CN103146650B - 基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法，其特征是以鼠尾I型胶原作为三维支架，以微柱阵列式微流控芯片为培养平台，采用两步培养法，即培养初期向细胞培养室中注入促使神经干细胞扩增的培养基，后期改用适合神经干细胞及其子细胞生长的条件培养基，通过模拟体内神经发生不同阶段的微环境，形成一个与神经组织相类似的三维复合结构。本发明建立的方法重复性好，可同时构建多组试验样品；所采用的微流控培养体系为微升体积，并可精确调控，大大缩减了细胞培养过程各种昂贵的细胞生长因子、免疫荧光抗体、细胞的荷尔蒙添加剂的使用量，降低了细胞培养成本。因此有望成为新型药物筛选或环境毒素监测的神经组织替代物。

Description

基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法

技术领域

本发明属于微加工技术与组织工程领域，涉及一种应用微流控细胞培养系统体外构建神经干细胞三维细胞模型的方法。

背景技术

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）体外培养方式主要分为悬浮培养法和单层培养法。悬浮培养的NSCs在体外以“神经球”（neurospheres）形式生长，大量的NSCs以及其所分化的子细胞共同存在于神经球内部。随着神经球的不断增大，营养物质向神经球内部的传递会出现困难，造成处于内部核心的细胞大量凋零、坏死，甚至出现中空的现象。单层培养法在NSCs的形态特征、生长特点、以及其分化成的神经元与神经胶质细胞特性方面的相关研究中均发挥了重要的作用。但是越来越多的实验证明在二维条件下培养的细胞无法真正体现其在体内的生物学特性与功能。单层贴壁生长的细胞，因缺少立体支架，只能向二维发展，因此，存在于细胞-细胞、细胞-细胞外基质之间相互关系都被同化。这样的生长模式与细胞体内的生长状况相去甚远。细胞三维培养方法就是想要利用三维生物支架来培养细胞，使细胞呈空间立体方式生长，建立细胞与生物支架的三维空间复合体。这种培养方式更接近于体内细部的生长模式，容易形成类似体内组织的有生物活性的结构。

目前，体外构建NSCs来源的三维类神经组织的研究，在国内外还处于实验探索阶段，没有标准化的实验方法。微流控细胞培养系统是近年来新兴的一种基于微流体技术的细胞培养平台。正是由于微流体技术对于微量流体的精确控制和操纵能力，并且依据该技术构建的平台具有多种单元技术灵活组合、整体可控和规模集成的特点，因此，可更精准地模拟体内的物理与化学信号，从而提供一个与人体微环境相似的，稳定可控的细胞与组织的培养环境。

本发明将微加工技术与组织工程技术有机的结合起来，建立起一套微流控细胞培养系统，采用两步培养法在微流控芯片上构建了NSCs三维模型。与已有的三维NSCs芯片相比，两步法建立的NSCs三维模型，操作简便，重复性好，成功率高；芯片便于倒置显微镜下观察检测；便于对细胞代谢产物进行取样分析。有望应用于新型神经类药物的毒性甄别与筛选。

发明内容

本发明提出了.一种基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法，是以终浓度0.5mg/ml的鼠尾I型胶原水凝胶作为三维支架，将其与20μm左右的“神经球”混合均匀后，接种到聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控芯片上由若干微柱构成的特定细胞培养池中，待细胞-胶原复合物凝固之后，采用两步培养法，即培养初期向细胞培养室中注入促使神经干细胞扩增的培养基，待神经干细胞在胶原水凝胶中形成直径为50-100μm团簇后，改用条件培养基，使细胞由团簇中向三维空间迁移，相邻的细胞团簇内的细胞相遇，相互连接，形成一个与神经组织相类似的三维复合结构，并利用可自动操控的微流控细胞培养系统对此三维复合物进行了连续培养，并进行了初步的研究和评价。

本发明的技术方案如下：

（1）以鼠尾I型胶原水凝胶作为三维支架，将其与不小于20μm的“神经球”混合均匀后，接种到PDMS微流控芯片上由若干微柱构成的细胞培养池中，待细胞-胶原复合物凝固后，采用以下的两步培养法：

第一步，培养初期以1μl/min的流速向细胞培养池中注入促使NSCs扩增培养基，待NSCs在胶原水凝胶中形成直径为50-100μm团簇；

第二步，将扩增培养基更换为条件培养基，流速不变，使细胞由团簇中向三维空间迁移，相邻的细胞团簇内的细胞相遇，相互连接，形成一个与神经组织相类似的三维复合模型结构，并利用可自动操控的微流控细胞培养系统对三维复合物进行了连续培养。

所述的鼠尾I型胶原的最终浓度为0.5mg/ml。

所述的扩增培养基通过正交试验确定营养成分，能够促进NSCs体外扩增，并保持其生物学特性的培养基，是DMEM、F12和RPMI-1640以1：1：1比例混合，添加生长因子EGF20ng/ml、bFGF10ng/ml、血清白蛋白2mg/ml、1%荷尔蒙添加剂N2和1/1000脂类，培养基中主要的营养成分为葡萄糖4.2mg/ml、谷氨酰胺0.44mg/ml。

所述的条件培养基是适合NSCs及其子细胞群体生长的培养基，是在基础培养基Neurobasal中添加2%B-27、10ng/ml BDNF、10ng/ml bFGF。

本发明的方法建立的NSCs三维生长的微流控培养系统，该微流控培养系统包括装有培养液进出管的无菌培养皿、微量注射泵和收集管。无菌培养皿用于放置微流控芯片，无菌培养皿的上盖与微流控芯片的进液室和废液池相对应的位置有两个孔，用于安插芯片的培养液进出管；与进液室相连的进液管在无菌培养皿的上盖下方、靠近上盖的位置设置有一个微型无菌滤器；芯片完成细胞-胶原混合物接种后，在芯片四周的培养皿中注入无菌水；再将培养皿内侧的培养液进出管分别通过微型三通与芯片上的两个进液室和两个废液池相连接后，将含有芯片的培养皿置于二氧化碳培养箱中。用于定时定量补充培养基的微量注射泵是通过无菌的连通管将微量注射泵与芯片的进液管相连，调控流速，对芯片上的NSCs三维细胞模型进行连续培养；用于培养物样品采集的收集管由芯片废液池引出的导管末端与一个1.5ml的离心管相连组成，便于收集由细胞培养室中流出的废液。

本发明的效果和益处是，建立了适合神经干细胞体外三维培养的微流控系统，该系统可视、透气，可精确调控，其自动化的操作不但节约大量人工劳动，同时为细胞提供了一个与体内相似的稳定的代谢环境；采用两步培养法，使用本研究筛选确定的神经干细胞体外扩增培养基和条件培养基在微流控芯片上构建了神经干细胞三维培养模型；该模型在倒置显微镜下观察有良好的三维细胞形态，免疫荧光化学的检测结果显示了神经干细胞及其分化的子细胞的特征表型；整个培养体系为微升体积，大大缩减了各种昂贵的细胞生长因子、免疫荧光抗体、细胞的荷尔蒙添加剂的使用量，降低了细胞培养成本；该方法重复性好，可同时构建多组试验样品，有望成为新型药物筛选或环境毒素监测的神经组织替代物。

附图说明

图1是微流控芯片整体设计示意图。

图中：1左细胞进样孔，2右细胞进样孔；3培养基注入口；4废液池口；5细胞培养室。

图2是细胞培养室的局部结构示意图。

图3是芯片掩膜设计图。

图4是应用于NSCs三维培养的微流控芯片外观照片。

图5是利用改性的模具浇注的PDMS微柱显微镜照片。

图6是采用优化后的培养基扩增得到的细胞免疫荧光检测显示呈nestin阳性图片。

图7(A)是优化培养基扩增得到的NSCs经诱导分化后的β-tubilinⅢ免疫荧光染色阳性图片。

图7(B)是优化培养基扩增得到的NSCs经诱导分化后的GFAP免疫荧光染色阳性图片。

图7(C)是优化培养基扩增得到的NSCs经诱导分化后的RIP免疫荧光染色阳性图片。

图8（A）是NSCs接种到芯片48h在扩增培养基中的生长状态图。

图8（B）是更换为条件培养基后48h NSCs的生长状态图。

图8（C）是更换培养基后96h mNSCs的生长状态图。

图8（D）是静态三维培养的NSCs更换培养基96h后生长状态图（对照组）。

图8（E）是静态二维贴壁培养96h的NSCs的生长状态图（对照组）。

图9（A）是芯片中生长的三维NSCs免疫荧光染色后MAP-2/DAPI的阳性表达图。

图9（B）是芯片中生长的三维NSCs免疫荧光染色后GFAP/DAPI的阳性表达图。

图9（C）是芯片中生长的三维NSCs免疫荧光染色后Nestin/DAPI的阳性表达图。

图10是三维培养的微流控系统示意图。

图11是不同培养条件下的乳酸含量的变化示意图。

图12是不同培养条件下的谷氨酰胺含量的变化示意图。

具体实施方式

实施例1适用于神经干细胞三维培养的微流控芯片的设计与制作

1、微流控芯片的设计

为了能给NSCs-胶原复合物的生长提供一个良好的微环境，本研究设计了一种适合NSCs-胶原复合物体外生长的微流体芯片，芯片整体设计如图1所示：图中1为左细胞进样孔，直径为2mm；2为右细胞进样孔，直径为3mm；3为废液出口，直径为3mm；4为细胞培养室。细胞培养室的长度为200mm，宽度为1mm，深度为150μm。其内部结构如图2所示：培养室侧壁是由数个长100μm，宽50μm的微柱构成的栅栏状结构，每个微柱间隔20μm。细胞进样孔与培养室之间为宽400μm的进样通道。细胞培养室两侧为宽500μm侧通道，用来输送培养基或其他调控细胞生长的化学成分。

此芯片的工作原理是将NSCs-胶原的混合液通过细胞进样口进入芯片培养室中，微柱阵列起到拦截作用，以确保细胞与胶原存留在培养室中。待NSCs-胶原凝胶凝固后，利用微量注射泵将培养基注入芯片的侧通道，培养基通过微柱阵列的空隙渗透到三维复合物中，为细胞的生长提供养分；同时，细胞新陈代谢产生的副产物也扩散到培养基中，随着培养基的流动，最终被带到废液口排出。

2、芯片模具的设计与制作

本实验芯片的加工与制作将采用具有透光性、透气性及良好的生物相容性的聚合物材料聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS），通过模具浇注的方法使PDMS成形。首先进行模具的设计制作。模具采用4寸硅片通过光刻工艺和干法刻蚀来完成。光刻所需的掩膜设计如图3所示，由深圳清溢光电股份有限公司完成铬板掩膜的制作，模具制作流程如下：

（1）硅片清洗：浓硫酸煮沸，待冷却后用去离子水冲洗；然后用1号硅片标准清洗液（体积比：去离子水:双氧水:氨水=5:2:1）煮沸，冷却后再用去离子水冲洗；用2号硅片标准清洗液（体积比：去离子水:双氧水:盐酸=8:2:1）煮沸，冷却后用去离子水清洗，烘干备用。

（2）硅片氧化：氧化炉中湿法氧化3小时，温度1180℃，烘箱保存备用。

（3）甩胶：选用BP212正胶，采用中科院微电子中心研究部生产的KW5-型台式匀胶机进行甩胶，参数为低速500rpm，4秒，高速2600rpm,30秒。

（4）前烘：采用烘板加热至85℃，保持30min。

（5）曝光：采用德国SUSS光刻机，紫外光强4.7mW/cm²，将掩膜与硅片上胶层紧贴，曝光50s。

（6）显影：采用0.125M的NaOH溶液作为显影液，显影28s。

（7）后烘：烘板加热至85℃，保持40min。

（8）干刻SiO2层：干刻工艺采用法国产AMS-100刻蚀设备来完成，刻蚀气体为C4F8,刻蚀6分，上电极2800W，下电极300W。

（9）干刻Si：刻蚀气体为SF6与C4F8交替进气，25分钟，上电极2800W，下电极40W。刻蚀深度在150μm。

（10）去胶、去氧化层：去胶采用丙酮溶液浸泡，然后依次用无水乙醇，去离子水清洗干净。采用HF:H₂O=1：10（v:v）溶液去氧化层，模具制作完成。

3、PDMS芯片的制作

模具制作完成后就可以进行PDMS芯片的制作。以10:1（v:v）的比例将PDMS母液与固化剂混合搅拌均匀，浇注于模具上，抽真空使得PDMS完全脱气，直到PDMS中没有气泡为止。将浇注好的模具放入烘箱中升温至80℃，烘两个小时，这时PDMS已经完全固化，然后将固化好的PDMS从模具上剥离下来，完成芯片的制作。

4、PDMS芯片的封装

PDMS芯片完成后，需要对芯片进行封装。采用K1050X型等离子去胶机，在15W功率下对待键合的PDMS表面和玻璃基片的表面进行氧等离子体处理50s，随即将处理好的表面紧贴确保互相接触的表面之间没有气泡存在，放入烘箱中100℃烘2分钟，冷却即可。这样，完整的芯片制作完成。

5、芯片外观

本发明制作的芯片以生物相容性好、可透气及透明可视的PDMS为原材料，经过模具浇注的方式成型，最后通过氧等离子处理后，与载玻片键合封接，芯片外观如图4所示。其中细胞培养池的尺寸为20mm×1mm×0.15mm（长宽高），小柱子的尺寸为100μm×50μm×150μm（长宽高），小柱子间的空隙为20μm，其特征显微镜下可见图5。

实施例2NSCs体外无血清扩增培养基的筛选

本实施例旨在实现无血清培养条件下，NSCs在体外的大量扩增，进而为构建NSCs三维模型提供充足的细胞数。实验选用DMEM/F12/RPMI1640（1:1:1，V:V:V）的混合培养液作为基础培养基，在常用的添加剂中选取4种关键组分：葡萄糖（Glucose），谷氨酰胺(Glutamine)，脂类（Lipids），牛血清白蛋白（BSA)，建立4因素三水平正交实验，来确定这4种组分在扩增培养基中的最佳添加剂量及其对NSCs的扩增效果。

正交实验分为9组，在24孔培养板上进行，每组选取3孔进行平行实验。实验细胞来自于小鼠E14前脑的第3代NSCs，以5×10⁴cells/ml的密度接种到含有基础培养基的孔板中。为防止蒸发，将培养板置于经过灭菌的湿盒中，然后将培养板连同湿盒一同放置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育。每天跟踪细胞的生长情况，同时轻轻摇晃孔板防止神经球贴壁。培养期间不作换液处理，细胞经连续培养5～6天后，用台盘兰计数活细胞数。

以上实验重复三次。

表1四因素三水平正交试验表

表2无血清NSCs扩增培养基配方及终浓度（100ml）

本实施例的实验结果经过单因素方差分析，并采用Origin7.0软件进行处理。正交实验极差分析结果显示，BSA和葡萄糖对于细胞增殖能力影响最为显著；谷氨酰胺和脂类影响次之。经过台盼蓝计数统计，在5天的培养周期里，实验组1、4、5、8中的NSCs长势较好，细胞的倍增次数均大于2，所收获的活细胞总数比原来提高了3～7倍。其中实验组5扩增的细胞数量达到4.53×10⁵cells/ml，是初始活细胞总数的8倍。

4种组分（葡萄糖、谷氨酰胺、BSA、脂类）的最优水平组合为（2、2、3、1），最终的扩增培养基配方及终浓度如表2所示。采用最优水平组合的培养基扩增小鼠NSCs，连续培养3代后所收获的细胞总数达到5.5×10⁵cells/ml，且活率达到70％～80％。通过此批次培养的NSCs的免疫荧光检测发现，细胞高表达神经干细胞的标志性蛋白nestin（图6），撤去生长因子，并添加5%胎牛血清，培养3天后，NSCs发生分化，免疫荧光鉴定结果显示，神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的表面标记抗原β-tubulin III(TuJ1)、GFAP和RIP均有表达（图7A、B、C），从而说明扩增后的NSCs依然保持其多分化潜能的干细胞特性。

实施例3微流控芯片上NSCs-胶原三维复合物的构建

本实施例中，首先将NSCs-胶原水凝胶混合液接种到微流控芯片的细胞培养室中，然后采用两步法，通过更换培养基实现NSCs在胶原支架中的三维生长。具体方法如下：

1、单细胞悬液的制备

将第3代NSCs“神经球”由培养瓶转移至15ml的离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，收集悬浮神经球；向收集物中加入等体积的Accutase^TM酶，37℃水浴振荡15min后，加入5ml新鲜培养基，1000rpm离心5min；弃上清，再用1ml新鲜的培养基重新悬浮细胞，将管口经抛光处理的巴斯德吸管抵住离心管的底部，轻轻吹打20下，将酶处理后的神经球解离均匀，调整细胞密度待用。

2、芯片上“神经球”的接种与扩增培养

根据本实验所设计的微流控芯片的细胞培养池的尺寸，将要构建的细胞-胶原复合物的厚度为150μm。由于构筑细胞培养池的小柱子间的空隙为20μm，不足以拦截NSCs单细胞悬液，因此，在使用微流控芯片进行NSCs三维培养前，先将制备好的单细胞悬液，采用扩增培养基悬浮培养48h左右，待“神经球”生长至20μm后，将其与鼠尾I型胶原混合进行接种。取适量5mg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原蛋白储备液，加入到0.06倍胶原储备液体积的0.1M的NaOH混匀（如果先将小体积的NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结），将胶原溶液的pH调节至7.2；再用10×PBS将其稀释至1mg/ml的工作液，为避免胶原蛋白变性，此操作过程需在低温下完成；将已经过无菌处理的芯片置于超净工作台中，用微量移液器（量程10μl～100μl）通过进样孔向培养室和整个沟道内注入无菌的0.01M PBS（微量移液器的枪头用剪刀剪成与加样孔的孔径相契合，以注入液体时不外溢为最佳），直至将芯片培养池和沟道内残留的去离子水全部置换出来；再用2×的NSCs扩增培养基调整单细胞悬液的密度到2.0×10⁴neurospheres/ml，将其与等体积的胶原工作液混合均匀后，用微量移液器取细胞-胶原混合液20μl加入到芯片的细胞培养池中，混合物中I型胶原蛋白的终密度为0.5mg/ml，细胞的终密度是2.0×10⁴neurospheres/ml；将芯片置于直径为8.8cm的特制培养皿中，并添加适量无菌水以维持饱和湿度。将培养皿放入37℃、5%CO2培养箱中孵育60min；

3、两步培养法实现NSCs的三维生长

待凝胶形成后，用无菌的硅胶管将培养箱中的培养皿与置于微量注射泵上的50ml注射器相连接。连接前开启微量注射泵，先以较大的流速使芯片外部硅胶管充满新鲜培养基，并尽量排尽所有气泡。连接后开启注射泵，将流速设定为1μl/min，采用单循环给养方式，将新鲜的扩增培养基注入细胞培养室旁边的侧通道内。置换出的含有代谢废物的培养基则通过培养皿盖上的排出管进行收集分析。待“神经球”的平均直径为100μm左右时，将扩增培养液更换为条件培养液(配方见表.3)继续培养，直至“神经球”之间相互连接，实现三维生长。

表.3条件培养基各组分的配制与含量（10mL）

本实施例的结果显示，包埋于胶原支架中的“神经球”48h小时后的平均直径为50～100μm后（图8A），此时将扩增培养基更换为条件培养基，流速不变。更换培养基后的48h及96h倒置显微镜照片分别如图8B和8C所示。包埋于胶原水凝胶中的NSCs在微流控芯片上的生长状态良好，说明加工芯片所用材料PDMS与NSCs有很好的相容性。芯片中NSCs在胶原水凝胶搭建的支架中圆润饱满、突起粗壮，分支向三维空间纵深，清晰可见。同时细胞突起间形成的连接在倒置荧光显微镜下可清晰分辨，无需染色。三维静态培养条件下的NSCs与芯片中细胞形态特征相似（图8.D），在条件培养基的调控作用下，96h后细胞沿着胶原纤维铺展纵深，并建立起细胞间的相互连接，形成类神经组织样结构。二维贴壁生长的NSCs（图8.E）在形态特征上与三维培养的细胞具有明显差异。二维贴壁培养NSCs呈扁平状，折光性差，细胞突起全部贴附于一个平面之上，杂乱无章，很难分辨，需染色加以区分。

采用免疫荧光染色对芯片上三维生长的NSCs及其分化的子细胞进行了特征染色，染色结果如图9所示。神经元的标记蛋白MAP-2及星形胶质细胞的标记蛋白GFAP都呈阳性表达，且从图9.A和B图中可见三维生长的神经细胞突起清晰，彼此相连。NSCs的标记蛋白Nestin的染色结果也呈阳性(图9.C)，但是表达量要少于MAP-2和GFAP。表达Nestin阳性的细胞呈圆形，没有形成神经突。在形态上与分化后的神经细胞有明显的差异。

实施例4微流控细胞培养系统的建立

本实施例旨在为三维培养的NSCs建立一套微流控操控系统，其构成如图10所示。根据现有的实验条件与需要，将已制备好的微流控芯片置于直径为8.8cm的特制无菌培养皿中，培养皿上盖连接了培养液进出口的连通管，并在外部进口处配以微型无菌滤器，以方便随时将含有芯片的培养皿从系统中取出进行镜下观测，同时可防止由于反复安装引起的细菌或真菌污染；芯片完成细胞-胶原混合物接种后，在芯片四周的培养皿中注入5ml无菌水，为细胞提供一个湿润的生长环境，以防止芯片内培养体系中水分的蒸发；再将培养皿内侧的进出连通管分别通过微型三通与芯片上的两个进液室和两个废液池相连接后，将含有芯片的培养皿置于二氧化碳培养箱中。这样整个培养期间，特制的培养皿为芯片提供一个通气、湿润、无菌、可视的培养空间。

待细胞-胶原混合物凝固后，通过无菌的硅胶管（外径3mm）将培养箱中的培养皿与置于微量注射泵上的50ml注射器相连接。连接前开启微量注射泵，先以较大的流速使芯片外部管道内充满培养液，并尽量排尽所有气泡。连接后将流速设定为1μl/min，采用单循环给养方式，24h消耗1.44ml新鲜培养液。置换出的含有代谢废物的培养基则通过培养皿盖上的排出管进行收集分析。这样一个营养物质的持续更新、代谢废物不断排出的微流控系统便建立起来，如图10所示。此微流控系统可为NSCs三维复合物提供一个稳定的生理微环境。

本实施例结果显示，特制的芯片培养皿便于芯片内细胞的观察与检测。图8中A～B两组照片是透过特制的PVC培养皿拍摄的，C是将芯片从培养皿中取出，置于载物台进行拍摄。实验发现，透过PVC培养皿可以很好地进行细胞的观察和拍摄，所以在整个细胞培养过程中，使用特制的培养皿作为芯片的载体可以使得细胞观测工作更加直接便利，也可避免操作不当带来的污染。另外，芯片作为培养平台进行观测的更大优势在于，整个培养体系相对微小，全部细胞状态一目了然，并且所有细胞固定在胶原水凝胶中，其位置是固定的，这样，在实验中可以定时、定点地追踪固定目标，观测细胞生长变化。

另外，对本实施例中构建的NSCs三维培养体系的养分及代谢产物进行了跟踪检测。传统的细胞静态培养方法，通常以传代培养来更新细胞的生长环境，并在每一代的生长周期内，定期定量更换培养液。尽管这些方法能够为细胞提供一个在耐受范围内的生存条件。但是，在静态三维培养过程中，每次更换培养液的前后，乳酸的浓度都会产生一定的波动，而这种波动无疑会引起培养体系中pH值的改变。

已有研究表明体液pH与细胞膜离子通道的改变、ATP受体电流的激活、细胞骨架的整合、细胞内酶的活性以及细胞生长与分化等细胞生理活动密切相关。而细胞这种不稳定的生存条件势必会对细胞自身生理特性造成潜在的危害。而动态的微流控培养系统则可时刻为细胞培养体系带来新鲜的营养物质，并带走多余的代谢废物，从而创造了一个稳定均一的生存环境，更加接近动物体内的真实微环境。

谷氨酰胺是细胞体外培养重要的氮源，是不可或缺的营养成分。谷氨酰胺在中性条件下稳定性差，易降解，但如果添加过量则会因其降解产生有毒的副产物氨，而直接造成细胞的损伤。因此，定时补充细胞消耗的谷氨酰胺尤为重要。静态培养法主要通过人工补加的方式，这样，不仅耗费人力而且整个培养体系处于一种不稳定的波动状态，与动物体内的真实环境相去甚远，不能提供一个稳定的充足的氮源。而微流控细胞培养系统则可通过微量注射泵，自动补充细胞培养所需氮源，并维持一个稳定的范围区间（如图12所示）。

综上所述，利用本发明所建立起来的微流控细胞培养系统，可实现NSCs微尺度条件下的三维培养。实验通过两步法在芯片上建立起来的NSCs三维模型，细胞生长状态良好，重复性好。这种动态的细胞培养体系为细胞生长提供了一个与体内环境相近的稳定环境，利于细胞生长。尽管本发明是以NSCs为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，其它种类细胞以及实施例的其他变形，对于本领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。

Claims (2)

1.一种基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法，其特征包括以下步骤，

（1）以鼠尾I型胶原水凝胶作为三维支架，将其与不小于20μm的“神经球”混合均匀后，接种到PDMS微流控芯片上由若干微柱构成的细胞培养池中，待细胞-胶原复合物凝固后，采用以下的两步培养法：

第一步，培养初期以1μl/min的流速向细胞培养池中注入促使NSCs扩增培养基，待NSCs在胶原水凝胶中形成直径为50-100μm团簇；所述的扩增培养基通过正交试验确定营养成分，能够促进NSCs体外扩增，并保持其生物学特性的培养基，是DMEM、F12和RPMI-1640以1：1：1比例混合，添加生长因子EGF 20ng/ml、bFGF 10ng/ml、血清白蛋白2mg/ml、1%荷尔蒙添加剂N2和1/1000(v/v)脂类，培养基中主要的营养成分为葡萄糖4.2mg/ml、谷氨酰胺0.44mg/ml；第二步，将扩增培养基更换为条件培养基，流速不变，使细胞由团簇中向三维空间迁移，相邻的细胞团簇内的细胞相遇，相互连接，形成一个与神经组织相类似的三维复合模型结构，并利用可自动操控的微流控细胞培养系统对三维复合物进行了连续培养;所述的条件培养基是适合NSCs及其子细胞群体生长的培养基，是在基础培养基Neurobasal中添加2%B-27、10ng/ml BDNF、10ng/ml bFGF。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征是所述的鼠尾I型胶原与细胞球溶液混合后的最终浓度为0.5mg/ml。