JP4637545B2 - Ｄｎａチップおよびｄｎａハイブリダイゼーション法 - Google Patents

Description

本発明はポリヌクレオチド混合試料中に含まれる種々のポリヌクレオチドを一度に検査するＤＮＡプローブチップあるいはＤＮＡプローブアレーと呼ばれるものに関するもので、対象はＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドで、基板に固定したプローブＤＮＡと試料中のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを高速かつ高収率で行うチップ構造とハイブリダイゼーション法に関する。

ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレー、あるいは、ＤＮＡプローブチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている。

ＤＮＡチップを作るには、光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基ずつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)）、あるいは、ＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)）などがある。

これらチップは、いずれも、スライドガラスなどの基板の平面上に多数の区画を区切り、アレー状に整列させた構造の各区画のそれぞれに異なったプローブが固定されている。どのプローブが、どの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。

使用方法は、チップ基板上のプローブに蛍光標識したＤＮＡ断片やｍＲＮＡやこれを逆転写したｃＤＮＡなどの試料ポリヌクレオチド（以下単に試料ポリヌクレオチド）をハイブリダイズさせて、基板上に導入される蛍光体を蛍光スキャナーで検出する。あるいは、試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後に、プローブと隣接して試料ポリヌクレオチドに相補な蛍光標識オリゴを連結反応（ライゲーション）で連結したり、ＤＮＡポリメラーゼを用いて蛍光標識ｄＮＴＰ基質を反応させたりして、基板上に導入された蛍光体を検出するのが主流である。

最近では、酸化還元反応を利用した電気化学的な検出を行う方法も実用になっている。

ＤＮＡやＲＮＡ以外にも、タンパク質分析用に同様な技術が開発されている。タンパク質の場合は抗原抗体反応のようなアフィニティー反応を利用して、基板上に特定タンパク質などを補足した後、質量分析機で分析する方法、蛍光標識抗体や酵素標識抗体でサンドイッチ反応をおこない、基板上に残る蛍光体や酵素活性を検出する方法、電気化学発光を用いる検出法がある。

電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539（１９９９１））。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発するので、これを検出する。ＤＮＡやＲＮＡの場合にも同様な技術が適応できる。

ＤＮＡプローブチップにおけるハイブリダイゼーションのメカニズムの検討に関していくつかの報告がある。Ｐｅｔｅｒｓｏｎらの非特許文献４：Nucleic Acids Research, 29, 5163-5168（２００１）記載の内容によると、プローブ平均間隔が３ｎｍ〜７ｎｍの範囲では、チップ表面のプローブ固定密度が高くなると、プローブのマイナス荷電と試料ポリヌクレオチドのマイナス荷電の斥力により、試料ポリヌクレオチドのチップ表面への接近速度とハイブリダイゼーション速度が低下するという。他方、Ｗａｔｔｅｒｓｏｎら（非特許文献５：Langmuir, 16, 4984-4992（２０００））によると数〜数十ｎｍ間隔でプローブを固定すると高密度のほうが感度が上がるという。

他方、ハイブリダイゼーションの高速化に関してもいくつかの報告がある。たとえば、岡野らはＤＮＡチップと対向する板に試料用液を挟み込み、ＤＮＡチップに対して対向板を相対的に動かすことで平面状に広く広がっている試料用液とチップ上のエレメントに固定されているプローブとの分子衝突確率を向上させ、高速ハイブリダイゼーションを実現している（特開２００４−１４４５２１号公報）。

特開２００４−１４４５２１号公報 Science 251, 767-773(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996) Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991) Nucleic Acids Research, 29, 5163-5168 (2001) Langmuir, 16, 4984−4992(2000)

上記従来技術の項で明らかなように、ＤＮＡプローブチップを用いる試料ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関しては、ある程度の実験的なメカニズムの検討がなされているものの、それらが実際のＤＮＡチップの構造やハイブリダイゼーションのさせ方に反映されているわけではない。むしろ、チップ上に固定するプローブのコンテンツ開発や計測手段開発が主流であり、プローブごとの速度論的、熱力学的な原理に基づいて優れた条件でのハイブリダイゼーションを行おうとする試みは少ない。このため、従来の方法では、ハイブリダイゼーションの反応時間として１２時間程度の長い時間が必要となる上、反応効率も低い。特開２００４−１４４５２１号公報では機械的に反応の高速化を実現しているが、チップ表面に動作用のかなり広いスペースを必要とする点で改良の余地がある。

本発明は、このような難点を解決するためになされたもので、固体チップ表面でのハイブリダイゼーション速度を改善し、短時間で計測が可能で高感度、かつ、擬陽性ハイブリダイゼーションの少ないＤＮＡプローブチップ、このような問題点を解決するＤＮＡプローブチップの作成法、および、ＤＮＡプローブチップにおけるハイブリダイゼーション法を提供することにある。

本発明は、
１）隣接するプローブとの間隔を適度に保ちながら（プローブの密度を大きくしない）で、プローブとターゲットポリヌクレオチドの反応表面積を大きくすることの出来る基板とすること、このため、従来の平面にプローブを固定する構造を改め、表面にピラーないしウェルを多数形成し凹凸をつくり反応表面積を大きくする構造とすること、
２）上記ピラーやウェルは試料ＤＮＡがピラーやウェル表面のプローブにアクセスしやすいようにテーパーがついていること、すなわち、円錐、円錐台ないし角錐、角錐台状のピラーあるいはウェルであること、
３）ピラーの谷底ないしウェルの底面に電極を設け、ターゲットポリヌクレオチドをピラーの谷底あるいはウェルの底の電極表面近傍に濃縮できる構造とすること、
により上記の目的を実現する。

本発明により、ＤＮＡプローブチップ表面に固定したプローブ量を増し、プローブに対する試料ＤＮＡのアクセスを容易にし、試料中の非相補的なＤＮＡのハイブリダイゼーションを防止することができるため、プローブチップ上でのプローブのハイブリダイゼーション効率を数十倍以上に高めることができる。

プローブとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの過程を考察すると、効率よくハイブリダイゼーションを行うには、以下の点を考慮する必要があることに気づく。

１）ＤＮＡプローブチップでは、プローブは固相表面に固定されており、プローブとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、実質的に、固液界面での相補鎖結合反応となる。このため、試料溶液中のターゲットポリヌクレオチドがプローブと衝突するにはターゲットポリヌクレオチドが固液界面まで拡散する必要がある。ターゲットポリヌクレオチドが固体表面の拡散層に達するためには、十分攪拌するか、ターゲットポリヌクレオチドに濃度勾配をつけて、固液界面近傍の濃度を高めることが必要であるが、単に攪拌するだけでは拡散層内はターゲットポリヌクレオチドの拡散係数に頼ることになり時間がかかる。

本発明では、ＤＮＡプローブチップ表面（プローブを固定している固相表面）をプラス電位として、マイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチドをＤＮＡプローブチップ表面に静電的に引き寄せる。この結果、ＤＮＡプローブチップ表面とターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液との固液界面から試料溶液に向かって、ターゲットポリヌクレオチドの濃度勾配を形成することができる。すなわち、ＤＮＡプローブチップ表面に近いところに試料ＤＮＡを濃縮する。

さらに、本発明では、プローブとターゲットポリヌクレオチドの反応表面積を大きくするため、プローブを固定する固相表面を大きくしている。このために、従来の平面のプローブ固定領域に多数のピラーを建てて凹凸のプローブ固定領域とする。このプローブ固定領域の近傍のターゲットポリヌクレオチドの濃度を高くすることが重要である。単にピラーが円筒状であると、試料ＤＮＡがピラーの間の谷にはいりづらいと考え、ピラーにはテーパーがつけてある。すなわちピラーは円錐状、角錐状、あるいは円錐台、角錐台の形状をしている。ピラーの代わりにテーパーをつけたウェルが無数にあるような構造でも同じ効果が得られる。この場合は、円錐台や角錐台のウェル構造となる。

このようにテーパー付の谷やテーパー付のウェルの底にＤＮＡを引き寄せるのは基板のゼータ電位（ζ電位）を制御し、試料ＤＮＡの電気的な性質を用いて引き寄せる。具体的には基板のテーパー付の谷やテーパー付のウェルの底の電位をプラスとすることでマイナスの試料ＤＮＡを引き寄せる。

ＤＮＡプローブチップ表面をプラス電位とするには、ＤＮＡプローブチップ表面にプラスに解離する残基（プラス電荷）を導入して調製するか、あるいは、ＤＮＡプローブチップ表面とＤＮＡプローブチップ表面から離れた位置の試料溶液の部分とに電極を配し、ＤＮＡプローブチップ表面がプラス電位となるように電圧を印加することで実現する。このため、円錐形などのピラーとピラーの間やウェルの底に電極を設ける。

２）ＤＮＡプローブチップ上のプローブとターゲットポリヌクレオチドは、いずれも、マイナスに荷電されたポリマーである。ハイブリダイゼーション形成の過程では、プローブとターゲットポリヌクレオチドの最もハイブリダイゼーションしやすい部分が核となり、ハイブリッドを形成し、その領域が広がることにより完全なハイブリダイゼーションが完了すると考えられる。このときに考慮しなくてはならないのが、ＤＮＡプローブチップ表面の影響と隣接するプローブの立体障害である。

従来技術の項で示したNucleic Acids Research, 29, 5163-5168 (2001)とLangmuir, 16, 4984−4992（2000）の両者を比較すると、プローブ密度が、十分、疎な状態では熱力学的にプローブ量が多いほうがハイブリダイゼーションに有利であるが、密度が７ｎｍ以下になると、隣接するプローブの電荷反発力によりハイブリダイゼーション効率が低下すると解釈できる。また、本文献には記載されていないが、プローブ密度が高いと立体障害によりハイブリダイゼーション効率が低下する。反応速度や反応収率を上げるには、基本的にはＤＮＡチップ表面に存在するプローブ量を多くすることである。しかし、プローブ密度を上げるとPetersonらの上記論文（Nucleic Acids Research, 29, 5163-5168 (2001)）のように静電的な斥力によりハイブリダイゼーション効率が低下する。

発明者らは、従来のように実質的に平面からなるエリアにプローブを固定するのではなく、表面を凸凹にすることでプローブ密度を上げずにプローブ固定量を上げればよいことに気づいた。本発明では、表面積を稼ぐために、表面を多数のピラーで覆った構造あるいは多数のウェルを掘った構造とする。

プローブ固定領域をテーパー付のピラーやウェルにすることは、計測の面からも感度向上に重要である。たとえば円錐形のピラーを用いるとすると、ハイブリダイゼーション反応を蛍光で検出しようとすると、ピラー表面の垂直方向に蛍光分子が重なることになる。このため励起光や検出時に光軸方向に蛍光分子が並ぶ構造となり、定量性が低くなる。垂直なウェルを用いる場合も同様である。テーパーをつけたウェルやピラーでは光を当てる方向や検出方向に対して、蛍光分子が面的に分散した形となるので、よりダイナミックレンジの広い検出が可能である。あるいは後述するように、検出用標識物にナノ粒子を用いる系では、観測方向に対して垂直方向にナノ粒子が重なると検出できない。テーパーをつけることでナノ粒子がずれて観察できるようになるので、定量性が向上する。

以下、図面を参照しながら、より具体的に説明する。

（実施例１）
図１（Ａ）は、本発明の実施に好適なＤＮＡプローブチップ１００の概要を示す平面図、（Ｂ）は、図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た概要を示す断面図である。

１はＤＮＡプローブチップ基板としての溶融石英ガラス（２０×４０ｍｍ×１ｍｍ(t)）である。２は電極であり、基板１の表面に蒸着されている。電極は１０×１０ｍｍで３００ｎｍの厚さのＩＴＯ（Indium-Tin Oxide）である。３はＩＴＯ電極２の表面に形成された１０ｎｍ厚のフッ素樹脂表面コーティングである。４はプローブ固定領域である。フッ素樹脂表面コーティング３は、隣接するプローブ固定領域４間のクロスコンタミネーションを防ぐ目的で導入されている。それぞれのプローブ固定領域４には、ピンアレー装置により数百ｐｌのオーダーで、所定のプローブ液が塗布されるので、プローブ液がプローブ固定領域４からはみ出さないように、フッ素樹脂表面コーティング３は撥水性の性質が要求される。プリント技術でＩＴＯ電極２の表面の全域にフッ素樹脂表面コーティングを施すと、この全域が撥水性となる。次いで、塗布されたフッ素樹脂表面コーティング３の表面に、マスクを用いて酸素プラズマでアッシングして部分的にフッ素樹脂表面コーティングを除去することができる。酸素プラズマアッシングによりフッ素樹脂表面コーティングが除去され、露出したＩＴＯ電極２の表面は親水性となり、プローブ固定領域４として利用できる。

図１（Ａ）では、プローブ固定領域４は４×４個として大きな円形で示したが、実際のプローブ固定領域４は１００μｍφ程度の広さとされ、例えば、１００×１００個設けられる。隣接するプローブ固定領域４とは６０μｍ程度離れているとともに、隣接するプローブ固定領域４間はフッ素表面コーティングにより撥水性とされているので、各プローブ固定領域４はそれぞれ独立した形となっている。

図２（Ａ）、（Ｂ）および図３（Ａ）、（Ｂ）は、図１で説明したプローブ固定領域４のひとつを中心として拡大して示す平面図、断面図である。ここでは、プローブ固定領域４は１００×１００μｍの四角形とした。７はピラーであり、底面が１０×１０μｍまたは１０μｍφの錐体とされる。プローブ固定領域４に１５μｍピッチで７×７個形成されている。７’はピラー７の頂面であり、ピラー７の高さは５０μｍである。図２では、ピラー７は円錐台の形状とされ、図３では４角錐台の形状とされている。いずれの場合も、ピラー７の断面は同じ形状となる。ここで、ピラー７の頂面を形成する必要は無く、尖ったままとしても良い。その場合は、ピラー７は、図２では、円錐の形状となり、図３では４角錐の形状となる。ここで、説明したサイズの例によれば、プローブ固定領域４が単純な平面である場合に比較して、円錐台でおよそ、３．５〜８倍、角錐台で４．４〜１０の面積のプローブ固定領域を得ることができる。ここでは、ピラーの底の電極部にはプローブが結合しないとして計算している。

反応速度や反応収率を上げるには、プローブ固定領域４に固定するプローブの数を多くすれば良いと言えるが、上述したように、プローブ密度を上げると静電的な斥力によりハイブリダイゼーション効率が低下する。プローブを高密度で固定することは、通常のポリヌクレオチドプローブを用いる限り良いことが無く、プローブ長が５０塩基と長めなときは、むしろ１０〜４０ｎｍとまばらな方が良い。本発明では、プローブ密度自体を大きくするのではなく、プローブ固定領域４の面積を大きくして、これに固定するプローブの数を多くする。従って、プローブ密度としてはそれほど大きくしなくても、例えば、１０〜２０ｎｍの平均間隔でプローブを固定することで、従来よりも多くのプローブを固定することができる。

ピラー７の作成法にはいくつかある。まず、ガラスあるいはシリコンを使用する場合を説明する。電極２を蒸着形成した基板１上に１００μｍ厚のガラスあるいはシリコンを張り合わせ、所定の厚みにまでスパッタリングやエッチングで削る。あるいはスパッタリングで２０ｎｍ厚のガラスあるいはシリコン層を形成する。その後、既存の方法を駆使し、複数マスクを使用したりスパッタリングの電子線の集束状況により角錐や角錐台形を作成する。なお、本発明は、プローブ固定領域４の面積を大きくすることができれば良いので、ピラー７は完全な形の錐体である必要は無く、若干側面がカールしていてもよい。既知技術であるマイクロレンズアレー作成技術をそのまま利用し、アスペクト比の高い山を作成しても本発明による効果は確保できる。

次に、プラスチック製のピラーとする場合を説明する。フッ素表面コーティング３のなされた電極２の表面にエポキシ系の樹脂を５０〜１００μｍとなるようにスピナーで塗布し、図２、図３の形となるような形状の石英金型でプレスし、紫外線を当てて重合させる。

重合終了後、石英金型をはずす。この時点では、金型と電極２の密着性の悪さから、ピラー７間の谷の部分、すなわち、電極表面２に薄い樹脂層が残っている。この樹脂層のため金型を剥がすと、成型されたピラー７が薄い樹脂層で連なって電極２の上に残る。電極を露出させるために酸素プラズマにさらし、電極上の薄い樹脂層を除去する。このときピラー先端も丸みを帯び、かつピラーの高さが低くなるが、本発明を実施するうえでは問題ない。あるいはマスクを用いてプラズマがピラーの谷部に集中的に照射されるように工夫することでより正確な円推形、円錐台、角錐、角錐台を作成することができる。

試料ＤＮＡの濃縮とピラー側面への接触の観点からは、ピラー７の錐体の側面がアールを描いて（丸まって）いても、先端部が丸くなっていても問題ないし、その方が試料ＤＮＡ分子が先端部に引っかかるなどの問題が少なくなる。

他方、測定は、ピラー７を上面から底面の垂直方向に投影したような形で観察することになるので、測定の観点からすると、錐体の側面は一定の傾斜であるほうが有利となる。例えば、ピラー７が半球を伏せたような形である場合を想定すると、錐体の底面の近くは側面が垂直に近く、垂直方向に投影して見ると、ＤＮＡ分子の重なりが大きい。一方、錐体の先端の方では、側面が緩やかに円弧を描くので、ＤＮＡ分子の重なりが小さい。このような錐体での蛍光検出を考えると、一定の密度でＤＮＡ分子が捕捉された場合でもピラーの根元と先端で蛍光強度が異なることになるので、錐体の側面にアールが無いほうが良い。しかし、いずれも一長一短あるので、ここではピラーの微細な構造は問題としない。

プローブをピラー７の表面に固定する方法を述べる。まず、ピラー素材がガラスあるいはシリコンの場合であるが、Genome Research(1997)7、606−14記載のＴ．Ｐａｓｔｉｎｅｎらの方法を改変して用いる。すなわち、ＮＮ−ジイソプロピルエチルアミンを触媒に、キシレン溶媒中で３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを８０℃で１６時間反応させ、ピラー表面にグリシドキシ基を導入する。あるいは、２％３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランの水溶液に触媒として酢酸を０．５％程度加え、３０分間放置し、シラノール基を活性化した後、ピラー７の表面に塗布し、３０分間放置後、純水で洗浄し１０５℃３０分間乾燥させても、ピラー７の表面にグリシドキシ基を導入できる。次にアミノ基を５’末端に持つ５０塩基長のプローブＤＮＡを、５０μＭの濃度としてｐＨ９〜１０で２時間反応させる。洗浄し、ピラー７の表面にプローブを固定したＤＮＡチップを得る。

ピラー７の表面がエポキシ系の樹脂の場合は、酸素プラズマあるいはＵＶオゾンで表面処理する。ピラー７の表面にＯＨ基や酸素ラジカルが生成する。これらは不安定な残基なので、経時的に減少するので、直ちに０．５％Ｎ−（β−アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン水溶液（あらかじめ室温で３０分間放置し、活性化シランカップリング溶液としたもの）に浸漬して、１時間放置する。純水でリンスした後、１０５〜１１０℃で、空気中で乾燥させる。これでエポキシ樹脂系のピラー７の表面にアミノ基を得ることができる。アミノ基を無水コハク酸で修飾し、アミノ基にカルボキシル基を導入する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをエステル結合させ、カルボキシル基を活性エステルとする。５’末端にアミノ基を持つ合成ＤＮＡプローブを添加し、ペプチド結合によりプローブをピラー７の表面に固定する。

（実施例２）
図４Ａは、図１−図３を参照して説明したＤＮＡプローブチップ１００の表面にターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液を導入した状態、図４Ｂは、ＤＮＡプローブチップ１００の表面と試料溶液との固液界面から試料溶液に向かって、ターゲットポリヌクレオチドの濃度勾配を形成する最初の手順をとった状態、図４Ｃは濃度勾配を形成する次の手順をとった状態を、それぞれ、断面図の形で示す図である。なお、ピラー７については、図が見にくくなるので、断面の意味でのハッチングは省略した。

ＤＮＡプローブチップ１００の表面に、適当なスペーサー（図示しない）を入れて０．１ｍｍのギャップを空け、カバーガラス１１を乗せる。カバーガラス１１の内面には、１００ｎｍの厚さのＩＴＯ電極１５を設ける。ＤＮＡプローブチップ１００の表面とカバーガラス１１との隙間に４０マイクロリットルのｍＲＮＡ試料溶液５０を添加する。試料溶液５０は、スライドガラスを一定の速度で往復運動させ、攪拌される。図４Ａはこの状態を示す図であり、１２はプローブ固定領域４のピラー７の表面に固定されたプローブである。１４は試料溶液５０内に分散しているターゲットポリヌクレオチドである。この状態では、ターゲットポリヌクレオチド１４はターゲットポリヌクレオチドの拡散係数に応じて拡散するに過ぎない。

図４Ｂは、ＤＮＡプローブチップ１００の電極２とカバーガラス１１の電極１５との間に、電源２５により、電極２がプラスになるように＋１５Ｖ／ｃｍになるように電界（実効的には電極間で０．１５Ｖ）を印加した状態を示す図である。この結果、ＤＮＡプローブチップ表面側をプラス電位とすることで、マイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４を静電的にプローブ固定領域４のピラー７の谷間（ＤＮＡプローブチップ表面）に引き寄せる。このとき、プローブ１２も電極に引き寄せられる力が働くので、プローブ１２は片方の末端を固定されているので自由端が電極のほうに引き寄せられ、プローブ１２はピラー７の表面にそって伸びるものと考えられる。ここで、ピラー７の表面は、電気的に中性、あるいは、わずかにマイナスに荷電した状態なので、プローブ１２は完全にピラー７の表面に吸着されるわけではなく、若干の自由度をもっている。このため、ターゲットポリヌクレオチド１４が衝突するとハイブリダイゼーションを起こす能力を保持している。実際、ターゲットポリヌクレオチド１４を電極２に引き寄せる途中で、参照符号１７を付した矢印のようにターゲットポリヌクレオチド１４は、ピラー７の表面にぶつかる。このため、一部のターゲットポリヌクレオチド１４は参照符号１８を付したように、この段階でも、プローブ１２にハイブリダイゼーションするものがある。

なお、電極１５はカバーガラス１１に貼り付けてある必要はなく、試料溶液５０内のＤＮＡプローブチップ１００の電極１２の表面から離れた部位にあれば良い。

図４Ｃは、電源２５により電圧を印加した３０秒後に、ＤＮＡプローブチップ１００の電極２とカバーガラス１１の電極１５との間に、電源２６により、電極２がマイナスになるように−１５Ｖ／ｃｍの電界（実効的には電極間で０．１５Ｖ）をかけた状態を示す図である。電極２がマイナスになるため、静電的に、プローブ固定領域４のピラー７の谷間（ＤＮＡプローブチップ表面）に引き寄せられていたマイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４はピラー７の谷間（ＤＮＡプローブチップ表面）から電極１５に向かって移動を始める。

すなわち、図４Ｃに示すように、電界を反転させると電極２とターゲットポリヌクレオチド１４のマイナス電荷との反発力が働き、これらがＤＮＡプローブチップ表面から遠ざかる方向に働く。この際、ターゲットポリヌクレオチドは分子が大きいので、動きが鈍く、ピラー７の谷間近辺の表面に固定されたＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションをする確率が高くなる。更に電源のプラスマイナスを繰り返すことでハイブリダイゼーション効率をあげることができる。

図５（Ａ）−（Ｆ）の一連の図は、実施例２の効果を説明する図である。図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃで説明したようにしてプローブ１２に捕捉されるターゲットポリヌクレオチドを評価するために、ターゲットポリヌクレオチドに蛍光色素を用いて標識とし、これを蛍光検出するものとする。金コロイドのようなナノ粒子を標識物にして直接粒子をカウントするものとしても良く、この場合は走査型電子顕微鏡で複数の画像を再構成するトモグラフィーの手法を用いることで実現できる。

図５（Ａ）は従来の平面型のＤＮＡプローブチップに蛍光標識付ターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせたプローブ固定位置３１を示す図である。落射蛍光顕微鏡で蛍光像を取り込み、画像処理ソフトで蛍光プロファイル化する。図５（Ｂ）は、このときに得られる蛍光プロファイル３２である。プローブ固定位置の蛍光強度がバックグランドレベルより若干上昇していることがわかる。

次に、本発明の錐体にピラーを付したＤＮＡチップでの検出結果の蛍光プロファイルを示す。

図５（Ｃ）はプローブを固定するピラーの位置を模式的に表す。図５（Ａ）と図５（Ｃ）の縮尺は同じものとする。図５（D）に示すように、錐体にピラーを付したＤＮＡチップで得られる蛍光プロファイル３４はピラーの位置で強い蛍光が観察される。電極部にはプローブが固定されていないので、ほとんど蛍光強度はバックグランドレベルである。単に平面にプローブを固定するのに比べ高い強度が得られ、ハイブリダイゼーション効率が上がり、高感度化が実現されていることがわかる。ピラー頂部では、ピラー側面と比較して、強度が低下する。

図５（Ｅ）は本発明のピラーとの比較のために、円筒ピラーとしたときの位置を模式的に表す。図５（Ｃ）と図５（Ｅ）の縮尺は同じものとする。図５（Ｅ）に示すように、ピラーが円筒ピラーとなっている結果、図４Ｂで説明した、電界で試料ポリヌクレオチドをピラーの底の部分に引き寄せるときにターゲットポリヌクレオチドとプローブの衝突によるハイブリダイゼーションがおきづらいこと、また、ピラー側面は測定方向に垂直に重なるため、光学的なスタッキングが起きる。このような現象より、テーパー付のピラーに比べハイブリダイゼーション効率が落ちたり、測定時の光学特性で不利になったりするため、得られる蛍光プロファイル３５は、図５（Ｄ）のそれと比較して、格段に蛍光強度が低下している。また、円筒の頂部の蛍光強度の低下が著しい。

図６はＤＮＡプローブチップに印加する電界の条件をパラメータとして、ターゲットポリヌクレオチドを捕捉する時間を種々変えて蛍光強度を調べた結果の例を示す図である。横軸は電界をかける時間、縦軸は蛍光強度である。

特性曲線１０１は、円錐台ピラーがついたチップで電源２５により、電極２−１５間に、＋１５Ｖ／ｃｍの電界を印加した後、電源２６により、電極２−１５間に、−１５Ｖ／ｃｍの電界を印加した場合のＤＮＡプローブチップのターゲットポリヌクレオチドの捕捉結果、１０２は、コントロールとして、同じ円錐台ピラーがついたチップでいかなる電界も加えないときのＤＮＡプローブチップのターゲットポリヌクレオチドの捕捉結果、および、１０３は円柱ピラー付チップの場合で、電源２５により、＋１５Ｖ／ｃｍを印加した後、電源２６により、−１５Ｖ／ｃｍを印加した場合のＤＮＡプローブチップのターゲットポリヌクレオチドの捕捉結果を、それぞれ、示す。ここで、特性曲線１０１と１０３については、最初の＋１５Ｖ／ｃｍを印加する時間は同じとする。いずれもプローブ固定エリアの平均蛍光値を示す。

特性曲線１０１に明らかなように、まず、電源２５により、電極２−１５間に、＋１５Ｖ／ｃｍの電界を印加して、マイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４を静電的に、ピラー７の谷間（ＤＮＡプローブチップ表面）に引き寄せる。このとき、すでにハイブリダイゼーションが始まっており時間とともに蛍光強度が上昇する。その後、電源２６により、電極２−１５間に、−１５Ｖ／ｃｍの電界を印加して、静電的に、ピラー７の谷間（ＤＮＡプローブチップ表面）に引き寄せられていたマイナスの電荷を有するターゲットポリヌクレオチド１４を、ピラー７の谷間（ＤＮＡプローブチップ表面）から離す。この手順をとることにより、試料溶液５０内のターゲットポリヌクレオチド１４の濃度はピラー７の谷間（ＤＮＡプローブチップ表面）側ほど濃度が高い勾配を持ったものとなり、この結果、効率よくターゲットポリヌクレオチドを捕捉出来たことが分かる。なお、図からも分かるように、所定時間を過ぎるとターゲットポリヌクレオチドがピラーから遠ざかってしまうのでこれ以上電圧をかける意味は無い。

円筒形のピラーでは前記した理由により得られる蛍光強度１０３が低い。

いかなる電圧も印加しないときは、試料溶液５０内のターゲットポリヌクレオチド１４の濃度勾配は生じないので、ターゲットポリヌクレオチド１４の捕捉率は低いものとなるのは当然である。

ここでは、電界をかける方向を１回変化させただけであるが、これを何回か繰り返しても良い。そうすると、図４Ｂと図４Ｃの状態が繰り返されることになり、ピラー７の表面のＤＮＡプローブ近傍に、ハイブリダイズしていないターゲットポリヌクレオチド１４が多く分布することになるので、ターゲットポリヌクレオチド１４の捕捉率を向上させることが出来る。

（実施例３）
図７は、基板にウェルを多数作成して表面積をあげる実施例３のＤＮＡチップを示す断面図であり、実施例１及び２と同様にウェルの側面にテーパーがついて、より反応効率と光学測定がしやすいように工夫されている。シリコン基板５１の上には電極５２、その上にウェル５３を作成した部材５４が存在する。ウェル５３は底面で電極が露出している。シリコン基板５１の表面にクロムを蒸着し電極５２とする。その上に白金を蒸着する。この上に実施例１と同様にエポキシ樹脂層を形成し、プラズマ処理でウェルを形成する。表面にはシラン処理でアミノ基を導入し、実施例１の手法に従ってプローブＤＮＡを固定する。このようにして作成した、ウェルを多数持つプローブ固定エリアからなる電極付ＤＮＡチップと蛍光検出を組み合わせることで、従来の平面型ＤＮＡプローブチップに比べ少なくとも１０倍の検出感度が得られる。

更に、ターゲットポリヌクレオチドに５ｎｍの金ナノ粒子を標識したものをハイブリダイズし、走査型電子顕微鏡で金粒子を定量検出することも可能である。このケースでは、計測時間が１分程度で単分子レベルでの計測が可能になる利点がある。円筒型のウェルではウェル側面にハイブリダイゼーション反応で結合した金ナノ粒子が縦方向に重なってしまうので走査型電子顕微鏡であっても粒子同士が重なり、検出しづらい。テーパーをつけたウェルにする本発明により、ウェル側面に結合している粒子はお互いにあまり重ならないで計測することができる。このため、ナノ粒子と査型電子顕微鏡を用いる単分子計測形のＤＮＡプローブチップとしても、本発明は有用である。

（Ａ）は、本発明の実施に好適なＤＮＡプローブチップ１００の概要を示す平面図、（Ｂ）は、図１（Ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た概要を示す断面図である。 （Ａ）、（Ｂ）は図１で説明したプローブ固定領域４のひとつを中心として拡大して示す平面図である。 （Ａ）、（Ｂ）は図１で説明したプローブ固定領域４のひとつを中心として拡大して示す断面図である。 図１−図３を参照して説明したＤＮＡプローブチップ１００の表面にターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液を導入した状態を示す断面図である。 ＤＮＡプローブチップ１００の表面と試料溶液との固液界面から試料溶液に向かって、ターゲットポリヌクレオチドの濃度勾配を形成する最初の手順をとった状態を示す断面図である。 図４Ｂに続く、濃度勾配を形成する次の手順をとった状態を示す断面図である。 （Ａ）−（Ｆ）は、実施例２の効果を説明する図である。 ＤＮＡプローブチップに印加する電界の条件をパラメータとして、ターゲットポリヌクレオチドを捕捉する時間を種々変えて蛍光強度を調べた結果の例を示す図である。 基板にウェルを多数作成して表面積をあげる実施例３のＤＮＡチップを示す断面図である。

符号の説明

１…ＤＮＡプローブチップ基板、２，５２…電極、３…フッ素表面コーティング、４…プローブ固定領域、７…ピラー、１１…カバーガラス、１２…プローブ、１４…ターゲットポリヌクレオチド、１５…ＩＴＯ電極、１８…プローブにハイブリダイゼーションしたターゲットポリヌクレオチド、２５，２６…電源、３１，３３，３５…プローブ固定位置、３２，３４，３６…蛍光プロファイル、５０…試料溶液、５１…シリコン基板、５３…ウェル、５４…部材、１００…ＤＮＡプローブチップ、１０１，１０２，１０３…特性曲線。

Claims (5)

1. 基板上の独立したプローブ固定領域に円錐、円錐台あるいは角錐、角錐台状の側面にテーパーの付いたピラーが多数形成され、ピラー間に形成される谷部は谷底へ向かって断面積が小さくなっており、前記それぞれのピラーの表面上に共有結合で固定された所定のＤＮＡプローブを有し、ピラー間の谷部の底面に電極を有することを特徴とするＤＮＡプローブチップ。
2. 基板上の複数の独立したプローブ固定領域に底の方へ向かって断面積が小さくなるように側面にテーパーの付いたウェルが多数形成され、前記それぞれのウェルの表面上に共有結合で固定された所定のＤＮＡプローブを有し、各ウェル底面に電極を有することを特徴とするＤＮＡプローブチップ。
3. 基板、該基板上に形成された複数の独立したプローブ固定領域に複数の円錐、円錐台あるいは角錐、角錐台状の側面にテーパーの付いたピラーが形成され、ピラー間に形成される谷部は谷底へ向かって断面積が小さくなっており、該谷部の底面に電極が配され、且つ、前記それぞれのピラーの表面上に共有結合で固定された所定のＤＮＡプローブを有するＤＮＡプローブチップと、該ＤＮＡプローブチップ表面に対向して配置された部材との間に、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液を添加する工程、前記電極と前記試料溶液部位との間に所定の電界を印加して、前記ターゲットポリヌクレオチドをＤＮＡプローブチップ表面のピラーの谷間に濃縮する工程、前記電極と前記試料溶液部位との間に印加する電界を反転させる工程により、前記ターゲットポリヌクレオチドをピラー表面のプローブとハイブリダイゼーションを行うことを特徴とするＤＮＡハイブリダイゼーション法。
4. 基板、該基板上に形成された複数の独立したプローブ固定領域に複数の底の方へ向かって断面積が小さくなるように側面にテーパーの付いたウェルが形成され、各ウェルの底面に電極が配された構造で、前記それぞれのウェルの表面上に共有結合で固定された所定のＤＮＡプローブを有するＤＮＡプローブチップと、該ＤＮＡプローブチップ表面に対向して配置された部材との間に、ターゲットポリヌクレオチドを含む試料溶液を添加する工程、前記電極と前記試料溶液部位との間に所定の電界を印加して、前記ターゲットポリヌクレオチドをＤＮＡプローブチップのウェルに濃縮する工程、前記電極と前記試料溶液部位との間に印加する電界を反転させる工程により、前記ターゲットポリヌクレオチドをピラー表面のプローブとハイブリダイゼーションを行うことを特徴とするＤＮＡハイブリダイゼーション法。
5. 前記電界を印可する工程および前記電界を反転させる工程を繰り返すことによって、前記ハイブリダイゼーションの効率を上げることを特徴とする、請求項３または４に記載のＤＮＡハイブリダイゼーション法。

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