JP2019110794A - 細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 細胞培養容器に対して、所望の位置に容易に細胞保持領域を生成できる細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法の提供。【解決手段】 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００では、本体１０１は、中空円柱形状を有している。本体１０１は、容器接触面Ｐ１０１に自己吸着性を有し、自己吸着性によって、細胞培養容器に吸着し、位置が固定され、また、容易に取り外すことができる。細胞保持空間１０３は、本体１０１の容器接触面Ｐ１０１から上面Ｐ１０２まで、本体１０１を貫通する中空円柱形状の中空空間として形成される。細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の細胞保持空間１０３が位置する領域を細胞保持領域Ｒ１００に、播種した心筋細胞を保持する細胞保持領域生成処理を施す。細胞保持領域生成処理の親水処理によって、細胞保持領域Ｒ１００に親水処理を施す。これにより、細胞培養容器上の所望の位置に親水領域を形成できる。【選択図】 図３

Description

本発明は、細胞培養容器細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法に関し、特に、所望の領域に細胞保持領域を生成することができるものに関する。

従来の細胞培養容器における細胞の保持について、ＭＥＡプローブ（後述）を用いて心筋細胞の細胞外電位を計測する際を例に説明する。ＭＥＡプローブを用いて細胞外電位を計測する際には、基板上に配置された計測電極上に細胞を播種する。細胞を播種する際には、実験者によるピペットを用いて播種する細胞を培養していたディッシュから取得した後、計測電極上を狙ってＭＥＡプローブの基板上に細胞を吐出する。なお、細胞外電位計測において、計測した電位から細胞状態を比較する際には、各細胞外電位計測における条件のばらつきを少なくすることが望ましく、特に、細胞の播種状況も均一にすることが望ましい。細胞の播種状況も均一でない場合、結果として、ＭＥＡプローブによる計測シグナルが不均一となる。

一般に、播種の際の細胞培養液の液量については、実験者によって比較的容易にコントロールできていた。しかしながら、播種後の細胞培養液の形状や大きさ等、播種状況に関しては、実験者の技術、習熟度等が様々であり、十分にコントロールされておらず、事実上、実験者に依存している状況であった。

また、細胞培養容器に対して播種した細胞が容易に定着できるように、細胞培養容器の細胞播種面に、親水処理を施すことがある。親水処理についても、親水処理を施す実験者の技術、習熟度に依存しており、現状、親水処理の大きさや均一性等、親水処理の処理状況にムラが生じている場合がある。さらに、親水処理に続いてコーティングを施す場合があるが、コーティング処理についても、親水処理と同様の問題がある。

図９に、ＭＥＡプローブの計測電極上に播種した際の細胞の播種状況を示す。実験者は、外部電極上を狙って細胞を播種したが、実際には、外部電極に対して大きく広がるように播種されている。播種状況は、実験者毎、実験毎に異なるため、計測により取得した細胞外電位は、厳密には同じ状況で計測されたものではないとも言える。

このような細胞の播種状況のばらつきを軽減するために、基材上に形成された撥水性表面を有する撥水層と、 基材上に形成された所定のパターンの親水性面とを備える、細胞培養用基板を用いる技術がある。撥水層と所定のパターンの親水性面とを備える 細胞培養用基板について図１０の基材１を用いて説明する。

図１０（１）に示すように、先ず、基材１の表面に対して、化学処理、プラズマ処理、紫外光照射処理等の活性化処理を施し、 有機化合物層を基材１面に化学的に結合させるための種々の反応性基（表面官能基）を基材１表面に導入する。例えば、基材１がシリコンである場合では、好ましくは例えば大気中又は減圧条件下で真空紫外光を照射して基材１表面を親水化（具体的にはシラノール基即ち水酸基を導入）し得る。 また、酸素を含む雰囲気中で照射処理した場合には、 当該紫外光照射により雰囲気酸素から発生したオゾンによって基材１表面に残存する有機含有物を除去することができる。

次いで、図１０（２）に示すように、活性化された基材１を有機化合物の気相中において処理し、 有機化合物を基材１上において成長させ、 撥水層３を形成することができる。有機化合物から成る原料ガスをプラズマ状態にし、 この活性プラズマを利用して、 気相中および基材表面での化学反応により薄膜形成を行うプラズマＣＶＤ法の採用が好ましい。 この方法によると、 室温付近の温度で基材の表面に撥水性表面（撥水層）を形成することができる。 従って、 例えば耐熱性の低い高分子材料 (合成樹脂) 製の基材（例えばポリスチレン製ぺトリディッシュ）に撥水層を形成するのに好適である。

好適には撥水層３として、有機化合物が所定方向に配向する単分子層に形成する。単分子層とすることにより、層の厚さを一定とし、かつ超薄に形成することができる。 このため、均一な撥水性能を付与することができるとともに、超微細なバターンを形成可能である。 撥水層３が単分子層よりも成長した場合には、 所望により、過剰に吸着した分子を除去して単分子層に形成することができる。 この単分子属形成手段としては、 特に限定されず、 使用した物質に応じて酸処理、アルカリ処理、水洗処理等を適宜組み合わせて行うことができる。

撥水層３の表面と水滴のなす角である接触角（即ち水滴接触角）は１２０°以上が好ましく、１４０°以上がさらに好ましく、接触角（水接触角）が１５０°以上（例えば１５０−１６０°）である超撥水性表面の形成が特に好ましい。このような高い接触角が実現される撥水性表面によると通常の培地から成る比較的高容積の液滴（水滴）をほぼ真球形状に保つことができる。

なお、接触角は、従来公知の種々の手段によって測定することができる。 例えば、蒸留水から成る水滴の静的接触角（例えば液滴直径約２ｍｍ）を液滴法により２５℃の雰囲気下で接触角計（例えば、協和界面科学株式会社製の「ＣＡ−Ｘ１５０型」) を用いて測定することができる。

次に、図１０（３）に示すように、所定のバターンの親水性面５が形成されるように、撥水属３の当該バターンに対応する部分を種々の技法、 例えばリソグラフィによって除去する。例えば、フォトリソグラフィ法の適用が好ましい。例えば所定バターンと同じ透過部（光透過可能な開口部）が形成されたフォトマスクを用意し、 フォトマスク越しに所定の光源（例えばエキシマランプ）から高エネルギー光（例えば真空紫外光）を照射する。 このことによって、光照射部分即ち上記パターン部分の撥水層３（少なくともその表面部分）のみを選択的に光化学反応によって除去（分解又は変性を包含する）することができる。 同時に、 この処理によって、 基材１表面を活性化させ、 該表面５に種々の親水性基を導入することができる。 例えば、基材がシリコンである場合では、 好ましくは例えば大気中又は減圧条件下で真空紫外光を照射して撥水層３を除去すると同時に基材１の表面５を親水化（具体的にはシラノール基即ち水酸基を導入) し得る。

この結果、 所定パターンの親水性面５を形成することができる。 即ち、本発明の好ましい態様において、リソグラフィによって、撥水層３の除去と同時に除去された基材１表面に親水性面５を形成することができる。 尚、基材１表面の親水性が十分でない場合には、 さらに化学処理などを施すことによって、 親水性を付与又は向上させることができる。また、リソグラフィとしては、フォトリソグラフィに限られず、 従来公知のリソグラフィを採用することができる。 好適な例としては、電子線リソグラフィ、ＥＵＶ（波長が１３．５ｍｍ近傍の極端紫外光、即ちＥｘｔｒｅｍｅ ＵｌｔｒａＶｉｏｌｅｔ）リソグラフィ、及び集束イオンビームリソグラフィが挙げられる（以上、特許文献１参照）。

国際公開第２００６／０２８２７４号公報

前述の基材１には、以下に示すような改善すべき点がある。基材１を形成する際には、予めパターンを形成しておく必要があるため、製造後、例えば実験中には、容易に親水領域の位置を変更できないという改善すべき問題もある。また、基材１を形成する際にプラズマＣＶＤ法や各種リソグラフィ法等、専門の製造装置を要するため、製造装置を有さない者には利用できない、という改善すべき点がある。また、専門の製造装置を使用するためコストがかかるという改善すべき点がある。

そこで、本発明は、細胞培養容器に対して、所望の位置に容易に細胞保持領域を生成できる細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法を提供することを目的とする。

本発明における課題を解決するための手段及び発明の効果を以下に示す。

本発明に係る細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法は、培地内で細胞を培養する細胞培養容器に親水領域を形成する際に用いる細胞培養容器用細胞保持領域形成装置であって、少なくとも前記細胞培養容器に接する面である容器接触面に吸着性を有する本体、前記容器接触面から前記容器接触面に対向して位置する面まで前記本体を貫通するように形成される細胞保持空間、を有する細胞培養容器用細胞保持領域形成装置を用いて、細胞培養容器に細胞保持領域を形成する細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法であって、前記細胞培養容器に前記細胞培養容器用細胞保持領域形成装置を配置し、前記細胞保持空間に対して親水処理を施すことによって、少なくとも、前記細胞培養容器の前記細胞保持空間に囲まれた領域である細胞保持領域を親水処理する細胞保持領域生成処理を施すこと、を特徴とする。

これにより、細胞培養容器に対して、所望の位置に容易に親水処理を施した細胞保持領域を生成することができる。ひいては、所望の位置に生成した細胞保持領域に細胞を播種できる。

本発明に係る細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法では、前記細胞保持領域生成処理後に前記細胞培養容器に配置した前記細胞培養容器用細胞保持領域形成装置を取り除くこと、を特徴とする。

これにより、細胞培養容器に親水処理を施した細胞保持領域のみを配置できる。ひいては、細胞培養容器の所望の位置に生成した細胞保持領域に細胞を播種できる。

本発明に係る細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法では、前記親水処理によって、前記細胞保持領域の接触角が、前記細胞培養容器の前記細胞保持領域以外の領域の接触角よりも小さくすること、を特徴とする。

これにより、親水処理を施した細胞保持領域にのみ、正確に細胞を播種することができる。

本発明に係る細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法では、前記細胞保持領域生成処理として、さらに、前記親水処理の後、前記細胞保持空間を洗浄する洗浄処理を施し、前記洗浄処理の後、前記細胞保持空間に対して所定の表面被覆処理を施すこと、を特徴とする。

これにより、細胞保持領域に細胞を保持することができる親水処理を施すだけでなく、その他の機能を有する表面処理、例えば、細胞接着性の向上を補助する処理を施すことができる。

本発明に係る細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法に用いる細胞培養容器用細胞保持領域形成装置の一実施例である細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を示す図である。 ＭＥＡプローブＰを示す図である。 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００のＭＥＡプローブＰに使用する際の状態を示す図である。 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００のＭＥＡプローブＰに使用する際の状態を示す図である。 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００のＭＥＡプローブＰに使用する際の実際の状態を示す図である。 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００のＭＥＡプローブＰに使用する際の状態を示す図である。 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００のＭＥＡプローブＰに使用する際の実際の状態を示す図である。 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００のその他の使用例を示す図である。 従来の細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法を説明するための図である。 従来の細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法を説明するための図である。

以下、本発明の実施例について、図面を参照しながら詳細に説明していく。

本発明に係る細胞培養容器用細胞保持領域形成装置について、一実施例である細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を用いて説明する。細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００は、培地内で細胞を培養する細胞培養容器に、培養した細胞を保持するための細胞保持領域を形成する際に、細胞培養容器に取り付け、および／または、取り外して用いる装置である。

第１ 構成
細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の構成について、図１を用いて説明する。ここで、図１Ａは細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の平面図を、図１Ｂは細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の正面図を、図１Ｃは図１ＡのＸ−Ｘ断面を、それぞれ示す。

図１Ａに示すように、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００は、本体１０１、及び、細胞保持空間１０３を有している。図１Ｂに示すように、本体１０１は、細胞培養容器に接する面である容器接触面Ｐ１０１、及び、容器接触面Ｐ１０１に対向して位置する上面Ｐ１０２を有している。

本体１０１は、シリコンゴムを用いて中空円柱形状に形成されている。シリコンゴムは、自己吸着性を有している自己吸着物質である。したがって、本体１０１は、容器接触面Ｐ１０１に自己吸着性を有している。細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００は、容器接触面Ｐ１０１の自己吸着性によって、容器接触面Ｐ１０１を介して細胞培養容器に吸着し、細胞培養容器に対して位置が固定される。なお、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００は、自己吸着力により細胞培養容器に吸着されているため、容易に取り外すことができる。なお、本体１０１の自己吸着力は、少なくとも、細胞保持空間１０３に配置される液体、例えば細胞懸濁液が、本体１０１の容器接触面Ｐ１０１と細胞培養容器との間から漏れない程度のものである。

また、本体１０１は、シリコンゴムを材質とし、薄い円筒形状を有し、また、特に表面処理を施していないことから、６０°以上の接触角を有している。なお、部材の接触角については、一般的に、材質、形状、及び、表面の状態等によって決定される。

また、本体１０１は、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を取り付ける細胞培養容器において細胞培養のための培地貯留高さよりも低い高さを有している。これにより、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を細胞培養容器に取り付けた際に、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を培地中に配置することができる。

図１Ｃに示すように、細胞保持空間１０３は、本体１０１の容器接触面Ｐ１０１から上面Ｐ１０２まで、本体１０１を貫通する中空円柱形状の中空空間として形成される。

細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の大きさは、使用する細胞培養容器の大きさ等、使用環境によって決定する。例えば、外直径Ｄ１＝８ｍｍ、内直径Ｄ３＝２ｍｍ、高さＨ＝０．５ｍｍの薄い中空円柱形状とする。

このように、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００によって、細胞培養容器に対して、所望の位置に細胞保持空間１０３を配置することができる。したがって、細胞保持空間１０３に対して所定の処理を施すことによって、細胞培養容器上の所望の位置に、所定の処理を施した領域を形成することができる。例えば、所定の処理として親水処理を施す場合、細胞培養容器上の所望の位置に、親水領域を形成することができる。

また、細胞培養容器に対して細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を配置した状態で使用することによって、細胞培養容器上の所望の位置に、細胞保持空間を配置し、３次元的に所望の細胞を配置することができる。

さらに、シリコンゴムを利用することによって、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を容易に生成することができ、コストを低減できる。さらに、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を用いることによって、細胞培養容器の細胞保持空間１０３に囲まれた領域（細胞保持領域Ｒ１００：後述）対して容易に均一な親水処理を施すことができる。

第２ 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の使用方法
細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の使用方法について、細胞培養容器としても機能するＭＥＡ（Ｍｕｌｔｉ−Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ａｒｒａｙ）プローブＰの電極位置に心筋細胞を培養する場合を例に、図２〜図６を用いて説明する。

ここで、ＭＥＡプローブＰについて説明する。ＭＥＡプローブＰは、細胞活動により生ずる細胞外電位を計測するための装置である。ＭＥＡプローブＰについて、図２を用いて簡単に説明する。ここで、図２Ａは、ＭＥＡプローブＰの平面図を、図２Ｂは、図２Ａに示すＭＥＡプローブＰのＸ２−Ｘ２断面図を、それぞれ示す。図２Ａ、図２Ｂに示すように、ＭＥＡプローブＰは、基板部ＰＢ及び容器壁部ＰＷを有している。基板部ＰＢは、薄板形状を有している。容器壁部ＰＷは、基板部ＰＢ上に形成される。容器壁部ＰＷは、一端が解放された円筒形状を有している。基板部ＰＢ及び容器壁部ＰＷによって、所定の培地を貯留し、基板部ＰＢ上に細胞を培養できる細胞培養容器を形成する。

基板部ＰＢについては、ガラスを基材として、表面にポリイミドによる表面処理が施されている。このため、基板部ＰＢは、６０°以上の表面の接触角を有している。

また、ＭＥＡプローブＰは、計測電極Ｅ１及び参照電極Ｅ２を有している。計測電極Ｅ１は、容器壁部ＰＷのほぼ中央に、基板部ＰＢに沿って形成される。なお、計測電極Ｅ１は、４×４のマトリクス状に配置される。参照電極Ｅ２は、計測電極Ｅ１を中心に、所定数配置される。ＭＥＡプローブＰは、計測電極Ｅ１と参照電極Ｅ２との電位差に基づき、細胞活動による細胞外電位を計測する。なお、計測電極Ｅ１、及び、参照電極Ｅ２のそれぞれから、引き出し線（図２中点線）が配置される。

使用する細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００は、外直径Ｄ１＝８ｍｍ、内直径Ｄ３＝２ｍｍ、高さＨ＝０．５ｍｍの薄い中空円柱形状の本体１０１を有している（図１参照）。細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００は、シリコンゴムを用いて形成されている。なお、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の本体１０１は、６０°以上の接触角を有している。

ＭＥＡプローブＰを用いて細胞外電位を計測しようとする心筋細胞は、心筋細胞を含む一般的な細胞懸濁液を使用する。

１．ＭＥＡプローブＰの基板部ＰＢ上に、細胞保持領域Ｒ１００を形成する際の使用方法
ＭＥＡプローブＰを用いて培養した心筋細胞の細胞外電位を計測しようとする使用者は、図３Ａ、図３Ｂに示すように、ＭＥＡプローブＰの計測電極Ｅ１上に細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の細胞保持空間１０３が位置し、容器接触面Ｐ１０１が基板部ＰＢに対向するように、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００をＭＥＡプローブＰの基板部ＰＢ上に配置する。細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００は、容器接触面Ｐ１０１の自己吸着性により、基板部ＰＢに吸着し、ＭＥＡプローブＰの計測電極Ｅ１上に細胞保持空間１０３が位置するように固定される。なお、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を配置した後、本体１０１を上から指、ピンセット等を用いて押圧することによって、より強固に吸着させることができる。

ここで、ＭＥＡプローブＰの基板部ＰＢにおいて、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の細胞保持空間１０３が位置する領域を細胞保持領域Ｒ１００とする。細胞保持領域Ｒ１００は、計測電極Ｅ１を含む領域として形成される。

そして、細胞保持領域Ｒ１００に、播種した心筋細胞を保持する細胞保持領域生成処理を施す。細胞保持領域生成処理は、親水処理、洗浄処理、及び、表面被覆処理を有している。

まず、実験者は、細胞保持領域Ｒ１００に親水処理を施す。親水処理は、例えば、ピペットに吸引した牛の血清を細胞保持空間１０３に吐出し、細胞保持空間１０３に牛の血清を所定時間滞留させた後、アスピレータで吸引することによって行う。親水処理により、例えば、細胞保持領域Ｒ１００を、接触角θ＝０°〜１０°とする。

次に、親水処理を施した細胞保持領域Ｒ１００に洗浄処理を施す。洗浄処理は、例えば、ピペットを用いて純水を吸引し、細胞保持空間１０３に吐出し、アスピレータを用いて吸引することにより行う。洗浄処理により、例えば、細胞保持領域Ｒ１００を、接触角θ＝０°〜２０°とする。

さらに、洗浄処理を施した細胞保持領域Ｒ１００に表面被覆処理を施す。表面被覆処理は、例えば、市販の表面被覆材、例えばゲルトレックス（Ｇｅｌｔｒｅｘ：商標）をピペットで吸引し、細胞保持空間１０３に吐出し、所定時間、乾燥する。なお、乾燥は、湿度６０％以上で、３０分〜２時間とする。表面被覆処理により、例えば、細胞保持領域Ｒ１００を、接触角θ＝０°〜２０°とする。

以上、一連の親水処理、洗浄処理、表面被覆処理によって、細胞保持領域Ｒ１００を、ＭＥＡプローブＰの細胞保持領域Ｒ１００以外の基板部ＰＢの領域の接触角よりも小さい接触角を有する領域にできる。

乾燥処理の後、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００をＭＥＡプローブＰの基板部ＰＢ上から取り外す。これにより、図４Ａ、図４Ｂに示すように、計測電極Ｅ１上に、正確に、親水処理を施した細胞保持領域Ｒ１００を形成することができる。実際に、ＭＥＡプローブＰの基板部ＰＢ上に、細胞保持領域Ｒ１００を形成した状態を図５に示す。

ＭＥＡプローブＰの基板部ＰＢ上の細胞保持領域Ｒ１００に、心筋細胞を含む細胞懸濁液を用いて、心筋細胞を播種する。図６Ａ、図６Ｂに示すように、親水処理を施した細胞保持領域Ｒ１００（接触角：０°〜２０°）と、基板部ＰＢの細胞保持領域Ｒ１００以外の領域（接触角：６０°以上）とでは接触角が異なるため、計測電極Ｅ１上に形成されている細胞保持領域Ｒ１００に、正確に、計測対象である心筋細胞を含む細胞懸濁液を配置し、つまり、心筋細胞を播種し、保持することができる。実際に、ＭＥＡプローブＰの基板部ＰＢ上に形成した細胞保持領域Ｒ１００に心筋細胞を播種した状態を図７に示す。なお、図７においては、点線によって、細胞保持領域Ｒ１００を示している。

ＭＥＡプローブＰの基板部ＰＢ及び容器壁部ＰＷによって形成される細胞培養容器に所定量の培地を注ぎ（図６Ｂ：一点鎖線参照）、細胞保持領域Ｒ１００において、通常通り、心筋細胞を培養しながら、細胞外電位を計測する。

［その他の実施形態］
（１）細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の形状：前述の実施例１においては、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の本体１０１は中空円柱形状としたが、本体に細胞保持空間を有するものであれば、例示のものに限定されない。例えば、本体及び細胞保持空間が共に角柱形状の中空角柱形状としてもよい。また、本体が角柱形状、細胞保持空間が円筒形状としてもよい。

（２）細胞保持空間１０３：前述の実施例１においては、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００は、１つの細胞保持空間１０３を有するとしたが、複数の細胞保持空間１０３を有するようにしてもよい。

（３）細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の本体１０１の材料：前述の実施例１においては、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の本体１０１を、シリコンゴムを用いて形成するとしたが、自己吸着性を有するものであれば、例示のものに限定されない。例えば、シリコンゴム以外のＰＤＭＳ（ＰｏｌｙＤｉＭｅｔｈｙｌＳｉｌｏｘａｎｅ）、ポリカーボネイト、高分子ゲル、その他のプラスチック材料であってもよい。

また、本体１０１は、６０°より大きい接触角を有するものであれば例示のものに限定されない。例えば、細胞保持空間に配置する細胞に影響を与えない表面処理を施すことによって、６０°以上の接触角を持たせるようにしてもよい。

（４）計測対象の細胞：前述の実施例１においては、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を用いて細胞培養容器に貯留する培地内で培養する細胞として心筋細胞を用いたが、例示のものに限定されない。例えば、神経細胞であってもよい。また、多能性幹細胞由来の心筋細胞や神経細胞であってもよい。なお、多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞がある。

（５）ＭＥＡプローブＰ：前述の実施例１においては、細胞培養容器としてＭＥＡプローブＰを用いたが、細胞を培養できるものであれば、例示のものに限定されない。例えば、細胞培養用のディッシュやウェルであってもよい。

（６）親水処理：前述の実施例１においては、親水処理を牛の血清を用いて行ったが、少なくとも細胞保持領域Ｒ１００を親水化できるものであれば、例示のものに限定されない。

（７）洗浄処理：前述の実施例１においては、洗浄処理を、純粋を用いて行ったが、少なくとも細胞保持領域Ｒ１００を洗浄できるものであれば、例示のものに限定されない。また、必要でなければ、細胞保持領域生成処理において、洗浄処理を施さなくてもよい。

（８）表面被覆処理：前述の実施例１においては、表面被覆処理を、ゲルトレックスを用いて行ったが、少なくとも細胞保持領域Ｒ１００を、表面を被覆できるものであれば、例示のものに限定されない。また、必要でなければ、細胞保持領域生成処理において、表面被覆処理を施さなくてもよい。

（９）細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の取り外し：前述の実施例１においては、細胞保持領域生成処理を施した後、ＭＥＡプローブＰから細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００を取り外したが、取り外さなくてもよい。この場合、図８Ａ、図８Ｂに示すように、細胞培養容器用細胞保持領域形成装置１００の細胞保持空間１０３に播種した細胞懸濁液が保持されるため、細胞保持空間１０３において３次元的に細胞を培養し、保持することができる。

（１０）本体１０１の自己吸着性：前述の実施例１においては、本体１０１は自己吸着性を有し、自己吸着性により細胞培養容器に固定できるとしたが、吸着性を有するものであれば、例示のものに限定されない。例えば、本体１０１の容器接触面Ｐ１０１に、細胞毒性がない粘着層を配置することによって、細胞培養容器に吸着させるようにしてもよい。

本発明に係る細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法は、例えば、培養した心筋細胞の細胞活動に基づく細胞外電位の計測に用いることができる。

１００ 細胞培養容器用細胞保持領域形成装置
１０１ 本体
１０３ 細胞保持空間
Ｐ１０１ 容器接触面
Ｐ１０２ 上面
Ｒ１００ 細胞保持領域
Ｐ ＭＥＡプローブ
ＰＢ 基板部
ＰＷ 容器壁部
Ｅ１ 計測電極
Ｅ２ 参照電極

Claims (4)

1. 培地内で細胞を培養する細胞培養容器に親水領域を形成する際に用いる細胞培養容器用細胞保持領域形成装置であって、
   少なくとも前記細胞培養容器に接する面である容器接触面に吸着性を有する本体、
   前記容器接触面から前記容器接触面に対向して位置する面まで前記本体を貫通するように形成される細胞保持空間、
   を有する細胞培養容器用細胞保持領域形成装置を用いて、細胞培養容器に細胞保持領域を形成する細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法であって、
   前記細胞培養容器に前記細胞培養容器用細胞保持領域形成装置を配置し、
   前記細胞保持空間に対して親水処理を施すことによって、少なくとも、前記細胞培養容器の前記細胞保持空間に囲まれた領域である細胞保持領域を親水処理する細胞保持領域生成処理を施すこと、
   を特徴とする細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法。
2. 請求項１に係る細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法において、さらに、
   前記細胞保持領域生成処理後に前記細胞培養容器に配置した前記細胞培養容器用細胞保持領域形成装置を取り除くこと、
   を特徴とする細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法。
3. 請求項１または請求項２に係る細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法において、
   前記親水処理によって、前記細胞保持領域の接触角が、前記細胞培養容器の前記細胞保持領域以外の領域の接触角よりも小さくすること、
   を特徴とする細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法。
4. 請求項１〜請求項３に係るいずれかの細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法において、
   前記細胞保持領域生成処理として、さらに、
   前記親水処理の後、前記細胞保持空間を洗浄する洗浄処理を施し、
   前記洗浄処理の後、前記細胞保持空間に対して所定の表面被覆処理を施すこと、
   を特徴とする細胞培養容器に対する細胞保持領域生成方法。