CN104560709A - 一种微观生物培养装置及制作和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微观生物培养装置，包括基底和采用三维激光直写技术制作在基底之上的聚合物结构，所述聚合物结构包括具有顶部的注入容器，具有顶部的转移容器以及将所述转移容器和所述注入容器连通的连接管道，所述注入容器顶部留有通孔。本发明还提供了所述微观生物培养装置的制备方法和使用方法。本发明能够提供局域化液态环境，有利于研究细胞在不同的营养与酸碱度环境中的变化情况，从而更好地模拟人体或其它生物体环境。

Description

一种微观生物培养装置及制作和使用方法

技术领域

本发明涉及微纳米技术和三维生物结构与器件技术领域，具体地说，本发明涉及一种微观生物培养装置及制作和使用方法。

背景技术

三维微纳米功能结构在很多领域有着重要的应用，将其用于三维生物结构与器件领域，使得人们能够对生物细胞的培养以及癌细胞转移特性进行进一步地深入研究。

分析癌细胞的转移过程，癌细胞的转移是一个三维的侵入过程，当转移细胞突破血管，它们就会通过血管并向远处转移并侵入其它器官组织。当侵入成功，新的侵入点就蜕变成了癌细胞新的栖息地。

文献“Elastic 3D Scaffolds:Elastic Fully Three-dimensionalMicrostructure Scaffolds for Cell Force Measurements,Advanced Materials 22836(2010)”提出了一种利用双光子吸收三维激光直写设备来加工各种三维微纳结构，进而研究癌细胞的转移过程的方案。该方案中，设计癌细胞转移三维模型，在体外环境模拟癌细胞转移过程，或者将不同的原始癌细胞从一个部位放入，研究它们在不同的路径上的繁殖与转移，以及转移细胞的数量及不同癌细胞转移数量的差异。然而，该方案中，癌细胞转移三维模型均属于网状结构，网状结构无法提供局域化液态环境，不利于研究细胞在不同的营养与酸碱度环境中的变化情况，无法满足完全意义上的拟人体环境模拟。此外，三维激光直写技术中，一般只能在可发生光聚合的材料上制备图形，聚合物稳定性较差，且容易与溶剂发生反应，能承受的温度范围有限。因此，现有的基于双光子吸收三维激光直写设备制备的三维网状三维微纳结构还不能同时满足生体环境的高仿真性与多种环境兼容性的要求，并且也难以满足生体环境对结构热力学稳定性和极端环境的牢固性等方面的要求，也就是说，现有的三维网状微纳结构的生物细胞培养装置难以满足细胞及生物研究中日益复杂的需求。

发明内容

因此，本发明的任务是提供一种能够克服现有技术的上述缺陷的基于三维微纳米结构的微观生物培养装置及制作和操作方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种微观生物培养装置，包括基底和采用三维激光直写技术制作在基底之上的聚合物结构，所述聚合物结构包括具有顶部的注入容器，具有顶部的转移容器以及将所述转移容器和所述注入容器连通的连接管道，所述注入容器顶部留有通孔。

其中，所述注入容器顶部的通孔是样品和液体注入所述聚合物结构的唯一入口。

其中，所述基底包括衬底，制作在衬底上的微加热器，以及制作在所述微加热器之上的电绝缘层，所述微加热器用于对所述注入容器，所述转移容器和所述连接管道的温度进行调节；所述微加热器包括多个微加热区，每个微加热区分别对应一个所述注入容器，所述转移容器或者所述连接管道。

其中，所述注入容器和/或所述转移容器中，在靠近所述连接管道处设置有用于模拟生物体内组织的三维网状结构。

其中，所述注入容器的高度低于所述转移容器。

其中，所述转移容器的数目至少为2，每个所述转移容器均通过所述连接管道与所述注入容器连通并且每个所述转移容器的高度各不相同。

本发明还提供了一种微观生物培养装置制备方法，包括下列步骤：

1)在基底涂覆负光刻胶，基于三维激光直写技术基于预定的三维图形在所述负光刻胶上进行三维扫描，然后进行显影，定影，得到与预定的三维图形一致的聚合物结构，所述聚合物结构包括具有顶部的注入容器，具有顶部的转移容器以及将所述转移容器和所述注入容器连通的连接管道，所述注入容器顶部留有通孔，该通孔是样品和液体注入所述聚合物结构的唯一入口；

2)采用化学电镀，银镜反应或者原子层沉积的方法，在所述聚合物结构的内表面制作生物兼容层；

3)在所述转移容器顶部通过刻蚀技术进行减薄处理，制作出可视窗口。

其中，所述步骤2)还包括：在制作生物兼容层后，在所述聚合物结构的外表面制作保护层，然后通过刻蚀使得所述注入容器顶部的通孔保持畅通。

其中，所述步骤2)中，采用Ag，TiO₂和金刚石薄膜中任意一项或者数项所构成的复合薄膜制作生物兼容层；采用Al₂O₃或SiO₂薄膜，或者Al₂O₃和SiO₂所构成的复合薄膜作为保护层；所述保护层采用蒸发或溅射或沉积或电镀或化学镀，或是上述几种方法的结合进行制备。

本发明还提供了一种前述微观生物培养装置的使用方法，包括下列步骤：

a)将样品和作为样品液态环境的液体通过注入容器的通孔注入所述微观生物培养装置，所述样品包括生物细胞或者微生物；

b)将注入容器的通孔密封，使所述聚合物结构内的液体环境与外界完全隔离；

c)对样品从所述注入容器迁移到所述转移容器的情况进行观察。

其中，所述步骤c)还包括：调整所述注入容器，所述转移容器和所述连接管道各自的温度，对不同温度组合下的样品从所述注入容器迁移到所述转移容器的情况进行观察，进而得到样品对不同环境的选择性。

其中，所述步骤a)还包括：将所述液体注满所述注入容器，使各个所述转移容器获得所需的不同液面高度，进而获得所需的不同氧气富集程度；

所述步骤c)还包括：对不同温度以及氧气富集程度组合下的样品从所述注入容器迁移到所述转移容器的情况进行观察，进而得到样品对不同环境的选择性。

与现有技术相比，本发明具有下列技术效果：

1、本发明能够提供局域化液态环境，有利于研究细胞在不同的营养与酸碱度环境中的变化情况，从而更好地模拟人体(或其它生物体)环境。

2、本发明的培养装置能够同时满足生体环境的高仿真性与多种环境兼容性的要求。

3、本发明能够提供用于模拟生体环境的多种不同温度，不同氧气富集程度。

4、本发明的微观生物培养装置具有更好的结构热力学稳定性。

5、本发明的微观生物培养装置具有更好的牢固性，能满足一些生物实验所需的极端环境下的牢固性要求。

6、本发明的微观生物培养装置便于对生物细胞的内部变化进行观测。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1示出了本发明的一个实施例的制备过程中加工对准标记后的器件示意图；

图2示出了本发明的一个实施例的制备过程中制作微观生物培养装置的平面电阻加热器及其电极的示意图；

图3示出了本发明的一个实施例的制备过程中在基底上制作微观生物培养装置的聚合物结构的示意图；

图4示出了表面功能化后的注入容器的局部结构剖面示意图；

图5示出了加工可视窗口后的转移容器的局部结构剖面示意图；

图6示出了本发明一个实施例中的生物细胞培养装置的成品的立体结构示意图。

具体实施方式

根据本发明的一个实施例，提供了一种生物细胞培养装置制作方法，包括下列步骤：

步骤101：取一石英衬底1，在其上加工对准标记2。对准标记2采用光刻胶图形加工-金属沉积-金属剥离的方法进行加工。图1示出了加工对准标记后的器件示意图。根据一个实施例，对准标记2光刻胶图形的加工方法如下：将石英衬底1依次进行丙酮、乙醇、去离子水超声清洗，采用异丙醇冲洗，然后用氮气吹干，并在热板上180℃加热20分钟。等石英衬底1冷却后，进行S1813光刻胶的旋涂，转速为3000转/分，然后在热板上115℃加热1分钟，采用带有十字叉的光刻掩模版，通过紫外光刻进行衬底上对准标记光刻胶图形的曝光，曝光时间为15秒，光强为10毫瓦/平方厘米(10mW/cm²),显影时间为40秒。去离子水清洗后，氮气吹干。金属沉积的方法如下：采用热蒸发，在表面蒸镀Au(100nm)/Cr(5nm)。根据一个实施例，金属剥离的方法如下：将样品在丙酮溶液中超声清洗，去离子水超声清洗，氮气吹干。经过上述光刻胶图形加工-金属沉积-金属剥离工序后，对准记号2加工完毕。

需要说明的是，在本发明的其它一些实施例中，衬底材质还可以是除了石英外的具有温度稳定性、抗腐蚀性、生物兼容的其它半导体材料，或者具有上述特性的绝缘体材料，当采用半导体衬底时，对准标记可以采用光刻胶图形加工-金属沉积-金属剥离的方法，或采用电子束/离子束直写沉积加工，或离子束直写刻蚀的方法进行加工，当采用绝缘体衬底时，对准标记通常采用光刻胶图形加工-金属沉积-金属剥离的方法进行加工。

步骤102：参考图2，在具有对准标记2的衬底1上制作平面电阻加热器3及其电极4。本实施例中，平面电阻加热器3及其电极4的制作方法与对准记号2的加工方法一致，即采用光刻胶图形加工-金属沉积-金属剥离制作平面电阻加热器3及其电极4。平面电阻加热器3包括多个微加热区31，32和33，每个微加热区具有一个栅形电阻。

需要说明的是，在另一个实施例中，步骤102的对准标记2，电阻加热器3及其电极4也可以通过：金属沉积-光刻胶掩模图形的制备-金属刻蚀-光刻胶去除工艺获得。

步骤103：参考图3，在平面电阻加热器3及其电极4之上制作电绝缘层5。本实施例中，通过原子层沉积在步骤102完成后的样品上沉积20纳米的Al₂O₃，获得电绝缘层5(该电绝缘层的厚度能将电阻加热器图形完全覆盖)。然后利用镓离子聚焦离子束直写系统，在电极4上刻蚀20微米x 20微米的通孔6(该通孔6的尺寸要适合引线键合加工，直径或长宽尺寸通常在20微米～100微米范围内)，每个孔的刻蚀时间为2分钟，束流为200pA。所刻蚀的通孔中制备电极接触块，可供电极4引出，从而便于为平面电阻加热器3供电。

需要说明的是，在其它一些实施例中，步骤103的电绝缘层还可以是SiO₂,Si₃N₄或HfO₂，或者Al₂O₃,SiO₂,Si₃N₄和HfO₂中任意几种的组合。

上述步骤101至103实际上是制作了一个具有多个微加热区的基底，这些微加热区将对应于不同的微型容器，以便为各个微型容器提供不同的温度环境。

步骤104：仍然参考图3，采用双光子干涉吸收三维激光直写设备在基底上制备聚合物结构7。该聚合物结构7包括两个具有上顶的圆柱形微型容器及二者之间的连接通道，其中一个微型容器的顶部具有通孔，该通孔将作为细胞及液体注入口，本文中将该微型容器称为注入容器71，另一个圆柱形微型容器顶部完全封闭，本文中将该微型容器称为转移容器76。由于上述聚合物结构7由多个微型容器组成，因此也可以称为容器组结构。另外，图3中注入容器71和转移容器76之间的连接管道被标记为77。注入容器71，转移容器76和连接管道77分别对应于微加热区31，32和33。

通常来说，注入容器71的高度小于转移容器76，这样可以保证转移容器77不被液体充满(即液面的高度总低于转移容器上表面的高度)，以满足实验中可能需要的不同液面高度以及具有不同富氧度的空气界面。

上述聚合物结构7采用双光子干涉吸收三维激光直写设备一次成型。在一个例子中，在经过步骤103加工过的样品的中央滴一滴负光刻胶IP-L(也可以是SU-8负光刻胶等其它负光刻胶)，然后用封片(Fixogum)胶水将其固定在激光直写设备的样品架上。在常温下放置5分钟等胶水晾干后，将样品架放入激光直写设备的样品台上。然后，采用矩阵实验室(Matlab)编写不同高度和直径的具有上顶的中空圆柱体以及它们的连接通道图形，该图形中，在作为注入容器的中空圆柱体的顶部留有通孔，以便显影过程中溶液进入和流出中空圆柱体，并且该通孔还可以并作为生物细胞与液态环境装载的入口。然后，将写好的图形结构文件载入到激光直写设备(Nanoscribe)的软件DeScribe中。通过显微镜，找到对准标记2，并移动样品台，进行加工对准定位调制，使得中空圆柱体与平面电阻加热器3的微加热区一一对应。再采用从下至上(Invert)方式，利用47毫瓦的激光功率，使光束以50微米/秒的速度按设定的图形结构扫描。最后，将曝光后样品浸泡在丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)显影液中30分钟，采用异丙醇定影5分钟，后用氮气枪吹干，得到负性光刻胶IP-L构成的具有不同高度和直径的圆柱体IP-L微型容器，即得到了前文所述的聚合物结构7。

需要说明的是，本发明的一个实施例中，所述注入容器和转移容器直接制备在电绝缘层5上，而在另一个实施例中，所述注入容器和转移容器的下方制作有支脚，使得注入容器和转移容器的底部不直接与电绝缘层5接触，而是与电绝缘层5之间具有一定间距，该间距通常在200微米以下。

特别地，在一个优选实施例中，聚合物结构的注入容器和/或转移容器中还设置有三维网状结构(参考图4,图5)以模拟体内组织，这些三维网状结构同样使用激光直写设备一次成型。优选地，三维网状结构设置在靠近连接管道处。

另外，在本发明另外一些实施例中，聚合物结构的所述转移容器可以不只一个，而是两个，三个等，并且其中每个转移容器均通过管道与注入容器连通，且各个转移容器的高度可以不同，以在一次实验中同时提供多个不同的液面高度和具有不同富氧度的空气界面。

步骤105：在聚合物结构7的内外表面制作表面功能层，即聚合物结构7的表面功能化。本发明中通过三维的激光直写技术制备出复杂的微纳米图形结构，这种微纳米图形结构需要使用与激光直写技术匹配的聚合物材料，然而，该聚合物材料的生物兼容性、热力学与机械稳定性以及抗腐蚀性等方面均有待提高。步骤105就是通过对聚合物结构7的表面功能化来解决上述问题。在一个实施例中，步骤105包括表面功能层的沉积以及光刻胶的溶脱两个子步骤。采用原子层沉积的方法能在容器曝露的任何部位得到功能层的沉积。本案例中，首先在步骤104处理过的体系上采用原子层沉积250纳米的TiO₂作为生物兼容层，然后沉积150纳米厚Al₂O₃膜保护层，可抗腐蚀，抗氧化，耐高温，作为表面功能层8。然后，利用聚焦离子束技术在所得样品的注入容器的顶部加工切口(该切口可作为成品的细胞和液体注入口)。这样就获得了具有TiO₂/Al₂O₃表面功能层的聚合物结构7。在本发明的其它一些实施例中，也可以用Ag或者金刚石薄膜，或者Ag，TiO₂和金刚石薄膜中任意数项所构成的复合薄膜作为生物兼容层，用SiO₂薄膜，或者Al₂O₃和SiO₂所构成的复合薄膜作为保护层。

概括地说，聚合物结构7的表面功能化包括：(1)对完全裸露的外表面，采用蒸发或溅射或沉积或电镀或化学镀，或是几种方法的结合进行保护层的制备，以提高聚合物结构的热力学稳定性以及抗腐蚀性；(2)对聚合物结构的内表面，采用化学电镀，银镜反应或者原子层沉积的方法制备生物兼容层。这样，一方面解决了通常内表面不易功能化的问题，另一方面，可根据内外表面对材料的种类与尺寸的不同需求，满足功能化需求，提高结构的稳定性，节约加工成本。例如，原子层沉积反应速度慢，但可以对任何表面进行沉积反应，所以在一个实施例中，原子层沉积主要用来生长容器内表面以及内置结构的功能材料。而蒸发，溅射等工艺，生长的材料种类多，速度快，但材料的沉积只限于某些空间方向上，所以在一个实施例中，蒸发，溅射等工艺主要用于结构的外表面功能化，用于提高结构的热力学与机械性能。

图4示出了一个实施例中的表面功能化后的注入容器的剖面示意图，其中，注入容器71具有通孔72，注入容器71的内外表面分别具有生物兼容层73和保护层74，并且，在注入容器71中，靠近连接管道77处设置有模拟生物体内组织的三维网状结构75。

步骤106：在转移容器的上表面加工可视窗口9。本实施例中，将步骤105处理过后的样品放入聚焦离子束设备的真空腔中，采用10皮安(pA)的镓离子束流，在转移容器的密封圆柱体的上表面加工圆形的可视窗口9，每个转移容器的可视窗口9的数目可以是一个或多个。加工圆形的可视窗口9时，离子束圆形扫描区域的直径为2微米，并进行2分钟的镓离子束扫描刻蚀，将转移容器顶部以及顶部的TiO₂/Al₂O₃表面功能层减薄，从而在转移容器上表面的局部区域加工出对电子束或光透明的可视窗口9。图5示出了一个实施例中的加工了可视窗口9的转移容器76。其中，转移容器76的内外表面分别具有生物兼容层73和保护层74，转移容器76还具有通过外部刻蚀得到的可视窗口9，以及靠近连接管道77处设置有模拟生物体内组织的三维网状结构75。可视窗口9加工完成后，就得到了微区温度可调且可实时观测的细胞培养装置的成品。图6就示出了这种细胞培养装置的成品。参考图6，本实施例中，注入容器顶部的通孔是样品和液体注入所述聚合物结构的唯一入口，这样有助于确保细胞转移实验环境与外界隔绝，从而获得更加准确的实验数据。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的制备方法可设计，可重复且精度高，可帮助研究不同的温度及多种其它外场条件下的细胞转移的动态过程及环境选择性，从而为生物细胞学以及分子化学等领域的研究提供一种极为有效的手段。并且，本发明采用平面工艺制备的微纳电阻加热器具有可加工体积小，可设计性强的特点，同时加工工艺与三维激光直写技术具有很好的兼容性，能实现准确的对准，获得多功能异构三维集成器件。而三维激光直写是一种简便有效且可写任意三维结构的微纳加工技术，可解决三维容器型结构的高精度与跨尺度要求，可用于不同衬底材料，具有高效、灵活、可靠、可控、可设计的特点；负性光刻胶的采用，可极大地降低工艺难度并提高加工速度与成品率。而采用多种手段进行三维聚合物结构的表面功能化处理，能够增强结构的热力学稳定性，获得生物兼容或抗腐蚀性的特征，解决分子生物物理研究环境的高度仿，获得多种化学反应所需得实际环境。而通过功能化结构表面的聚焦离子束加工，实现开孔，减薄等处理，也具有高精度，高灵敏度与可设计的特点。

进一步地，根据本发明的一个实施例，还提供了一种利用该细胞培养装置进行细胞培养实验的方法，包括下列步骤：

步骤201：通过注入容器的通孔注入液体以形成细胞培养所需的液态环境，其中由于注入容器与转移容器通过管道连通，基于连通器效应，所有容器内均能够形成所需的液态环境。同时将细胞(即反应物)注入该注入容器中。

步骤202：通过覆盖速干环氧树脂对注入容器的通孔进行密封，从而使容器内的液体环境与外界完全隔离，满足在高度封闭环境进行实时高分辨观测的要求。本步骤中的密封操作一般在光学显微镜下进行。

步骤203：调整基底各个微区的温度，使得注入容器和转移容器处于所需的温度之下。通过转移容器的可视窗口，观察生物细胞在溶液中是否通过管道迁移以及迁移情况。

在选取细胞培养装置时，还可以为各个容器设置不同的高度差，以使各个容器获得不同液面高度以及能够提供不同氧气富集程度的空气界面，从而观察到不同环境下的生物细胞在溶液中的迁移情况，进而获得生物细胞对环境的选择性。

相对于现有技术，本发明的实验方法能够更好的模拟生物体的真实环境，从而更加准确地得到生物细胞对环境的选择性。并且，本发明还能够进行高分辨原位化学与生物物理过程的实时在线检测，从而研究生物物理过程与温度及多种外场条件下的动态过程，具有重要的应用价值。

另外，上述细胞培养装置不局限于细胞转移实验和实时观测，它也能够进行具有类似尺度的微生物的转移实验和实时观测装置。因此，广义地说，该细胞培养装置可以作为微观生物培养装置使用。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应指出的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种微观生物培养装置，包括基底和采用三维激光直写技术制作在基底之上的聚合物结构，所述聚合物结构包括具有顶部的注入容器，具有顶部的转移容器以及将所述转移容器和所述注入容器连通的连接管道，所述注入容器顶部留有通孔。

2.根据权利要求1所述的微观生物培养装置，其特征在于，所述注入容器顶部的通孔是样品和液体注入所述聚合物结构的唯一入口；所述转移容器顶部具有可视窗口。

3.根据权利要求2所述的微观生物培养装置，其特征在于，所述基底包括衬底，制作在衬底上的微加热器，以及制作在所述微加热器之上的电绝缘层，所述微加热器用于对所述注入容器，所述转移容器和所述连接管道的温度进行调节；所述微加热器包括多个微加热区，每个微加热区分别对应一个所述注入容器，所述转移容器或者所述连接管道。

4.根据权利要求3所述的微观生物培养装置，其特征在于，所述注入容器和/或所述转移容器中，在靠近所述连接管道处设置有用于模拟生物体内组织的三维网状结构。

5.根据权利要求1所述的微观生物培养装置，其特征在于，所述注入容器的高度低于所述转移容器。

6.根据权利要求5所述的微观生物培养装置，其特征在于，所述转移容器的数目至少为2，每个所述转移容器均通过所述连接管道与所述注入容器连通并且每个所述转移容器的高度各不相同。

7.一种微观生物培养装置制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)利用三维激光直写技术在基底上制作聚合物结构，所述聚合物结构包括具有顶部的注入容器，具有顶部的转移容器以及将所述转移容器和所述注入容器连通的连接管道，所述注入容器顶部留有通孔，该通孔是样品和液体注入所述聚合物结构的唯一入口；

2)采用化学电镀，银镜反应或者原子层沉积的方法，在所述聚合物结构的内表面制作生物兼容层；

3)在所述转移容器顶部通过刻蚀技术进行减薄处理，制作出可视窗口。

8.根据权利要求7所述的微观生物培养装置制备方法，其特征在于，所述步骤2)还包括：在制作生物兼容层后，在所述聚合物结构的外表面制作保护层，然后通过刻蚀使得所述注入容器顶部的通孔保持畅通。

9.根据权利要求8所述的微观生物培养装置制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，采用Ag，TiO₂和金刚石薄膜中任意一项或者数项所构成的复合薄膜制作生物兼容层；采用Al₂O₃或SiO₂薄膜，或者Al₂O₃和SiO₂所构成的复合薄膜作为保护层；所述保护层采用蒸发或溅射或沉积或电镀或化学镀，或是上述几种方法的结合进行制备。

10.一种权利要求1所述的微观生物培养装置的使用方法，其特征在于，包括下列步骤：

a)将样品和作为样品液态环境的液体通过注入容器的通孔注入所述微观生物培养装置，所述样品包括生物细胞或者微生物；

b)将注入容器的通孔密封，使所述聚合物结构内的液体环境与外界完全隔离；

c)对样品从所述注入容器迁移到所述转移容器的情况进行观察。

11.根据权利要求10所述的微观生物培养装置的使用方法，其特征在于，所述微观生物培养装置的基底包括衬底，制作在衬底上的微加热器，以及制作在所述微加热器之上的电绝缘层，所述微加热器用于对所述注入容器，所述转移容器和所述连接管道的温度进行调节；

所述步骤c)还包括：调整所述注入容器，所述转移容器和所述连接管道各自的温度，对不同温度组合下的样品从所述注入容器迁移到所述转移容器的情况进行观察，进而得到样品对不同环境的选择性。

12.根据权利要求10或11所述的微观生物培养装置的使用方法，其特征在于，所述微观生物培养装置中，所述注入容器的高度低于所述转移容器，所述转移容器的数目至少为2，每个所述转移容器均通过所述连接管道与所述注入容器连通并且每个所述转移容器的高度各不相同；

所述步骤a)还包括：将所述液体注满所述注入容器，使各个所述转移容器获得所需的不同液面高度，进而获得所需的不同氧气富集程度；

所述步骤c)还包括：对不同温度以及氧气富集程度组合下的样品从所述注入容器迁移到所述转移容器的情况进行观察，进而得到样品对不同环境的选择性。