JP2006254838A - 検出チップ及びこれを用いた物質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ウェル状反応部を有する検出チップにおいて、反応液の充填が容易で、簡便かつ高感度な検出が可能な検出チップ及びこれを用いた物質の検出方法を提供すること。
【解決手段】 基板に、ウェル状反応部３を有する検出チップにおいて、ウェル状反応部３は、平面形状を成す底部９と、この底部９から開口部６に向かってテーパ状を成す側部１０とで構成されている。
【選択図】 図１

Description

本発明は、例えば抗原抗体反応による抗原の検出及びＤＮＡの検出等に用いられる検出チップ及びこれを用いた物質の検出方法に関するものである。

近年、化学反応やＤＮＡ反応、たんぱく質反応などをチップ上にて行うμ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ技術やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ技術が研究され実現してきており、今まで大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下のチップで少量の試薬で行えるようになってきている。

このようなチップ上には、通常、ウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが形成され反応場として用いられており、半導体やガラスにエッチングで作られたり穴のあいた板を積層することでウェルが形成されていた。

例えば、チップ基板と、チップ基板に積層される薄膜部材とを備え、薄膜部材のチップ基板への積層状態においてチップ基板と協働して試料を収容するための開孔部を薄膜部材に設けるマイクロリアクタチップが開示されている（特許文献１参照）。
特開２００２−０２７９８４号公報

従来のマイクロチップの多くは、半導体やガラスにエッチングで作られたり穴の開いた板を積層することでウェルが作られていたため、その形状が図３に示すような側部１７が垂直な垂直穴のウェル１６や、図４に示すような、側部１８が傾斜し、底部１９は球面状と成っているすり鉢型のウェル２０、あるいはコーン型のウェルなどがあった。垂直穴形状の場合、試薬充填の際に気泡を巻き込んでしまう。また、気泡の混入を防ぐためには、充填方法に工夫をする必要があり煩雑である等の問題があった。例えば、直径２ｍｍ〜３ｍｍの垂直穴に試薬の充填を試みると、気泡と試薬との入れ替わりが起きず、気泡を含んだ状態になる。この状態において、熱による反応を利用する場合、反応のための熱をかけると気泡の膨張により試薬があふれるなどの不具合が生じる。
また、コーン型、すり鉢型形状の場合、垂直穴形状の場合と違って、側面が傾斜しているため、反応液が側面からつたっていき、ウェル内に存在する気体と入れ替わり、気泡の混入は避けることができる。しかし、これらマイクロチップでは、反応の有無を蛍光などの発光検出などにより検出することが多く、チップの裏面からの発光検出する際、この形状により光が屈折してしまい、精度の高い検出が困難である等の問題があった。具体的には、底部が丸まっているため、光が拡散する。そのため、蛍光の検出はウェルの上方から行わなければならないという制約がある等の問題があった。

本発明は、このような事情を考慮してなされたもので、ウェル状反応部を有する検出チップにおいて、反応液の充填が容易で、簡便かつ高感度な検出が可能な検出チップ及びこれを用いた物質の検出方法を提供することを目的とする。

そこで、本発明において上記目的を達成するために、まず請求項１に係る発明は、基板に、ウェル状反応部を有する検出チップにおいて、ウェル状反応部は、平面形状を成す底部と、この底部から開口部に向かってテーパ状を成す側部とで構成されていることを特徴とする。

請求項２記載の発明は、請求項１に係る発明において、ウェル状反応部の側部と底部との成す角度が１００度〜１４０度の範囲内であることを特徴とする。

請求項３記載の発明は、請求項１または請求項２に係る発明において、ウェル状反応部の開口部の直径が５ｍｍ以下、深さが５ｍｍ以下であることを特徴とする。

請求項４記載の発明は、請求項１から請求項３のいずれか一項に係る発明において、ウェル状反応部の内面の、純水との接触角が６０度未満であることを特徴とする。

請求項５記載の発明は、請求項１から請求項４のいずれか一項に係る発明において、基板が、樹脂であることを特徴とする。

請求項６記載の発明は、基板に、底部が平面形状で側部がテーパ状を成すウェル状反応部を複数有した検出チップの各ウェル状反応部内に認識物質を注入する工程と、各ウェル状反応部に検出物質を注入する工程とを有し、認識物質又は検出物質のいずれかが蛍光標識されており、認識物質と検出物質との反応の有無をウェル状反応部の底部側から蛍光検出する工程を有することを特徴とする。

請求項７記載の発明は、請求項６に係る発明において、検出物質が核酸であることを特徴とする。

請求項１記載の発明によれば、ウェル状反応部の側部がテーパ状を成しているので、試薬である反応液をウェル状反応部に充填する際、反応液を側面からつたわるようにして注入させることができ、ウェル状反応部内に存在する気体と入れ替わりやすく、反応液内に気泡が混入してしまうことを避けることができると同時に、ウェル状反応部の底面が平面形状を成しているので、裏面から発光検出しても、光が屈折してしまうことがなく、簡便かつ高感度な検出が可能になる。

請求項２記載の発明によれば、ウェル状反応部の側部と底部との成す角度を１００度〜１４０度の範囲内に設定しておくことにより反応液を充填しやすく、また、底面の径方向外側に向かって傾斜しているため発光面積が拡大し、裏面からの発光分析も感度よく行うことができる。

請求項３記載の発明によれば、ウェル状反応部の開口部の直径が５ｍｍ以下で深さが５ｍｍ以下の範囲内であるので、検出に必要な試料及び試薬が少量で済み、コストの削減が図れるとともに貴重な試料及び試薬を無駄なく使用することができる。

請求項４記載の発明によれば、ウェル状反応部の内面の、純水との接触角が６０度未満なので、反応液である例えばプローブＤＮＡ等を反応部内に確実に保持させることができる。

請求項５記載の発明によれば、基板が樹脂でできているため、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているだけでなく、特性の異なる樹脂を組み合わせて基板を作成することができる。

請求項６記載の発明によれば、ウェル状反応部の側部がテーパ状を成しているので、試薬である反応液をウェル状反応部に充填する際、反応液を側面からつたわるようにして注入させることができ、ウェル状反応部内に存在する気体と入れ替わりやすく、反応液内に気泡が混入してしまうことを避けることができるとともに、検出チップの裏面から発光検出する際、反応部の底面が平面形状を成しているため、紫外線等の光源が屈折することがなく、高感度な検出が可能となる。また、認識物質が標識されていることによって、反応の有無を視認することができる。

請求項７記載の発明によれば、検出物質が核酸であるので、これを検出することにより、疾病の診断及び治療のために役立てることができる。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
図２は、本発明における一実施形態を示す図であって、本発明を適用した検出チップ１を示す。この検出チップ１は、略長方形の板状の基板２に、試料及び試薬を反応させるためのウェル状反応部３が複数形成されている。

この基板２は、プラスチック等を用いて作成され、全体的に略長方形状を呈しており、その縦横寸法はウェル状反応部３を所定個数配置可能なものとし、さらに使用中に容易に折れ曲がることのない厚みをもたせて形成される。ここで、基板２を形成するためのプラスチックとしては、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン系ポリマー、フッ素ポリマー、シリコン樹脂などを用いることができる。このような合成樹脂を用いて基板２を作成すれば、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているため好ましい。さらに、２種類以上の樹脂を接合して用いてもよい。この場合、それぞれの樹脂の特徴を活かして基板２を作成することにより、試薬及び試料等の特性に応じた多様な基板２とすることが可能となり、用途ごとに使い分けることができる。例えば、基板２の上半分と下半分とで材料を分けたりすることも可能となる。
なお、基板２の素材としてガラスを用いてもよい。

そして、基板２には、その平坦な上面２ａからその厚さ方向に沿って、ウェル状反応部３が、例えば樹脂成型或いは樹脂切削によって所定の数形成されている。このウェル状反応部３は、図１及び図２に示すように、上面２ａに直交する中心軸線を有し、上面２ａに開口する開口部６から下方にいくにつれて径が徐々に小さくなるように形成されている。ウェル状反応部３の底部９の底面９Ａは平面形状に形成され、水平であるとともに基板２の上面２ａに対して平行になっている。このウェル状反応部３の側部１０の側面４は、底面９Ａに対して１００度〜１４０度の範囲内の角度θで傾斜しており、開口部６に向かって拡大する形状を成している。この開口部６は、その直径及び深さが５ｍｍ以下であればよく、特に０．０１ｍｍ〜５ｍｍの範囲内が好ましい。
これにより、反応液の注入がしやすく、反応液内に気泡が混入してしまうことを防ぐことができる。
又、ウェル状反応部３内の表面は、平滑である事が好ましい。液の充填が容易になるためである。

また、基板２にウェル状反応部３を形成する際、基板２がＰＣ（ポリカーボネート）などのような硬質の樹脂で構成されている場合には、樹脂切削法を用いることが好ましい。一方、基板２がＰＰ（ポリプロピレン）などの軟質な材料で構成されている場合には、樹脂成型法を用いてウェル状反応部３を形成することが好ましい。

このような基板２には、ウェル状反応部３内への試液の充填を行いやすくするために、親水化処理を施工する。ここでは大気圧プラズマ処理により親水化処理を行い、ウェル状反応部３の内面の、純水との接触角が６０度未満、好ましくは３０度未満となるように設定する。この範囲内であれば、ウェル状反応部３に充填した反応液が、玉状にならず底面９Ａに均一に広がるため検出を行いやすい。また、ウェル状反応部３内に反応液を充填する際、反応液がウェル状反応部３内からはねたりせず、その側面４をつたわって速やかに底面９Ａ上に広がるため充填しやすく、さらに、気泡がうまく逃げていき、反応液内に気泡が混入してしまうことがなくなる。
なお、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定し、反応液の充填には、分注器、注射器、シリンジ等を用いて充填する。又、親水化処理は大気圧プラズマ処理に限られず、コロナ処理や、コーティング処理で行っても良い。

さらに、基板２の長手方向一側には、ウェル状反応部３よりも大径を成す収容穴部１３が複数形成されている。この収容穴部１３は、試薬を注入しておく収容場となり、検出に用いる試薬の種類に応じた数だけ形成されている。

また、基板２上にウェル状反応部３同士を繋ぐ流路を設けてもよい。またウェル状反応部３同士だけではなく、上記収容穴部１３及びこれら各ウェル状反応部３を接続する流路を形成することにより、収容穴部１３から送液によって各ウェル状反応部３へと反応液を注入することができるとともに流路の中で連続した反応を行わせることが可能となる。これにより、検査時間の短縮が図れるとともに微量な試料及び試薬で各種の分析を行うことができ、コストの削減を実現することができる。
また、樹脂を複数種用いる場合、ウェル状反応部３のある部位と収容凹部１３とで、流路のある部位とで、使用する樹脂を分けることができる。

なお、基板２、特に底部９の底面９Ａの部分には、透明度の高い素材を選定することが好ましいが、素材が透明でなくても、上記のようなウェル状反応部３の形状によれば、側部がテーパ状を成しているため発光面積が拡大し、感度の高い検出を行うことができる。

本発明の検出チップ１は、抗原抗体反応及びＤＮＡ反応の検出などに用いることができる。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め検出チップ１の各ウェル状反応部３内に認識物質として抗原を含む試料を入れておき、後から検出物質として抗体を含む試薬を添加し、認識物質または、検出物質のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が一般的に用いられる。

ＤＮＡの検出の場合、例えば、予め検出チップ１のウェル状反応部３内に認識物質として核酸プローブを用意しておき、その後、血液等から抽出したＤＮＡを検体物質とし、ハイブリダイゼーションさせることにより、ＤＮＡの検出を行うことができる。その際、検出物質または認識物質のいずれかに標識物質を付けておけば、その標識物質の有無を検出することにより検出が可能となる。また、認識物質である核酸プローブとして配列の異なる核酸を複数用意することで検体物質としてのＤＮＡがどのような配列であるかを検出することができる。また、検出チップ１は、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。なお、認識物質は複数あってもよく、検出物質が蛍光標識されていない場合には、認識物質のひとつが標識されていればよい。このように、複数の認識物質からなる場合には認識物質を複数種用意し、多段階反応を行ってＳＮＰを検出する場合にも、検出チップ１を用いることが可能である。

例えば、検出チップ１をサードウェイブテクノロジーズ，Ｉｎｃ（米国ウィスコンシン州マディソン市）が開発したインベーダー法と組み合わせて解析を行うことができる。これによりＳＮＰ解析の具現化を図ることが可能となる。

ここで、認識物質はウェル状反応部３内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。

次に、上述した検出チップ１を実際に試験に用いる場合について、説明する。

厚さ２ｍｍのポリカーボネートの板に、機械的切削加工により、直径１ｍｍの底面９Ａから直径３ｍｍの開口部６に向かって、底面９Ａに対して１３０度の緩やかな角度θで、底面９Ａの径方向外側に拡大するようにして傾斜する側面４からなり、容量が１０μｌ程度のウェル状反応部３を２４個設けて作成した基板と、厚さ６ｍｍのポリカーボネートの板に、直径６ｍｍ、深さ５ｍｍの収容穴部１３を形成した基板とを貼り合わせて１枚の検出チップとした。この検出チップに、窒素を用いた大気圧プラズマ処理を３分間施し、ＦＡＣＥ接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて測定したところ、処理前には９０度前後だった接触角が処理後には２２度になった。

このような上記ポリカーボネート製の検出チップにおける直径６ｍｍの収容穴部１３に、蛍光付検体ＤＮＡの入った試薬を注入し、直径３ｍｍを成す２４個のウェル状反応部３にそれぞれ異なったプローブＤＮＡを滴下して乾燥させたバイオチップを製造してハイブリダイゼーションを行った。
そして、２４個のウェル状反応部３それぞれに試薬を滴下し、設定された一定の温度で一定時間反応させて蛍光検出を行った。

（比較例１）
厚さ２ｍｍのポリカーボネートの板に、側面４が垂直を成し、容量が１０μｌ程度のウェル状反応部３を形成した基板と、厚さ６ｍｍのポリカーボネートの板に、直径６ｍｍ、深さ５ｍｍの収容穴部１３を形成した基板とを貼り合わせて１枚の検出チップとした。この検出チップに、上記同様、窒素を用いた大気圧プラズマ処理を３分間施し、ＦＡＣＥ接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて測定したところ、処理前には９０度前後だった接触角が処理後には２３度になった。

このような上記ポリカーボネート製の検出チップの直径６ｍｍの収容穴部１３に、蛍光付検体ＤＮＡの入った試薬を注入し、２４個のウェル状反応部３にそれぞれ異なったプローブＤＮＡを滴下して乾燥させたバイオチップを製造してハイブリダイゼーションを行った。
そして、２４個のウェル状反応部３それぞれに試薬を滴下し、設定された一定の温度で一定時間反応させて蛍光検出を行った。

（比較例２）
底面９Ａが半球状で開口部６が直径３ｍｍ、容量が１０μｌ程度のウェル状反応部３を２４個設けた厚さ２ｍｍのポリカーボネートの基板と、直径６ｍｍ、深さ５ｍｍの収容穴部１３を設けた厚さ６ｍｍのポリカーボネートの基板とを貼り合わせて１枚の検出チップとした。この検出チップに、窒素を用いた大気圧プラズマ処理を３分間施し、ＦＡＣＥ接触角計（協和界面科学株式会社製）を用いて測定したところ、処理前には９０度前後だった接触角が処理後には２２度になった。

このような上記ポリカーボネート製の検出チップの直径６ｍｍの収容穴部１３に、蛍光付検体ＤＮＡの入った試薬を注入し、直径３ｍｍを成す２４個のウェル状反応部３にそれぞれ異なったプローブＤＮＡを滴下して乾燥させたバイオチップを製造してハイブリダイゼーションを行った。
そして、２４個のウェル状反応部３それぞれに試薬を滴下し、設定された一定の温度で一定時間反応させて蛍光検出を行った。

以上の実験結果は、以下のようになった。

試薬の滴下時の操作性、ウェル状反応部３内での気泡の抜け方、蛍光検出の検出強度の全てにおいて実施例１は優位であった。

なお、検出方法は、蛍光検出に限った方法だけでなく、比色、化学発光、沈殿、発熱法等も利用することができる。

以上に述べた本実施形態によれば、ウェル状反応部３の側部１０がテーパ状を成しているので、試薬である反応液をウェル状反応部３に充填する際、反応液を側面４からつたわるようにして注入させることができ、ウェル状反応部３内に存在する気体と入れ替わりやすく、反応液内に気泡が混入してしまうことを避けることができると同時に、ウェル状反応部３の底面９Ａが平面形状を成しているので、裏面から発光検出しても、光が屈折してしまうことがなく、簡便かつ高感度な検出が可能になる。

ウェル状反応部３の側部１０と底部９との成す角度θを１００度〜１４０度の範囲内に設定しておくことにより反応液を充填しやすく、また、側面４は底面９Ａの径方向外側に向かって傾斜しているため発光面積が拡大し、検出チップ１の裏面からの発光分析も感度よく行うことができる。

ウェル状反応部３の開口部６の直径が５ｍｍ以下で深さが５ｍｍ以下の範囲内であるので、微量な試薬及び試料で迅速且つ効果的に分析を行うことができる。その上、検出に必要な試薬及び試料が少なくて済むので、コストを抑えることができるとともに貴重な試料及び試薬を無駄なく使用することができる。

ウェル状反応部３の内面の、純水との接触角が３０度以下なので、反応液である例えばプローブＤＮＡ等をウェル状反応部３内に確実に保持させることができる。

基板２が樹脂でできているため、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているだけでなく、特性の異なる樹脂を組み合わせて基板２を作成することができるので、取り扱いの容易化を図ることができる。

ウェル状反応部３の側部１０がテーパ状を成しているので、試薬である反応液をウェル状反応部３に充填する際、反応液を側面４からつたわるようにして注入させることができ、ウェル状反応部３内に存在する気体と入れ替わりやすく、反応液内に気泡が混入してしまうことを避けることができるとともに、検出チップ１の裏面から発光検出する際、ウェル状反応部３の底面９Ａが平面形状を成しているため、紫外線等の光源が屈折することがなく、高感度な検出が可能となっている。また、認識物質が標識されていることによって、反応の有無を視認することができる

検出物質が核酸であるので、これを検出することにより、疾病の診断及び治療のために役立てることができる。

本発明における一実施形態のウェル状反応部の形状を示す斜視図である。 本発明における一実施形態の検出チップを示す平面図である。 従来のウェルの形状を示す側面図である。 従来のウェルの他の形状を示す側面図である。

符号の説明

１ 検出チップ
２ 基板
３ ウェル状反応部
６ 開口部
９ 底部
１０ 側部

Claims (7)

1. 基板に、ウェル状反応部を有する検出チップにおいて、
   前記ウェル状反応部は、平面形状を成す底部と、該底部から開口部に向かってテーパ状を成す側部とで構成されていることを特徴とする検出チップ。
2. 前記ウェル状反応部の側部と底部との成す角度が１００度〜１４０度の範囲内であることを特徴とする請求項１記載の検出チップ。
3. 前記ウェル状反応部の前記開口部の直径が５ｍｍ以下、深さが５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の検出チップ。
4. 前記ウェル状反応部の内面の、純水との接触角が６０度未満であることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の検出チップ。
5. 前記基板が、樹脂であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の検出チップ。
6. 基板に、底部が平面形状で側部がテーパ状を成すウェル状反応部を複数有した検出チップの各ウェル状反応部内に認識物質を注入する工程と、
   各ウェル状反応部に検出物質を注入する工程とを有し、
   前記認識物質又は前記検出物質のいずれかが蛍光標識されており、前記認識物質と前記検出物質との反応の有無を前記ウェル状反応部の底部側から蛍光検出する工程を有することを特徴とする物質の検出方法。
7. 前記検出物質が核酸であることを特徴とする請求項６記載の物質の検出方法。

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