KR102185443B1 - 디지털 실시간 pcr용 카트리지 - Google Patents

Abstract

반응 공간의 코너나 에지 영역에서 에어포켓의 발생을 방지할 수 있는 디지털 실시간 PCR용 카트리지가 개시된다. 디지털 실시간 PCR용 카트리지는, 미소유체 챔버, 웰 어레이, CMOS 포토센서 어레이 및 PCB를 포함한다. 미소유체 챔버는 액체시료의 투입을 위해 형성된 인렛을 포함하고, 사출 성형으로 제조가 가능하다. 웰 어레이는 미소유체 챔버의 하부 면에 부착된다. CMOS 포토센서 어레이는 웰 어레이 아래에 배치되고, 웰 어레이의 마이크로 웰들에 충진된 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영한다. PCB에는 인렛을 통해 액체시료가 투입됨에 따라 미소유체 챔버에 형성된 마이크로 유로, 웰 어레이와 미소유체 챔버간에 형성된 공간, 웰 어레이에 형성된 마이크로 웰의 진공 처리를 위한 통풍구(vent)가 형성된다.

Description

디지털 실시간 PCR용 카트리지{CATRIDGE FOR DIGITAL REAL-TIME PCR}

본 발명은 디지털 실시간 PCR용 카트리지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 반응 공간의 코너나 에지 영역에서 에어포켓의 발생을 방지하며 동시에 실시간 반응을 측정할 수 있는 디지털 실시간 PCR용 카트리지에 관한 것이다.

유전자 증폭기술은 분자진단에 있어서 필수적인 과정으로서 시료 내 미량의 디옥시리보핵산(Deoxyribonucleic Acid; DNA) 또는 리보핵산(Ribonucleic Acid; RNA)의 특정 염기서열을 반복적으로 복제하여 증폭하는 기술이다. 그 중 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)은 대표적인 유전자 증폭 기술로서 DNA 변성단계(denaturation), 프라이머(Primer) 결합단계(annealing), DNA 복제단계(extension)의 3단계로 구성되어 있으며 각 단계는 시료의 온도에 의존되어 있으므로 시료의 온도를 반복적으로 변하게 함으로서 DNA를 증폭할 수 있다.

이전에 PCR은 일반적으로 96 또는 384-우물 미소판들(well microplates)에서 수행되었다. 더 높은 처리량을 요구하는 경우, 종래의 미소판들에서의 PCR 방법은 비용에 있어 효과적 또는 효율적이지 않다. 한편, PCR 반응 용적을 감소시키면 시약의 소비를 줄이고 반응 용적의 감소된 열 질량에서 증폭 시간을 줄일 수도 있다. 이 전략은 배열 형식(m x n)으로 구현할 수도 있으므로, 그 결과 다수의 더 작은 반응 용적을 구현할 수도 있다. 또한 어떤 배열을 사용하면 증가된 정량 감도, 동적 범위와 특이성을 갖는 확장가능 고 처리량 분석을 허용한다.

지금까지 배열 형식들을 사용하여 디지털 중합 효소 연쇄 반응(dPCR)을 수행하였다. dPCR로부터의 결과들을 사용하여 희귀 대립 유전자(rare alleles)의 농도를 검출 및 정량화하고, 핵산 시료들의 절대 정량화를 제공하고, 또한 핵산 농도가 낮은 접이식 변화를 측정할 수 있다. 일반적으로, 복제의 수를 증가시키면 dPCR 결과들의 정확도 및 재현성이 증가한다.

대부분의 정량 중합 효소 연쇄 반응(qPCR) 플랫폼의 배열 형식은 시료별로 분석 실험을 위해 설계되며, 여기서 PCR 결과들은 사후 분석을 위해 어드레스 가능 해야한다. 그러나, dPCR에 대하여, 각각의 PCR 결과의 특정 위치 또는 우물은 중요하지 않으며, 단지 시료당 양성 및 음성 복제들의 수만 분석될 수도 있다.

dPCR에서, 타겟 폴리 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열의 상대적으로 적은 수를 포함하는 용액을 작은 테스트 시료들로 분할할 수도 있으며, 그에 의해 각각의 시료는 일반적으로 타겟 뉴클레오타이드 서열의 한 분자를 포함하거나 또는 타겟 뉴클레오타이드 서열의 분자를 포함하지 않는다. 이어서 시료들이 PCR 프로토콜, 절차, 또는 실험에서 열적으로 순환되는 경우, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료는 증폭되어, 양성 검출 신호를 생성하는 한편 어떠한 타겟 뉴클레오타이드 서열도 포함하지 않는 시료들은 증폭되지 않고 검출 신호를 생성하지 않는다.

이러한 디지털 PCR의 경우, 반응 공간의 크기가 매우 작고 그 숫자가 매우 많기 때문에 반응 공간들 각각에 시료를 투입하기 어렵다.

또한 시료가 반응 공간의 코너나 에지 영역까지 주입되지 않아서, 반응 공간의 코너나 에지 영역에 에어포켓이 생길 수 있다. 에어포켓은 PCR 과정 중의 온도변화에 의해 팽창하거나 수축하여 시험결과에 오류가 발생한다.

기존의 주된 dPCR 방식은 시료를 반응공간으로 투입하는 과정과 염기서열을 증폭하는 과정이 나누어지는 엔드-포인트(end-point) PCR을 사용하므로 각 반응공간에서 실시간으로 염기서열이 증폭되는 반응을 측정하지 못한다.

한국공개특허 제10-2017-0024827호(2017. 03. 08.) 한국공개특허 제10-2016-0086937호(2016. 07. 20.)

이에 본 발명의 기술적 과제는 이러한 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 반응 공간의 코너나 에지 영역에서 에어포켓의 발생을 방지하면서 동시에 실시간 PCR 측정이 가능한 디지털 실기간 PCR용 카트리지를 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 실현하기 위하여 일실시예에 따른 디지털 실기간 PCR용 카트리지는, 미소유체 챔버(Microfluidic Chamber), 웰 어레이, CMOS 이미지 센서 및 PCB를 포함한다. 상기 미소유체 챔버는 액체시료의 투입을 위해 형성된 인렛을 포함하고, 사출 성형으로 제조가 가능하다. 상기 웰 어레이는 상기 미소유체 챔버의 하부 면에 부착된다. 상기 CMOS 이미지 센서는 상기 웰 어레이 아래에 배치되고, 상기 웰 어레이의 마이크로 웰들에 충진된 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영한다. 상기 PCB에는 상기 인렛을 통해 액체시료가 투입됨에 따라 상기 미소유체 챔버에 형성된 마이크로 유로, 상기 웰 어레이와 상기 미소유체 챔버간에 형성된 공간, 상기 웰 어레이에 형성된 마이크로 웰의 진공 처리를 위한 통풍구(vent)가 형성된다.

일실시예에서, 상기 미소유체 챔버는, 사각 형상의 베이스부재 및 사각 형상의 탑부재를 포함할 수 있다. 상기 베이스부재는 사각 형상의 제1 플랫부, 상기 제1 플랫부의 중심영역에 형성된 사각 형상의 지지홀, 상기 제1 플랫부의 모서리 영역에 형성된 원형상의 홀을 포함한다. 상기 탑부재는 사각 형상의 제2 플랫부, 접시 형상의 멤브레인 스위치 및 페루프 형상의 인렛부를 포함하고, 상기 베이스부재 위에 배치된다.

일실시예에서, 상기 미소유체 챔버는 PDMS 재질, 투명 플라스틱, 투명 고무 재질 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 미소유체 챔버는 낮은 자가형광성(Autofluorescence)을 가질 수 있다.

일실시예에서, 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 상기 미소유체 챔버에 부착되어 상기 미소유체 챔버에 형성된 마이크로 유로의 바닥을 형성하는 스티커를 더 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 웰 어레이는 에칭된 실리콘 재질을 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 CMOS 포토센서 어레이의 상부면에는 밀봉 후 웰의 바닥을 형성하기 위해 층이 코팅될 수 있다.

일실시예에서, 상기 층은 PDMS(Polydimethylsiloxane) 재질, 유연성을 가진 투명 플라스틱, 투명 고무 재질 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 웰 어레이는 친수성 코팅 처리될 수 있다.

일실시예에서, 상기 웰 어레이는 플라즈마 또는 열 또는 UV 경화 접착제에 의해 상기 미소유체 챔버에 부착될 수 있다.

삭제

일실시예에서, 상기 웰 어레이에는 육각형상의 마이크로 웰들이 형성될 수 있다.

일실시예에서, 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 어퍼 케이스 및 바텀 케이스를 더 포함할 수 있다. 상기 어퍼 케이스는 상기 미소유체 챔버 위에 배치되고, 상기 인렛에 대응하도록 형성된 홀을 갖는다. 상기 바텀 케이스는 상기 어퍼 케이스에 체결되어 상기 미소유체 챔버, 상기 웰 어레이, 상기 CMOS 포토센서 어레이 및 상기 PCB를 수용하고, 상기 통풍구에 대응하여 형성된 홀을 갖는다.

일실시예에서, 상기 멤브레인 스위치 위에 배치된 윈도우 부재를 더 포함하고, 상기 윈도우 부재는 상기 어퍼 케이스의 중앙 영역에 형성된 홀에 대응하여 배치될 수 있다.

일실시예에서, 상기 윈도우 부재는 투명한 재질을 포함할 수 있다.

일실시예에서, 상기 윈도우 부재는 PDMS 재질을 포함할 수 있다.

이러한 디지털 실시간 PCR용 카트리지에 따르면, 진공 장치의 펌핑을 통해 PCR 용액을 이동시키고 그 용액이 반응공간을 채울 때, 반응 공간인 웰 어레이의 코너나 에지 영역에 에어 포켓이 생성되는 것을 차단할 수 있다. 이에 따라, PCR 시험결과에서 에어포켓에 의한 오류가 발생되는 것을 방지할 수 있다. 또한 CMOS 포토센서 어레이 위에 웰 어레이가 위치하므로 실시간 PCR 반응을 측정할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시된 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 분해 사시도이다.
도 3은 도 2에 도시된 웰 어레이 형상의 일례를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다.
도 4a 및 도 4b는 디지털 실시간 PCR 결과를 보여주는 도면들이다.
도 5a는 도 2에 도시된 미소유체 챔버를 개략적으로 설명하기 위한 정면 사시도이고, 도 5b는 도 2에 도시된 미소유체 챔버를 개략적으로 설명하기 위한 배면 사시도이고, 도 5c는 도 2에 도시된 미소유체 챔버의 분해 사시도이다.
도 6은 도 2에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다.
도 7은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 분해 단면도이다.
도 8은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제1 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다.
도 9는 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제2 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다.
도 10, 도 11, 도 12 및 도 13은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제3 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도들이다.
도 14, 도 15 및 도 16은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제4 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도들이다.
도 17, 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제5 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도들이다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 설명하고자 한다. 도면상의 동일한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 사용하고 동일한 구성요소에 대해서 중복된 설명은 생략한다.

본 발명은 기판에 일정 배열로 시료들, 시료 용적들 또는 반응 용적들을 탑재하기 위한 구조이며, 보다 구체적으로는 기판 내의 각각의 반응 위치들의 일정한 배열로 시료들을 탑재하는 것에 관한다.

다양한 실시예들에서, 대량의 작은 용적 시료들에서 타겟들을 검출하기 위해 사용되는 물품 내에 시료들을 탑재하기 위한 장치, 기기, 시스템, 및 방법들이 제공된다. 이러한 타겟들은 임의의 적절한 생물학적 타겟일 수 있지만, DNA 서열(무 세포 DNA를 포함함), RNA 서열, 유전자, 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotides), 분자, 단백질, 생체표식(biomarkers), 세포(예, 순환 종양 세포), 또는 다른 적당한 타겟 생체 분자를 포함하는 것들로서, 그들로 한정되지 않는다. 다양한 실시예들에서, 이러한 생물학적 성분들은 태아 진단, 다중화 dPCR, 바이러스 검출, 및 정량 표준화, 유전자형(genotyping), 서열 검증, 돌연변이 검출, 유전자 생물, 희귀 대립 유전자 검출, 및 복제 수 변화 검출 등의 응용들에서 다양한 PCR, qPCR, 및/또는 dPCR 방법 및 시스템과 연관하여 사용될 수도 있다.

일반적으로, 대량의 시료들이 처리되는 정량 중합 효소 연쇄 반응(qPCR)에 적용가능하지만, 임의의 적절한 PCR 방법은 본 명세서에 기재된 다양한 실시예들에 따라 사용될 수도 있음을 인식해야 한다. 적절한 PCR 방법들은, 예를 들어, 디지털 PCR, 대립 유전자 특이 PCR, 비대칭 PCR, 결합 매개(ligationmediated) PCR, 다중 PCR, 맞춤형(nested) PCR, qPCR, 캐스팅 PCR, 게놈 워킹(genome walking), 브리지(bridge) PCR을 포함하지만 그들로 제한되지 않는다.

본원에 기재된 다양한 실시예들에 따른 후술되는 바와 같이, 반응 위치들은 예를 들어 관통 구멍, 시료 보유 영역, 우물, 요홈(indentations), 지점(spots), 공동, 및 반응 챔버들을 포함하지만 그들로 제한되지 않는다.

여기에 설명되는 다양한 실시예들은 특히 디지털 PCR(dPCR)에 적합하다. 디지털 PCR에서, 타겟 폴리 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열의 상대적으로 적은 수를 내장하는 용액을 각각의 시료를 대량의 작은 시료들로 더 분할할 수도 있으며, 그에 의해 각 시료는 일반적으로 타겟 뉴클레오타이드 서열의 한 분자를 포함하던가 또는 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않을 수도 있다. 연이어, 시료들이 PCR 프로토콜, 절차, 또는 실험에서 열적으로 순환되는 경우, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료가 증폭되어 양의 검출 신호를 생성하는 반면 어떠한 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 시료들은 증폭되지 않고 검출 신호를 생성하지 않는다. 푸아송 통계(Poisson statistics)를 사용하여, 원래 용액에서 타겟 뉴클레오타이드 서열들의 숫자를 양의 검출 신호를 생성하는 시료들의 개수와 상관할 수도 있다.

전형적인 dPCR 프로토콜, 절차, 또는 실험을 위해서, 간단하여 비용에 효과적인 방법으로 수만 또는 수십만의 시료들에, 즉 각각 수 나노리터, 1 또는 대략 1 나노리터, 또는 1 나노리터 미만의 용적을 갖는 시료들에 초기 시료 용액을 분할할 수 있는 이점이 있다. 타겟 뉴클레오타이드 서열의 수를 매우 작게 할 수 있기 때문에, 초기 용액의 전체 내용물이 복수의 반응 위치들을 고려하여 내장하는 그러한 환경들에서도 중요할 수도 있다.

본원에서 설명되는 실시예들은 이들 및 기타 dPCR 설계 제약들을 초기 시료 용액을 복수의 반응 위치들에 시료 용액의 모두, 또는 필수적인 것들 모두를 고려하는 방식으로 분배함으로써 해결한다.

높은 처리량의 PCR 분석들 및 dPCR 방법들 때문에, 한번에 수행되는 반응들의 수를 증가시키면서 액체시료의 반응 용적을 감소시키기 위해 배열 형식을 사용하는 전략이 적용될 수도 있다. 액체시료의 반응 용적들의 배열은 복수의 반응 위치들을 갖는 기판 일 수도 있다. 반응 위치들은 관통 구멍들, 우물들, 요부들, 지점들, 공동들, 반응실들, 또는 본 명세서에 기재된 다양한 실시예들에 따른 시료를 보유할 수 있는 임의의 구조들일 수 있으며, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 관통 구멍 또는 우물들은 지름이 테이퍼질 수도 있다.

주어진 영역 내에서 더 많은 반응이 수행될 수 있도록 액체시료의 반응 용적을 줄이면 반응 용적들의 밀도를 더 높일 수도 있다. 예를 들어, 기판 내의 관통 구멍들을 통해 300 ㎛의 직경으로 구성되는 일정 배열의 반응 위치들은 약 30 nL의 반응 용적을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 배열 내의 각 관통 구멍의 사이즈를 직경 60 내지 70 ㎛로 줄임으로써 예를 들어 각 반응 용적은 100 pL의 액체시료일 수도 있다. 본원에 기재된 다양한 실시예들에 따른 반응 용적들은 약 1 pL 로부터 30 nL까지의 액체시료일 수도 있다. 더욱이, 동적 범위는 액체시료의 희석액을 1이상 사용하여 증가될 수도 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. 도 2는 도 1에 도시된 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 분해 사시도이다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 카트리지 타입의 검사 모듈로서 어퍼 케이스(110), 바텀 케이스(120), 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(160)를 포함한다. 본 실시예에서, 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 디지털 실시간 PCR 장비의 리더 시스템에 탈착 가능하도록 결합될 수 있다. 본 실시예에서, 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 이미지 센서(150) 및 PCB(160)는 PCR 모듈을 정의할 수 있다.

어퍼 케이스(110)는 중심 영역에 형성된 어퍼홀을 포함하는 도우넛 형상의 커버 몸체와 상기 어퍼홀에 배치된 윈도우 부재를 포함한다. 어퍼 케이스(110)는 바텀 케이스(120)에 체결된다. 본 실시예에서, 어퍼 케이스(110) 및 바텀 케이스(120)는 납작한 원통 형상인 것을 도시하였으나, 다양한 형상이 가능하다. 상기 윈도우 부재는 투명 재질을 포함할 수 있다. 상기 윈도우 부재는 PDMS 재질을 포함할 수 있다.

바텀 케이스(120)는 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(160)를 수용하고, 어퍼 케이스(110)에 체결된다. 바텀 케이스(120)와 어퍼 케이스(110)는 후크 방식으로 체결될 수 있다.

미소유체 챔버(130)는 상향으로 돌출된 멤브레인 스위치, 상기 멤브레인 스위치의 일측에 형성되어 액체시료의 주입을 위한 인렛을 포함한다. 미소유체 챔버(130)의 하부 에지 영역은 PCB(160)의 에지 영역에 접한다. 미소유체 챔버(130)의 하부 중앙 영역에는 PCB(160)에 탑재된 CMOS 포토센서 어레이(150) 및 웰 어레이(140)를 수용하기 위해 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 미소유체 챔버(130)는 PDMS와 같은 재질로 구성될 수 있다. 미소유체 챔버(130)는 유연성, 투명성, PCR 호환성 및 낮은 자가 형광성을 갖고서, 사출 성형이 가능하다.

웰 어레이(140)는 미소유체 챔버(130)의 하부 면에 부착되고, CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치된다. 웰 어레이(140)는 에칭된 실리콘 재질로 구성될 수 있다. 웰 어레이(140)는 PCR 반응 위치의 역할을 수행하는 복수의 마이크로 웰들(대략 1,000개~100,000개)을 포함한다.

도 3은 도 2에 도시된 웰 어레이 형상의 일례를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. 도 3에서 마이크로 웰의 형상이 원형상인 것을 도시하였으나, 육각형, 사각형 등과 같이 다양한 형상이 가능하다.

도 3을 참조하면, 상기 마이크로 웰들의 형태, 크기 및 부피는 조절이 가능하다. 상기 마이크로 웰들은 상하부가 관통된 형상을 갖는다. 본 실시예에서, 상기 마이크로 웰은 700um미만의 두께와 150um 미만의 피치를 가질 수 있다. 상기 마이크로 웰은 육각 형상, 원형상 등과 같은 다양한 형상을 가질 수 있다. 웰 어레이(140)는 친수성 코팅으로 처리될 수 있다. 웰 어레이(140)는 플라즈마 또는 열 또는 UV 경화 접착제에 의해 미소유체 챔버(130)에 부착될 수 있다.

도 1 및 도 2를 다시 참조하면, CMOS 포토센서 어레이(150)는 웰 어레이(140) 아래에 배치되고, 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들에서 PCR 반응 산물을 실시간으로 촬영한다. 구체적으로, CMOS 포토센서 어레이(150)는 PCB(160)에 형성된 기판홀에 대응하도록 배치되어 웰 어레이(140)에서 방출되는 광을 수용하여 PCR 장치에서 수행되는 PCR 반응 산물을 도 4a에 도시된 바와 같이, 측정한다. 측정된 PCR 반응 산물은 도 4b에 도시된 바와 같이, 그래프 등의 방식으로 분석될 수 있다.

도 4a 및 도 4b는 디지털 실시간 PCR 결과를 보여주는 도면들이다. 특히, 도 4a는 웰 어레이에서 PCR 양성/음성 결과를 표시한 사진이고, 도 4b는 각 마이크로 웰에서 실시간으로 형광을 측정하여 해당 웰이 양성인지 음성인지를 판별하게 하는 그래프이다.

도 1 및 도 2를 다시 참조하면, CMOS 포토센서 어레이(150)의 상부면에는 밀봉후 마이크로 웰의 바닥을 형성하기 위해 PDMS와 같은 물질의 얇은 층이 코팅될 수 있다.

PCB(160)는 CMOS 이미지 센서(150)를 수용한다. 상기 인렛을 통해 투입된 액체시료가 웰 어레이(140)에 빠르게 제공되도록, PCB(160)에는 진공 처리를 위한 통풍구(152)가 형성될 수 있다. 통풍구(152)는 CMOS 포토센서 어레이(150)와 웰 어레이(140) 사이의 공간과 도통한다.

본 실시예에서, 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 열 순환을 위해 히터(170)를 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 열 순환은 열 순환기(thermal cycler), 등온 증폭, 열 관습(thermal convention), 적외선 매개 열 사이클링(infrared mediated thermal cycling), 또는 헬리카제 의존 증폭(helicase dependent amplification)을 사용하는 단계를 포함할 수도 있다. 일부 실시예들에서, 칩이 내장된 가열 소자와 통합될 수도 있다. 다양한 실시예들에서, 칩은 반도체들과 통합될 수도 있다. 다양한 실시예들에 따른 타겟의 검출은 예를 들어, 형광 검출, 양 또는 음 이온 검출, 산도(pH) 검출, 전압 검출, 또는 전류 검출을 단독 또는 조합할 수도 있지만, 그들로 한정되지 않는다.

도 5a는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)를 개략적으로 설명하기 위한 정면 사시도이고, 도 5b는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)를 개략적으로 설명하기 위한 배면 사시도이고, 도 5c는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)의 분해 사시도이다.

도 2 내지 도 5c를 참조하면, 본 실시예에 따른 미소유체 챔버(130)는 사각 형상의 베이스부재(132)와 베이스부재(132) 위에 배치되는 사각 형상의 탑부재(134)를 포함한다. 본 실시예에서, 베이스부재(132)와 탑부재(134)는 물리적으로 분리된 것을 도시하였으나, 일체형으로 구성될 수도 있다.

베이스부재(132)는, 사각 형상의 제1 플랫부(132a), 제1 플랫부(132a)의 중심영역에 형성된 사각 형상의 지지홀(132b), 제1 플랫부(132a)의 모서리 영역에 형성된 원형상의 플랫홀(132c)을 포함한다. 지지홀(132b)에는 중심 영역으로 돌출된 가이드 돌기들이 형성되어 사각 톱니 형상을 정의할 수 있다.

탑부재(134)는 사각 형상의 제2 플랫부(134a), 접시 형상의 멤브레인 스위치(134b) 및 페루프 형상의 인렛부(134c)를 포함한다. 제2 플랫부(134a)는 제1 플랫부(132a)의 상부면에 밀착된다. 멤브레인 스위치(134b)는 제2 플랫부(134a)의 중심영역에 배치되고 상향으로 돌출된다. 멤브레인 스위치(134b)의 하부 영역은 베이스부재(132)의 지지홀(132b)에 대응한다. 이에 따라 미소유체 챔버(130)의 바닥부에는 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 후퇴된 공간에는 CMOS 이미지 센서(150)와 웰 어레이(140)가 수용될 수 있다.

인렛부(134c)는 울타리 형상(fence shape)을 갖고서, 멤브레인 스위치(134b)의 일측에 상향으로 돌출되어 액체시료가 외부로 유출되는 것을 차단한다. 인렛부(134c)의 중심영역에는 베이스부재(132)의 수직 방향으로 인렛(134d)이 형성된다.

인렛부(134c)의 인렛(134d)과 멤브레인 스위치(134b)의 바닥 에지 영역을 연결하는 영역에는 마이크로 유로(134e)가 형성된다. 인렛부(134c)의 인렛(134d)에 투입된 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 통해 멤브레인 스위치(134b)의 바닥 에지 영역까지 도달된다.

탑부재(134)는 멤브레인 스위치(134b)의 타측에 관찰자 관점에서 상향으로 돌출된 그립부(134f)를 더 포함할 수 있다. 그립부(134f)는 멤브레인 스위치(134b)를 기준으로 인렛부(134c)와 마주하도록 배치된다. 그립부(134f)의 높이는 인렛부(134c)의 높이보다 높을 수 있다. 인렛부(134c)의 높이와 멤브레인 스위치(134b)의 높이는 동일하다.

이상에서 설명된 바와 같이, 미소유체 챔버(130)에서 인렛(134d)과 마이크로 유로(134e)는 서로 도통된다. 인렛(134d)을 통해 액체시료가 투입되면, 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 통해 멤브레인 스위치(134b)의 아래에 형성된 공간으로 낙하한다. 또한 멤브레인 스위치(134b)가 눌려지는 경우, 마이크로 유로(134e)를 통해 노출된 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들 각각에 액체시료가 완전 충전될 수 있다.

도 6은 도 2에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다. 도 7은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 분해 단면도이다.

도 2 내지 도 7을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 PCR 모듈은 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(150)을 포함한다.

미소유체 챔버(130)의 바닥 영역에는 PCB(150)에 배치된 CMOS 포토센서 어레이(150) 및 웰 어레이(140)를 수용하도록 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 미소유체 챔버(130)는 도 5a 내지 도 5c에서 설명하였으므로 그 설명은 생략한다.

웰 어레이(140)는 미소유체 챔버(130)의 하부 면에 부착된다. 웰 어레이(140)는 CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치되고, PCB(150)에 형성된 기판홀에 삽입되어 배치된다. 웰 어레이(140)는 복수의 마이크로 웰들(142)을 포함한다. 마이크로 웰들(142)의 형상이나, 치수, 개수 등은 다양할 수 있다. 마이크로 웰들(142) 각각에는 분말시료 또는 액체시료와 같은 분석시료가 수용될 수 있다. 상기 분석시료는 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분이다. 즉, 상기 분석시료란 특정한 생물학적 물질, 예를 들어 단백질, DNA, RNA 등의 정량 또는 정성 분석을 위한 성분으로서, 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, DNA 또는 RNA 중합효소 등을 의미하며, 특히 실시간 중합효소연쇄반응, 정온 효소반응 또는 LCR(Ligase Chain Reaction) 등을 수행하기 위해 필요한 성분을 의미한다.

CMOS 포토센서 어레이(150)는 웰 어레이(140)의 아래에 배치되고, 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들(142)에서 수행되는 PCR 반응 산물의 영상을 실시간으로 촬영한다. CMOS 포토센서 어레이(150)는 PCB(150)에 형성된 기판홀에 삽입되어 배치된다. CMOS 포토센서 어레이(150)는 방출되는 광을 수용하여 PCR 장치에서 수행되는 PCR 반응 산물을 실시간으로 촬영한다. 즉, CMOS 포토센서 어레이(150)는 여기 광선에 의하여 다수의 프로브에서 발생하는 형광(emission light)을 검출한다. 상기한 형광의 검출은 시간 분리 방식에 의해 이루어질 수도 있고, 파장 분리 방식에 의해 이루어질 수도 있다.

상기한 시간 분리 방식의 경우, 형광물질이 여기광에 응답하여 방출광을 발현함에 따라, 형광센서 어레이 또는 어레이를 구성하는 단일 센서는 이미션 필터를 통과하는 방출광을 검출하고 검출된 방출광의 시상수를 구하여 형광을 감지한다.

상기한 파장 분리 방식의 경우, 형광물질이 여기광에 응답하여 방출광을 발현함에 따라, 형광센서 어레이 또는 어레이를 구성하는 단일 센서는 이미션 필터를 통과하는 방출광을 검출하고 검출된 방출광의 스펙트럼 분석을 통해 형광을 감지한다.

PCB(150)는 미소유체 챔버(130) 아래에 배치되고, 탑재되는 CMOS 포토센서 어레이(150)를 수납한다. PCB(150)는 미소유체 챔버(130)의 바닥 에지 영역에 접하도록 배치된다. 미소유체 챔버(130)의 바닥 에지 영역에 접하는 PCB(150)의 일부 영역에는 통풍구(vent hole)(152)가 형성된다. 통풍구(152)는 CMOS 포토센서 어레이(150)와 웰 어레이(140) 간의 공간과 도통된다.

액체시료가 인렛(134d)에 투입되면, 통풍구(152)에 연결된 진공 장치(미도시)를 통해 공기가 펌핑된다. 공기의 펌핑에 따라, 인렛(134d)에 투입된 액체시료는 미소유체 챔버(130)에 형성된 마이크로 유로(134e)를 경유하여 웰 어레이(140)의 일부 영역, 상기 일부 영역의 상부 영역 및 상기 일부 영역의 하부 영역에 제공된다.

본 실시예에서, 미소유체 챔버(130)에 형성된 마이크로 유로(134e)의 바닥을 형성하는 스티커(180)를 더 포함할 수 있다. 스티커(180)의 부착에 따라 마이크로 유로(134e)에 유입된 액체시료는 다른 영역으로 유출되지 않고 웰 어레이(140)에 온전하게 제공될 수 있다. 스티커(180)의 두께는 웰 어레이(140)의 두께와 동일할 수 있다.

본 실시예에서, 상기 PCR 모듈은 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들(142) 각각에 수용된 프로브를 향해 여기 광선(excitation light)을 조사하도록 배치된 광 제공부(미도시)를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 광 제공부는 LED(Light Emitting Diode) 광원, 레이저 광원 등과 같이 광을 방출하는 광원을 포함할 수 있다. 광원으로부터 방출된 광은 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들(142)을 통과하거나 반사하고, 이 경우 핵산 증폭에 의해 발생하는 광신호를 CMOS 포토센서 어레이(150)가 검출할 수 있다.

본 실시예에서, 상기 PCR 모듈은 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 역할을 수행하는 이미션 필터(미도시)를 더 포함할 수 있다. 상기 이미션 필터는 CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치될 수 있다.

그러면, 이하에서, 본 발명의 실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 사용 방법을 순차적으로 나타낸 도면들을 이용하여 설명한다. 설명의 편의를 위해, 어퍼 케이스(110; 도 2에 도시됨) 및 바텀 케이스(120; 도 2에 도시됨)에 대한 도시는 생략한다.

도 8은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제1 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다.

도 8을 참조하면, PCR 과정의 제1 단계로서, 빈 상태의 PCR 모듈을 평평한 위치에 배치한다.

도 9는 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제2 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다.

도 9을 참조하면, PCR 과정의 제2 단계로서, 액체시료를 미소유체 챔버(130)의 인렛(134d)에 피펫한다. 인렛(134d)에 피펫되는 액체시료의 양은 웰 어레이(140)와 미소유체 챔버(130) 사이의 공간 및 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들(142)에 채워질 수 있는 양인 것이 바람직하다. 인렛(134d)에 피펫된 액체시료는 마이크로 유로(134e; 도 3b에 도시됨)에 존재하는 공기의 저항에 의해 마이크로 유로(134e)에 흐르지 못한다.

도 10, 도 11, 도 12 및 도 13은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제3 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도들이다.

도 10, 도 11, 도 12 및 도 13을 참조하면, PCR 과정의 제3 단계로서, 인렛(134e)에 액체시료가 피펫된 후 통풍구(152)에 연결된 진공 장치(미도시)를 온시킨다.

이에 따라, 공기는 통풍구(152)를 통해 펌핑되고, 인렛(134e)에 피펫된 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 따라 웰 어레이(140)에 제공된다. 웰 어레이(140)에 제공된 액체시료는 마이크로 유로(134e)의 종단부에 근접한 마이크로 웰들(142)을 통해 CMOS 포토센서 어레이(150) 위까지 도달한다. 이러한 진공 장치의 펌핑을 통해 마이크로 웰들에 액체시료가 보다 빠르게 제공될 수 있다. 또한, 진공 장치의 펌핑을 통해 웰 어레이의 코너나 에지 영역에 존재할 수 있는 공기를 보다 용이하게 제거할 수 있다.

도 14, 도 15 및 도 16은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제4 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도들이다.

도 14, 도 15 및 도 16을 참조하면, PCR 과정의 제4 단계로서, 통풍구(152)에 연결된 진공 장치를 오프시킨다. 상기 진공 장치가 오프됨에 따라, 웰 어레이(140)의 하부 공간에 도달된 액체시료는 모세관 힘에 의해 웰 어레이(140)의 상부 공간까지 점진적으로 끌어 올려진다.

이에 따라, 액체시료는 웰 어레이(140)와 미소유체 챔버(130) 사이의 공간 및 웰 어레이(140)의 마이크로 웰들(142)에 채워진다.

도 17, 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 이용한 PCR 과정의 제5 단계를 개략적으로 설명하기 위한 단면도들이다. 특히, 실링에 따른 PCR 과정이 도시된다.

도 17, 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21을 참조하면, PCR 과정의 제5 단계로서, 사용자의 가압 또는 기계류의 가압에 따라 어퍼 케이스(110)의 중심 영역에 배치된 윈도우 부재가 눌려지면, 마이크로 웰들(142) 각각에 채워진 액체시료를 갖는 웰 어레이(140)는 CMOS 포토센서 어레이(150)에 눌려진다.

이에 따라, 웰 어레이(140)의 코너나 에지 영역에 에어 포켓이 생성되는 것을 차단할 수 있다. 상기 에어포켓은 PCR 과정 중의 온도변화에 의해 팽창하거나 수축하여 시험결과에 오류가 발생한다. 하지만, 본 발명에 따르면 진공 장치의 펌핑을 통해 PCR 용액을 이동시키고 그 용액이 반응공간을 채울 때, 반응 공간인 웰 어레이의 코너나 에지 영역에서 에어 포켓의 생성이 차단되므로 PCR 시험결과에서 에어포켓에 의한 시험결과에 오류가 발생되는 것을 방지할 수 있다. 또한 CMOS 포토센서 어레이 위에 웰 어레이가 위치하므로 실시간 PCR 반응을 측정할 수 있다.

이상에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따르면, PCR 모듈의 웰 어레이에 시약이 내장된 상태로 출시되기 때문에, 시약을 셋팅하기 위한 별도의 절차가 불필요하여 오염가능성이 획기적으로 저하되고 검사 준비를 위한 별도의 절차가 필요하지 않다.

또한 디지털 실시간 PCR의 경우, 반응 공간인 웰 어레이의 마이크로 웰들의 크기가 매우 작고 그 숫자가 매우 많더라도 반응 공간들 각각에 시료를 투입하는 것이 가능하다.

또한 시료가 웰 어레이의 코너나 에지 영역까지 주입되어, 반응 공간인 웰 어레이의 코너나 에지 영역에 에어포켓이 생성되는 것이 방지되고, 시험결과의 신뢰성이 향상된다.

이상에서는 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명은 생화학물질의 검사를 수행하는 장치, 혈액검사장치, 질병 검사장치 등으로 연구용, 재난방지용, 의료용, 축산용, 애완동물치료용 등으로 사용될 수 있는 산업상 이용가능성을 갖는다.

110 : 어퍼 케이스 120 : 바텀 케이스
130 : 미소유체 챔버 132 : 베이스부재
134 : 탑부재 132a : 제1 플랫부
132b : 지지홀 132c : 플랫홀
134a : 제2 플랫부 134b : 멤브레인 스위치
134c : 인렛부 134d : 인렛
134e : 마이크로 유로 134f : 그립부
140 : 웰 어레이 150 : CMOS 포토센서 어레이
152 : 통풍구 160 : PCB
170 : 히터 180 : 스티커

Claims (16)

1. 액체시료의 투입을 위해 형성된 인렛을 포함하고, 사출 성형으로 제조 가능한 미소유체 챔버;
   상하부가 관통된 복수의 마이크로 웰들을 포함하고, 상기 미소유체 챔버의 하부 면에 부착된 웰 어레이;
   상기 웰 어레이 아래에 배치되고, 상기 웰 어레이의 마이크로 웰들에 충진된 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영하는 CMOS 포토센서 어레이; 및
   상기 인렛을 통해 액체시료가 투입됨에 따라 상기 미소유체 챔버에 형성된 마이크로 유로, 상기 웰 어레이와 상기 미소유체 챔버간에 형성된 공간, 상기 웰 어레이에 형성된 마이크로 웰의 진공 처리를 위한 통풍구(vent)가 형성된 PCB를 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
2. 제1항에 있어서, 상기 미소유체 챔버는,
   사각 형상의 제1 플랫부, 상기 제1 플랫부의 중심영역에 형성된 사각 형상의 지지홀, 상기 제1 플랫부의 모서리 영역에 형성된 원형상의 홀을 포함하는 사각 형상의 베이스부재; 및
   사각 형상의 제2 플랫부, 접시 형상의 멤브레인 스위치 및 페루프 형상의 인렛부를 포함하고, 상기 베이스부재 위에 배치되는 사각 형상의 탑부재를 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
3. 제1항에 있어서, 상기 미소유체 챔버는 PDMS(Polydimethylsiloxane) 재질, 투명 플라스틱, 투명 고무 재질 중 적어도 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
4. 제1항에 있어서, 상기 미소유체 챔버는 낮은 자가 형광성(Autofluorescence)을 갖는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
5. 제1항에 있어서, 상기 미소유체 챔버에 부착되어 상기 미소유체 챔버에 형성된 마이크로 유로의 바닥을 형성하는 스티커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
6. 제1항에 있어서, 상기 웰 어레이는 에칭된 실리콘 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
7. 제1항에 있어서, 상기 CMOS 포토센서 어레이의 상부면에는 밀봉후 웰의 바닥을 형성하기 위해 층이 코팅된 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
8. 제7항에 있어서, 상기 층은 PDMS 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
9. 제1항에 있어서, 상기 웰 어레이는 친수성 코팅 처리된 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
10. 제1항에 있어서, 상기 웰 어레이는 플라즈마 또는 열 또는 UV 경화 접착제에 의해 상기 미소유체 챔버에 부착된 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
11. 삭제
12. 제1항에 있어서, 상기 웰 어레이에는 육각형상의 마이크로 웰들이 형성된 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
13. 제2항에 있어서,
    상기 미소유체 챔버 위에 배치되고, 상기 인렛에 대응하도록 형성된 홀을 갖는 어퍼 케이스; 및
    상기 어퍼 케이스에 체결되어 상기 미소유체 챔버, 상기 웰 어레이, 상기 CMOS 포토센서 어레이 및 상기 PCB를 수용하고, 상기 통풍구에 대응하여 형성된 홀을 갖는 바텀 케이스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
14. 제13항에 있어서, 상기 멤브레인 스위치 위에 배치된 윈도우 부재를 더 포함하고,
    상기 윈도우 부재는 상기 어퍼 케이스의 중앙 영역에 형성된 홀에 대응하여 배치된 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
15. 제14항에 있어서, 상기 윈도우 부재는 투명한 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
16. 제14항에 있어서, 상기 윈도우 부재는 PDMS 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지.
    

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