JP5526426B2 - 基板の細胞非接着領域を除去することによる細胞培養方法 - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
生物学的試料との関係、接着領域または、非接着領域の形成との関係、オゾン処理との関係で、好ましい基板の種類は、ガラス、金属薄膜、シリコンウェハである。それらが好ましい理由は、ガラスは、基板として一般的で、入手しやすく、加工性も良好であり、それ自体が細胞非接着有機分子や細胞接着タンパク質などと結合する表面を持ち、その被覆した細胞非接着有機分子をオゾン曝露によって部分的に剥離させ、その剥離部分に細胞接着タンパク質を被覆すれば、細胞非接着領域および細胞接着領域を所望のパターンで得ることができる。金属薄膜は、一般的にセンサデバイス基板として用いられ、それ自体がチオール有機分子などと結合する表面を持つためである。またオゾン曝露により、有機分子層を部分的に剥離できることから、試料の接着および非接着領域の制御が容易にできる。シリコンウェハは、二酸化珪素から形成されており、タンパク質接着阻害有機分子、細胞接着性タンパク質と結合する領域を形成することが容易であるためである。
ここで使用する細胞接着タンパク質などの有機分子には、フィブロネクチン、それ以外にコラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリンや、その他の細胞接着分子などが利用できる。
細胞非接着タンパク質などの有機分子には、たとえば、ウシ血清アルブミン(BSA)などのような細胞非接着タンパク質、ポリエチレングリコール(PEG)などのような細胞非接着性有機分子、これら以外に細胞やタンパク質の接着および/または吸着を阻害したり、抑制したりする分子などを基板表面に高密度に修飾固定化できる方法を広く用いることができる。
使用するUV波長域は広く用い得るが、波長200nm程度以下のより高エネルギーのUV波長が好適である。
非接着または接着の基準は相対的であることができる。すなわち、非接着または接着というときには、それ自体またはその領域が接着または非接着領域よりも、それぞれ低いか、または高い接着性を持つものであってよい。
ポリジメチルシロキサン(PDMS)とフォトリソグラフィー法を用いて細胞アレイ化パターンスタンプを作成する。細胞アレイ化基板はパターンスタンプにアルカンチオール溶液をつけて、金薄膜を有する基板へスタンプすることで形成する。
参考文献1:Langmuir(ラングミュア), 18, 3645-3649 (2002)
参考文献2:Experimental Cell Research(エクスペリメンタル・セル・リサーチ), 235, 305-313 (1997)
温度に応答して構造を変化させる温度応答性高分子ポリイソプロピルアクリルアミド(PIPAAm)をグラフトし、温度を制御することにより、PIPAAmの親水性および疎水性を制御することで細胞接着および脱着を制御する。温度応答性高分子層をグラフトしたポリマー層を、UVエキシマレーザーを用いて細胞捕捉ドメインをアレイ状に整列させる。
参考文献3:Polymer Science Series(ポリマー・サイエンス・シリーズ)A, 46(4), 405-410 (2004)
金薄膜表面全てに末端メチル基のアルカンチオールの自己組織膜を形成させる。次にこれにフォトマスクを載せ、紫外光を5時間照射することで、アルカンチオールの自己組織膜の一部を光酸化分解する。酸化物を洗い流して、金表面をパターン状に露出させる。その後、希望する末端官能基を有するアルカンチオール溶液に浸漬してパターン部分に新たなアルカンチオールを埋め込む。
参考文献4:Biomolecular Engineering(バイオモレキュラー・エンジニアリング), 19, 161-170 (2002)
ブロッキング機能を有するタンパク質、アルブミンやヘパリンなどは、次亜臭素酸(HOBr)の酸化剤によりその機能が消失する。基板の表面近傍にマイクロ電極を配置してHOBrを生成させる。その酸化作用で、ブロッキング層が脱着する。
参照文献5:Langmuir, 22, 10784-10787 (2006)
オゾン曝露による細胞接着アレイ基板の作成方法(図1)
(1) 細胞は、細胞接着性タンパク質を介して基板に接着する。よって細胞非接着基板は、細胞接着性タンパク質の接着を阻害するポリエチレングリコール(PEG)を基板上に固定化した基板である。細胞非接着基板は、ガラス基板を8M水酸化ナトリウム水溶液に10分間浸した後、超純水で超音波洗浄することで親水処理を行った。
(2) PEGの固定化は、二通り行った。下記にそれぞれの方法を示す。
(2-1)
親水化したガラス基板を2%の2-メトキシ(ポリエチレンオキシ)プロピルトリクロロシラン/クロロホルム溶液50mlに2時間浸し、行った。細胞非接着ガラス基板は、その後、クロロホルムで超音波洗浄を行い、窒素ガスで乾燥させた。
(2-2)
親水化したガラス基板2枚に2-Methoxy (polyethyleneoxy) propyl trichlorosilane/トルエン溶液を挟んだ。ガラス基板は、80℃雰囲気下に2時間静置した。細胞非接着ガラス基板は、その後、トルエン、エタノール、超純水で超音波洗浄を行い、窒素ガスで乾燥させた。
(1) オゾン曝露は、オゾン発生装置内に酸素を充満させ、UVを照射することで行った。細胞接着領域の制御は、細胞非接着基板にマスクを覆うことで行った。
(2) 1.で作成した細胞非接着基板上に水を垂らし、その上にマスクを置いた。本研究の作成方法は、マスクを変えることで、自由にアレイの形、場所、細胞数を簡単に制御することができる事が特徴である。
(3) オゾンは、酸素ガス流入を10分間、UV照射を5分間行うことで発生させた。
(4) 2.(2)の基板は、2.(3)の条件で発生させたオゾン雰囲気下に静置した。細胞非接着基板表面のマスクで覆われていない部位は、オゾンラジカルがPEGと基板の結合を解離すると考えられる。
(5) 2.(4)で作成された細胞アレイ基板は、10mMフィブロネクチン溶液に1時間浸した。オゾンにより解離した部位は、細胞接着タンパク質であるフィブロネクチンが吸着する。
(6) 2.(5)で作成した細胞アレイ基板は、5×104個の細胞を播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。一時間後、PBSで洗浄し、24時間培養した。
(7)細胞非接着ガラス基板は、オゾン曝露し、細胞接着タンパク質を被覆することにより、細胞接着領域制御することに成功した。またマスクを用いることで、細胞接着領域は、マスクパターニングどおりに作成することができる。
(8)この細胞アレイ基板は、ガラス基板を用いているため透過性に優れ、顕微鏡による蛍光プローブ評価も可能となる。
オゾン曝露による細胞非接着アレイ基板の作成方法(図4)
細胞接着基板は、細胞接着性タンパク質の接着を基板上に固定化した基板である。細胞接着基板は、ガラス基板を8M水酸化ナトリウム水溶液に10分間浸し、親水処理を行った。親水性ガラス基板は、100mg/mlポリ-L-リジン/PBS溶液に浸し、37℃、5%CO2 雰囲気下で一晩インキュベートした。その後、ガラス基板は、1mg/mlフィブロネクチン/PBS溶液に浸し、1時間インキュベートすることで細胞接着ガラス基板を得る。
(1) オゾン処理は、オゾン発生装置内に酸素を充満させ、UVを照射することで行った。細胞非接着領域の制御は、細胞接着基板にマスクを覆うことで行った。
(2) 1.で作成した細胞接着基板上に水を垂らし、その上にマスクを置いた。本研究の作成方法は、マスクを変えることで、自由にアレイの形、場所、細胞数を簡単に制御することができる事が特徴である。
(3) オゾンは、酸素ガス流入を10分間、UV照射を5分間行うことで発生させた。
(4) 2.(2)の基板を2.(3)の条件で発生させたオゾン雰囲気下に静置した。細胞接着基板表面のマスクで覆われていない部位は、フィブロネクチンが基板から解離すると考えられる。
(5) 2.(4)で作成された細胞アレイ基板は、細胞非接着タンパク質である5mg/mlのBSA溶液に1時間浸した。2.(4)でO3処理された部位は、細胞非接着タンパク質であるBSAが吸着する。
(6) 2.(5)で作成した細胞アレイ基板は、5×104個の細胞を播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。一時間後、PBSで洗浄し、24時間培養した。
(7)細胞接着ガラス基板は、オゾン曝露し、細胞非接着タンパク質を被覆することにより、細胞非接着領域を制御することに成功した。またマスクを用いることで、細胞非接着領域は、マスクパターニングどおりに作成することができる。
Claims (5)
- 基板を親水化処理すること、
細胞非接着性有機分子を基板上に結合させることによって前記基板上に細胞非接着領域を形成すること、
マスクを密着させるために、水、溶液またはゲル液を基板上で用いること、
細胞非接着領域を、細胞接着領域形成のためのパターニングが形成されたマスクによって覆うこと、
細胞非接着性有機分子と基板との間の結合を、前記マスクのパターニングに従ったオゾンによる選択的な曝露によって解離させること、
前記細胞非接着性有機分子が解離した領域において、細胞接着性有機分子を基板上に結合させることによって前記基板上に細胞接着領域を形成すること、および
細胞を細胞接着領域上で培養すること
を含む、細胞培養方法。 - 細胞非接着性有機分子は、オゾン曝露と紫外線とによって化学的に基板との結合を解離される、請求項1に記載の細胞培養方法。
- 細胞非接着性有機分子はポリエチレングリコールである、請求項1または2に記載の細胞培養方法。
- 細胞非接着性有機分子はウシ血清アルブミン(BSA)である、請求項1または2に記載の細胞培養方法。
- 細胞接着性有機分子はフィブロネクチンである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
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