KR101894279B1 - 산소 투과도 조절이 가능한 3차원 세포배양 칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상부로 세포가 수용되는 웰을 가지는 웰 구조물; 및
상기 웰의 하부를 외부로 노출시키도록 웰 구조물을 지지하는 프레임을 포함하는 세포배양 칩에 관한 것으로, 상기 세포배양 칩은 산소 투과도 조절이 가능하며, 3차원 세포집합체를 대용량(high-throughput)으로 형성이 가능하다.

Description

산소 투과도 조절이 가능한 3차원 세포배양 칩{Oxygen permeability controllable chip for 3D cell culture}

본 발명은 세포 배양 플랫폼 제작에 관한 것이며, 보다 상세하게는 산소 투과도 조절이 가능한 세포배양 칩을 이용하여 3차원 세포집합체를 대용량(high-throughput)으로 형성이 가능한 시스템에 관한 것이다.

생체의 조직 및 장기는 세포를 기본 단위로 하여 세포외기질과 함께 구성되어 있다. 최근, 기존의 2차원에서 배양된 세포와 3차원에서 배양된 세포를 비교하였을 때, 세포의 생존율 및 단백질 분비량의 차이가 난다는 연구들이 발표됨에 따라 3차원 세포 배양기술에 관심이 집중되고 있다. 3차원으로 배양된 세포가 생체를 더욱 비슷하게 모사한다는 사실 때문에 세포를 3차원으로 만들기 위한 플랫폼들이 개발되고 있다. 회전플라스크(rotating flask), 표면개질(surface modification), 행잉드랍(hanging drop) 기술은 3차원 세포 배양이 가능하게 하지만, 세포 집합체의 사이즈를 컨트롤하기 힘들거나 매우 노동 집약적이며 미디어 교체에 어려움이 있다.

다른 방법으로는 마이크로웰 플레이트가 개발됨에 따라 일정한 세포집합체 크기를 비교적 간단히 제작할 수 있다. 하지만 마이크로웰 플레이트는 폴리스티렌이나 폴리프로필렌으로 제작되어 산소의 투과도가 상당히 낮다. 세포 배양에 있어 산소는 세포의 성장 및 증식, 기능에 있어 중요한 역할을 한다. 세포의 대사에 필요한 충분한 산소가 공급되지 않으면 산소의 규제를 담당하는 이온채널을 통해 반응을 하게 되고 세포가 손상을 입게 되어 유전자, 단백질 발현에 이상이 발생하게 된다. 이에 배양되는 세포에 산소를 효율적으로 전달하기 위해 많은 여러 연구가 진행되고 있다. 산소 투과를 높이기 위해 진행된 기존의 연구로서, 얇은 막을 제작하고 그 위에 세포를 배양하는 2차원적 배양법이 있다. 또한, 3차원 배양을 위해 PDMS를 이용하여 오목한 마이크로웰을 이용한 방법(특허문헌 1)이 있다. 그러나 상기 방법은 PDMS의 두께가 약 1.5 mm로 충분히 얇지 못하여 세포 공급이 원활하지 않다.

또한 몸속의 세포는 조직마다 다른 산소분압을 공급받고 있다. 생리학적으로 폐는 13%, 간은 10~13%, 정맥은 5%, 뇌는 0.5~7% 의 산소농도를 유지하고 있는데, 이를 모사하기 위해서는 산소 투과도 조정이 가능해야한다.

1. 한국공개특허 제10-2013-0013537호

본 발명은 산소 투과도 조절이 가능하며, 3차원 세포집합체를 대용량(high-throughput)으로 형성이 가능 세포배양 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상부로 세포가 수용되는 웰을 가지는 웰 구조물; 및

상기 웰의 하부를 외부로 노출시키도록 웰 구조물을 지지하는 프레임을 포함하는 세포배양 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 웰을 가지는 웰 구조체에 포토레지스트를 채워 넣고 경화하여, 돌출부를 가지는 몰드를 제조하는 단계;

상기 몰드에 폴리머 코팅막을 형성하는 단계;

상기 몰드에 돌출부보다 높이가 높은 프레임을 형성하고, 상기 프레임 안쪽으로 폴리머를 주입하는 단계; 및

경화 후 몰드를 제거하는 단계를 포함하는 세포배양 칩의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 세포배양 칩의 웰에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법을 제공한다.

종래 3차원 세포 배양을 위한 마이크로웰 플레이트는 PDMS를 이용하여 웰의 하부를 오목하게 제조하였다. 상기 마이크로웰 플레이트의 바닥 두께는 약 1.5 mm로 얇게 제작되었지만, 충분한 산소공급이 이루어지지 않았다. 또한, 상기 플레이트를 이용하기 위해서는 일반적으로 사용되는 Perti dish의 가운데에 크게 구멍을 뚫어야지만 사용할 수 있었다.

본 발명에 따른 세포배양 칩을 사용하면 하기와 같은 효과를 가질 수 있다.

첫째, 웰 구조물의 바닥 두께를 최소 5 μm로 제작이 가능하며, 산소 투과도의 극대화가 가능하다.

둘째, 웰 구조물의 바닥 두께를 5 내지 3000 μm, 또는 10 내지 1500 μm 로 조정이 가능하며, 이에 따라 제작하고자하는 세포에 필요한 산소 공급을 원할하게 할 수 있다.

셋째, 기존 얇은 막을 이용한 세포배양은 막이 매우 쉽게 찢어지고 구멍이 나기 때문에 컨트롤이 매우 힘든 단점이 있었다. 본 발명에서는 특정 부분만 바닥을 얇게 제작하여 안정적인 컨트롤이 가능하다.

넷째, 본 발명에서는 웰 구조물의 하부에 프레임을 일체형으로 제작할 수 있다. 웰 구조물에서 웰이 형성된 부분은 프레임과 붙지 않고 공중에 위치함으로써, 산소를 원할히 공급받을 수 있으며 이에 따라 안정적인 3차원 세포배양이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일례에 따른 세포배양 칩의 제조 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 비교예 및 실시예에 따른 세포배양 칩의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 세포배양 칩에서 웰 구조물의 바닥 두께(H)의 계산을 위한 과정을 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 다양한 바닥 두께를 가지는 세포배양 칩의 사진 및 이를 정량화한 그래프이다.
도 5는 산소 투과 실험 개요(a, b), 세포배양 칩의 바닥 두께에 따른 산소 투과 속도 그래프(c), 세포 배양시 바닥 두께에 따른 산소 분포도 시뮬레이션 결과 그래프(d) 및 상기 (d)에서 A-A’선을 기준으로한 산소 분포도(e)이다.
도 6은 배양 일자별 세포집합체의 사진 및 생존율 염색 사진으로, 세포 집합체의 표면을 SEM으로 촬영한 사진(스케일바: 10 μm) (a), 산소 공급 7일 및 14일차 세포집합체의 모양의 비율을 나타내는 그래프(b), 세포를 염색한 사진(c) 및 상기 (c)에서 염색한 사진을 바탕으로 분석한 세포 생존율 그래프(d)이다.
도 7은 세포배양 칩의 바닥 두께에 따른 세포사멸인자(a) 및 저산소증(b) 발현 마커 염색 결과를 나타내는 사진이다(스케일바: 100 μm).

본 발명은 상부로 세포가 수용되는 웰을 가지는 웰 구조물; 및

상기 웰의 하부를 외부로 노출시키도록 웰 구조물을 지지하는 프레임을 포함하는 세포배양 칩에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 세포배양 칩을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 웰 구조물은 세포가 3차원적으로 배양할 수 있는 웰을 하나 이상 포함한다. 상기 웰 구조물에서 세포는 상부에 형성된 웰의 개구를 통해 수용될 수 있다.

상기 웰 구조물은 웰을 하나 이상 포함할 수 있으며, 구체적으로 복수개 포함할 수 있다. 상기 웰 구조물은 복수의 웰의 어레이를 형성할 수 있다.

본 발명에서 웰 구조물은 당 업계에서 일반적으로 사용되는 마이크로 유체칩 또는 마이크로웰 플레이트의 형상을 지닐 수 있다. 특히 마이크로 유체칩의 형상을 지닐 경우, 내부에 있는 유로에 동일한 유량을 공급함으로서 세포를 거의 동일하게 공급할 수 있고, 세포집합체를 동일한 크기로 생산할 수 있으며, 동시에 세포집합체의 대량 생산이 가능하다.

상기 웰 구조물의 웰의 하부, 구체적으로 웰의 바닥면의 형상은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 오목한 형상을 가질 수 있다. 종래 웰 구조물에서 웰의 바닥면은 평평한 형상을 지니거나 펠렛과 같이 원뿔형인 경우가 많다. 이러한 웰 구조물은 모서리를 가지고 있으므로 세포들이 부착되어 떨어져 나오기 쉽지 않다는 문제점을 가진다. 본 발명에서는 웰의 바닥면이 오목한 형상을 지님으로서 세포의 부착을 방지하고, 웰 구조물의 바닥 두께를 보다 얇게하여 산소 투과도를 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 오목 형상은 웰 상부의 개구로부터 오목 형상이 시작되어 웰의 한 단면이 반구형 또는 반타원형일 수 있으며, 또는 원통형의 웰의 하부 부분이 반구형 또는 반타원형을 형성할 수 있다. 본 발명에서, 반구형 또는 반타원형 등의 도형을 나타내는 용어는 기하학적으로 완벽한 반구형 또는 반타원형의 도형을 의미하는 것은 아니며, 이에 가깝다고 볼 수 있는 도형까지 모두 포함한다.

또한, 웰의 개구의 형상은 특별히 제한되지 않으며, 원형, 타원형 또는 다각형의 형상을 지닐 수 있다.

본 발명에서, 웰 구조물의 재질은 웰의 하부로 산소가 투과될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 폴리디메틸실록산(Polydemethylsiloxane, PDMS), 폴리에틸렌(PE), 폴리스티렌(PS), 폴리프로필렌(PP), 아가로스 또는 콜라겐을 사용할 수 있다. 상기 PDMS는 산소투과도가 약 933 barrer로, 높은 산소투과도를 가지므로 본 발명의 웰 구조물의 재질로 용이하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 웰 구조물은 낮은 산소투과도를 가지는 폴리스티렌(산소투과도 약 2.24 barrer) 및 폴리프로필렌(산소투과도 약 2.6 barrer)을 사용할 경우에도 세포배양이 가능한 장점을 가진다. 이때, 1barrer =

를 의미한다.

본 발명의 웰 구조물에서 웰의 너비 및 깊이는 특별히 제한되지 않으며, 웰에 저장되어야 하는 생체 세포의 종류(세포집합체의 형상이나 치수)를 고려하여 적절히 조절될 수 있다. 예를 들어, 상기 웰의 너비는 100 내지 1000 ㎛, 200 내지 600 ㎛, 또는 300 내지 500 ㎛일 수 있으며, 깊이는 100 내지 1000 ㎛, 200 내지 900 ㎛, 또는 300 내지 800 ㎛일 수 있다. 웰의 하부가 오목한 형상을 지닐 경우, 깊이는 웰의 개구로부터 오목 형상의 가장 깊은 부분까지의 거리를 의미한다.

또한, 웰 구조물의 바닥 두께(이하, 세포배양 칩의 바닥 두께라 표현할 수 있다.)는 특별히 제한되지 않으며, 웰에 저장되어야 하는 생체 세포의 종류를 고려하여 적절히 조절될 수 있다. 일반적으로 몸속의 세포는 조직마다 다른 산소분압을 공급받는데, 생리학적으로 폐는 13%, 간은 10~13%, 정맥은 5%, 뇌는 0.5~7%의 산소농도를 유지한다. 따라서, 세포집합체의 제조시 세포 종류에 따라 산소 투과도를 조정할 필요성이 있다. 본 발명에서는 웰 구조물의 바닥 두께를 조절함으로써 세포 종류에 따른 알맞은 세포집합체를 제조할 수 있다.

이러한 웰 구조물의 바닥 두께는 예를 들어, 5 내지 3000 μm, 5 내지 2000 μm, 10 내지 1500 μm, 10 내지 1000 μm일 수 있다. 상기 두께는 도 4에 나타난 바와 같이 웰의 오목 형상의 가장 깊은 부분에서 웰 구조물의 하부면까지의 거리를 의미힌다. 상기 바닥 두께에서 세포집합체의 배양이 유리하다.

또한, 웰 구조물의 상부면 및 하부면의 모양은 특별히 제한되지 않으며, 원형, 타원형 또는 다각형의 형상을 지닐 수 있다.

본 발명의 세포배양 칩은 전술한 웰 구조물의 하부면에 형성된 프레임을 포함한다. 상기 프레임은 웰의 하부를 외부로 노출시키도록 웰 구조물을 지지할 수 있다. 이에 따라 웰 구조물에서 웰이 형성된 부분에 대응되는 하부면은 외부로 노출되며, 이를 통해 산소가 웰 내로 용이하게 유입될 수 있다.

본 발명에서 프레임의 형상 및 위치는 웰 구조물을 안정적으로 지지할 수 있고, 웰의 하부가 외부로 노출된다면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 상기 프레임은 웰 구조물의 바닥 가장자리에 형성될 수 있다. 구체적으로 바닥 가장자리를 감싸도록 내부가 빈 원기둥의 모양으로 형성되거나, 바닥 가장자리에 2개 이상의 막대형의 프레임이 형성될 수 있다. 상기 원기둥 및 막대에는 산소의 원활한 이동을 위해 구멍이 형성될 수 있다.

상기 프레임의 높이는 1 내지 10 mm일 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 세포배양 칩의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 세포배양 칩은 웰 구조물 및 프레임을 결합 또는 접착하여 제조할 수 있다. 상기 웰 구조물 및 프레임은 시중에서 시판되는 제품을 사용하거나, 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 세포배양 칩은 하기 단계를 통해 제조될 수 있다.

(1) 웰을 가지는 웰 구조체에 포토레지스트를 채워 넣고 경화하여, 돌출부를 가지는 몰드를 제조하는 단계;

(2) 상기 몰드에 폴리머 코팅막을 형성하는 단계;

(3) 상기 몰드에 돌출부보다 높이가 높은 프레임을 형성하고, 상기 프레임 안쪽으로 폴리머를 주입하는 단계; 및

(4) 경화 후 몰드를 제거하는 단계

이에 제한되는 것은 아니나, 이해를 돕기 위해 이하 도 1을 예를 들어 본 발명에 따른 세포배양 칩의 제조 방법에 대해 설명한다.

단계 (1)에서 웰을 가지는 웰 구조체는 시중에서 시판되는 제품을 사용하거나, 제조하여 사용할 수 있다.

상기 웰 구조체에서 웰의 하부는 오목한 형상을 지닐 수 있다. 이러한 웰 구조체는 예를 들어 표면장력을 이용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 오목 형상은 웰의 하부가 평평한 웰 구조체의 웰 내부에 폴리머를 주입하고, 상기 폴리머의 일부를 웰로부터 제거하며, 남아있는 폴리머가 표면장력에 의해 메니스커스(meniscus)를 형성하도록 하고, 상기 메니스커스를 형성한 폴리머를 경화시키는 방법을 통해 제조할 수 있다(도 1의 첫줄 네 그림).

상기 하부가 평평한 웰을 가지는 웰 구조체는 시중에서 시판되는 제품을 사용하거나, 제조하여 사용할 수 있는데, 제조할 경우 당업계에서 일반적으로 사용되는 포토리소그래피 방법을 이용할 수 있다. 구체적으로, 포토리소그래피 방법으로 포토레지스트를 제작하고, 상기 포토레지스트에 폴리머를 도포한 뒤, 경화하여 웰의 하부가 평평한 웰 구조체를 제조할 수 있다. 상기 웰 구조체를 형성하는 폴리머는 PDMS, 폴리에틸렌(PE), 폴리스티렌(PS), 폴리프로필렌(PP), 아가로스 또는 콜라겐일 수 있으며, 구체적으로 PDMS일 수 있다.

상기 웰 구조체의 제조에 사용되는 폴리머 및 후술할 몰드와 웰 구조물의 제조시 사용되는 폴리머는 서로 상이한 종류일 수 있으나, 동일한 종류의 폴리머를 사용하는 것이 균일한 웰을 가지는 웰 구조체의 형성 및 비용적인 측면에서 바람직하다.

상기 웰 구조체의 제조시 사용되는 폴리머는 액상일 수 있으며, 구체적으로 프리폴리머일 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 폴리머로 PDMS 프리폴리머를 사용할 수 있다.

부연하면, 프리폴리머란 폴리머와 경화제의 혼합 상태로서, 고분자 중합체를 형성하는 과정에서 성형하기 쉽게 하기 위하여 중합 반응의 중도 단계에 있는, 비교적 중합도가 낮은 중합체를 말한다. 즉 고분자 중합체가 형성 완료된 단계에서는(유연성 및 탄성을 가지기는 하되) 고체 상태지만, 프리폴리머 단계에서는 점도가 높은 액체 상태를 유지한다.

PDMS 프리폴리머는 PDMS 및 경화제가 혼합된 상태에서 열을 가함으로써 고분자 중합 반응을 촉진시켜 제조할 수 있다. 이때, PDMS 및 경화제의 혼합액에 열을 가하기 전에는 액체 상태이며, 여기에서 약간만 열을 가하게 되면 점도가 높아지기는 하나 여전히 액체 상태를 유지한다. 즉, 본 발명에서는 중합 반응이 일부만 일어난 상태(즉 액체 상태를 유지하고 있는 상태)의 PDMS 및 경화제의 혼합액을 PDMS 프리폴리머라 할 수 있다.

본 발명에서 상기 프리폴리머는 폴리머 및 경화제를 5: 1 내지 15:1, 또는 8:1 내지 12:1의 함량비로 포함할 수 있다.

상기 웰의 하부를 오목 형상으로 제조시 사용되는 폴리머의 종류는, 표면장력에 의해 웰 내에 메니스커스를 형성할 수 있고, 열 또는 UV 등을 통해 경화될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 상기 폴리머로 웰 구조체를 형성하는 폴리머를 사용할 수 있으며, 상기 웰 구조체의 재질과 동일한 것을 사용하는 것이 좋다. 본 발명의 실시예에서는 상기 폴리머로 PDMS 프리폴리머를 사용할 수 있다.

한편, 웰 내에 채워진 폴리머의 일부는 메니스커스의 형성을 위해 적절한 양으로 웰 내에 남겨지는 것이 좋다. 처음부터 메니스커스의 형성을 위한 양으로 웰 내에 주입되도록 조절할 수 있으나, 일정한 크기의 웰의 제조를 위해서는 웰 구조체 내의 웰을 폴리머로 전체적으로 채운 후 일부를 제거해 내는 것이 보다 용이하다.

웰 내의 폴리머 중 일부를 제거하는 방법으로는, 웰 구조체의 상단을 판형 또는 원통형의 밀대로 누르면서 눌러 상기 폴리머를 웰로부터 제거할 수 있다.

제거 후 웰 내에 남아있는 폴리머는 웰 내에 메니스커스를 형성할 수 있을 정도로 남아야 하며, 동시에 세포를 배양할 수 있는 공간을 충분히 제공할 수 있도록 웰 내에 부피를 많이 차지하지 않아야 한다.

상기 폴리머, 구체적으로 프리폴리머를 경화시키는 방법은 사용되는 폴리머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 폴리머는 열 또는 UV에 의해 경화될 수 있으며, 이에 따라 웰의 하부를 오목 형상을 가지는 웰 구조체를 제조할 수 있다(도 1의 중간 줄 왼쪽 첫번째 그림).

본 발명에서 단계 (1)은 전술한 웰 구조체에 포토레지스트를 채워 넣고 경화하여, 돌출부를 가지는 몰드를 제조하는 단계이다.

상기 단계는 도 1의 중간줄 왼쪽 두번째 그림을 통해 확인할 수 있으며, 경화는 UV 조사를 통해 수행될 수 있다. 상기 몰드의 제조 후, 몰드와 웰 구조체를 용이하게 제거할 수 있다. 상기 제조된 몰드는 웰 구조체의 웰에 의해 돌출부가 형성된 구조를 가질 수 있다.

본 발명에서 단계 (2)는 몰드에 코팅막을 형성하는 단계이다.

상기 코팅막 물질로는 전술한 폴리머를 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 폴리머로 PDMS 프리폴리머를 사용할 수 있다.

상기 단계에서는 몰드 상에 폴리머를 부운 후, 스핀코팅을 수행하여 얇은 막을 형성할 수 있다(도 1의 중간줄 왼쪽 세번째, 네번째 그림). 이때, 막의 두께는 5 μm 이상, 또는 10 μm 이상일 수 있다. 상기 막 두께의 상한은 3000 μm, 2000 μm, 1500 μm, 1000 μm일 수 있다.

본 발명에서 단계 (3)은 몰드에 돌출부보다 높이가 높은 프레임을 형성하고, 상기 프레임 안쪽으로 폴리머를 주입하는 단계이다.

상기 프레임의 재질은 특별히 제한되지 않으며, 최종 제조되는 웰 구조물의 재질과 동일한 재질일 수 있다. 상기 프레임은 몰드 상에 형성된 코팅막 상에 형성될 수 있으며, 플라즈마 처리 등에 의해 코팅막에 부착될 수 있다.

상기 단계에서는 몰드의 가장자리를 감싸도록 내부가 빈 원기둥 모양의 프레임을 형성하거나, 몰드의 가장자리에 2개 이상의 막대형의 프레임을 형성할 수 있다. 상기 프레임은 몰드에 형성된 돌출부와는 접촉하지 않는 상태로 형성될 수 있다. 상기 프레임의 형성 후, 프레임 내부로 폴리머를 주입할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 상기 폴리머로 PDMS 프리폴리머를 사용할 수 있다(도 1의 마지막줄 왼쪽 첫번째, 두번째 그림).

본 발명에서는 프레임 내로 주입되는 폴리머에 의해 최종 제조되는 웰 구조물의 바닥 두께가 결정된다.

상기 제조되는 웰 구조물의 바닥 두께(H)는 하기 식 1에 의해 계산될 수 있다.

[식 1]

상기 식에서 H는 웰 구조물의 바닥 두께(mm)이고, V는 추가되는 폴리머의 함량(ml)이며, D는 몰드의 지름(mm)을 나타낼 수 있다.

상기 웰 구조물의 바닥 두께는 5 내지 3000 μm, 5 내지 2000 μm, 10 내지 1500 μm, 10 내지 1000 μm일 수 있다.

본 발명에서 단계 (4)는 경화 후 몰드를 제거하는 단계이다.

상기 경화는 전술한 경화 방법을 용이하게 이용할 수 있으며, 경화 후 몰드를 제거하여 웰의 하부에 공간이 형성되도록 웰 구조물를 지지하는 프레임을 포함하는 세포배양 칩을 제조할 수 있다(도 1의 마지막줄 왼쪽 세번째 그림).

또한, 본 발명에서는 제조된 세포배양 칩의 상부에 프레임을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다(도 1의 마지막줄 왼쪽 네번째 그림). 상기 프레임의 재질은 웰 구조물의 하부에 형성되는 프레임의 재질을 사용할 수 있다.

상기 프레임의 형성을 통해 웰 내부에서 세포의 배양시 세포가 자랄 수 있는 공간을 확보할 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 세포배양 칩의 웰에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 마이크로웰 어레의의 웰에 세포를 포함하는 배양액을 투입하고 배양할 수 있다. 상기 어레이에서 제조되는 세포집합체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 상기 세포배양 칩에 도입되는 세포는 췌장 세포, 간세포, 뉴런세포 또는 배아줄기세포일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

실시예

실시예 1. 세포배양 칩 제조

세포배양 칩은 도 1에 도시된 방법에 따라 제조하였다.

포토리소그래피 방법으로 두께가 500 μm인 다수의 웰(200 개)을 가지는 포토레지스트를 제작하였다. 상기 포토레지스트 위에 PDMS 프리폴리머(PDMS와 경화제(curing agent)의 함량비 10:1)를 도포하고, 진공펌프에서 1시간 두어 기포를 제거하였다. 그 뒤 60℃에서 6시간 동안 구워 PDMS를 경화시켰다. 상기 포토레지스트에서 경화된 웰 구조체를 분리하였다.

상기 분리된 웰 구조체에 PDMS 프리폴리머를 넣고, 6 N의 힘으로 긁어 표면장력에 의해 웰의 하부의 바닥면을 오목한 형태로 만들었다. 이후, 60℃에서 3시간 구워 PDMS를 경화 시켜 웰의 하부가 오목 형상을 가지는 웰 구조체를 제작하였다.

상기 웰 구조체에 네거티브 포토레지스트를 채워넣은 후 UV를 15 mJ/cm²의 세기로 5분간 조사하여 몰드(지름 7 cm)를 제조하였다.

상기 몰드에 PDMS 프리폴리머를 부은 후, 2000 rpm으로 스핀코팅을 하여 얇은 PDMS 막을 제조하였다.

몰드 주변에 다리에 해당하는 PDMS로 된 프레임을 산소 플라즈마를 사용하여 60W로 30초간 처리 하여 붙이고, 프레임에 PDMS 프리폴리머를 넣었다. 이때, 프리폴리미의 함량을 달리하여 웰 구조물의 바닥 두께를 조정하였다.

그 후, 몰드에서 웰 구조물을 분리하고, 상기 구조물의 상부에 PDMS로 된 프레임을 붙여 세포배양 칩을 제조하였다.

비교예 1.

포토리소그래피 방법으로 두께가 500 μm인 다수의 웰(200 개)을 가지는 포토레지스트를 제작하였다. 상기 포토레지스트 위에 PDMS 프리폴리머(PDMS와 경화제(curing agent)의 함량비 10:1)를 도포하고, 진공펌프에서 1시간 두어 기포를 제거하였다. 그 뒤 60℃에서 6시간 동안 구워 PDMS를 경화시켰다. 상기 포토레지스트에서 경화된 웰 구조체를 분리하였다.

상기 분리된 웰 구조체에 PDMS 프리폴리머를 넣고, 6 N의 힘으로 긁어 표면장력에 의해 웰의 하부를 오목한 형태로 만들었다. 이후, 60℃에서 3시간 구워 PDMS를 경화 시켜 웰의 하부가 오목 형상을 가지는 세포배양 칩을 제작하였다.

본 발명에서 도 2는 비교예(도 2a) 및 실시예(도 2b)에 따른 방법으로 제조된 세포배양 칩의 모식도이다.

비교예의 세포배양 칩은 바닥 부분이 두껍고 petri dish 바닥에 붙어있어서 아래를 통한 산소의 투과가 거의 불가능하며, 세포 배양액을 통한 용존산소가 유일한 산소 전달의 수단이다. 반면, 실시예의 세포배양 칩은 세포집합체로의 산소전달이 용이하다.

실험예 1. 세포배양 칩 바닥 두께 조절

세포배양 칩의 웰 구조물의 바닥 두께를 하기과 같이 조정하였다.

프레임에 추가하는 PDMS 프리폴리머의 양을 0.1 ml 부터 1.0 ml까지 0.1 ml단위로 조절하여 바닥의 두께를 조정하였다.

PDMS 프리폴리머 양에 따른 바닥의 두께를 전자현미경(SEM)으로 측정하였다.

도 4는 추가된 PDMS 프리폴리머의 농도에 따른 세포배양 칩의 사진 및 농도에 따른 바닥 두께 그래프이다. 상기 도 4a)에서 검정 스케일바는 500 μm, 흰 스케일바는 10 μm이다.

0.1 ml의 PDMS를 추가하였을 때 약 10 μl의 바닥 두께를 보였고, 0.2, 0.3 ml에서도 10 μl 내외의 바닥 두께를 보였다. 0.4 ml부터 바닥의 두께가 일정하게 증가하였고 1.0 ml를 추가하였을 때 1450 μl로 두꺼운 바닥의 두께를 가졌다.

추가하는 PDMS의 양과 몰드의 지름(D)을 고려하여, 0.4 ml 추가 시 100 μm 두께를 갖는 것으로 보아 추가하는 PDMS의 함량(V)과 바닥 두께(H)와의 식을 식 1로 표시할 수 있다(도 3 및 식 1 참조).

[식 1]

실험예 2. 산소 투과 실험 및 시뮬레이션

두께에 따른 산소 투과도 차이를 증명하기 위해, 실시예의 방법으로 웰 구조물의 바닥 두께가 상이한 세포배양 칩을 제작하였다.

산소 투과 실험은 하기와 같이 수행하였다.

먼저 산소의 농도에 따라 반응하는 물질인 platinum(II) octaethyporphrin(PtOEP)을 유리에 코팅하고, 그 위에 세포배양 칩을 부착하였다(도 5a)). 밀폐된 박스에 상기 유리에 부착된 세포배양 칩을 넣고 질소로 가득 채웠다. 이후 산소를 넣어주면서 PtOEP에서 방출하는 빛의 강도를 측정하였다(도 5b)).

상기 측정 결과를 도 5c)에 그래프로 나타내었다. 산소가 0 %일 때 PtOEP가 가장 밝고 산소가 21%일 때 가장 어두운 것을 기준으로 하였다.

PDMS 프리폴리머를 0.1 ml를 넣었을 때(바닥 두께 약 10 μm)보다 1.0 ml를 넣었을 때(바닥두께 1450 μm)가 약 90배 느린 산소 투과 시간을 보이는 것을 확인할 수 있다.

바닥 두께에 따른 산소 투과도 실험을 실시간으로 측정한 후 세포집합체가 배양되는 상황에서 산소 소모 및 산소 투과도를 시뮬레이션으로 구동하였다. 웰에 들어가는 세포 배양액의 높이를 5 mm로 가정했다. 실시예의 방법으로 제조되며 웰 구조물의 바닥 두께가 10 μm 및 1050 μm인 세포배양 칩을 사용하였다. 대조군인 비교예의 세포배양 칩(바닥 두께 1450 μm)는 바닥을 통해 들어오는 산소의 양이 극히 적으므로 무시하였다. 또한, 세포집합체가 소모하는 산소의 비율은 0.034으로 설정하였고, 배양액과 PDMS에서의 산소 확산 속도는 각각

과

로 하였다.

상기 측정 결과를 도 5d) 및 e)에 나타냈다. e)는 도 5d)에서 A-A’선을 기준으로 한 산소 분포도이다. 상기 도에 나타난 바와 같이, 컨트롤 그룹과 바닥 두께가 1050 μm인 어레이에는 산소의 공급보다 소모되는 속도가 커 세포 집합체에 충분한 산소가 공급이 되지 못했다. 그러나, 바닥 두께가 10 μm인 어레이에서는 세포집합체 내부까지 산소가 충분히 전달되는 것을 확인할 수 있다.

실험예 3. 세포 배양 실험

실시예에서 제조된 세포배양 칩(웰 구조물 바닥 두께: 10 μm 및 1050 μm)를 이용하여 산소 투과에 따른 세포 배양 실험을 수행하였다. 대조군(Control)으로 비교예에서 제조된 세포배양 칩을 사용하였다.

상기 세포배양 칩에서 췌장세포를 14일간 배양을 하였다.

도 6 a)는 각각의 어레이에서 14일 간 배양한 췌장세포를 전자현미경으로 관측한 사진이다(스케일 바: 10 μm). 증식을 하지 않는 췌장세포의 특성상 세포 집합체의 전체 지름에는 큰 차이를 보이지 않았으나 세포집합체의 표면 및 세포 생존율에서 큰 차이를 나타내었다. 구체적으로, 산소가 충분히 공급된 바닥 두께가 10 μm인 실시예의 어레이에서 배양된 췌장세포는 세포들 사이에 정션(junction)이 고르게 분포되어 매끈한 표면을 가지는 것을 확인할 수 있다. 반면 그렇지 못한 경우(바닥 두께가 1050 μm인 실시예의 어레이, 대조군) 세포가 괴사하여 표면이 거칠어지게 나타났다.

도 6 b)는 7일 및 14일간 배양한 췌장세포의 세포 집합체 표면의 거칠기를 세단계로 나누고, 그 단계에 해당하는 세포의 양을 정량화한 그래프이다. 7일차에는 표면의 거칠기가 바닥 두께가 10 μm 어레이와 1050 μm 어레이가 비슷하지만, 14일 차에서는 표면의 거칠기에 따른 세포양이 10 μm에서는 그대로 유지되는 반면 1050 μm인 어레이에서는 67%에서 41%로 26% 표면이 매끈한 세포들이 줄어든 것을 확인할 수 있다. 반면 대조군에서는 14일차 배양에서 겨우 10%의 세포집합체만이 표면이 매끄러운 것을 확인할 수 있다.

도 6 c) 및 d)는 세포의 생존율을 나타낸 사진 및 그래프로, 배양 14일 차 세포 생존율은 본 발명에 따른 어레이가 대조군에 비해 약 25 % 높은 양상을 보이는 것을 확인 할 수 있다. 그중에서도 바닥 두께가 10 μm인 어레이에서 세포 생존율이 높은 것을 확인할 수 있다.

또한 배양 7일차 및 14일차의 세포집합체를 세포사멸 마커(caspase-3) 및 저산소증 마커(HIF-1α)를 이용하여 염색하였다.

그 결과를 도 7에 나타내었다(스케일바:100 μm).

상기 도 7에 나타난 바와 같이, 세포사멸 마커는 14일차에서 상당한 차이를 보이고 있는 것을 확일할 수 있다. 저산소증 마커인 HIF-1α는 일반적으로 세포 집합체의 내부에서 확연하게 나타나게 되는데, 이는 세포집합체의 안쪽으로 갈수록 산소 및 영양분의 확산이 힘들어지게 되어 세포가 충분한 대사를 할 수 없기 때문이다. 본 실험에서는 세포 집합체의 안쪽을 본 것이 아니고 바깥 부분을 보았는데도 바닥 두께가 10 μm 실시예의 어레이에서 배양한 세포집합체와 비교하였을 때 바닥 두께가 1050 μm인 어레이에서 많이 발현하는 것을 관측할 수 있었다. 이는 10 μm 어레이에서 충분한 산소가 공급되어 세포 집합체에서 저산소증 현상이 거의 발견되지 않았기 때문이다.

Claims (15)

1. 웰을 가지는 웰 구조체에 포토레지스트를 채워 넣고 경화하여, 돌출부를 가지는 몰드를 제조하는 단계;
   상기 몰드에 폴리머 코팅막을 형성하는 단계;
   상기 몰드에 돌출부보다 높이가 높은 프레임을 형성하고, 상기 프레임 안쪽으로 폴리머를 주입하는 단계; 및
   경화 후 몰드를 제거하는 단계를 포함하는 세포배양 칩의 제조 방법으로,
   상기 프레임은 몰드의 가장자리에 2개 이상 형성되고,
   상기 제조되는 세포배양 칩에서 웰 구조물의 바닥 두께(H)는 하기 식 1에 의해 계산되는 세포배양 칩의 제조 방법:
   [식 1]
   
   상기 식에서 H는 웰 구조물의 바닥 두께(mm)이고, V는 프레임 안쪽으로 주입되는 폴리머의 함량(ml)이며, D는 몰드의 지름(mm)을 나타낸다.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   웰 구조체의 웰의 하부는 오목한 형상을 가지는 세포배양 칩의 제조 방법.
   
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   프레임 안쪽으로 주입되는 폴리머는 프리폴리머인 세포배양 칩의 제조 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   프리폴리머는 폴리머 및 경화제를 5: 1 내지 15:1로 포함하는 세포배양 칩의 제조 방법.
   
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서,
   제조되는 세포배양 칩의 웰 구조물의 상부에 프레임을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 세포배양 칩의 제조 방법.
   
8. 제 1 항에 있어서,
   세포배양 칩의 제조 방법에 의해 제조되는 세포배양 칩은
   상부로 세포가 수용되는 웰을 가지는 웰 구조물; 및
   상기 웰의 하부를 외부로 노출시키도록 웰 구조물을 지지하는 프레임을 포함하는 세포배양 칩의 제조 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   웰은 복수의 웰의 어레이인 세포배양 칩의 제조 방법.
   
10. 제 8 항에 있어서,
    웰의 하부는 오목한 형상을 가지는 세포배양 칩의 제조 방법.
    
11. 제 8 항에 있어서,
    웰 구조물은 웰의 하부로 산소가 투과될 수 있는 재질로 형성되는 세포배양 칩의 제조 방법.
    
12. 제 8 항에 있어서,
    웰 구조물의 재질은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리에틸렌(PE), 폴리스티렌(PS), 폴리프로필렌(PP), 아가로스 또는 콜라겐인 세포배양 칩의 제조 방법.
    
13. 제 8 항에 있어서,
    웰 구조물의 바닥 두께는 5 내지 3000 μm인 세포배양 칩의 제조 방법.
    
14. 제 8 항에 있어서,
    프레임은 웰 구조물의 가장자리에 형성되는 세포배양 칩의 제조 방법.
    
15. 제 1 항에 따른 세포배양 칩의 제조 방법에 의해 제조된 세포배양 칩의 웰에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.
    
    

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