CN109055315A - 一种神经细胞定位培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种神经细胞定位培养方法，主要包括配制聚二甲基硅氧烷液体和固化剂混合液，在玻璃基底上制备聚二甲基硅氧烷薄膜，采用激光打标机制备微孔阵列薄膜，将微孔阵列薄膜黏附于细胞培养皿底部，培养神经细胞，揭去微孔阵列薄膜，最终实现多种图案神经细胞定位。本发明采用激光打标机制备微孔阵列，不需要搭建光路，操作简单，通过CAD软件可以制备多种尺寸的圆形、矩形、线条形微孔阵列，可实现圆形、矩形和线条形图案的神经细胞定位培养，该方法成本低，精度高，定位效果好，可用于细胞力学、电学特性测量及药物筛选等。

Description

一种神经细胞定位培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术，具体的，本发明涉及一种以激光打标机为基础微流控芯片神经细胞定位培养方法。
背景技术
20世纪70年代，细胞图案化技术开始出现。通过微加工技术在基底上制备微尺度物理及化学图案，可诱导细胞选择性地黏附于特定区域。由于神经细胞是一种贴壁细胞，因此通过对基底进行修饰或加工可实现表面神经细胞的微尺度图案化，并将其应用于神经细胞力学、电学特性及药物筛选等研究中。随着技术的发展，越来越多的细胞图案化方法被提出，如：激光干涉光刻法、软光刻法、浸蘸笔纳米刻蚀法、表面化学修饰法等，极大地促进了人们对组织工程、生物传感器、神经元网络的形成以及基本细胞生物学等问题的研究。
然而，这些目前已有的细胞图案化方法仍存在设备昂贵、工艺复杂及工业化实现困难等问题。
聚二甲基硅氧烷是一种价格低廉、热稳定性好的弹性材料，无毒、生物相容性好，广泛应用于细胞生物学和生物工程领域。由于其表面能低和疏水性等特点，能够抑制细胞的粘附，此外，聚二甲基硅氧烷与组织培养聚苯乙烯板和玻璃等表面之间有很好的附着力。因此，通过使用聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜进行细胞定位培养的方法，能够解决上述方法存在的问题。
发明内容
本发明的技术解决问题是：克服以上缺点，提供一种神经细胞定位培养方法，该方法操作简单，成本低，精度高，定位效果好，方法中涉及的聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜可重复使用。
本发明技术解决方案：一种神经细胞定位培养方法，将聚二甲基硅氧烷液体和固化剂混合，在玻璃基底上均匀旋涂所得混合物后一起放入真空干燥箱中干燥得到聚二甲基硅氧烷薄膜，使用激光打标机在聚二甲基硅氧烷薄膜上制备微孔阵列，从玻璃基底上剥离所述聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜黏附在细胞培养皿底部，在所述细胞培养皿中培养神经细胞，细胞贴壁后揭去所述聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜即实现神经细胞在培养皿上定位培养。
本发明原理：配制聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液，在玻璃基底上均匀旋涂聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液并放入真空干燥箱中干燥得到聚二甲基硅氧烷薄膜，使用激光打标机在聚二甲基硅氧烷薄膜上制备微孔阵列，将所得的聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜从玻璃基底上剥离，黏附在细胞培养皿底部，所述细胞培养皿表面孵育一层多聚赖氨酸，使用聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液密封膜边缘。在所述的细胞定位培养基底上培养神经细胞，将其放入细胞培养箱中，神经细胞贴壁后揭去聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜。
所述激光打标机扫描速度为50mm/s-200mm/s，扫描次数为2-4次。
所述微孔阵列形状包括圆形、矩形、线条形。
所述圆形微孔阵列的直径为50-300μm，阵列间距为200-1000μm；所述矩形微孔阵列的长为50-300μm，宽为50-300μm，阵列间距为200-1000μm；所述线条形微孔阵列的线宽为50-300μm，线长小于所述细胞培养皿直径，阵列间距为200-1000μm。
所述二甲基硅烷液体和固化剂按照10:1或12:1的质量比例均匀混合。
所述真空干燥箱中干燥的温度为100-120℃，干燥时间为0.8-1.5小时。
本发明与现有技术相比的优点在于：
(1)本发明打破了传统光刻法技术的限制，将价格低廉、热稳定性好的聚二甲基硅氧烷弹性材料应用于神经细胞定位培养方法，该方法操作简单，成本低，所述聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜可重复利用。
(2)和表面修饰化学物质实现细胞定位相比，本发明中的聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜可进行高压灭菌操作，降低神经细胞在培养过程中被污染的可能性。
(3)本发明直接使用激光打标机进行微孔阵列制备，不需要进行复杂光路的搭建，操作简单，且精度可达到50μm。
(4)本发明根据实际需要可以制备多种尺寸的圆形、矩形、线条形微孔阵列，参数调节更方便。
(5)本发明可应用于微电极阵列中，实现神经细胞仅在电极位置处定位生长，有利于电信号的测量，降低噪声干扰。
附图说明
图1为一种神经细胞定位培养方法流程图；
图2为圆形聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜示意图；
图3为矩形聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜示意图；
图4为线条形聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜示意图；
图5为圆形微孔阵列的神经细胞定位培养效果图；
图6为矩形微孔阵列的神经细胞定位培养效果图；
图7为线条形微孔阵列的神经细胞定位培养效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明的实现方法为：以10:1或12:1的质量比例配制聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液，在玻璃基底上均匀旋涂聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液并放入真空干燥箱中干燥得到聚二甲基硅氧烷薄膜，在聚二甲基硅氧烷薄膜上制备微孔阵列，将所得的聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜从玻璃基底上剥离，依次置于丙酮溶液和乙醇溶液中超声清洗，将清洗后的薄膜放入乙醇溶液中储存，使用前用去离子水清洗并放入干燥箱中干燥后黏附在细胞培养皿底部，边缘涂抹聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液防止细胞悬浮液渗入所述薄膜与培养皿的缝隙中，在所述的细胞培养皿中加入神经细胞悬浮溶液，将其放入细胞培养箱中，神经细胞贴壁后揭去聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜。
所述的微孔阵列制备步骤中，使用激光打标机进行制备，包括以下步骤：
(1)设计微孔图案并进行参数设定；
(2)调节激光打标机焦距，使之聚焦于样品平面；
(3)设定激光打标机扫描速度和扫描次数；
所述细胞培养皿的基底为玻璃或高分子材料，表面孵育一层多聚赖氨酸，具体包括以下步骤：
(1)使用PBS溶液配制浓度为100μg/mL的多聚赖氨酸；
(2)将所述多聚赖氨酸完全覆盖细胞培养皿底，将其放入37℃培养箱1-2小时；
(3)取出所述的细胞培养皿并用PBS溶液清洗，放在细胞超净台中使PBS溶液自然蒸干。
所述微孔阵列形状包括圆形、矩形、线条形。
所述圆形微孔阵列的直径为50-300μm，阵列间距为200-1000μm；所述矩形微孔阵列的长为50-300μm，宽为50-300μm，阵列间距为200-1000μm；所述线条形微孔阵列的线宽为50-300μm，线长小于所述细胞培养皿直径，阵列间距为200-1000μm所述激光打标机扫描速度为50mm/s-200mm/s，扫描次数为2-4次。
所述真空干燥箱中干燥的温度为100-120℃，干燥时间为0.8-1.5小时。
所述细胞培养箱的温度为37℃，二氧化碳体积浓度为5％，培养时间为2-12小时。
下面结合实施例进行更详细的说明。
实施例1
本发明的实现步骤如下：
(1)聚二甲基硅氧烷液体和固化剂按照12:1的质量比例均匀混合后置于真空脱泡机中，利用抽真空的方式消除混合液中的气泡。
(2)切割20mm*20mm的玻璃基底，依次置于丙酮溶液和乙醇溶液中超声清洗；在玻璃基底上均匀旋涂制备好的混合液，将其放入120℃真空干燥箱中固化0.8小时，切割10mm*10mm的薄膜，所述薄膜厚度为240μm。
(3)使用CAD软件设计圆形微孔阵列图案，圆的直径为100μm，阵列间距为430μm，激光打标机扫描速度为200mm/s，扫描次数为4次，得到聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜，如图2所示，将聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜从玻璃基底上去除，依次置于丙酮溶液和乙醇溶液中超声清洗，将清洗后的薄膜放入乙醇溶液中储存，使用前用去离子水清洗并放入干燥箱中干燥。
(4)使用PBS溶液配制浓度为100μg/mL的多聚赖氨酸，将所述多聚赖氨酸完全覆盖在35mm*35mm细胞培养皿底，将其放入37℃培养箱1.5小时，取出所述的细胞培养皿并用PBS溶液清洗，放在细胞超净台中使PBS溶液自然蒸干。
(5)将聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜覆盖在多聚赖氨酸修饰的细胞培养皿底部，为防止聚二甲基硅氧烷薄膜与培养皿底部有气泡产生，加入少量细胞培养液，然后置于温度为37℃，二氧化碳体积浓度为5％的细胞培养箱中，至培养液蒸干后取出，用PBS润洗两次，洗去残余的培养液；使用聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液封住薄膜与培养皿边缘，等待固定。
(6)在所述的细胞培养皿中加入神经细胞悬浮液，放入温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％的细胞培养箱中2.5小时后取出，揭去聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜，即完成神经细胞定位培养。实验结果如图5所示，将聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜揭去后，神经细胞在微孔处区域定位生长，由于聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜的微孔形状为圆形，神经细胞在所述的定位区域形成了圆形的细胞图案，微孔以外的区域没有图案化神经细胞的生长。
实施例2
本发明的实现步骤如下：
(1)聚二甲基硅氧烷液体和固化剂按照10:1的质量比例均匀混合后置于真空脱泡机中，利用抽真空的方式消除混合液中的气泡。
(2)切割30mm*30mm的玻璃基底，依次置于丙酮溶液和乙醇溶液中超声清洗；在玻璃基底上均匀旋涂制备好的混合液，将其放入100℃真空干燥箱中固化1小时，切割12mm*12mm的薄膜，所述薄膜厚度为265μm。
(3)使用CAD软件设计矩形微孔阵列图案，矩形的长和宽均为70μm，阵列间距为250μm，激光打标机扫描速度为100mm/s，扫描次数为3次，得到聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜，如图3所示，依次置于丙酮溶液和乙醇溶液中超声清洗；将清洗后的薄膜放入乙醇溶液中储存，使用前用去离子水清洗并放入干燥箱中干燥。
(4)使用PBS溶液配制浓度为100μg/mL的多聚赖氨酸，将所述多聚赖氨酸完全覆盖在35mm*35mm细胞培养皿底，将其放入37℃培养箱1小时，取出所述的细胞培养皿并用PBS溶液清洗，放在细胞超净台中使PBS溶液自然蒸干。
(5)将聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜覆盖在多聚赖氨酸修饰的细胞培养皿底部，为防止聚二甲基硅氧烷薄膜与培养皿底部有气泡产生，向装置中加入少量细胞培养液，然后将该装置置于温度为37℃，二氧化碳体积浓度为5％的细胞培养箱中，至培养液蒸干后取出，用PBS润洗两次，洗去残余的培养液；使用聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液封住薄膜与培养皿边缘，等待固定。
(6)在所述的细胞培养皿加入神经细胞悬浮液，放入温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％的细胞培养箱中2小时后取出，揭去聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜，即完成神经细胞定位培养。实验结果如图6所示，将聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜揭去后，神经细胞在微孔处区域定位生长，由于聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜的微孔形状为矩形，神经细胞在所述的定位区域形成了矩形的细胞图案，微孔以外的区域没有图案化神经细胞的生长。
实施例3
本发明的实现步骤如下：
(1)聚二甲基硅氧烷液体和固化剂按照10:1的质量比例均匀混合后置于真空脱泡机中，利用抽真空的方式消除混合液中的气泡。
(2)切割40mm*40mm的玻璃基底，依次置于丙酮溶液和乙醇溶液中超声清洗；在玻璃基底上均匀旋涂制备好的混合液，将其放入80℃真空干燥箱中固化0.8小时，切割20mm*20mm的薄膜，所述薄膜厚度为230μm。
(3)使用CAD软件设计线条形微孔阵列图案，线条宽度最大值为100μm，阵列间距为1000μm，激光打标机扫描速度为50mm/s，扫描次数为2次，得到聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜，如图4所示，依次置于丙酮溶液和乙醇溶液中超声清洗；将清洗后的薄膜放入乙醇溶液中储存，使用前用去离子水清洗并放入干燥箱中干燥。
(4)使用PBS溶液配制浓度为100μg/mL的多聚赖氨酸，将所述多聚赖氨酸完全覆盖在35mm*35mm细胞培养皿底，将其放入37℃培养箱2小时，取出所述的细胞培养皿并用PBS溶液清洗，放在细胞超净台中使PBS溶液自然蒸干。
(5)将聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜覆盖在多聚赖氨酸修饰的细胞培养皿底部，为防止聚二甲基硅氧烷薄膜与培养皿底部有气泡产生，向装置中加入少量细胞培养液，然后将该装置置于温度为37℃，二氧化碳体积浓度为5％的细胞培养箱中，至培养液蒸干后取出，用PBS润洗两次，洗去残余的培养液；使用聚二甲基硅氧烷液体和固化剂的混合液封住薄膜与培养皿边缘，等待固定。
(5)在所述的细胞培养皿加入神经细胞悬浮液，放入温度为37℃，二氧化碳体积浓度为5％的细胞培养箱中12小时后取出，揭去聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜，即完成神经细胞定位培养。实验结果如图7所示，将聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜揭去后，神经细胞在微孔处区域定位生长，由于聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜的微孔形状为线条形，神经细胞在所述的定位区域形成了线条形的细胞图案，微孔以外的区域没有图案化神经细胞的生长。
综上，本发明提供的神经细胞定位培养方法，将价格低廉、热稳定性好的聚二甲基硅氧烷弹性材料应用于神经细胞定位培养方法，是一个更方便、经济和有效的细胞定位方法。具体地，本发明使用激光打标机在聚二甲基硅氧烷薄膜上制备微孔阵列，无需进行复杂光路的搭建，操作简单，且精度可达到50μm，通过CAD软件可以制备多种尺寸的圆形、矩形、线条形微孔阵列。在所述的聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜上培养神经细胞，细胞贴壁后揭去该薄膜，精准地实现了神经细胞在微孔处的定位生长，在培养皿底部分别形成了圆形、矩形和线条形的细胞图案。相对传统细胞定位方法来说，该方法操作简单，成本低，精度高，定位效果好。

Claims (6)

1.一种神经细胞定位培养方法，其特征在于：将聚二甲基硅氧烷液体和固化剂混合，在玻璃基底上均匀旋涂所得混合物后一起放入真空干燥箱中干燥得到聚二甲基硅氧烷薄膜，使用激光打标机在聚二甲基硅氧烷薄膜上制备微孔阵列，从玻璃基底上剥离所述聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜黏附在细胞培养皿底部，在所述细胞培养皿中培养神经细胞，细胞贴壁后揭去所述聚二甲基硅氧烷微孔阵列薄膜即实现神经细胞在培养皿上定位培养。
2.根据权利要求1的一种神经细胞定位培养方法，其特征在于：所述激光打标机扫描速度为50mm/s-200mm/s，扫描次数为2-4次。
3.根据权利要求1所述的一种神经细胞定位培养方法，其特征在于：所述微孔阵列形状包括圆形、矩形、线条形。
4.根据权利要求3所述的一种神经细胞定位培养方法，其特征在于：所述圆形微孔阵列的直径为50-300μm，阵列间距为200-1000μm；所述矩形微孔阵列的长为50-300μm，宽为50-300μm，阵列间距为200-1000μm；所述线条形微孔阵列的线宽为50-300μm，线长小于所述细胞培养皿直径，阵列间距为200-1000μm。
5.根据权利要求1所述的一种神经细胞定位培养方法，其特征在于：所述二甲基硅烷液体和固化剂按照10:1或12:1的质量比例均匀混合。
6.根据权利要求1所述的一种神经细胞定位培养方法，其特征在于：所述真空干燥箱中干燥的温度为100-120℃，干燥时间为0.8-1.5小时。
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