CN108107205A - 高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其包括：提供三维细胞培养芯片，其包括选定基底以及形成于选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由若干图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂组成；在所述芯片表面施加细胞悬浮液，再进行细胞培养，之后去除多余细胞，获得单细胞阵列；将基质胶施加到所述芯片表面，并将所述图纹结构完全覆盖，其后孵育至所述基质胶充分固化；以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并持续培养，之后甄选阳性杂交瘤细胞进行后续处理。本发明还公开了一种相应的系统。本发明的方法操作简单，培养周期短，无需饲养细胞，且能大幅提高杂交瘤筛选通量，减小筛选结果的假阳性率。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物芯片，特别涉及一种能够高通量快速筛选分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的方法及系统。
背景技术
自从科学家Kohler和Milstein于1975年创建单克隆抗体(McAb)技术以来，该技术不断发展完善，应用也日益广泛。能分离稳定高效分泌抗原特异性抗体的融合杂交瘤细胞是最终是否能纯化得到有效单克隆抗体的关键步骤。
目前，杂交瘤细胞的筛选和克隆化方法有有限稀释法、流式细胞术筛选法、半固体培养法、微流控法以及微井法等。但这些方法各有缺陷。例如，有限稀释法的假阳性率高、耗时长、工作量大、操作繁琐且成本高；流式细胞术筛选法所需设备昂贵，成本较高，材料来源质量难以控制；半固体培养法中的杂交瘤细胞分布不均，降低了细胞筛选通量，细胞生长受限，克隆挑选困难及不易检测；微流控法的细胞污染可能性大，通量低；而微井法的成本高，过程中仅仅依靠重力作用，较难控制。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法及系统，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其包括：
提供三维细胞培养芯片，所述芯片包括选定基底以及形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养以使所述的各图案捕获单细胞，之后去除多余的细胞，获得单细胞阵列；
将基质胶施加到所述三维细胞培养芯片的表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶充分固化；
以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并在细胞培养环境中持续培养，之后甄别和挑取阳性杂交瘤细胞并进行后续处理。
进一步的，所述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原。
优选的，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质。
进一步的，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性。
进一步的，所述的后续处理包括：对挑取出的阳性杂交瘤细胞并进行单克隆培养或抗体轻重链基因扩增。
本发明实施例还提供了一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统，其包括：
三维细胞培养芯片，包括选定基底以及形成所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
基质胶，至少能够将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，并能在细胞培养环境中固化；
以及，细胞培养完全培养基，至少能够完全覆盖固化的基质胶。
本发明实施例还提供了一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统，其包括：
印章及修饰剂，所述印章的印面具有设定立体结构，所述修饰剂能够以可脱离方式附着在所述印面上，且当在所述印章的印面上附着修饰剂后，并以所述印面接触选定基底表面时，至少部分修饰剂会脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
选定基底，用于与所述印章及修饰剂配合构建三维细胞培养芯片；
基质胶，至少能够将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，并能在细胞培养环境中固化；
以及，细胞培养完全培养基，至少能够完全覆盖固化的基质胶。
进一步的，前述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原。
优选的，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质，例如荧光探针。
在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法包括：
采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；
以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；
使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；
以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；
以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构，获得所述三维细胞培养芯片。
进一步的，前述印章印面的设定立体结构由一个以上凸设于所述印章印面的突出部和/或一个以上凹设于所述所述印章印面的下凹部组成。
进一步的，前述高分子化合物包括能够热固化和/或光固化的高分子化合物。优选的，前述高分子化合物包括高分子有机硅化合物，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，且不限于此。
进一步的，前述修饰剂包括能够在选定基底表面修饰活性氨基的试剂，例如可以选用丙基多巴乙酰胺(PDAC)、对氨基马尿酸(PAH)、聚醚酰亚胺(PEI)或纤维连接蛋白(fibronectin)等，且不限于此。
较之现有技术，本发明至少具有如下优点：
(1)本发明提供的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法具有简单易操作、高通量、高可靠性、高稳定性等特点，例如，该方法在实施时，每个信号均由单个细胞形成，因此不需要反复克隆既能获得单纯的分泌抗原特异性抗体的细胞株，而且藉由该方法可以同时筛选通量达到105个杂交瘤细胞，能大幅提高筛选细胞获得率，同时筛选时间短，不需要细胞增殖，仅在单细胞层面就能获得阳性结果，还可有效避免因成纤维细胞生长而使杂交瘤细胞的生长受到抑制，此外还无需标记即可直接检测杂交瘤分泌的抗体，能同时鉴定出单个杂交瘤细胞分泌抗体的特异性和分泌强度。
(2)本发明提供的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统成本低廉，只需一次投入，可以很长时间反复使用，且仍保持精确、高效的检测效果。
附图说明
图1是本发明一典型实施方案中一种PDMS印章的制备工作流程图；
图2是本发明一典型实施方案中一种单细胞微阵列的形成过程示意图；
图3是本发明一典型实施例中形成的一种单细胞微阵列的照片；
图4是本发明一典型实施例中一种单细胞分泌的特异性单克隆抗体信号的荧光检测图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本说明书涉及的一些技术术语的释义如下：
光刻：是通过一系列生产步骤，将晶圆表面薄膜的特定部分除去的工艺。在此之后，晶圆表面会留下带有微图形结构的薄膜。通过光刻工艺过程，最终在晶圆上保留的是特征图形部分。
软光刻：是涉及传统光刻、有机分子(例如硫醇和硅氧烷等)自组装、电化学、聚合物科学等领域的一类综合性技术的统称。
杂交瘤细胞：杂交瘤细胞是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B细胞融合而成的细胞。
基质胶(Matrigel)：基质胶可认为是一种可溶性的基底膜基质。主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含TGF-β成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子以及其它在EHS肿瘤中自然表达的生长因子等。
单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb)：因单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定决定簇的特异性抗体。
微流控技术(microfluidics)：指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术。
又及，若非特别说明，则本说明书中述及的其它术语的含义均是本领域技术人员所知悉的，此处不再赘述。
本发明实施例提供的一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法包括：
提供三维细胞培养芯片，所述芯片包括选定基底以及形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养以使所述的各图案捕获单细胞，之后去除多余的细胞，获得单细胞阵列；
将基质胶施加到所述三维细胞培养芯片的表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶充分固化；
以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并在细胞培养环境中持续培养，之后甄别和挑取阳性杂交瘤细胞并进行后续处理。
进一步的，所述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原。
在一些较为优选的实施方案中，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质，例如荧光探针。
进一步的，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性，以阻止细胞在除图纹结构之外的选定基底表面区域贴附。
进一步的，所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法还可包括：在完成细胞培养后，除去所述三维细胞培养芯片表面的培养基，并以新鲜培养基或者磷酸缓冲液润洗所述三维细胞培养芯片表面，去除多余的细胞，获得单细胞阵列。
进一步的，所述细胞悬浮液中细胞总数为所述三维细胞培养芯片表面的图案数量的2～3倍。
进一步的，所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法还可包括：以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并在细胞培养环境中持续培养，之后在荧光显微镜下拍照、定位，并甄别和挑取阳性杂交瘤细胞进行后续处理。
进一步的，所述的后续处理可以包括：对挑取出的阳性杂交瘤细胞并进行单克隆培养或抗体轻重链基因扩增。
本发明实施例提供的一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统包括：
三维细胞培养芯片，包括选定基底以及形成所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
基质胶，至少能够将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，并能在细胞培养环境中固化；
以及，细胞培养完全培养基，至少能够完全覆盖固化的基质胶。
本发明实施例提供的一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统也可包括：
印章及修饰剂，所述印章的印面具有设定立体结构，所述修饰剂能够以可脱离方式附着在所述印面上，且当在所述印章的印面上附着修饰剂后，并以所述印面接触选定基底表面时，至少部分修饰剂会脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
选定基底，用于与所述印章及修饰剂配合构建三维细胞培养芯片；
基质胶，至少能够将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，并能在细胞培养环境中固化；
以及，细胞培养完全培养基，至少能够完全覆盖固化的基质胶。
进一步的，前述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原。
在一些较佳实施方案中，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质，例如荧光探针。
在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法可以包括：
采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；
以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；
使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；
以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；
以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而使至少部分修饰剂脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成所述图纹结构，获得所述三维细胞培养芯片。
在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法具体可以包括：在基片上涂覆一层光刻胶，之后烘烤、曝光，并再次烘烤，其后显影，制得所述掩模。其中所述掩模的厚度可以依据实际需求设置，例如可以优选为7～15μm。
在一些实施方案中，所述印章印面的设定立体结构由一个以上凸设于所述印章印面的突出部和/或一个以上凹设于所述所述印章印面的下凹部组成。
在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法还可以包括：至少将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，之后取出，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。
在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法具体可以包括：在室温条件下，将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，保持10min以上，之后取出，洗涤、干燥，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。
进一步的，所述高分子化合物包括能够热固化和/或光固化的高分子化合物。优选的，所述高分子化合物包括高分子有机硅化合物，例如可优选为聚二甲基硅氧烷等，且不限于此。
在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法还可以包括：先对所述选定基底进行表面处理，以至少使所述选定基底表面具有排斥细胞的特性(防止细胞贴附)，之后将所述印面与选定基底表面接触，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构。最终使所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性，防止细胞在这些不期望的区域贴附。
前述表面处理的方式可以包括：以等离子体(plasma，例如氧等离子体)对所述选定基底表面进行处理。
或者，前述表面处理的方式也可以包括：以化学物质对所述选定基底表面进行表面修饰。所述化学修饰处理用的试剂可以包括聚苯乙烯磺酸钠(PSS)或硅烷化的聚乙二醇等，且不限于此。
其中，单独的Plasma处理可以产生足够的block细胞的负电效应(不仅可以防止细胞贴附，也利于增强印面表面的正电性聚合物类修饰剂的转移)，但与采用PSS等试剂修饰的方式相比，Plasma对环境要求更高，适用于环境条件较高的实验室，例如无尘室等。但如果进行化学修饰(例如PSS修饰)，则基底表面需要提前修饰，相应的方法也是业界已知的，此处不再赘述。
在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法具体可以包括：将印面附着有修饰剂的印章一次性放置在所述选定基底上，使所述印面与选定基底表面在设定压力下(例如可以手轻压)接触并保持30s以上(例如30～40s)，然后移除所述印章，从而在所述选定基底表面形成所述的图纹结构。
进一步的，前述实施例中的修饰剂可以包括能够在选定基底表面修饰活性氨基的试剂，例如可以选用丙基多巴乙酰胺(PDAC)、对氨基马尿酸(PAH)、聚醚酰亚胺(PEI)或纤维连接蛋白(fibronectin)等，且不限于此。
进一步的，前述实施例中的图纹结构厚度可以可以优选为7～15μm。
进一步的，前述实施例的图纹结构中，任一图案的面积由所需的吸附细胞面积决定，而任意两个相邻图案的距离由所需的相邻细胞的间距决定。
其中，相邻图案之间的间距应足以区分开不同细胞分泌的抗体。优选的，相邻图案之间的间距可以为30μm以上，例如30μm～100μm，例如30μm～60μm，例如60μm～100μm，当然，也可以为30μm以下或100μm以上，但若相邻图案之间的间距过小，则可能导致相邻图案上的不同细胞分泌的抗体相互干扰，而若间距过大，则将导致相同面积上的筛选通量过小。
其中，各图案用以吸附细胞的面积可以为5μm×5μm～15μm×15μm，若过小会使图案对细胞的吸附力量过小，容易脱落，而若过大，将难以保证各图案上吸附的细胞为单细胞。
前述实施例的图纹结构中的各图案可以完全相同，也可以是部分图案相同，其可以依据实际应用的需要而进行相应设置。优选的，前述图纹结构中的图案完全相同，以利于加工，也利于后续的细胞甄别。
进一步的，前述实施例中的选定基底表面可以优选为平整面。
进一步的，前述实施例中的选定基底可以优选为透明基底，例如可以选用玻璃片等，利用普通盖玻片玻璃，如此便于在细胞培养过程中观察细胞生长和各种不同指标特征。
本发明提供的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法操作简单，培养周期短，在实施过程中无需饲养细胞，且能大幅提高杂交瘤筛选通量，减小筛选结果的假阳性率，能高通量快速、准确的筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
以下结合典型实施例及附图对本发明的技术方案作更为详细的解释说明。
请参阅图1所示，在本发明的一典型实施案例中，一种三维细胞培养芯片的制备方法可以包括步骤：
1.掩模(Master)的制作：
1)利用软件(Photoshop/AutoCAD/Clewin)等设计图案，然后制作。
2)取干净的硅片，氮气吹去表面的杂质颗粒。浸泡于酸液中(体积比为3:1的H2SO4和H2O2)，80℃、1h。
3)用蒸馏水润洗3遍以上，从而去除硅片表面的酸性物质及油脂。
4)将洗净的硅片放置于溶液中(体积比为5:1:1的H2O:NH4OH:H2O2)，室温浸泡1h。
5)用蒸馏水润洗3遍去除硅片表面的化学物质并用氮气吹干，之后于120℃加热处理5min，取下放置冷却至室温。
6)涂胶：利用旋转法(Spin Coater)在硅片上涂一薄层粘附性好、厚度适当、均匀的光刻胶。将清洁的硅片放置于甩胶盘中心托盘上，然后用滴管滴上数滴光刻胶于片子上，利用转动时产生的离心力，将片子上多余的胶液甩掉，在光刻胶表面粘附能力和离心力的共同作用下形成厚度均匀的胶膜。要求：厚度适当(根据试验要求和参考说明书)，胶膜层均匀，粘附良好，表面无颗粒无划痕。以Su8 2005为例，若其厚度为5μm，则相应操作条件包括：500rpm、5-10s，100rpm/s；2500rpm、30s，300rpm/s)
7)前烘：将硅片放置于加热台上烘烤，促使胶膜内溶剂充分地挥发掉，使胶膜干燥，增加胶膜与硅片之间的粘附性和提高胶膜的耐磨性，不沾污掩模板，只有干燥的光刻胶才能充分进行光化学反应。前烘时间(与胶的种类和厚度相关，以Su8 2005为例，若其厚度为5μm，则相应工艺条件为：65℃、2min，95℃、9min)，之后取下硅片冷却至室温。
8)曝光：在专用的光刻机上或者UV光源下曝光，包括“定位”和“曝光”两部分。预热紫外光灯(高压水银灯)使光源稳定—将光刻掩模板安装在支架上，使有图形的玻璃面向下---把涂有光刻胶的硅片放在可微调的工作台上胶面朝上---在显微镜下仔细调节微动装置，使掩模板上的图形与硅片相应的位置准确吻合---使硅片和掩模板紧密接触---复查是否对准---曝光---取下片子。曝光时间的选择根据光源强弱、光刻胶性能及光刻图形尺寸大小相关。一般情况下，先试曝光一片，显影后检查一下表面，看其图形是否清晰。曝光不足会导致光刻胶反应不充分，显影时部分胶膜被溶解，显微镜下观察胶膜发黑；曝光时间过长会导致不感光部分的边缘微弱感光，产生“晕光”现象，边界模糊，出现皱纹。曝光时间：约8s～25s不等。(以Su8 2005为例，若其厚度约5μm，则相应工艺条件包括：100W UV、15s)。
9)后烘：将曝光后的硅片放置于加热台上烘烤直至曝光影像出现(对于小尺度的图形，可能会很难看到)。后烘时间及温度(和胶的种类和厚度相关，以Su8 2005为例，若其厚度约5μm，则相应工艺条件包括：65℃、2min，95℃、7min。之后取下硅片冷却至室温。
10)显影：将未感光部分的光刻胶溶除，以获得曝光所需图形。以厚度5μm的Su82005为例，将曝光后的片子放入Su8显影液中不断震荡直至曝光图案逐渐清晰，立即放入蒸馏水中清洗。
11)观察：将水清洗干净的硅片用氮气吹干，置于显微镜下观察所曝光图案的质量，制得掩模，置于封闭容器中待用。
2.PDMS印章的制作及表面修饰
1)PDMS原始溶液(两种：有机硅橡胶silicone elastomer base，有机硅固化剂silicone elastomer curing agent)按照10:1的质量比混合均匀；将均匀混合的PDMS溶液倾倒在掩模表面(提前将掩模放到容器中，可以是塑料培养皿)直至均匀的覆盖整个表面并使高度达到要求(一般1cm左右)；置于真空干燥器中除气(时间大概1h，期间不断观察)；将覆盖PDMS溶液的掩模放到烘箱中固化(60℃过夜)；固化完成后，取出并切割成所需大小，显微镜观察质量，获得PDMS印章，待用。
2)PDMS修饰：将清理过的PDMS印章浸泡在1％(V/V)的PDAC或者PAH溶液中，在室温下保持10min。取出，用蒸馏水润洗3次，氮气吹干并待用。
3)玻璃片修饰：将清理过的玻璃片浸泡在1％(V/V)的PPS(聚苯乙烯磺酸钠)溶液中，在室温下保持10min。取出，用蒸馏水润洗3次，氮气吹干并待用。
4)PDAC或PAH微阵列的形成：将修饰好的PDMS印章轻轻的放在修饰好的玻璃片上(不要移动，一次性放置)，稍稍加力使两表面接触并保持30s～40s，然后揭掉PDMS印章，于玻璃片上形成所需的图纹结构，即为三维细胞培养芯片。该过程可以参阅图2所示。
3.单细胞阵列的形成
1ml细胞悬浮液(细胞数量根据图案不同决定，大体来说，细胞总数为图案数量的2～3倍)被置于修饰好(盖好印章图案后)的玻璃片上，将载有细胞的玻璃片放置于细胞培养箱内20～30min。之后，取出玻璃片，小心的将培养基除去，并用新鲜培养基或者PBS(磷酸缓冲液)轻轻的润洗玻璃片，从而去除多余的细胞，获得单细胞阵列(该过程可继续参阅图2所示)。最后，用显微镜观察单细胞阵列的质量。
请参阅图3所示是在本发明的一典型实施例中所获的单细胞阵列的相差倒置显微镜照片。
4.用鼠尾来源的基质胶(Matrigel)封闭细胞。取约200～300ul基质胶(4℃下操作，防止胶凝固，包含荧光标记的抗原，按照1:100的比例稀释)，轻轻滴加到载有前述单细胞阵列的三维细胞培养芯片上直到基质胶能覆盖所有细胞区域。放置于细胞培养箱中孵育15min，使基质胶充分固化。取出，加入适量(覆盖住基质胶即可)细胞培养完全培养基持续培养。
5.持续培养3小时，取出在荧光显微镜下拍照(本发明一典型实施例中所获的荧光显微照片如图4所示)、定位、挑取阳性杂交瘤细胞并进行后续单克隆培养或进行抗体轻重链基因扩增。这些后处理工序可参考一系列相关文献，例如：PNAS,1996,93,7843-7848；Nat.Med.,2009,15,1088-1093.，等等。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (25)
1.一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于包括：
提供三维细胞培养芯片，所述芯片包括选定基底以及形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养以使所述的各图案捕获单细胞，之后去除多余的细胞，获得单细胞阵列；
将基质胶施加到所述三维细胞培养芯片的表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶充分固化；
以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并在细胞培养环境中持续培养，之后甄别和挑取阳性杂交瘤细胞并进行后续处理。
2.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原；优选的，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质；优选的，所述标记性物质包括荧光探针。
3.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：
采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；
以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；
使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；
以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；
以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而使至少部分修饰剂脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成所述图纹结构，获得所述三维细胞培养芯片。
4.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法具体包括：在基片上涂覆一层光刻胶，之后烘烤、曝光，并再次烘烤，其后显影，制得所述掩模；和/或，所述掩模的厚度为7～15μm。
5.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述印章印面的设定立体结构由一个以上凸设于所述印章印面的突出部和/或一个以上凹设于所述所述印章印面的下凹部组成。
6.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：至少将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，之后取出，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；优选的，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：在室温条件下，将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，保持10min以上，之后取出，洗涤、干燥，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。
7.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述高分子化合物包括能够热固化和/或光固化的高分子化合物；优选的，所述高分子化合物包括高分子有机硅化合物；优选的，所述高分子化合物包括聚二甲基硅氧烷。
8.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述图纹结构中，任一图案的面积由所需的吸附细胞面积决定，而任意两个相邻图案的距离由所需的相邻细胞的间距决定；优选的，相邻图案之间的间距在30μm以上，尤其优选为30μm～100μm；优选的，所述图案用以吸附细胞的面积为5μm×5μm～15μm×15μm；和/或，所述图纹结构的厚度为7～15μm；和/或，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性。
9.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：先对所述选定基底进行表面处理，以至少使所述选定基底表面具有排斥细胞的特性，之后将所述印面与选定基底表面接触，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构；优选的，所述表面处理包括等离子体处理或者化学修饰处理；优选的，所述化学修饰处理用的试剂包括聚苯乙烯磺酸钠或硅烷化的聚乙二醇。
10.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：将印面附着有修饰剂的印章一次性放置在所述选定基底上，使所述印面与选定基底表面在设定压力下接触并保持30s以上，然后移除所述印章，从而在所述选定基底表面形成所述的图纹结构。
11.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述修饰剂包括能够在选定基底表面修饰活性氨基的试剂；优选的，所述修饰剂包括丙基多巴乙酰胺、对氨基马尿酸、聚醚酰亚胺或纤维连接蛋白。
12.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述选定基底表面为平整面；优选的，所述选定基底包括透明基底，优选的，所述选定基底包括玻璃片。
13.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于还包括：在完成细胞培养后，除去所述三维细胞培养芯片表面的培养基，并以新鲜培养基或者磷酸缓冲液润洗所述三维细胞培养芯片表面，去除多余的细胞，获得单细胞阵列。
14.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述细胞悬浮液中细胞总数为所述三维细胞培养芯片表面的图案数量的2～3倍。
15.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于还包括：以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并在细胞培养环境中持续培养，之后在荧光显微镜下拍照、定位，并甄别和挑取阳性杂交瘤细胞进行后续处理；优选的，所述的后续处理包括：对挑取出的阳性杂交瘤细胞并进行单克隆培养或抗体轻重链基因扩增。
16.一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统，其特征在于包括：
三维细胞培养芯片，包括选定基底以及形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
基质胶，至少能够将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，并能在细胞培养环境中固化；
以及，细胞培养完全培养基，至少能够完全覆盖固化的基质胶。
17.一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统，其特征在于包括：
印章及修饰剂，所述印章的印面具有设定立体结构，所述修饰剂能够以可脱离方式附着在所述印面上，且当在所述印章的印面上附着修饰剂后，并以所述印面接触选定基底表面时，至少部分修饰剂会脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；
选定基底，用于与所述印章及修饰剂配合构建三维细胞培养芯片；
基质胶，至少能够将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，并能在细胞培养环境中固化；
以及，细胞培养完全培养基，至少能够完全覆盖固化的基质胶。
18.根据权利要求16或17所述的系统，其特征在于：所述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原；优选的，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质；优选的，所述标记性物质包括荧光探针。
19.根据权利要求16或17所述的系统，其特征在于：所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：
采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；
以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；
使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；
以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；
以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构，获得所述三维细胞培养芯片。
20.根据权利要求17或19所述的系统，其特征在于：所述印章印面的设定立体结构由一个以上凸设于所述印章印面的突出部和/或一个以上凹设于所述所述印章印面的下凹部组成。
21.根据权利要求19所述的系统，其特征在于：所述高分子化合物包括能够热固化和/或光固化的高分子化合物；优选的，所述高分子化合物包括高分子有机硅化合物，优选的，所述高分子化合物包括聚二甲基硅氧烷。
22.根据权利要求17、19、20中任一项所述的系统，其特征在于：在与所述印章的印面接触之前，所述选定基底的表面是经过预处理的，并至少具有排斥细胞的特性；优选的，所述预处理包括等离子体处理或者表面修饰；优选的，所述化学修饰处理用的试剂包括聚苯乙烯磺酸钠或硅烷化的聚乙二醇。
23.根据权利要求16或17所述的系统，其特征在于：所述修饰剂包括能够在选定基底表面修饰活性氨基的试剂；优选的，所述修饰剂包括丙基多巴乙酰胺、对氨基马尿酸、聚醚酰亚胺或纤维连接蛋白。
24.根据权利要求16或17所述的系统，其特征在于：所述选定基底表面为平整面；优选的，所述选定基底包括透明基底，优选的，所述选定基底包括玻璃片。
25.根据权利要求16或17所述的系统，其特征在于：所述图纹结构中，任一图案的面积由所需的吸附细胞面积决定，而任意两个相邻图案的距离由所需的相邻细胞的间距决定；优选的，相邻图案之间的间距在30μm以上，尤其优选为30μm～100μm；优选的，所述图案用以吸附细胞的面积为5μm×5μm～15μm×15μm；和/或，所述图纹结构的厚度为7～15μm；和/或，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性。
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