CN101955595B - 在多种材料表面制备化学微图案引导细胞定点生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在多种材料表面制备化学微图案，引导细胞定点生长的方法。制备过程包括：1)玻璃片，石英片，硅片，过渡金属氧化物等表面羟基化以及聚合物或其它无机材料表面覆盖多巴胺；2)在预处理后的表面通过分子自组装或原子转移自由基聚合方法得到致密的抗蛋白吸附膜：聚乙二醇膜或聚乙二醇异丁烯酸酯膜；3)在抗蛋白吸附膜上加盖掩模板，紫外光照射后，加入纤连蛋白得到蛋白微图案，接种细胞即可得到细胞图案。本方法操作简单，成本低廉，制备条件温和，不需要超净的实验条件。采用本方法可以在多种材料表面获得稳定的高选择性细胞微图案，在细胞生物学基础研究、组织工程，药物筛选以及基于细胞的生物传感器领域有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种稳定的高选择性细胞微图案的制备。采用分子自组装技术结合紫外光照，在多种材料表面制备化学微图案达到引导细胞定点生长的目的，通过调节微图案的形状和尺寸，可以控制细胞的粘附、迁移、分化及细胞间相互作用，在细胞生物学基础研究、组织工程、药物筛选以及基于细胞的生物传感器领域有广阔的应用前景。
背景技术
细胞图案化是一种研究和控制细胞行为的有效实验方法，广泛用于细胞生物学、组织工程学、药物筛选和创伤治疗等各个研究领域。有多种技术可实现基底图案化，包括两大类：光刻技术和软光刻技术，通过图案化可以有效地限制细胞定点生长。
光刻技术来源于半导体工业，最初用于金属在微电子电路上的图案化.在细胞培养基底上旋涂感光胶，覆以掩模，继而曝光成型，是光刻技术的常规操作步骤。光刻用来制作细胞图案化，因昂贵的仪器设备、必备的洁净条件以及感光胶带给生物物质的毒害等缺陷大大制约了其在普通生物实验室的普及应用。
软光刻技术中使用频率最高的是微接触印刷技术.在光刻法制备的含微图案的原版上浇注弹性体预聚物，经固化制得表面具有浮雕的“印章”，以印章蘸取待转移物质，于基底上进行简单印刷实现其从“印章”至基底的转移。但弹性印章的使用从根本上限制了高保真度的几何图案的制备，且经常发生基底上的弹性印章残留物的污染现象。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种工艺简单，能够实现上述要求的在多种材料基底上制备引导细胞定点生长的图案化方法。
技术方案：本发明的在多种材料表面引导细胞定点生长的微图案制备方法包括以下步骤：
1)在第一种基底材料表面产生羟基；在富含羟基的表面通过分子自组装得到抗蛋白吸附膜：聚乙二醇PEG膜或聚乙二醇异丁烯酸酯PEGMA膜，前者是通过硅烷化反应在预处理过的基片表面自组装形成PEG膜；后者是通过原子转移自由基聚合反应得到PEGMA膜，
2)在第二种基底材料即聚合物和其它无机物表面覆盖上多巴胺层，然后将一端带氨基或巯基的聚乙二醇反应到多巴胺表面，从而制备得到抗蛋白吸附膜，
3)在已得到的抗蛋白吸附膜上，覆盖具有微图案的透紫外掩模板，用波长为365nm紫外光，照射不同时间：对PEG膜作用20min，对PEGMA膜作用30min，紫外光照后可获得化学微图案，
4)在紫外光光照后的样品表面滴加浓度为50μg/ml的纤连蛋白缓冲溶液，15分钟后超纯水冲洗表面，得到蛋白微图案；
5)在蛋白图案化的表面接种一种细胞即可得到细胞图案。
所述的第一种基底材料包括玻璃、石英、硅、过渡金属氧化物、表面含有或能产生羟基的材料、聚合物或其它无机材料。
所述的表面产生羟基，是将玻璃、石英、硅片放在piranha溶液H2SO4∶H2O2＝3∶1v∶v中80℃浸泡30min，然后按超纯水，乙醇，超纯水的顺序各超声10min，每次超声后用大量超纯水冲洗，最后用氮气吹干，在120℃干燥箱内烘10min，即得到富含羟基的表面；对过渡金属氧化物基底，较好的方法是用氧等离子体处理2min使表面羟基化。
所述的PEG自组装膜的制备是在预处理后的玻璃，石英，硅，过渡金属氧化物等基底表面采用硅烷化反应实现的，反应采用冷凝回流装置，反应时间为18h，反应温度为硅油浴60℃，反应后需用甲苯，异丙醇各超声5min，并用大量的超纯水冲洗表面。
所述的PEGMA膜的制备是在预处理后的玻璃，石英，硅，过渡金属氧化物等基底表面采用原子转移自由基聚合反应ATRP实现的，首先是在表面偶联3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES，随后接上表面引发剂异丁酰溴，以二联吡啶为配体，溴化亚铜为催化剂进行表面聚合反应，反应气氛为氮气，反应温度为25度，反应后用大量超纯水冲洗表面。
所述的在其它基底材料即聚合物和其它无机物表面制备抗蛋白吸附膜的方法，是将基底放置在浓度为2mg/ml的多巴胺溶液中，溶剂为PH＝8.5的10mM Tris缓冲溶液，进行24小时反应后，再放入浓度为5mg/ml的末端带氨基或巯基的PEG溶液中，在温度为50度的条件下反应24小时，即可在聚合物和其它无机物表面形成PEG膜。
所述的化学微图案的制备是将具有微图案的透紫外掩模板覆盖在已制备的抗蛋白吸附膜上，用波长为365nm的紫外光照射，紫外灯光源(500W，365nm)与样品间的距离为10cm，对PEG膜光照20min，对PEGMA膜光照30min；受紫外光照射区域的PEG膜或PEGMA膜被降解而形成化学微图案，该区域易于吸附蛋白，进而有利于细胞粘附形成细胞微图案；掩模板的制备是在石英板上真空镀一层铬膜后用光电子刻蚀得到不同尺寸的透紫外光区域，面积包括100μm2，900μm2，3600μm2，8100μm2；图案的不透光区域的间距尺寸为250μm，150μm，100μm，50μm，得到16种组合的图案。
本发明方法操作工艺简单，成本低廉，制备条件温和，不需要超净的实验条件。采用本方法可以控制细胞的粘附、迁移、分化及细胞间相互作用，在细胞生物学基础研究、组织工程、药物筛选以及基于细胞的生物传感器领域有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明的流程示意图，
具体实施方式
1)在玻璃片，石英片，硅片，过渡金属氧化物等表面产生羟基，在聚合物材料或其它无机材料表面反应上多巴胺层；
2)在富含羟基的表面通过反应得到抗蛋白吸附膜：聚乙二醇(PEG)膜或聚乙二醇异丁烯酸酯(PEGMA)膜，前者是通过硅烷化反应在羟基化表面自组装形成PEG膜，反应温度：硅油浴60℃，反应时间：18h；后者是通过原子转移自由基聚合反应得到PEGMA膜；在多巴胺表面通过与一端带氨基或巯基的聚乙二醇反应得到PEG膜。
3)在已得到的抗蛋白吸附膜上，覆盖具有微图案的透紫外掩模板，用紫外光(波长为365nm)照射不同时间：PEG膜上作用20min，PEGMA膜上作用30min。紫外光照后可获得化学微图案。
4)在紫外光照射后的样品表面滴加纤连蛋白溶液，则得到蛋白微图案；
5)在蛋白图案化的表面接种一种细胞即可得到细胞图案。
本发明中，所用的基底材料不仅包括玻璃片，石英，硅，过渡金属氧化物或其它表面含有或能产生羟基的材料，还包括聚合物和其它无机材料。
本发明步骤1)中的表面硅羟基化，是将基底材料(玻璃片，石英，硅)放在piranha溶液(H2SO4∶H2O2＝3∶1v∶v)中80℃浸泡30min直到没气泡产生，然后按超纯水，乙醇，超纯水的顺序各超声10min，每次超声后用大量超纯水冲洗，最后用氮气吹干，在120℃干燥箱内烘10min，即得到富含硅羟基的表面。对过渡金属氧化物基底，较好的方法是用氧等离子体处理2min使表面羟基化。
本发明步骤1)中在聚合物和其它无机物材料表面反应上多巴胺层，是将基底放置在浓度为2mg/ml的多巴胺溶液中(溶剂为PH＝8.5的10mM Tris缓冲溶液)，室温条件下反应24小时后用大量超纯水冲洗，并用氮气吹干。
本发明步骤2)中PEG自组装膜的制备采用硅烷化反应，反应采用冷凝回流装置，反应时间为18h，反应温度为硅油浴60℃，反应后需用甲苯，异丙醇各超声5min，并用大量的超纯水冲洗表面。PEGMA膜的制备是采用原子转移自由基聚合反应(ATRP)，首先是在表面偶联3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，随后接上表面引发剂异丁酰溴，以二联吡啶为配体，溴化亚铜为催化剂进行表面聚合反应，反应气氛为氮气，反应温度为25度，反应后用大量超纯水冲洗表面。在多巴胺表面制备抗蛋白吸附膜PEG，是将多巴胺覆盖的基底放入浓度为5mg/ml的末端带氨基的PEG溶液中，在50度下反应24小时，溶剂为PH＝8.5的10mM Tris缓冲溶液。
本发明中化学微图案的制备是将具有微图案的透紫外掩模板覆盖在已制备的抗蛋白吸附膜上，用波长为365nm的紫外光照射，紫外灯光源(500W)与样品间的距离为10cm，对PEG膜光照20min，对PEGMA膜光照30min。受紫外光照射区域的PEG膜或PEGMA膜被降解而形成化学微图案。掩模板的制备是在石英板上真空镀一层铬膜后用光电子刻蚀得到不同尺寸的透紫外光区域，面积包括100μm2，900μm2，3600μm2，8100μm2。图案的不透光区域的间距尺寸为250μm，150μm，100μm，50μm，得到16种组合的图案。掩模板的微图案形状和尺寸并不局限于上述数据，可以根据需要任意设计，本发明的方法适合任意尺寸的透紫外掩模板。
本发明可采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的蛋白修饰紫外光照后的化学图案，得到蛋白图案，用荧光显微镜可观察这些图案的形状及大小。
本发明可以在图案化的表面接种各种可贴壁的细胞，先在图案化的表面滴加浓度为50μg/ml的纤连蛋白缓冲溶液，15分钟后超纯水冲洗表面，得到蛋白微图案，然后接种一定浓度的细胞，培养一定时间后，用显微镜观察，或者用0.1mg/ml吖啶橙染色观察细胞的生长情况。
本发明制备细胞微图案的方法适合于任何表面能产生羟基的基底材料和各种高分子材料，表面形成的薄膜可以是任意具有抗蛋白吸附能力的膜。以下实例只是进一步说明本发明，但不是限制本发明。
实例一：
基底表面羟基化：将直径为12mm的圆形玻片放在piranha溶液(H2SO4∶H2O2＝3∶1v∶v)中80℃浸泡30min直到无气泡产生，然后按超纯水，乙醇，超纯水的顺序各超声10min，每次超声后用大量超纯水冲洗，最后用氮气吹干，在120℃干燥箱内烘10min，即得到富含硅羟基的表面。
PEG抗蛋白吸附膜的制备：采用硅烷化反应，PEG硅烷的浓度为6mM，反应采用冷凝回流装置，反应时间为18h，反应温度为硅油浴60℃，反应结束时需用甲苯，异丙醇各超声5min，并且每次超声后用大量的超纯水冲洗表面，最后用氮气吹干。
UV光照PEG抗蛋白吸附膜：将待用的掩模板用超纯水冲洗，并用无水乙醇擦拭表面。然后将其覆盖在上述制备的PEG膜表面，紫外线光源(500W，365nm)与样品之间的距离为10cm，光照时间为20min。
蛋白图案的形成及观察：在UV光照后的PEG膜样品表面滴加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的50μg/ml蛋白溶液，在黑暗处静置30min，用PBS溶液冲洗后吹干，得到蛋白微图案。采用荧光显微镜可以观察到不同尺寸的蛋白图案，黑色背景是PEG抗蛋白吸附膜，绿色部分则是紫外光照射区域吸附了荧光蛋白所形成的图案。
细胞图案的形成及观察：将UV光照后的PEG膜样品用75％的酒精浸泡1h，用无菌的HEPES缓冲溶液(PH＝7.4)冲洗样品表面，然后在表面滴加50μg/ml的纤连蛋白溶液(HEPES，PH＝7.4)，静置20min，用无菌的HEPES溶液冲洗表面，分别接种浓度为2×104cells/ml的PC12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞和骨髓间充质干细胞(BMSCs)。培养一段时间后，用显微镜直接观察，或者用0.1mg/ml吖啶橙染色观察细胞的生长情况。吖啶橙染色的时候将0.1mg/ml的吖啶橙滴在样品表面，避光静置30min，然后用PBS缓冲溶液冲洗，采用荧光显微镜观察。
实例二：
除了抗蛋白吸附膜的制备不同，其余步骤与实例一相同。PEGMA抗蛋白吸附膜的制备是采用原子转移自由基聚合反应(ATRP)，首先在富含硅羟基的表面偶联三氨基三乙氧基硅烷(APTES)，然后接上表面引发剂异丁酰溴，以二联吡啶为配体，溴化亚铜为催化剂进行表面聚合反应，反应气氛为氮气，反应温度为25度，反应后用大量超纯水冲洗表面。在聚乙二醇PEG膜和聚乙二醇异丁烯酸酯PEGMA膜上形成的微图案表面分别接种浓度为2×104cells/ml的3T3成纤维细胞，用显微镜直接观察的结果。经持续细胞培养显示，在PEGMA膜上的细胞图案稳定性可达21天以上，而在PEG膜上的稳定性稍差。
综上所述，可根据要求选择不同方法制备抗蛋白吸附膜，若只需要在较短时间内观察细胞图案，可选择一步反应自组装形成PEG膜；若需较长时间观察细胞图案，则可选择相对复杂的ATRP的三步反应制备PEGMA膜。
Claims (6)
1.一种在多种材料表面引导细胞定点生长的微图案制备方法，其特征是该方法包括以下步骤：
1)在第一种基底材料表面产生羟基；在富含羟基的表面通过分子自组装得到抗蛋白吸附膜：聚乙二醇PEG膜或聚乙二醇异丁烯酸酯PEGMA膜，前者是通过硅烷化反应在预处理过的基底材料表面自组装形成PEG膜；后者是通过原子转移自由基聚合反应得到PEGMA膜，
2)在第二种基底材料即聚合物表面覆盖上多巴胺层，然后将一端带氨基或巯基的聚乙二醇反应到多巴胺表面，从而制备得到抗蛋白吸附膜，
3)在已得到的抗蛋白吸附膜上，覆盖具有微图案的透紫外掩模板，用波长为365nm紫外光，照射不同时间：对PEG膜作用20min，对PEGMA膜作用30min，紫外光照后可获得化学微图案，
4)在紫外光光照后的样品表面滴加浓度为50μg/ml的纤连蛋白缓冲溶液，15分钟后超纯水冲洗表面，得到蛋白微图案；
5)在蛋白图案化的表面接种一种细胞即可得到细胞图案。
2.按权利要求1所述的在多种材料表面引导细胞定点生长的微图案制备方法，其特征在于所述的第一种基底材料包括玻璃、石英、硅、过渡金属氧化物、聚合物或其它无机材料。
3.按权利要求2所述的在多种材料表面引导细胞定点生长的微图案制备方法，其特征在于所述的表面产生羟基，是将玻璃、石英或硅片放在piranha溶液体积比为H2SO4∶H2O2＝3∶1中80℃浸泡30min，然后按超纯水，乙醇，超纯水的顺序各超声10min，每次超声后用大量超纯水冲洗，最后用氮气吹干，在120℃干燥箱内烘10min，即得到富含羟基的表面；对过渡金属氧化物基底，采用氧等离子体处理2min使表面羟基化。
4.按权利要求2所述的在多种材料表面引导细胞定点生长的微图案制备方法，其特征在于所述的PEG自组装膜的制备是在预处理后的玻璃，石英，硅或过渡金属氧化物基底表面采用硅烷化反应实现的，反应采用冷凝回流装置，反应时间为18h，反应温度为硅油浴60℃，反应后需用甲苯，异丙醇各超声5min，并用大量的超纯水冲洗表面。
5.按权利要求2所述的在多种材料表面引导细胞定点生长的微图案制备方法，其特征在于所述的PEGMA膜的制备是在预处理后的玻璃，石英，硅或过渡金属氧化物基底表面采用原子转移自由基聚合反应ATRP实现的，首先是在表面偶联3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES，随后接上表面引发剂异丁酰溴，以二联吡啶为配体，溴化亚铜为催化剂进行表面聚合反应，反应气氛为氮气，反应温度为25度，反应后用大量超纯水冲洗表面。
6.按权利要求1所述的在多种材料表面引导细胞定点生长的微图案制备方法，其特征在于所述的化学微图案的制备是将具有微图案的透紫外掩模板覆盖在已制备的抗蛋白吸附膜上，用波长为365nm的紫外光照射，紫外灯光源与样品间的距离为10cm，对PEG膜光照20min，对PEGMA膜光照30min；受紫外光照射区域的PEG膜或PEGMA膜被降解而形成化学微图案，该区域易于吸附蛋白，进而有利于细胞粘附形成细胞微图案。
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