CN116622506A - 一种脑类器官培养芯片及其制备方法和脑类器官培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脑类器官培养芯片及其制备方法和脑类器官培养方法，涉及干细胞和类器官培养领域，包括相对贴合设置的上芯片和下芯片，上芯片与下芯片之间夹设有多孔膜；上芯片靠近下芯片的一侧设置有上腔室，下芯片靠近上芯片的一侧设置有下腔室，上腔室和下腔室中均灌注有类器官相应生长阶段的培养基；上腔室和下腔室均由若干培养室构成，若干培养室矩阵排列构成对称的双尖水晶形；本发明采用PDMS加工的器官芯片代替动物实验，可以极大节约实验成本；采用微流控芯片技术，在微通道和腔室内连续不断灌注流体对脑类器官进行培养，能够为脑类器官提供充足的氧气与养分供应。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞和类器官培养领域，具体涉及一种脑类器官培养芯片及其制备方法和脑类器官培养方法。
背景技术
脑类器官是近年来干细胞研究领域取得的一个突破性进展，是一种3维培养方式。区别于传统的细胞2维培养，脑类器官由能够代表某种器官功能的几种细胞组成，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。类脑器官即从干细胞诱导分化得到的脑器官部分功能和结构的模拟体。目前，诱导人脑类器官最常用的干细胞为人诱导多能干细胞。
在目前广泛应用的经典培养方案中，从第10天脑类器官进入成熟期开始，需将培养脑类器官的培养皿放置在定轨震荡器上进行振荡培养，或将脑类器官放置在旋转烧瓶中进行培养。
能够在二氧化碳培养箱中长期使用的定轨震荡器需要具有耐高温、耐高湿度、耐高二氧化碳水平等特点，是专业性极高的装置，价格较昂贵，且改装置重量一般在20kg以上，尺寸一般为35×30×15cm左右，体积大，重量高，放置在培养箱中会占据较大空间，且安装、移动较为复杂。旋转烧瓶造价高，需要使用大量培养基，且为一次性使用。
基于微流控芯片技术的器官芯片为体外脑类器官培养提供了有效的手段。目前，体外脑芯片建模主要有两类方案，一种是以神经细胞混合物(如神经元、胶质细胞)等作为微流控芯片培养内容物，这种方法不能充分模拟脑组织的复杂结构和细胞类型；一种方法是在微流控芯片上培养脑类器官，通常这种技术的芯片更加关注于脑类器官的早期形成而忽略了成熟期的长期培养，且在芯片的设计上没有充分考虑脑类器官与培养基间的密度差异，忽略了对脑类器官整体的氧气与养分供给。不利于脑类器官的长期稳定培养。
现有技术CN113926498A中，公开了一种可促进类脑器官成熟的层流低剪切力微流控芯片的制备方法，其采用大腔室设计，没有充分考虑脑类器官在分化过程中异质化成熟的问题，不同批次的实验得到的脑类器官在尺寸，结构，形态等方面可能会存在较大差异，在培养过程中，脑类器官的位置可能会随着芯片的移动而发生位移，不利于观察脑类器官。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种能够为细胞提供高通量的氧气和养分的脑类器官培养芯片及其制备方法和脑类器官培养方法。
为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
提供一种脑类器官培养芯片及其制备方法和培养方法，其包括相对贴合设置的上芯片和下芯片，上芯片靠近下芯片的一侧设置有上腔室，下芯片靠近上芯片的一侧设置有下腔室，上腔室和下腔室中均灌注有成熟培养基；上腔室和下腔室均由若干培养室构成，且上腔室的若干培养室与下腔室的若干培养室一一对应；若干培养室矩阵排列构成对称的双尖水晶形；且相邻两个培养室之间设置有连接通道，连接通道的宽度d连＝0.2Φ，其中，Φ为培养室的直径；且连接通道的长度l连＝2d连；
上芯片与下芯片之间夹设有多孔膜；多孔膜对脑类器官提供支撑使其位于上腔室，同时用于上腔室和下腔室的成熟培养基及代谢物质交换；上芯片的两端分别设置有上入口通道和上出口通道，上入口通道和上出口通道分别位于双尖水晶形的两个尖端；下芯片的两端分别设置有下入口通道和下出口通道；下入口通道和下出口通道分别位于双尖水晶形的两个尖端。
进一步的，多孔膜的孔径Φ孔＝0.002Φ；多孔膜的厚度h膜＝3Φ孔，且多孔膜中任意两个相邻的孔的间隔d孔＝2.5Φ孔。
进一步的，下腔室的高度h下＝0.4h上，其中，h上为上腔室的高度。
进一步的，上入口通道和上出口通道的长度均为l1；且下入口通道和下出口通道的长度l2＝2l1；上芯片的两端竖直设置有分别与上入口通道和上出口通道连通的第一开孔和第二开孔；下芯片的两端竖直设置有分别与下入口通道和下出口通道连通的第三开孔和第四开孔。
上入口通道和上出口通道的长度与下入口通道和下出口通道的长度不同的设置，使得第一开孔、第二开孔、第三开孔和第四开孔均能竖直设置，且开孔均朝上，上芯片不会阻挡第三开孔和第四开孔，方便为上腔室和下腔室输入成熟培养基；且开孔与通道垂直，减缓成熟培养基进入上/下入口通道的流速，使得成熟培养基在上/下腔室内的流速更易控制，且靠近上/下入口通道的脑类器官不会被成熟培养基直冲导致损伤。
进一步的，上芯片的侧面设置有若干限位槽，若干限位槽对称设置在上芯片的两侧；下芯片的侧面设置有与若干限位槽一一对应配合连接的若干限位块。
限位槽和限位块的设置，使得上芯片和下芯片在组合时，上腔室的培养室能与下腔室的培养室一一对齐，不容易发生错位的情况。
一种脑类器官培养芯片的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
A1：通过光刻加工制备具有圆柱形微阵列的硅晶片；
A2：配置PDMS预聚物，将PDMS预聚物浇筑在硅晶片的圆柱形微阵列上，对PDMS预聚物和硅晶片施加压力，并在60℃下保温12h，等待PDMS预聚物固化；
A3：PDMS预聚物固化后将多孔膜从硅晶片上剥离，对剥离下的多孔膜进行裁剪，将多孔膜裁剪为上芯片底面相同大小的形状尺寸；
A4：利用3D打印技术制备上芯片阳模和下芯片阳模，使用PDMS预聚物对上芯片阳模和下芯片阳模分别进行浇筑，得到上芯片初模和下芯片初模；
A5：在上芯片初模的上入口通道和上出口通道处钻得开孔得到上芯片；在下芯片初模的上入口通道和上出口通道处钻得开孔得到下芯片；将裁剪好的多孔膜放置在上芯片与下芯片之间，将上芯片和下芯片使用夹具固定得到脑类器官培养芯片。
进一步的，步骤A4中对上芯片阳模或下芯片阳模进行浇筑时的具体步骤包括如下：
A401：将PDMS预聚物分别浇在上芯片阳模和下芯片阳模中后，在-80kPa下脱气，使PDMS预聚物中的气泡逃逸；
A402：脱气后，使PDMS预聚物和上芯片阳模或下芯片阳模在60℃下保温4h，等待PDMS预聚物初步固化，将初步固化的PDMS预聚物从上芯片阳模或下芯片阳模中取出；
A403：初步固化的PDMS预聚物继续在60℃下保温8h，得到上芯片或下芯片。
一种采用脑类器官培养芯片的脑类器官培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
B1：培养得到成熟的人多能干细胞，并将人多能干细胞接种到培养板中进行稳定培养；
B2：将稳定培养后的人多能干细胞分化依次经过分化培养和扩增培养得到脑类器官；
B3：将脑类器官转移至脑类器官培养芯片中进行成熟培养。
进一步的，步骤B1-B2包括如下具体步骤：
C101：在mTeSR1中培养得到人多能干细胞，以9000cells/well的细胞接种密度将人多能干细胞接种到96孔超低粘附培养板中；且96孔超低粘附培养板的培养基中加入10μM的Rho-kinase抑制剂；
C102：人多能干细胞在超低粘附培养板中培养5天后，将人多能干细胞转移至含有诱导培养基的24孔超低粘附培养板进行分化培养；
C103：人多能干细胞在中24孔超低粘附培养板分化培养2天得到脑类胚体；
C104：使用Matrigel液体包裹脑类胚体，并使用扩增培养基对脑类胚体扩增培养3天以上得到脑类器官。
进一步的，步骤B3包括如下具体步骤：
B301：将上芯片的上腔室朝上放置，将若干脑类器官一一对应放置在上腔室的若干培养室中；
B302：向上腔室的培养室中加入100μL的成熟培养基，将多孔膜覆盖上腔室；
B303：将下芯片的下腔室朝下盖向上芯片，使用夹具将上芯片和下芯片固定，此时，上芯片在下芯片的正下方；
B304：将固定后的上芯片和下芯片上下翻转，第一开孔通过Tygon管道与上培养基输入装置连接；第三开孔通过Tygon管道与下培养基输入装置连接；第二开孔和第四开孔均通过管道连接培养基回收皿；且上培养基输入装置以50μL/h的流速向上腔室提供成熟培养基；下培养基输入装置以30μL/h的流速向下腔室提供成熟培养基。
本发明的有益效果为：
本发明采用PDMS加工的器官芯片代替动物实验，可以极大节约实验成本；采用微流控芯片技术，在微通道和腔室内连续不断灌注流体对脑类器官进行培养，每个脑类器官周围的培养基完成一次交换的频率更快，能够为脑类器官提供充足的氧气与养分供应，且能够及时带走细胞代谢产生的废物，可以加快实验进程，促进脑类器官的发育成熟，缩短实验时间；
通过多孔膜形成双层培养室，能够有效为脑类器官提供支撑以及充足供给，确保类器官整体的成熟，减小类器官因为沉降而导致的底部坏死；并且培养室之间的连接通道在完成培养基的流动下，能够使脑类器官之间进行交流通讯，提高每次培养的均质性。
并且多个培养室同时进行培养的高通量设计，能够进行大批量的脑类器官同时进行培养，适合大规模的实验研究。
通道和培养室之间的尺寸比例设计相对于现有技术的简单设置，本发明的尺寸比例能够为脑类器官在培养时提供合理的水平方向的流体剪切力，多孔膜的孔径与培养室的比例以及上腔室与下腔室的流速差，使得上下培养室的成熟培养基流体能够产生交换，为脑类器官在培养时提供合理的垂直方向的流体剪切力。尺寸的设计使得能够更好的控制脑类器官尺寸及形态的发育，从而使得脑类器官低异质化成熟，即提高脑类器官成熟的均质性。
附图说明
图1为脑类器官培养芯片的立体结构示意图；
图2为脑类器官培养芯片长度方向的截面示意图；
图3为脑类器官培养芯片的上侧视角的爆炸示意图；
图4为脑类器官培养芯片的下侧视角的爆炸示意图；
图5为脑类器官培养芯片的制备方法的流程示意图；
图6为采用脑类器官培养芯片的脑类器官培养方法的流程示意图；
图7为现有方法培养得到的脑类器官图像组；
图8为本发明培养方法得到的脑类器官图像组；
图9为现有方法与本发明得到的脑类器官尺寸对比图；
图10为现有方法得到的脑类器官TUNEL/DAPI示意图；
图11为本发明得到的脑类器官TUNEL/DAPI示意图；
其中，1、上芯片；2、下芯片；3、上腔室；4、下腔室；5、培养室；6、连接通道；7、多孔膜；8、上入口通道；9、上出口通道；10、下入口通道；11、下出口通道；12、第一开孔；13、第二开孔；14、第三开孔；15、第四开孔；16、限位槽；17、限位块；18、加宽通道。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1
如图1-4所示，一种脑类器官培养芯片，包括相对贴合设置的上芯片1和下芯片2，上芯片1靠近下芯片2的一侧设置有上腔室3，下芯片2靠近上芯片1的一侧设置有下腔室4，上腔室3和下腔室4中均灌注有成熟培养基；上腔室3和下腔室4均由若干培养室5构成，且上腔室3的若干培养室5与下腔室4的若干培养室5一一对应，即上腔室3的垂直投影与下腔室4的垂直投影一致；若干培养室5矩阵排列构成对称的双尖水晶形；且相邻两个培养室5之间设置有连接通道6，连接通道6的宽度d连＝0.2Φ，其中，Φ为培养室5的直径；且连接通道6的长度l连＝2d连；本实施例中，培养室5有20个，具体实施时，培养室的数量根据试验所需具体设置。
上芯片1与下芯片2之间夹设有多孔膜7；多孔膜7对脑类器官提供支撑使其位于上腔室3，同时用于上腔室3和下腔室4的成熟培养基及代谢物质交换；上芯片1的两端分别设置有上入口通道8和上出口通道9，上入口通道8和上出口通道9分别位于双尖水晶形的两个尖端；下芯片2的两端分别设置有下入口通道10和下出口通道11；下入口通道10和下出口通道11分别位于双尖水晶形的两个尖端。
具体实施时，靠近上腔室3或下腔室4尖端的培养室5与上入口通道8或上出口通道9或下入口通道10或下出口通道11之间设置有加宽通道18。
多孔膜7的孔径Φ孔＝0.002Φ；多孔膜7的厚度h膜＝3Φ孔，且多孔膜7中任意两个相邻的孔的间隔d孔＝2.5Φ孔。
下腔室4的高度h下＝0.4h上，其中，h上为上腔室3的高度。
上入口通道8和上出口通道9的长度均为l1；且上入口通道8和上出口通道9的长度l2＝2l1；上芯片1的两端竖直设置有分别与上入口通道8和上出口通道9连通的第一开孔12和第二开孔13；下芯片2的两端竖直设置有分别与下入口通道10和下出口通道11连通的第三开孔14和第四开孔15。
上芯片1的侧面设置有若干限位槽16，若干限位槽16对称设置在上芯片1的两侧；下芯片2的侧面设置有与若干限位槽16一一对应配合连接的若干限位块17。本实施例中，限位块17设置有四个，四个限位块17分别位于双尖水晶形的四个斜边中心。具体实施时，限位块17通过粘接固定在下芯片2的侧面。
本实施例中，连接通道6的宽度d连＝1mm，培养室5的直径Φ＝5mm；连接通道6的长度l连＝2mm，多孔膜7的孔径Φ孔＝10μm；多孔膜7的厚度h膜＝30μm，且多孔膜7中任意两个相邻的孔的间隔d孔＝25μm；下腔室4的高度h下＝2mm，上腔室3的高度h上＝5mm；上入口通道8或上出口通道9的长度l1＝5mm；下入口通道10或下出口通道11的长度l2＝10mm。
实施例2
如图5所示，一种脑类器官培养芯片的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
A1：通过光刻加工制备具有圆柱形微阵列的硅晶片；圆柱形微阵列即为多孔膜7的孔阳模；
A2：配置PDMS预聚物，将PDMS预聚物浇筑在硅晶片的圆柱形微阵列上，对PDMS预聚物和硅晶片施加压力，并在60℃下保温12h，等待PDMS预聚物固化；PDMS预聚物采用PDMS和固化剂以10:1的质量比混合得到；
A3：PDMS预聚物固化后将多孔膜7从硅晶片上剥离，对剥离下的多孔膜7进行裁剪，将多孔膜7裁剪为上芯片1底面相同大小的形状尺寸；多孔膜7将下腔室4完全覆盖，多孔膜7使上腔室3和下腔室4的成熟培养基能够相互连同流动，且脑类器官无法通过多孔膜7；
A4：利用3D打印技术制备上芯片1阳模和下芯片2阳模，使用PDMS预聚物对上芯片1阳模和下芯片2阳模分别进行浇筑，得到上芯片1初模和下芯片2初模；
A5：在上芯片1初模的上入口通道8和上出口通道9处钻得开孔得到上芯片1；在下芯片2初模的上入口通道8和上出口通道9处钻得开孔得到下芯片2；将裁剪好的多孔膜7放置在上芯片1与下芯片2之间，将上芯片1和下芯片2使用夹具固定得到脑类器官培养芯片。
步骤A4中对上芯片1阳模或下芯片2阳模进行浇筑时的具体步骤包括如下：
A401：将PDMS预聚物分别浇在上芯片1阳模和下芯片2阳模中后，在-80kPa下脱气，使PDMS预聚物中的气泡逃逸；
A402：脱气后，使PDMS预聚物和上芯片1阳模或下芯片2阳模在60℃下保温4h，等待PDMS预聚物初步固化，将初步固化的PDMS预聚物从上芯片1阳模或下芯片2阳模中取出；
A403：初步固化的PDMS预聚物继续在60℃下保温8h，得到上芯片1或下芯片2。
实施例3
如图6所示，一种采用脑类器官培养芯片的脑类器官培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
B1：培养得到成熟的人多能干细胞，并将人多能干细胞接种到培养板中进行稳定培养；
B2：将稳定培养后的人多能干细胞分化依次经过分化培养和扩增培养得到脑类器官；
B3：将脑类器官转移至脑类器官培养芯片中进行成熟培养。
步骤B1-B2包括如下具体步骤：
C101：在mTeSR1中培养得到人多能干细胞，以9000cells/well的细胞接种密度将人多能干细胞接种到96孔超低粘附培养板中；且96孔超低粘附培养板的培养基中加入10μM的Rho-kinase抑制剂；
C102：人多能干细胞在超低粘附培养板中培养5天后，将人多能干细胞转移至含有诱导培养基的24孔超低粘附培养板进行分化培养；
C103：人多能干细胞在中24孔超低粘附培养板分化培养2天得到脑类胚体；
C104：使用Matrigel液体包裹脑类胚体，并使用扩增培养基对脑类胚体扩增培养3天以上得到脑类器官。
步骤B3包括如下具体步骤：
B301：将上芯片1的上腔室3朝上放置，将若干脑类器官一一对应放置在上腔室3的若干培养室5中；
B302：向上腔室3的培养室5中加入100μL的成熟培养基，将多孔膜7覆盖上腔室3；
B303：将下芯片2的下腔室4朝下盖向上芯片1，使用夹具将上芯片1和下芯片2固定，此时，上芯片1在下芯片2的正下方；
B304：将固定后的上芯片1和下芯片2上下翻转，第一开孔12通过Tygon管道与上培养基输入装置连接；第三开孔14通过Tygon管道与下培养基输入装置连接；第二开孔13和第四开孔15均通过管道连接培养基回收皿；且上培养基输入装置以50μL/h的流速向上腔室3提供成熟培养基；下培养基输入装置以30μL/h的流速向下腔室4提供成熟培养基。
实验对比
使用现有技术的培养方法以及本发明的脑类器官培养方法对脑类器官进行培养，得到如图7所示的现有方法培养得到的脑类器官图像组以及如图8所示的本发明培养方法得到的脑类器官图像组；
记录脑类器官分别采用现有的培养方法和本发明的培养方法第10天到第40天脑类器官的尺寸，得到如图9所示的尺寸对比图；
由图7-9可知，本发明培育出的脑类器官平均尺寸比现有技术更大，且脑类器官大小更加均匀。
对培养出的脑类器官进行免疫荧光染色，得到如图10和图11所示的TUNEL/DAPI示意图；其中，亮色点为死亡的细胞，由图10-11可知，本发明的培养方法培养得到的脑类器官细胞死亡较现有技术更少，脑类器官得到的氧气和养分供应更加充足。
Claims (10)
1.一种脑类器官培养芯片，其特征在于，包括相对贴合设置的上芯片(1)和下芯片(2)，所述上芯片(1)靠近下芯片(2)的一侧设置有上腔室(3)，所述下芯片(2)靠近上芯片(1)的一侧设置有下腔室(4)，所述上腔室(3)和下腔室(4)中均灌注有成熟培养基；所述上腔室(3)和下腔室(4)均由若干培养室(5)构成，且上腔室(3)的若干培养室(5)与下腔室(4)的若干培养室(5)一一对应；所述若干培养室(5)矩阵排列构成对称的双尖水晶形；且相邻两个所述培养室(5)之间设置有连接通道(6)，所述连接通道(6)的宽度d连＝0.2Φ，其中，Φ为培养室(5)的直径；且所述连接通道(6)的长度l连＝2d连；
所述上芯片(1)与下芯片(2)之间夹设有多孔膜(7)；所述多孔膜(7)对脑类器官提供支撑使其位于上腔室(3)，同时用于上腔室(3)和下腔室(4)的成熟培养基以及代谢物质的交换；所述上芯片(1)的两端分别设置有上入口通道(8)和上出口通道(9)，所述上入口通道(8)和上出口通道(9)分别位于双尖水晶形的两个尖端；所述下芯片(2)的两端分别设置有下入口通道(10)和下出口通道(11)；所述下入口通道(10)和下出口通道(11)分别位于双尖水晶形的两个尖端。
2.根据权利要求1的脑类器官培养芯片，其特征在于，所述多孔膜(7)的孔径Φ孔＝0.002Φ；多孔膜(7)的厚度h膜＝3Φ孔，且多孔膜(7)中任意两个相邻的孔的间隔d孔＝2.5Φ孔。
3.根据权利要求1的脑类器官培养芯片，其特征在于，所述下腔室(4)的高度h下＝0.4h上，其中，h上为上腔室(3)的高度。
4.根据权利要求1的脑类器官培养芯片，其特征在于，所述上入口通道(8)和上出口通道(9)的长度均为l1；且所述上入口通道(8)和上出口通道(9)的长度l2＝2l1；所述上芯片(1)的两端竖直设置有分别与上入口通道(8)和上出口通道(9)连通的第一开孔(12)和第二开孔(13)；所述下芯片(2)的两端竖直设置有分别与下入口通道(10)和下出口通道(11)连通的第三开孔(14)和第四开孔(15)。
5.根据权利要求1的脑类器官培养芯片，其特征在于，所述上芯片(1)的侧面设置有若干限位槽(16)，所述若干限位槽(16)对称设置在上芯片(1)的两侧；所述下芯片(2)的侧面设置有与若干限位槽(16)一一对应配合连接的若干限位块(17)。
6.一种权利要求1-5任一所述的脑类器官培养芯片的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
A1：通过光刻加工制备具有圆柱形微阵列的硅晶片；
A2：配置PDMS预聚物，将PDMS预聚物浇筑在硅晶片的圆柱形微阵列上，对PDMS预聚物和硅晶片施加压力，并在60℃下保温12h，等待PDMS预聚物固化；
A3：PDMS预聚物固化后将多孔膜从硅晶片上剥离，对剥离下的多孔膜进行裁剪，将多孔膜裁剪为上芯片底面相同大小的形状尺寸；
A4：利用3D打印技术制备上芯片阳模和下芯片阳模，使用PDMS预聚物对上芯片阳模和下芯片阳模分别进行浇筑，得到上芯片初模和下芯片初模；
A5：在上芯片初模的上入口通道和上出口通道处钻得开孔得到上芯片；在下芯片初模的上入口通道和上出口通道处钻得开孔得到下芯片；将裁剪好的多孔膜放置在上芯片与下芯片之间，将上芯片和下芯片使用夹具固定，得到脑类器官培养芯片。
7.根据权利要求6的脑类器官培养芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤A4中对上芯片阳模或下芯片阳模进行浇筑时的具体步骤包括如下：
A401：将PDMS预聚物分别浇在上芯片阳模和下芯片阳模中后，在-80kPa下脱气，使PDMS预聚物中的气泡逃逸；
A402：脱气后，使PDMS预聚物和上芯片阳模或下芯片阳模在60℃下保温4h，等待PDMS预聚物初步固化，将初步固化的PDMS预聚物从上芯片阳模或下芯片阳模中取出；
A403：初步固化的PDMS预聚物继续在60℃下保温8h，得到上芯片或下芯片。
8.一种采用权利要求1-5任一所述的脑类器官培养芯片的脑类器官培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
B1：培养得到成熟的人多能干细胞，并将人多能干细胞接种到培养板中进行稳定培养；
B2：将稳定培养后的人多能干细胞分化依次经过分化培养和扩增培养得到脑类器官；
B3：将脑类器官转移至脑类器官培养芯片中进行成熟培养。
9.根据权利要求8所述采用脑类器官培养芯片的脑类器官培养方法，其特征在于，所述步骤B1-B2包括如下具体步骤：
C101：在mTeSR1中培养得到人多能干细胞，以9000cells/well的细胞接种密度将人多能干细胞接种到96孔超低粘附培养板中；且所述96孔超低粘附培养板的培养基中加入10μM的Rho-kinase抑制剂；
C102：人多能干细胞在超低粘附培养板中培养5天后，将人多能干细胞转移至含有诱导培养基的24孔超低粘附培养板进行分化培养；
C103：人多能干细胞在中24孔超低粘附培养板分化培养2天得到脑类胚体；
C104：使用Matrigel液体包裹脑类胚体，并使用扩增培养基对脑类胚体扩增培养3天以上得到脑类器官。
10.根据权利要求8所述采用脑类器官培养芯片的脑类器官培养方法，其特征在于，所述步骤B3包括如下具体步骤：
B301：将上芯片的上腔室朝上放置，将若干脑类器官一一对应放置在上腔室的若干培养室中；
B302：向上腔室的培养室中加入100μL的成熟培养基，将多孔膜覆盖上腔室；
B303：将下芯片的下腔室朝下盖向上芯片，使用夹具将上芯片和下芯片固定，此时，上芯片在下芯片的正下方；
B304：将固定后的上芯片和下芯片上下翻转，第一开孔通过Tygon管道与上培养基输入装置连接；第三开孔通过Tygon管道与下培养基输入装置连接；第二开孔和第四开孔均通过管道连接培养基回收皿；且上培养基输入装置以50μL/h的流速向上腔室提供成熟培养基；下培养基输入装置以30μL/h的流速向下腔室提供成熟培养基。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117384759A (zh) * | 2023-12-05 | 2024-01-12 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种基于微针阵列的类器官培养方法 |
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2023
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN117384759A (zh) * | 2023-12-05 | 2024-01-12 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种基于微针阵列的类器官培养方法 |
| CN117384759B (zh) * | 2023-12-05 | 2024-03-29 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种基于微针阵列的类器官培养方法 |
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