CN108570416A - 功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用及制备方法 - Google Patents
功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108570416A CN108570416A CN201810306070.8A CN201810306070A CN108570416A CN 108570416 A CN108570416 A CN 108570416A CN 201810306070 A CN201810306070 A CN 201810306070A CN 108570416 A CN108570416 A CN 108570416A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- culture
- unicellular
- chip
- grade
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/20—Material Coatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/22—Transparent or translucent parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用和制备方法,属于微流控技术领域。该微流控芯片包括玻片层A和细胞共培养层B。其中盖片A是载玻片,也可以是其他任何生物相容性材料,细胞共培养层B由任何生物相容性材料制成。所述细胞共培养层B包括进样口1,共培养阵列区域2及出样口4;所述共培养阵列区域2由若干共培养结构3呈阵列排布而成。该芯片的制备采用MEMS技术完成。本发明利用物理尺寸进行定位与数量的控制,并且结合了重力与微小流体的作用,将细胞精准的送入指定位置。具有操作步骤简便且制备加工简单可靠等特点,能够简单快速的实现单细胞直接共培养,为细胞生物学、组织工程等领域的研究提供了新思路与可靠的手段。
Description
所属领域
本发明涉及一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用和制备方法,属于微流控技术领域。
背景技术
细胞间的交互对细胞的行为至关重要,甚至能影响细胞的命运,因此成为近年来细胞研究领域的重点。为了深入研究细胞间的相互作用,常采用共培养的方式。现阶段共培养技术分为间接(非接触式)共培养和直接(接触式)共培养:间接共培养是将两种细胞分别接种于不同腔室上,然后将其置于同一培养环境之中,使不同种类的细胞共处同一种培养体系。这种方法便于对细胞进行增殖分化等方面的研究,但是细胞之间没有直接接触,因此不利于细胞通讯、旁分泌对细胞行为的影响和缝隙连接等研究;直接共培养是将两种细胞接种于同一结构中,不同种类的细胞之间直接接触。这种方法的好处在于可以研究两种细胞之间的相互作用,但是,由于难以将两种细胞分离,导致不利于细胞增殖分化等方面的研究。为解决两种共培养方法存在的问题,Burak Dura等人(Dura B,Dougan S K,Barisa M,et al.Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level bymicrofluidic cell pairing.[J].Nature Communications,2015,6:5940.)设计出一种利用双向捕获口转换液体流向来实现共培养的芯片,该芯片具有只能容纳两个细胞的正向捕获口与只能容纳一个细胞的反向捕获口。使用时,首先反向加样在反向捕获口获得细胞1,然后正向进样将Ⅰ种细胞转移至正向捕获口,接下来正向加入Ⅱ细胞,在正向捕获口实现细胞1与细胞2直接接触的共培养。这种芯片的好处在于能够精准的实现单细胞级共培养,其不足之处在于:1.在操作过程中要进行多次液体流向的转换,在流向转换的过程中容易造成已捕获细胞的流失,从而导致配对共培养效率低;2.换向频繁,增加了操作过程的复杂性;3.在芯片制备过程中需要对结构中的用于结构支承的细小面进行键合,这无疑增加了加工制备的难度4.该芯片结构内空间小不足以提供细胞贴壁生长。
发明内容
本发明的目的是:为了解决现有单细胞级直接共培养芯片由于多次流向转换造成配对共培养效率低,以及操作复杂,加工难度大的问题,提出了一种具有双层结构的捕获与培养功能分离的单细胞级共培养芯片。
本发明的技术方案是:一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片。该微流控芯片包括玻片层A和细胞共培养层B。其中盖片A是载玻片,也可以是其他任何生物相容性材料,细胞共培养层B由任何生物相容性材料制成。
所述细胞共培养层B包括进样口1,共培养阵列区域2及出样口4;定义进样口1到出样口4之间距离的方向为长度方向,与之垂直的在方向为宽度方向;所述共培养阵列区域2由若干共培养结构3呈阵列排布而成;所述共培养结构3主要为一凸起的非闭合环状结构外壁8,结构外壁8内部形成培养区域5;所述结构外壁8靠近进样口1的壁上有一空间U型区域,该区域靠近培养区域5侧有拦截定位微柱9,靠近进样口1侧则形成细胞拦截区域6;所述结构外壁8靠近出样口4的壁上有另一缺口,该缺口区域有结构微柱7;
定义单个共培养结构的环状结构外壁8宽度为D,长度方向为,d0为待操作细胞在悬浮状态下直径;了获得较好的单细胞效果,相邻共培养结构在宽度方向的间距C满足:D≤C≤2D,在长度方向的间距R满足D≤R≤2D;由于拦截定位微柱9与结构外壁8构成的空间区域主要用几何尺寸来控制细胞个数,拦截定位微柱9长度为w3:1.5d0≤w1-w3≤2d0,其中,w1为结构外壁宽度,拦截定位微柱9宽度为d3:d0≤d5-d3≤2d0,其中,d5为拦截区域6的宽度,拦截定位微柱9高度为h:d0≤h≤2d0且d0≤H-h≤2d0;
进一步的:
所述培养区域可以是任意图形,如矩形、圆形、带圆角的矩形等。
所述培养区域边长D,为保证良好的细胞铺展形态,应为细胞悬浮状态直径的6倍以上。
所述捕获区域尺寸,为获得良好的单细胞结果,使d5=1.5d0=w1-w3。
所述PDMS模板通过软光刻法结合PDMS复制模塑技术成型。
所述玻片层A为经过亲水处理的玻璃,也可以采用其他生物相容性亲水材料代替。
为得到较好的实验结果,应使结构微柱7长度为w2:0<w2≤w1,结构微柱7宽度为d4:0<d4<d5,高为H:d0<H≤5d0;结构外壁8外侧长度为L:2d0+w1+w2≤L≤5000d0+w1+w2;宽为D:2d0+d1+d2≤D≤5000d0+d1+d2;结构外壁8内侧长为w:2d0≤w≤5000d0,宽为d:2d0≤d≤5000d0;结构外壁的厚度尺寸包括:d1:1μm≤d1≤200μm、d2:1μm≤d2≤200μm、w1:1μm≤w1≤200μm、w2:1μm≤w2≤200μm。
所述基单细胞直接共培养微芯片的使用方法包括以下步骤:
步骤一:从入口1加入生物相容性液体直至将腔体内的空气完全排出。
步骤二:从入口1加入细胞A悬液,细胞停留在拦截区域6。
步骤三:从入口1加入培养液或缓冲液,将未被捕获的细胞冲走。
步骤四:将芯片上下翻转,细胞在重力作用下下落,维持一定的进样速度,细胞进入培养区域。
步骤五:加入细胞Ⅱ,重复步骤一~步骤三即可实现细胞Ⅰ和细胞Ⅱ的共培养。
步骤六:加入细胞Ⅲ,重复步骤一~步骤三即可实现细胞Ⅰ、细胞Ⅱ和细胞Ⅲ的共培养。以此类推通过一次步骤一~步骤三实现一种细胞的定位培养,重复步骤一~步骤三n次,实现n种细胞的共培养。
所述功能分离的单细胞级直接共培养芯片的制备方法,采用MEMS技术完成,具体包括如下步骤:
步骤一:制备硅模板。
子步骤一:溅射铝并涂光刻胶,进行曝光,显影,将刻蚀结构从掩膜板转移到光刻胶上,并去胶;
子步骤二:涂光刻胶,进行曝光,显影,将刻蚀结构从掩膜板转移到光刻胶上,刻蚀铝,对有光刻胶结构的硅片进行ICP刻蚀,用丙酮去除光刻胶;
子步骤三:对具有铝膜的硅片进行ICP刻蚀。
子步骤四:用铝刻蚀液去铝,并进行钝化。
步骤二:制备硅模板对应的PDMS模板。
子步骤一:以一定的比例混合PDMS预聚体和交联剂,充分搅拌均匀后,放入真空干燥箱中脱气,直至混合过程中产生的气泡完全排除;
子步骤二:将PDMS浇注在硅模板上,并静置;
子步骤三:将浇注PDMS后的硅模板置于烘箱中加热,使PDMS发生交联反应而固化;
步骤四:将基底材料彻底清洗并且浸泡在铬酸洗液,以获得良好的亲水性,冲洗干净浸泡在极性溶液中;
步骤五:将PDMS模板进行分割,将PDMS模板有图案的一面与基底材料利用电晕放电仪进行表面处理,然后迅速相对放置进行不可逆键合;
步骤六:将键合好的芯片置于烘箱加热,随炉冷却。
本发明的有益效果是:本发明针对现有的用于单细胞共培养的芯片存在的配对效率低、操作步骤繁琐、工艺要求高等问题,提出了一种功能分离的单细胞直接共培养微芯片及其制备方法,利用物理尺寸进行定位与数量的控制,并且结合了重力与微小流体的作用,将细胞精准的送入指定位置。具有操作步骤简便且制备加工简单可靠等特点,能够简单快速的实现单细胞直接共培养,为细胞生物学、组织工程等领域的研究提供了新思路与可靠的手段。
本发明具有以下优点:1、捕获与培养功能分离,既具备较高的配对效率,有能提供足够的生长空间;2、单细胞种类不限:可以实现两种、三种甚至更多不同种类单细胞的直接共培养;3、操作步骤简便:不需要芯片流向的改变,只需简单的芯片翻转即可实现单细胞共培养;4、制备工艺简单:本结构对制备加工的要求低,键合结构接触面大容易达到键合要求。
附图说明
图1为本发明提出的单细胞直接共培养微芯片效果图
图2为本发明提出的单细胞直接共培养微芯片的细胞培养层示意图
图3为本发明提出的单细胞直接共培养微芯片的单个共培养结构示意图
图4为本发明提出的单细胞直接共培养微芯片的结构设计图
图5为本发明提出的单细胞直接共培养微芯片硅模板制备工艺路线
图中:A、玻片层,B、细胞共培养层,1、入口,2、共培养结构,3、共培养阵列区域,4、出口,5、培养区域,6、拦截区域,7、结构微柱,8、结构外壁,9、拦截定位微柱
具体实施方式
实施例一
为了研究细胞通讯对干细胞分化方向的影响,本实施例中的芯片用于培养成纤维细胞L929和小鼠胚胎干细胞LT04来进行共培养研究。L929和LT04在悬浮液中平均直径d0为8μm。
参阅图1~图3。本实施例中将单细胞直接共培养微芯片用于小鼠成纤维细胞L929和小鼠胚胎干细胞LT04的共培养。其中,单细胞直接共培养微芯片的结构尺寸如下:w=60μm,L=100μm,d1=20μm,d2=20μm,d3=10μm,d4=10μm,w1=20μm,w2=20μm,w3=10μm,H=30μm,h=15μm。
本实施例中所述功能分离的单细胞级直接共培养芯片的使用方法,包括以下步骤:
步骤一:从入口1以10μL\min的速度加入三蒸水直至将腔体内的空气完全排出。
步骤二:从入口1以5μL\min的速度加入小鼠成纤维细胞L929的混合均匀的细胞悬液,单个的L929细胞将停留在拦截区域6。
步骤三:从入口1加入培养液或缓冲液,将未被捕获的细胞冲走。
步骤四:将芯片上下翻转,细胞在重力作用下下落,维持2μL\min的进样速度,细胞进入培养区域。
步骤五:以5μL\min的速度加入小鼠胚胎干细胞LT04的混合均匀的细胞悬液,重复步骤一~步骤三即可实现小鼠成纤维细胞L929和小鼠胚胎干细胞LT04的共培养。
步骤六:将芯片放入恒温培养箱中,隔12h换液,进样速度为1μL\min。
本实施例中单细胞直接共培养微芯片采用MEMS技术和复制模塑技术完成,具体包括如下步骤:
步骤一:按质量为10:1混合PDMS预聚体和交联剂,并充分搅拌均匀后,放入真空干燥箱中脱气30分钟,直至混合过程中产生的气泡完全排除;
步骤二:将PDMS浇注在硅模板上,并静置;
所述硅模板包括如下子步骤:
子步骤一:制作掩模版;
子步骤二:溅射铝,涂胶,光刻并进行铝刻蚀;
子步骤三:丙酮去除光刻胶,再次光刻,并刻蚀铝,电感耦合等离子体反应刻蚀,刻蚀深度为15μm;
子步骤四:丙酮去除光刻胶,并且电感耦合等离子体反应刻蚀,刻蚀深度为15μm;
子步骤五:钝化1min。
步骤三:将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中,使PDMS发生交联反应而固化,固化参数为:固化温度80℃,固化时间1h;
步骤四:将冷却后的PDMS轻轻剥下,就得到了所述基于PolyHEMA的单细胞培养芯片的PDMS模板;
步骤五:切片,将两个表面用电晕放电仪进行表面处理30s,将PDMS模板有图形一面与玻璃基底相对放置,进行键合。
子步骤一:将载玻片放在超声清洗机中,加洗洁精清洗;
子步骤二:将玻片冲洗干净放入烘箱烘干,放入铬酸洗液浸泡,隔夜;
子步骤三:将玻片彻底冲洗干净,放入极性溶液保存;
子步骤四:将玻片用氮气吹干,密封保存。
步骤六:将键合好的芯片放置于烘箱中加热至80℃停留1h,随炉冷却。
步骤七:紫外照射6h。
实施例二
为了研究细胞间的信号传导,如骨细胞与成骨细胞的间隙连接,本实施例中的芯片用于培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1、小鼠骨细胞MLO-Y4和小鼠胚胎干细胞LT04来进行共培养研究。小鼠成纤维细胞MC3T3-E1、小鼠骨细胞MLO-Y4和小鼠间充质干细胞C57BL/6在悬浮液中平均直径d01为20μm。
参阅图1~图3。本实施例中将单细胞直接共培养微芯片用于小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠骨细胞MlO-Y4的共培养。其中,单细胞直接共培养微芯片的结构尺寸如下:w=100μm,L=160μm,d1=30μm,d2=30μm,d3=15μm,d4=15μm,w1=30μm,w2=30μm,w3=15μm,H=50μm,h=25μm。
本实施例中所述功能分离的单细胞级直接共培养芯片的使用方法,包括以下步骤:
步骤一:从入口1以12μL\min的速度加入75%酒精排气,然后以同样的速度加入三蒸水维持进样约15min,直至将腔体内的空气完全排出。
步骤二:从入口1以3μL\min加入混合均匀的小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞悬液,单个的小鼠成骨细胞MC3T3-E1将停留在拦截区域6。
步骤三:从入口1以5μL\min的速度加入培养液或缓冲液,将未被捕获的细胞冲走。
步骤四:将芯片上下翻转,细胞在重力作用下下落,维持1μL\min的进样速度,细胞进入培养区域。
步骤五:以3μL\min的速度加入混合均匀的小鼠骨细胞MLO-Y4,重复步骤一~步骤三即可单个的小鼠成骨细胞MC3T3-E1和单个的小鼠骨细胞MLO-Y4的共培养。
步骤六:以2μL\min的速度加入均匀的小鼠间充质干细胞C57BL/6悬液,重复步骤一~步骤三即可实现小鼠成骨细胞MC3T3-E1、小鼠骨细胞MLO-Y4和小鼠胚胎干细胞LT04的共培养。
本实施例中单细胞直接共培养微芯片采用MEMS技术和复制模塑技术完成,具体包括如下步骤:
步骤一:按质量为5:1混合PDMS预聚体和交联剂,并充分搅拌均匀后,放入真空干燥箱中脱气30分钟,直至混合过程中产生的气泡完全排除;
步骤二:将PDMS浇注在硅模板上,并静置;
所述硅模板包括如下子步骤:
子步骤一:制作掩模版;
子步骤二:溅射铝,涂胶,光刻并进行铝刻蚀;
子步骤三:丙酮去除光刻胶,再次光刻,并刻蚀铝,电感耦合等离子体反应刻蚀,刻蚀深度为22μm;
子步骤四:丙酮去除光刻胶,并且电感耦合等离子体反应刻蚀,刻蚀深度为22μm;
子步骤五:钝化1min。
步骤三:将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中,使PDMS发生交联反应而固化,固化参数为:固化温度50℃,固化时间4h;
步骤四:将冷却后的PDMS轻轻剥下,就得到了所述基于PolyHEMA的单细胞培养芯片的PDMS模板;
步骤五:切片,将两个表面用电晕放电仪进行表面处理30s,将PDMS模板有图形一面与玻璃基底相对放置,进行键合。
子步骤一:将载玻片放在超声清洗机中,加洗洁精清洗;
子步骤二:将玻片冲洗干净放入烘箱烘干,放入铬酸洗液浸泡,隔夜;
子步骤三:将玻片彻底冲洗干净,放入极性溶液保存;
子步骤四:将玻片用氮气吹干,密封保存。
步骤六:将键合好的芯片放置于烘箱中加热至90℃停留1h,随炉冷却。
步骤七:紫外照射6h。
Claims (10)
1.一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片,其特征在于,包括玻片层A和细胞共培养层B;
所述细胞共培养层B包括进样口1,共培养阵列区域2及出样口4;定义进样口1到出样口4之间距离的方向为长度方向,与之垂直的在方向为宽度方向;所述共培养阵列区域2由若干共培养结构3呈阵列排布而成;所述共培养结构3主要为一凸起的非闭合环状结构外壁8,结构外壁8内部形成培养区域5;所述结构外壁8靠近进样口1的壁上有一空间U型区域,该区域靠近培养区域5侧有拦截定位微柱9,靠近进样口1侧则形成细胞拦截区域6;所述结构外壁8靠近出样口4的壁上有另一缺口,该缺口区域有结构微柱7。
2.如权利要求1所述的一种可实现单细胞直接共培养的微流控芯片,其特征在于,定义单个共培养结构的环状结构外壁8宽度为D,长度方向为,d0为待操作细胞在悬浮状态下直径;所述相邻共培养结构在宽度方向的间距C满足:D≤C≤2D,在长度方向的间距R满足D≤R≤2D;所述拦截定位微柱9长度为w3:1.5d0≤w1-w3≤2d0,其中,w1为结构外壁宽度,拦截定位微柱9宽度为d3:d0≤d5-d3≤2d0,其中,d5为拦截区域6的宽度,拦截定位微柱9高度为h:d0≤h≤2d0且d0≤H-h≤2d0。
3.如权利要求1所述的一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片,其特征在于,所述结构微柱7长度为w2:0<w2≤w1,结构微柱7宽度为d4:0<d4<d5,高为H:d0<H≤5d0;结构外壁8外侧长度为L:2d0+w1+w2≤L≤5000d0+w1+w2;宽为D:2d0+d1+d2≤D≤5000d0+d1+d2;结构外壁8内侧长为w:2d0≤w≤5000d0,宽为d:2d0≤d≤5000d0;结构外壁的厚度尺寸包括:d1:1μm≤d1≤200μm、d2:1μm≤d2≤200μm、w1:1μm≤w1≤200μm、w2:1μm≤w2≤200μm。
4.如权利要求1所述的一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片,其特征在于,所述培养区域是任意图形。
5.如权利要求1所述的一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片,其特征在于,所述培养区域边长D为细胞悬浮状态直径的6倍以上。
6.如权利要求1所述的一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片,其特征在于,所述捕获区域尺寸满足:d5=1.5d0=w1-w3。
7.如权利要求1所述的一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片,其特征在于,所述PDMS模板通过软光刻法结合PDMS复制模塑技术成型。
8.如权利要求1所述的一种功能分离的单细胞级直接共培养芯片,其特征在于,所述玻片层A为经过亲水处理的玻璃,或其他生物相容性亲水材料。
9.如权利要求1所述的功能分离的单细胞级直接共培养芯片的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一:从入口1加入生物相容性液体直至将腔体内的空气完全排出。
步骤二:从入口1加入细胞A悬液,细胞停留在拦截区域6。
步骤三:从入口1加入培养液或缓冲液,将未被捕获的细胞冲走。
步骤四:将芯片上下翻转,细胞在重力作用下下落,维持一定的进样速度,细胞进入培养区域。
步骤五:加入细胞Ⅱ,重复步骤一~步骤三即可实现细胞Ⅰ和细胞Ⅱ的共培养。
步骤六:加入细胞Ⅲ,重复步骤一~步骤三即可实现细胞Ⅰ、细胞Ⅱ和细胞Ⅲ的共培养。以此类推通过一次步骤一~步骤三实现一种细胞的定位培养,重复步骤一~步骤三n次,实现n种细胞的共培养。
10.如权利要求1所述的功能分离的单细胞级直接共培养芯片的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:制备硅模板:
子步骤一:溅射铝并涂光刻胶,进行曝光,显影,将刻蚀结构从掩膜板转移到光刻胶上,并去胶;
子步骤二:涂光刻胶,进行曝光,显影,将刻蚀结构从掩膜板转移到光刻胶上,刻蚀铝,对有光刻胶结构的硅片进行ICP刻蚀,用丙酮去除光刻胶;
子步骤三:对具有铝膜的硅片进行ICP刻蚀;
子步骤四:用铝刻蚀液去铝,并进行钝化;
步骤二:制备硅模板对应的PDMS模板:
子步骤一:以一定的比例混合PDMS预聚体和交联剂,充分搅拌均匀后,放入真空干燥箱中脱气,直至混合过程中产生的气泡完全排除;
子步骤二:将PDMS浇注在硅模板上,并静置;
子步骤三:将浇注PDMS后的硅模板置于烘箱中加热,使PDMS发生交联反应而固化;
步骤三:将基底材料彻底清洗并且浸泡在铬酸洗液,以获得良好的亲水性,冲洗干净浸泡在极性溶液中;
步骤四:将PDMS模板进行分割,将PDMS模板有图案的一面与基底材料利用电晕放电仪进行表面处理,然后迅速相对放置进行不可逆键合;
步骤五:将键合好的芯片置于烘箱加热,随炉冷却。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810306070.8A CN108570416B (zh) | 2018-04-08 | 2018-04-08 | 功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810306070.8A CN108570416B (zh) | 2018-04-08 | 2018-04-08 | 功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用及制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108570416A true CN108570416A (zh) | 2018-09-25 |
CN108570416B CN108570416B (zh) | 2021-08-10 |
Family
ID=63574163
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810306070.8A Expired - Fee Related CN108570416B (zh) | 2018-04-08 | 2018-04-08 | 功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用及制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108570416B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111440719A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-07-24 | 江苏奥素液芯生物技术有限公司 | 一种单细胞培养系统及单细胞培养方法 |
WO2022001631A1 (zh) * | 2020-06-29 | 2022-01-06 | 清华大学 | 用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101717717A (zh) * | 2009-12-11 | 2010-06-02 | 江阴司特易生物技术有限公司 | 细胞配对融合芯片 |
CN205382177U (zh) * | 2016-03-08 | 2016-07-13 | 朱廷准 | 一种内置细胞拦截器的高通量多单元微流控芯片装置 |
CN106047706A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-10-26 | 西北工业大学 | 一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用及制备方法 |
CN107849736A (zh) * | 2015-05-01 | 2018-03-27 | 卫理公会医院 | 用于细胞‑细胞通讯的高分辨率成像的方法和设备 |
-
2018
- 2018-04-08 CN CN201810306070.8A patent/CN108570416B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101717717A (zh) * | 2009-12-11 | 2010-06-02 | 江阴司特易生物技术有限公司 | 细胞配对融合芯片 |
CN107849736A (zh) * | 2015-05-01 | 2018-03-27 | 卫理公会医院 | 用于细胞‑细胞通讯的高分辨率成像的方法和设备 |
CN205382177U (zh) * | 2016-03-08 | 2016-07-13 | 朱廷准 | 一种内置细胞拦截器的高通量多单元微流控芯片装置 |
CN106047706A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-10-26 | 西北工业大学 | 一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用及制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BURAK DURA等: "Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture", 《PNAS》 * |
BURAK DURA等: "Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing", 《NATURE COMMUNICATIONS》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111440719A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-07-24 | 江苏奥素液芯生物技术有限公司 | 一种单细胞培养系统及单细胞培养方法 |
WO2022001631A1 (zh) * | 2020-06-29 | 2022-01-06 | 清华大学 | 用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108570416B (zh) | 2021-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110642222B (zh) | 一种高长径比的微米柱阵列、其制备方法和应用 | |
WO2019218101A1 (zh) | 高通量多参数的单细胞源性细胞外囊泡分析芯片及应用 | |
KR100476273B1 (ko) | 단세포 장기배양 현미경 관찰장치 | |
Lin et al. | Microfluidic cell trap array for controlled positioning of single cells on adhesive micropatterns | |
CN101598717A (zh) | 以水凝胶平面微图案化为基础的液塑法制备聚二甲基硅氧烷芯片的方法 | |
US20110294208A1 (en) | Method and device for cell selection and collection in an isolated culturing environment | |
CN108570416A (zh) | 功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用及制备方法 | |
CN108107205A (zh) | 高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法及系统 | |
CN201259501Y (zh) | 艾滋病诊断专用微流控芯片 | |
CN109810895B (zh) | 基于等高微柱的开放式三维细胞培养芯片及其制备技术 | |
CN108380253B (zh) | 阵列式油包液滴结构的制备方法 | |
CN101955595A (zh) | 在多种材料表面制备化学微图案引导细胞定点生长的方法 | |
JP2011155865A (ja) | 基板、細胞培養装置、細胞チップおよび培養方法 | |
TWI547694B (zh) | 微流道生物反應器及其套組和使用方法 | |
Liu et al. | Rapid cell pairing and fusion based on oscillating bubbles within an acoustofluidic device | |
CN114774275A (zh) | 基于旋转电场下双极性电极的三维细胞球生成芯片及应用 | |
CN108121161A (zh) | 一种高通量形成拟胚体的微阵列芯片的制备方法与应用 | |
CN104190482A (zh) | 以感光干膜为抗腐蚀掩膜制作玻璃微流体装置的方法 | |
CN109055315A (zh) | 一种神经细胞定位培养方法 | |
KR101433091B1 (ko) | 박테리아의 주화성 분석용 마이크로 플루이딕 장치, 제조방법 및 이를 이용한 박테리아의 주화성 분석 방법 | |
CN108529555A (zh) | 一种与循环肿瘤细胞尺寸匹配的微纳复合结构表面、制备方法及其应用 | |
JP2013239265A (ja) | パターニング装置およびパターニング方法 | |
CN111979090B (zh) | 一种基于磁性微模块的细胞培养方法 | |
KR101856033B1 (ko) | 유도만능 줄기세포의 배양 용기 및 배양 방법 | |
CN111269572B (zh) | 一种聚二甲基硅氧烷楔形多孔薄膜的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210810 |