a self-assembled peptide gel, collagen gel, or the like.
  • the gel 6 is disposed in the gel holding hole 20 of the gel holding member 4.
  • the cell culture device of the second embodiment will be described with reference to FIGS. 3 and 4, and the same reference numerals as in the first embodiment are attached to FIGS. 3 and 4 for the same configuration as in the first embodiment. Therefore, the description is omitted.
  • the gel holding member 24 is formed with a gel holding round hole 26 penetrating vertically in the center.
  • a support pole member 30 having an upper end surface 27 coinciding with the upper surface of the gel holding member 24 and a lower end surface 28 reaching the bottom surface of the liquid medium space 10 is disposed.
  • the cell culture device of the third embodiment will be described with reference to FIG. 5, but the same components as those of the first embodiment will be denoted by the same reference numerals as those of the first embodiment in FIG. To do.
  • the gel holding member 44 is supported so that there is a gap between the gel holding member 44 and the bottom of the liquid culture medium space 10 as in the first embodiment.
  • the gel holding member 44 is wider than the gel holding member 14 of the first embodiment, and has triangular notches 46 on both sides.
  • a W-shaped gel holding gap 48 is formed at the center of the gel holding member 44.
  • the gel holding member 104 silicon resin (TSE3032 (A) and TSE3032 (B)) manufactured by Momentive Performance Material Japan GK was used. A silicon resin obtained by mixing TSE3032 (A) and TSE3032 (B) at a ratio of 10: 1 and placing the mixture in a mold and heating at 60 ° C. for 2 hours was used.
  • the gel holding member 104 has a width of about 3.0 mm, a height of about 2.0 mm, and a length that is 20 mm, which is equal to the length of the liquid medium space 10. In the central portion extending in the length direction of the gel holding member 104, a vertically holding gel holding hole 120 having a width of about 1.0 mm is provided.
  • the gel holding member 104 is further provided with a plurality of 1.0 mm horizontal through holes 130 extending in the horizontal direction and penetrating the gel holding member 104 and intersecting the gel holding holes 120.
  • the horizontal through hole 130 acts to partially expose the cells suspended on the side surface of the gel 6 inserted into the gel holding hole 120 to the liquid medium.
  • the gel holding member 104 is adhered to the inner side wall of the culture vessel 2 that forms the liquid medium space 10.
  • silicon resin TSE3032 (A) and TSE3032 (B) manufactured by Momentive Performance Material Japan G.K. is used, and the TSE3032 (A) and TSE3032 (B) are mixed at a ratio of 10: 1.
  • the mixed solution is applied to the bonded portion and heated at 60 ° C. for 1 hour.
  • the first cell culture device is the cell culture device of the first embodiment according to the present invention.
  • the gel holding member 4 ′ and the gel 6 ′ are brought into contact with the bottom surface of the liquid medium space 10 ′, and the cells suspended in the gel 6 ′ are transferred from the liquid medium. It is estimated that sufficient nutrition is not provided.
  • mouse myoblasts (C2C12) were mixed with self-assembling peptide gel (Menicon, PanaceaGel SPG178, final concentration 0.27%) at 2 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • 60 uL of the mixed gel was added to the gap between the foamed silicon sheets using a pipette. Thereafter, about 3 mL of liquid medium (DMEM + 10% FCS) was added, the mixed gel was immersed in the liquid medium, placed in a 37 ° C. incubator (CO2 concentration 5%), and cultured for 3 days.
  • DMEM + 10% FCS liquid medium
  • FIG. 10 is a cross-sectional image of a gel by the first cell culture device of the first embodiment according to the present invention.
  • FIG. 11 is a cross-sectional image of a gel obtained by a second cell incubator according to the prior art. In these stained images, the white part indicates a living cell, and the dotted line indicates the boundary of the gel bottom. In these stained images, it can be seen that the cell viability by the first cell culture device of the first embodiment according to the present invention is much higher than the cell viability by the second cell culture device of the prior art.

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Abstract

　ゲルの中心部、下方部等にある細胞にも栄養を十分に供給して、培養された細胞の細胞生存率を高く維持し、かつゲル内の細胞に容易にかつ効率的に伸展させて機械刺激を与えることができる細胞培養器を提供すること。　液体培地を入れることができる容器と、該容器の内面により支持され、細胞懸濁体を保持するための細胞懸濁体保持部材を有する、細胞培養を行うための培養器であって、　液体培地で該培養器を満たした際に、前記細胞懸濁体保持部材に保持された細胞懸濁体が、液体培地に対し対向する外面を露出することを特徴とする培養器。

Description

細胞培養器
　本発明は、ゲル内で細胞を高い生存率で培養することができる細胞培養器に関する。
　従来、細胞の二次元培養はプラスチック製シャーレなどを用いて行われている。
　一方、細胞の三次元培養では足場となる材料（スキャホールド）としてコラーゲン等のゲルを使用し、細胞とゲルを混ぜ合わせた細胞懸濁ゲルを調製し、該細胞懸濁ゲルを液体培地に浸して行われる。その際、該細胞懸濁ゲルを前記プラスチック製シャーレに入れて、その上から液体培地を注いで細胞培養を行うこともあれば、別の方法では、細胞懸濁ゲルを伸展し、内部にある細胞へ機械刺激を加えることを目的とした、三次元培養器（特許文献１参照）に細胞懸濁ゲルを入れ、その上から液体培地を注ぎ、さらに必要に応じて、該三次元培養器を伸展させながら細胞培養を行う方法がある。
　前記三次元培養器は、細胞の足場となるゲルにおいて、細胞へ均一に応力をかけることが求められる。そのため、変形可能な材料で矩形箱状に形成され、底膜及び該底膜の全周縁から立設する側壁を備え、側壁の内面が多孔質に形成された細胞培養器が提案されている。
再公表ＷＯ２００７／１２３０３５号公報
　上述した従来技術の細胞培養器である、プラスチック製シャーレや既存の三次元培養器（特許文献１）は細胞を包含するゲルの上面のみが、細胞に栄養を供給する液体培地と接触し、液体培地へ露出したゲルの一面のみから栄養が供給され、ゲルの中心部、下方部等にある細胞には栄養が十分に供給されないことから培養された細胞の細胞生存率が低いという問題があった。
（発明の目的）
　本発明は、従来の細胞培養器における上述した問題に鑑みなされたものであって、従来技術に比較して、ゲルの中心部、下方部等にある細胞にも栄養を十分に供給して、培養された細胞の細胞生存率を高く維持できる細胞培養器を提供することを目的とする。
　本発明は、
　液体培地を入れることができる容器と、該容器の内面により支持され、細胞懸濁体を保持するための細胞懸濁体保持部材とを有する、細胞培養を行うための培養器であって、
　該培養器を液体培地で満たした際に、前記細胞懸濁体保持部材に保持された細胞懸濁体が、液体培地に対し対向する外面を露出することを特徴とする培養器である。
　本発明の細胞培養器によれば、従来技術に比較して培養された細胞の細胞生存率が高く維持し、かつゲル内の細胞に容易にかつ効率的に伸展させて機械刺激を与えることができる。
（発明の実施態様）
　前記課題を解決するための手段において、前記培養容器及び前記細胞懸濁体保持部材が、変型可能であることを特徴とする。
　前記課題を解決するための手段において、前記細胞懸濁体の対向する位置の外面が、前記細胞懸濁体の上面と底面であることを特徴とする。
　前記課題を解決するための手段において、前記細胞懸濁体の対向する位置の外面が、前記細胞懸濁体の側面であることを特徴とする。
　　前記細胞懸濁体の対向する位置の外面が、前記細胞懸濁体の上面、底面及び側面であることを特徴とする。
　前記課題を解決するための手段において、前記細胞懸濁体が、ゲルであることを特徴とする。
　このように構成することによって、細胞培養器の外部から培養細胞の伸展を行い、培養細胞により容易にかつより効率的に機械刺激を与えることができる。
本発明の第１実施形態の細胞培養器の斜視図である。 図１の線II－IIに沿った断面図である。 本発明の第２実施形態の細胞培養器の斜視図である。 図３の線IV－IVに沿った断面図である。 本発明の第３実施形態の細胞培養器の平面図である。 本発明の第４実施形態の細胞培養器の斜視図である。 図６の線VII－VIIに沿った断面図である。 図６の線VIII－VIIIに沿った断面図である。 比較試験のための従来技術の細胞培養器の断面図である。 比較試験の本発明の第１実施形態の細胞培養器のゲルの写真である。 比較試験の従来技術の細胞培養器のゲルの写真である。
（第１実施形態）
　第１実施形態の細胞培養器は、図１及び図２に示すように、培養容器２、細胞懸濁体であるゲルを保持するゲル保持部材４、及び細胞懸濁体であるゲル６を有する。
　培養容器２は、シリコンエラストマー、ＰＤＭＳ(Polydimethylsiloxane)等の材料で作成される。培養容器２は、ストレックス株式会社製造の培養器ＳＴＢ－ＣＨ－０４を使用することも可能である。ストレックス株式会社製造の培養器ＳＴＢ－ＣＨ－０４は、縦25ｍｍ、横40ｍｍ、高さ12ｍｍの略直方体であり、中央部に液体培地空間１０を形成する縦20ｍｍ、横20ｍｍ、深さ10ｍｍの凹部が形成されている。培養容器２の四隅には、培養容器２を応力装置（図示せず）にねじ固定するためのねじ止め孔１２が形成されている。前記応力装置（図示せず）は、培養容器２に応力を与えて、培養容器２及び後述するゲル保持部材４を変形させるためのものである。
　ゲル保持部材４は、アズワン株式会社製の発泡シリコンシート（SSP-2.0S、SSP-4.0S）を切断して作成した。ゲル保持部材４は、幅約1.5ｍｍ、高さ約2.0ｍｍ、長さは液体培地空間１０の縦と等しく20ｍｍである。ゲル保持部材４の長さ方向に延びる中央部には、幅約1.0ｍｍの上下貫通のゲル保持孔２０が設けられている。
　ゲル保持部材４は、液体培地空間１０を形成する培養容器２の内側側壁へ接着される。接着剤は、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアル・ジャパン合同会社製のシリコン樹脂（TSE3032(A)及びTSE3032(B)）を使用し、TSE3032(A)とTSE3032(B)を１０：１で混合した後に該混合液を接着部に塗布し、６０℃で１時間加温する。
　ゲル６は、その中に細胞を三次元的に懸濁させるものであり、自己組織化ペプチドゲル、コラーゲンゲル等である。ゲル６は、ゲル保持部材４のゲル保持孔２０内に配置される。
（第２実施形態）
　第２実施形態の細胞培養器は、図３及び図４を使用して説明するが、第１実施形態と同一の構成については、図３及び図４に第１実施形態と同一の符号を付してその説明を省略する。
　ゲル保持部材２４は、中心に上下貫通したゲル保持丸孔２６が形成されている。ゲル保持丸孔２６の中には、上端面２７がゲル保持部材２４の上面と一致し、下端面２８が液体培地空間１０の底面に到達した支持ポール部材３０が配置される。ゲル保持丸孔２６と支持ポール部材３０の間には間隙３２があり、間隙３２にゲル６が配置される。
（第３実施形態）
　第３実施形態の細胞培養器は、図５を使用して説明するが、第１実施形態と同一の構成については、図５に第１実施形態と同一の符号を付してその説明を省略する。
　ゲル保持部材４４は、第１実施形態のゲル保持部材１４と同じく液体培地空間１０の底部との間に間隔があるように支持されている。ゲル保持部材４４は、第１実施形態のゲル保持部材１４より幅広であり、両側に三角形の切り込み４６がある。ゲル保持部材４４の中央部には、Ｗ形ゲル保持隙間４８が形成されている。
（第４実施形態）
　第４実施形態の細胞培養器は、図６ないし図８を使用して説明するが、第１実施形態と同一の構成については、図６ないし図８に第１実施形態と同一の符号を付してその説明を省略する。
　ゲル保持部材１０４は、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアル・ジャパン合同会社製のシリコン樹脂（TSE3032(A)及びTSE3032(B)）を使用した。TSE3032(A)とTSE3032(B)を１０：１で混合し、該混合液をモールド型に入れた後に、６０℃で２時間加温して得られたシリコン樹脂を用いた。ゲル保持部材１０４は、幅約3.0ｍｍ、高さ約2.0ｍｍ、長さは液体培地空間１０の縦と等しく20ｍｍである。ゲル保持部材１０４の長さ方向に延びる中央部には、幅約1.0ｍｍの上下貫通のゲル保持孔１２０が設けられている。ゲル保持部材１０４にはさらに、水平方向に延びて貫通し、ゲル保持孔１２０と交差する複数の1.0ｍｍの水平貫通孔１３０が設けられている。水平貫通孔１３０は、ゲル保持孔１２０に挿入されたゲル６の側面に懸濁された細胞を、部分的に液体培地に露出させるように作用する。
　ゲル保持部材１０４は、液体培地空間１０を形成する培養容器２の内側側壁へ接着される。接着剤は、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアル・ジャパン合同会社製のシリコン樹脂（TSE3032(A)及びTSE3032(B)）を使用し、TSE3032(A)とTSE3032(B)を１０：１で混合した後に該混合液を接着部に塗布し、６０℃で１時間加温する。
（比較試験）
　本発明の細胞培養器によって、ゲルの中心部及び下方部にある細胞にも栄養を十分に供給されて培養された細胞の細胞生存率を高いこと確認するために、以下の比較試験を行った。
　第１細胞培養器は、本発明に係る前記第１実施形態の細胞培養器である。第２細胞培養器は、図９に示すように、ゲル保持部材４’及びゲル６’が、液体培地空間１０’の底面に接触して、ゲル６’に懸濁された細胞に液体培地から十分な栄養が供給されないことが推定される。
　第１細胞培養器及び第２細胞培養器において、マウス筋芽細胞（C2C12）を、2x106 cells/mLで自己集合性ペプチドゲル（メニコン、PanaceaGel SPG178、最終濃度0.27%）に混合した。混合されたゲル６０uLを、発泡シリコンシートの隙間にピペットを用いて加えた。その後、液体培地（DMEM+10%FCS）を約3mL加えて、混合ゲルを液体培地に浸し、３７℃のインキュベーター（CO2濃度 5%）にいれて、３日間培養した。
　３日後、液体培地を取り除き、代わりに生細胞染色色素（同仁化学、Calcein-AM）を  8.3 ug/mL　(1mg/mLの濃度の液50uLを6mLのDMEMに溶解)の濃度で溶解させたDMEMを、約3mL加え、37℃のインキュベーター（CO2濃度 5%）で30分間加温した。
　その後、ゲルを発泡シリコンシートの間隙から取り出し、メスで輪切りにした後、底面部分の生細胞の分布を、オリンパス製の共焦点レーザー顕微鏡FLUOVIEW　FV1000で観察した。図１０は、本発明に係る前記第１実施形態の第１細胞培養器によるゲルの断面像である。図１１は、従来技術の第２細胞培養器によるゲルの断面像である。これらの染色像において、白い部分は、生細胞を示し、点線は、ゲル底面の境界を示す。これらの染色像において、本発明に係る前記第１実施形態の第１細胞培養器による細胞生存率が、従来技術の第２細胞培養器による細胞生存率より遙かに高いことが読み取れる。
２　　　　　培養容器
４　　　　　ゲル保持部材
６　　　　　ゲル
１０　　　　液体培地空間
１２　　　　ねじ止め孔
２０　　　　ゲル保持孔
２４　　　　ゲル保持部材
２６　　　　ゲル保持丸孔
２７　　　　上端面
２８　　　　下端面
３０　　　　支持ポール部材
３２　　　　間隙
４４　　　　ゲル保持部材
４８　　　　Ｗ形ゲル保持隙間
１０４　　　ゲル保持部材
１２０　　　ゲル保持孔
１３０　　　水平貫通孔

Claims (6)

  1. 　液体培地を入れることができる容器と、該容器の内面により支持され、細胞懸濁体を保持するための細胞懸濁体保持部材を有する、細胞培養を行うための細胞培養器であって、
    　該培養器を液体培地で満たした際に、前記細胞懸濁体保持部材に保持された細胞懸濁体が、その対向する外面を液体培地に対し露出することを特徴とする培養器。
  2. 　前記培養容器及び前記細胞懸濁体保持部材が、変型可能であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器。
  3. 　前記細胞懸濁体の対向する位置の外面が、前記細胞懸濁体の上面と底面であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器。
  4. 　前記細胞懸濁体の対向する位置の外面が、前記細胞懸濁体の側面であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器。
  5. 　前記細胞懸濁体の対向する位置の外面が、前記細胞懸濁体の上面、底面及び側面であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器。
  6. 　前記細胞懸濁体が、ゲルであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器。
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