CN108121161A - 一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用，该方法利用软蚀刻技术制备了具有微米尺度的阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片。通过优化微柱结构的高度和间距来控制干细胞来源的拟胚体的形状、大小、均一性。该方法可以高通量形成拟胚体，并可以原位动态观察拟胚体增殖、发育的全过程。该芯片具有可以有效去除凋亡细胞和细胞碎片，保证拟胚体之间的营养供给和信号传递的特点，克服了传统拟胚体形成和悬浮培养分步实现的缺点，具有简化拟胚体操作步骤，高通量、原位形成与分化的优势，无需特殊的仪器和试剂，可与其他技术集成化。

Description

一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用。
背景技术
诱导性多潜能干细胞和胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的能力，在人体发育学研究，疾病模型构建，组织工程，细胞治疗，药物筛选等领域具有重要的应用价值。利用该细胞进行器官发育和细胞诱导分化过程中，拟胚体形成是关键的步骤。传统方法是利用悬滴法、以及商品化的小坑形成拟胚体。悬滴法具有操作繁琐，拟胚体形成效率低，营养供给缺乏等缺点。商品化的小坑结构在拟胚体形成后，由于小坑的结构使得死亡细胞和细胞碎片很难清除，这些细胞碎片会影响拟胚体的分化诱导效率。因此，应用这些方法形成拟胚体后，需要将拟胚体转移到低黏附的培养板中继续生长以及后续的诱导分化，使得实验步骤繁琐。此外，在转移过程中，拟胚体容易收到较大流体的剪切力刺激，干扰细胞的活性和分化的效果。
制备高通量阵列微柱结构的芯片的材料为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，PDMS是目前微加工和微流控领域用的最多的材料，具有透明、透气、惰性好、疏水性、易成型、细胞相容性佳等优势。目前文献报道的制备细胞球或者拟胚体的方法都是基于PDMS或者聚合物凝胶材料的小坑法，进一步研究需要转移细胞微球和拟胚体到新的低黏附培养系统，步骤繁琐；转移过程中对干细胞会造成一定程度的损伤，细胞碎屑不容易清除等缺点。目前形成拟胚体的方法是微流控技术的小坑芯片和悬滴法，主要缺陷是死亡细胞碎片不能及时清除，需要转移到新的低粘附培养皿中继续培养和分化，转移过程对拟胚体具有不同程度的损伤和丢失，而且无法实现原位拟胚体形成及培养，不能实时定位观察同一个拟胚体的发育分化过程。
目前利用微流控芯片制备的微柱结构中，主要以微小尺度为主，用于研究表面拓扑结构对单细胞行为学的影响，尚无利用较大微柱形成微培养空间进行拟胚体形成和原位发育研究的应用。
因此，本发明主要针对上述拟胚体形成局限性，制备一种新型的高通量拟胚体形成与原位生长培养的芯片，用于干细胞领域的应用研究。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用。
一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法，具体步骤如下：
(1)芯片的制备：利用软蚀刻技术制备SU-8模板，含有高通量圆柱形的凹陷结构，底部为凹陷的曲面，对模板进行低黏附修饰，确保SU-8与PDMS聚合物容易剥离；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS聚合物与引发剂按照体积比10～14：1混合，浇注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加热固化1～2h，常温剥离SU-8模板，得到高通量的固定间距的阵列微柱结构PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用PDMS模块形成围墙样结构的局限的开放培养池，得到高通量形成拟胚体的微阵列芯片。
芯片形状为圆形或者方形。
所述模板低黏附修饰具体为：采用低粘附处理试剂硅烷化处理10-15分钟，80℃烘烤1～2小时，自然降温。
所述低粘附处理试剂为三甲基氯硅烷或者全氟硅烷等；
所述模板凹陷小坑的深度在500-1000微米之间，间距在30-100微米之间。
所述微柱顶端为凸起的曲面结构，直径在500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同，其中微柱尺寸和微柱间距不限于该范围。
所述引发剂为：184silicone elastomer curing agent.
所述PDMS模块形成的开放培养池，特征为根据芯片的形状，制备相应的中空结构，如环形，方形。将该结构用等离子处理或者PDMS胶水与芯片封接，目的限制细胞培养基溢出芯片结构；
所述高通量是指该芯片结构可以无限放大，或者区域化。
一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的应用，利用上述芯片高通量形成拟胚体并进行拟胚体原位生长培养，具体步骤为：
(1)芯片无菌化：将上述拟胚体原位形成的微阵列芯片用氧等离子处理1～3分钟，加入去离子水；120～125℃高压灭菌20～30分钟；将芯片置于无菌的培养皿中4℃保存或降至室温后直接使用。
(2)拟胚体形成：取出芯片，加入mTeSR1培养基，不断用移液器吹打，去除小柱间的气泡，使微柱间隙充满培养基；将人诱导性多潜能干细胞(hiPSCs)用分散酶消化成单细胞，将密度在5×106-10×106个hiPSCs/cm2细胞接种到(1)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培养基，并加入10～20μM的Y27632。静止培养24～48小时，形成大小一致的拟胚体；根据细胞接种数量实现拟胚体大小的控制，(5-10)x106/cm2范围的细胞密度可以实现150-300微米直径的细胞球；
(3)拟胚体原位生长：拟胚体形成的24-48小时更换新鲜的不含Y27632的mTeSR1培养基继续培养，去除死亡细胞和细胞碎片，原位观察拟胚体生长 及分化；
(4)所形成的拟胚体可以用于切片，组织染色；
一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的应用，应用对象不局限于人诱导性多潜能干细胞，同样适用于其他干细胞，包括人和动物的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)以及动物来源的诱导性多潜能干细胞。
所述不同形状的干细胞微组织形成，主要是利用细胞的密度以及微柱间距的调节，控制细胞间力的作用，达到平衡形成不同形状的微组织。
所述Y27632的作用主要是减少细胞凋亡；
所述去除细胞碎屑方法主要是利用更换培养基前，轻轻的摆动芯片，在不影响细胞球的情况下，使得细胞碎片浮起，倾斜芯片至一侧，轻轻吸走培养基，轻轻在一侧加入培养基，缓慢放置水平，置于培养箱37°培养。
所述原位观察生长发育，通过标注微柱序列，定位每个拟胚体，通过显微镜观察每个定位的拟胚体的生长情况。
所述拟胚体切片，组织染色是指，芯片上的拟胚体在显微镜下定位，利用移液器手动取出，进行免疫组织切片染色。
利用芯片上形成的拟胚体，用于胚胎干细胞的拟胚体形成和生长培养。由于胚胎干细胞与诱导性多潜能干细胞在细胞生物学特性和功能上相似，本发明的应用范围同样适用于胚胎干细胞及其他诱导性多潜能干细胞的拟胚体形成和类组织分化。
本发明建立的高通量胚体原位形成与培养的微阵列芯片方法，原理是利用微柱围成四方相同的三维空间以及PDMS材料的疏水性引起的细胞低粘附特征，通过调节微柱的尺寸和间距，控制微空间的形状和曲度，调节人诱导性多潜能干细胞数量可以形成大小均一的球型结构。为保证细胞核培养基在微柱结 构内，阵列微柱结构芯片周边用PDMS模块围起形成局限的开放培养池。PDMS芯片首先亲水处理，采用氧等离子处理1～3分钟，再将阵列微柱芯片浸泡在去离子水里，120°～125°高压灭菌20～30分钟，保证芯片亲水性。在拟胚体形成过程中，为防止细胞黏附，芯片静止3天以上恢复疏水性。在接种细胞过程，吸走去离子水，加入正常培养基替换，经过吹打去除气泡，小柱间充满液体后可以直接接种细胞。将芯片置于合适大小的培养皿中，常规细胞培养。该芯片可以反复多次使用，单张芯片可以重复使用30～50次，使用后的芯片用无菌PBS清洗以去除细胞碎屑，浸泡在无菌PBS溶液中，4°冰箱无菌保存，再次使用时候更换细胞培养基即可。
本发明设计芯片阵列微柱结构相比凹陷的小坑结构，细胞碎屑在常规换液过程中即可被大部分清除，减少对拟胚体的活性和功能的影响。此外，由于微柱的限制作用以及细胞间的生物力学特征，使得每个拟胚体可以原位固定在微结构中，不会因为更换培养基而移动到其他位置，便于长期动态观察单个拟胚体发育的情况，同时也减少了拟胚体之间发生粘连。
本发明的主要应用范围：是拟胚体的形成和原位诱导分化，模拟人体器官发育和功能，为人诱导性多潜能干细胞的类器官(organoids)形成，人体器官发育学研究，疾病模型构建，药物研发，毒性评价以及细胞/组织/器官替代治疗提供了新的可控的技术手段。
本发明的创造性在于：通过调整微柱尺寸和微柱间距以及细胞密度，可以实现高通量的尺寸可调的拟胚体。
本发明的优点在于：高通量形成拟胚体并可以进行原位诱导分化，有利于原位观察拟胚体发育的动态过程，保证拟胚体之间的营养供给和信号传递，可以有效去除凋亡细胞和细胞碎片。该方法克服了传统拟胚体形成和悬浮培养诱 导分化分步实现的缺点，具有简化拟胚体操作步骤，高通量、原位形成与培养的优势，无需特殊的仪器和试剂，可与其他技术集成化。
附图说明
图1是具体实施例1中高通量拟胚体形成与原位直接诱导分化的阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片制备过程；其中1是带有图形的掩膜，2是SU-8，3是玻璃基底，4是紫外曝光过程，5是浇铸PDMS(与引发剂配比(10～14):1混合)，6是固化的带结构的PDMS芯片。
图2是具体实施例1中高通量拟胚体形成的阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片的俯视图和剖面图；
图3是图2中4的放大图，用来描述微结构的具体尺寸；
图2、图3中，1是微柱结构，2是微柱间距，3是芯片外围坝结构，4是有四个微柱结构围成的拟胚体形成区域；5是微柱结构的直径，长度在800微米之间，6是微柱间距，7是拟胚体形成区域。
图4是具体实施例2中人诱导性多潜能干细胞来源的拟胚体的形成及生长培养，其中1是微柱，2是拟胚体，3是微柱间距。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
本发明所用试剂均为市购。
实施例1
阵列微柱结构PDMS聚合物芯片的制备
利用光刻蚀技术制作SU-8聚合物模板，模板含有直径为500～800微米的圆形小孔。制备过程如图1所示。其中1是带有图形的掩膜，2是SU-8，3是玻璃基底，4是紫外曝光过程，5是浇铸PDMS(与引发剂配比(10～14):1混合)，6是固化的带结构的PDMS芯片。芯片制备过程如下：将制备好的SU-8聚合物模板采用硅烷化处理15分钟，放入80度烘箱内加热1～2h，自然降温。将PDMS((10～14):1混合)倾倒于SU-8模板上，真空除泡后在80度烘箱内加热40～60分钟，冷却后，将固化的PDMS剥离模板。在空白玻璃片上按照3000转每秒的速度甩一层PDMS(20:1)，将无结构的PDMS块，蘸取玻璃片上的PDMS(20:1)，然后封接在有结构的PDMS芯片周围，将阵列微柱结构围起形成局限的开放培养池，放于80度烘箱内加热60分钟。
芯片结构如图2所示，其中1是微柱结构，2是微柱间距，3是芯片外围坝结构，用来限定细胞和培养基，4是有四个微柱结构围成的拟胚体形成区域。芯片结构放大图3，5是微柱结构的直径，长度800微米，6是微柱间距，长度30微米；7是拟胚体形成区域，与周围微柱间隔相同，有利于培养区域间的液体交换该区域大小随着微柱结构和间距而变化。
实施例2
阵列微柱结构PDMS聚合物芯片用于拟胚体形成
芯片制备过程如实施例1。拟胚体形成以及原位生长培养步骤如下：
(1)芯片灭菌:将上述拟胚体原位形成与分化的微阵列芯片用氧等离子处理1～3分钟，加入去离子水；120～125℃高压灭菌20～30分钟；取出芯片，加入mTeSR1培养基，不断用移液器吹打，去除小柱间的气泡以促进细胞沉降到凹陷部位；
(2)拟胚体形成：将细胞密度在5×106-10×106/cm2个hiPSCs接种到(1)所述的 芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培养基，并加入10～20μM的Y27632，常规静止培养24～48小时；形成的拟胚体大小均一，在300微米左右，相互间未发生连接。如图4所示，1是微柱，2是拟胚体，3是微柱间距；拟胚体培养时间分别为2小时，48小时和4天。

Claims (5)

1.一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)芯片的制备：利用软蚀刻技术制备SU-8模板，含有高通量圆柱形的凹陷结构，底部为凹陷的曲面，对模板进行低黏附修饰；
(2)制作高通量阵列微柱结构的PDMS聚合物芯片：将PDMS聚合物与引发剂按照体积比10～14：1混合，浇注到SU-8模板上，真空除泡，80℃加热固化1～2h，常温剥离SU-8模板，得到高通量的固定间距的阵列微柱结构PDMS芯片；
(3)在PDMS芯片周边用PDMS模块形成围墙样结构的局限的开放培养池，得到高通量形成拟胚体的微阵列芯片。
2.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：SU-8模板低黏附修饰具体为：采用低粘附处理试剂硅烷化处理10-15分钟，80℃烘烤1～2小时，自然降温。
3.按照权利要求1所述的微阵列芯片的制备方法，其特征在于：微柱顶端为凸起的曲面结构，直径在500-1000微米，间距为30-100微米，微柱间距相同。
4.一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的应用，其特征在于：利用上述芯片高通量形成拟胚体并进行拟胚体原位生长培养，具体步骤为：
(1)芯片无菌化：将上述拟胚体原位形成的微阵列芯片用氧等离子处理1～3分钟，加入去离子水；120～125℃高压灭菌20～30分钟；将芯片置于无菌的培养皿中4℃保存或降至室温后直接使用；
(2)拟胚体形成：取出芯片，加入mTeSR1培养基，不断用移液器吹打，去除小柱间的气泡，使微柱间隙充满培养基；将人诱导性多潜能干细胞(hiPSCs)用分散酶消化成单细胞，将密度在5×106-10×106个hiPSCs/cm2细胞接种到(1)所述的芯片中，加入1.5～2ml的mTeSR1培养基，并加入10～20μM的Y27632；静止培养24～48小时，形成大小一致的拟胚体；根据细胞接种数量实现拟胚体大小的控制，(5-10)x106/cm2范围的细胞密度可以实现150-300微米直径的细胞球；
(3)拟胚体原位生长：拟胚体形成的24-48小时更换新鲜的不含Y27632的mTeSR1培养基继续培养，去除死亡细胞和细胞碎片，原位观察拟胚体生长及分化；
(4)所形成的拟胚体可以用于切片，组织染色。
5.一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的应用，其特征在于：应用对象不局限于人诱导性多潜能干细胞，同样适用于其他干细胞，包括人和动物的胚胎干细胞(embryonic stemcells,ESCs)以及动物来源的诱导性多潜能干细胞。
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