KR20240046076A - 디지털 실시간 pcr 분석 방법 - Google Patents

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KR20240046076A
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김재헌
엄재원
변재오
이도영
최경학
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Abstract

본 발명은 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 관한 것으로, 기존의 측정 한계를 넘어선 고농도 또는 저농도 샘플, 즉, 넓은 농도 범위의 샘플에 대해 디지털 실시간 PCR 분석이 가능한 디지털 실시간 PCR 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.

Description

디지털 실시간 PCR 분석 방법{ANALYSIS METHOD FOR DIGITAL REAL-TIME PCR}
본 발명은 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 관한 것으로, 기존의 측정 한계를 넘어선 고농도 또는 저농도 샘플, 즉, 넓은 농도 범위의 샘플에 대해 디지털 실시간 PCR 분석이 가능한 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 관한 것이다.
유전자 증폭기술은 분자진단에 있어서 필수적인 과정으로서 시료 내 미량의 디옥시리보핵산(Deoxyribonucleic Acid; DNA) 또는 리보핵산(Ribonucleic Acid; RNA)의 특정 염기서열을 반복적으로 복제하여 증폭하는 기술이다. 그 중 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)은 대표적인 유전자 증폭 기술로서 DNA 변성단계(denaturation), 프라이머(Primer) 결합단계(annealing), DNA 복제단계(extension)의 3단계로 구성되어 있으며 각 단계는 시료의 온도에 의존되어 있으므로 시료의 온도를 반복적으로 변하게 함으로서 DNA를 증폭할 수 있다.
PCR 분석 중, 디지털 PCR은 핵산을 탐지하고 정량하는 새로운 PCR 기술로서, 나노리터에서 피코 리터 크기의 분획(Partition) 수천개~수백만개를 생성하고 각 분획에 핵산의 존재 유무를 파악하는 방식으로 목표 핵산의 개수를 계산할 수 있다. 따라서 정량을 위해 표준물질을 이용한 표준곡선에 의존할 필요가 없고 단 한 번의 PCR로 정량할 수 있는 절대정량법이며, 높은 측정 정밀도를 가지고, 복잡한 혼합물의 분석 및 결과물의 선형적 정량 검출이 가능하다.
현재 가장 많이 이용되는 기술은 액적(droplet)으로 분획하는 방식을 채용한 액적 디지털 PCR(droplet digital PCR, ddPCR)방식으로서 20 마이크로리터의 시료를 20,000개의 액적으로 쪼개어 증폭시키는 기술이다. 그러나 시료의 액적화는 액적생성기라는 특수 장치를 이용하여야 하며, 형성된 액적을 96-well PCR 플레이트로 옮긴 후 일단 PCR 반응을 진행해야 한다. 또한, 액적이 깨지기 쉬워 시료 일부를 상실하는 단점이 있다. 분석 장비 외에도 5~6개의 기타 장비가 필요하며, 또한 분석을 위해 숙련된 인력이 필요하며 Real-time curve의 측정이 어렵다는 단점이 있다.
상기를 포함하여 현존하는 대부분의 Digital PCR 기술은 PCR 과정을 모두 마친 후 각 분획의 형광세기를 측정하는 End-point 방식이다. 형광세기가 높은 분획들은 양성, 형광세기가 낮은 분획들은 음성으로 판정한다. end-point 방식은 분획 내에 타겟 핵산의 존재 여부만 확인 가능하고 각 분획내 얼마나 존재하는지 알 수 없으므로 Poisson 확률 분포를 적용하여 시료내 타겟 핵산의 수를 계산한다. 이러한 Digital PCR 기술은 두가지 한계를 가진다.
우선, 각 분획에서 양성 및 음성을 분명히 구분하기 어려운 경우가 존재한다. 어떤 분획의 형광의 세기가 양성분획과 음성분획의 형광세기 중간에 위치하여 양성인지 음성인지 판정하기 어려운 경우가 해당된다. 사용자가 임의로 설정한 기준으로 분획을 양성, 음성으로 판정하게 되면 분획 단위의 위양성, 위음성 오류를 포함하게 된다. 이는 고농도의 시료보다는 저농도 시료, 즉 민감하게 검출하면서 정량을 해야한 경우에 정량 값의 정확도에 문제를 일으킬 수 있다. 극단적으로, 단 하나의 분획에서 양성으로 보이는 반응이 나올 때 이를 양성으로 분류할 지 음성으로 분류할지 판정하기 매우 어렵다. 이러한 저농도의 정확도 문제는 정량진단제품의 최소검출한계(Limit of Detectiom, LOD), 최소정량한계(Limit of Quatitation, LOQ)를 떨어뜨리는 원인이 될 수 있다. 저농도의 검체의 LOD를 향상시키기 위하여 분획의 수와 시료의 양을 증가시키더라도 이 문제를 해결하기 어렵다. 분획과 시료가 증가하더라도 양성, 음성 중간 세기의 분획도 같이 증가하기 때문이다. 신호의 세기를 증가시키면 잡음의 세기도 같이 증가하는 원리와 같다.
두번째로, 모든 분획이 양성으로 판정되는 경우 Poisson 확률분포를 사용할 수 없기 때문에 타겟 핵산의 수를 알 수 없다. 이런 경우 일반적으로 해당 시료를 Serial Dilution 하여 다시 테스트하고 음성 분획이 나오는 테스트에서 Poisson 확률분포를 사용하여 타겟 핵산의 수를 계산한다. 즉 End-point 방식은 한번의 테스트로 측정할 수 있는 dynamic range가 제한적인데 이는 분획의 수와 분획의 부피로 결정된다. 예를 들어 분획당 1나노리터, 분획수는 20,000개인 경우, 타겟을 검출할 수 있는 범위(Dynamic Range)는 1개에서 최소 10만개, 최대 30만개 정도된다. 만일 어떤 시료 20 마이크로리터에 100만개의 고농도 타겟이 들어 있다면, 한번의 테스트로 이를 정량할 수 없다.
본 발명은 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 관한 것으로, 기존의 측정 한계를 넘어선 고농도 또는 저농도 샘플, 즉, 넓은 농도 범위의 샘플에 대해 디지털 실시간 PCR 분석이 가능한 디지털 실시간 PCR 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 액상의 분석대상 시료가 저장되는 미소유체 챔버; 상기 미소유체 챔버의 저면에 부착되고 상기 미소유체 챔버로부터 상기 분석대상 시료를 공급받는 웰 어레이; 및 상기 웰 어레이의 저면에 위치하고 상기 웰 어레이에 마련되는 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영하는 CMOS 포토센서 어레이를 포함하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은,
상기 미소유체 챔버의 상기 분석대상 시료를 상기 복수의 분획 각각에 주입하는 시료 주입 단계(S10);
상기 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 상기 CMOS 포토센서 어레이를 통해 실시간으로 촬영하여 원시 데이터를 획득하는 원시 데이터 획득 단계(S20);
상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대한 복수의 Ct(cycle threshold) 값을 추출하는 Ct 추출 단계(S30);
상기 복수의 Ct 값을 근거로 상기 복수 분획 각각에 대한 복수의 타겟 수를 산출하는 개별 분획 타겟 수 산출 단계(S40); 및
상기 복수의 타겟 수를 근거로 상기 분석대상 시료에서의 타켓 농도를 산출하는 최종 산출 단계(S50)를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 시료 주입 단계(S10)에서, 상기 미소유체 챔버는 PDMS(polydimethylsiloxane) 소재로 마련되는 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 시료 주입 단계(S10)에서, 상기 복수의 분획 각각에 상기 분석대상 시료가 주입되면 상기 웰 어레이를 상기 CMOS 포토센서 어레이에 완전히 밀착시키는 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)는 모든 상기 복수의 분획에 상기 분석대상 시료가 채워짐을 확인한 후 수행되고, 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 복수의 분획에 대한 이미지를 상기 원시 데이터로서 획득하는 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 원시 데이터는 적어도 사이클 당 1회 이상 수집되는 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 Ct 추출 단계(S30)에서, 상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대해서 형광 세기를 종속 변수로 하고, 시간 또는 사이클 수를 독립 변수로 하는 형광 세기 함수가 획득되고, 상기 Ct 값은 형광 세기 함수를 2차 미분한 값이 최대인 시간 또는 사이클 수 값인 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서, 상기 복수 분획 각각에 대한 상기 복수의 타겟 수 각각은, 상기 수학식 1로 산출되는 것인 것일 수 있다.
[수학식 1]
,
Ni는 i번째 분획에서의 타겟 수이고,
Cti는 i번째 분획의 Ct 값이며,
Ctref는 Ct를 측정하기 위해 필요한 앰플리콘(amplicon) 수, 프로브의 형광 효율 중 적어도 하나 이상에 의해서 결정되는 것이고,
a는 상수로서 PCR 효율에 의해서 결정되는 상수이다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서, 상기 Ctref는 하기 수학식 2로 산출되는 것일 수 있다.
[수학식 2]
,
Ct0는 표준 시료로부터 획득되는 Ct값일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 표준 시료의 농도는 107 copies/rxn 내지 108 copies/rxn 인 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 최종 산출 단계(S50)에서, 상기 분석대상 시료의 농도 Con은 하기 수학식 3으로 산출되는 것일 수 있다.
[수학식 3]
,
n은 상기 복수의 분획의 총 개수이다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법의 상기 최종 산출 단계(S50)에서, 상기 Con 값을 근거로 상기 분석대상 시료의 음성 또는 양성을 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 기존의 측정 한계를 넘어선 고농도 또는 저농도 샘플, 즉, 넓은 농도 범위의 샘플에 대해 디지털 실시간 PCR 분석이 가능한 디지털 실시간 PCR 분석 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 개별 분획에 대하여 실시간 그래프를 제공하는 디지털 PCR을 구현할 수 있고, 이를 통해 위양성 또는 위음성의 오류를 제거할 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 하나의 카트리지로 디지털 실시간 PCR을 수만 번 반복 평가하는 것과 동일한 효과를 얻을 수 있으며, 각 단위 구획에서 측정된 값을 기반으로 각 단위 구획 내에 존재하는 타겟 수를 계산함으로써, 샘플내 초기 농도를 산출할 수 있다.
도 1 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시된 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 분해 사시도이다.
도 3은 도 2에 도시된 웰 어레이 형상의 일례를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다.
도 4a 및 도 4b는 디지털 실시간 PCR 결과를 보여주는 도면들이다.
도 5a는 도 2에 도시된 미소유체 챔버를 개략적으로 설명하기 위한 정면 사시도이고, 도 5b는 도 2에 도시된 미소유체 챔버를 개략적으로 설명하기 위한 배면 사시도이고, 도 5c는 도 2에 도시된 미소유체 챔버의 분해 사시도이다.
도 6은 도 2에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다.
도 7 내지 도 21은 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 개략적인 이용을 나타내는 단면도들이다.
도 22는 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법을 나타내는 블록도이다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 실시예를 상세히 설명한다. 이 과정에서 도면에 도시된 구성요소의 크기나 형상 등은 설명의 명료성과 편의상 과장되게 도시될 수 있다. 또한, 본 발명의 구성 및 작용을 고려하여 특별히 정의된 용어들은 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있다. 이러한 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 한다.
본 발명의 설명에 있어서, 유의하여야 할 점은 용어 "중심", "상", "하" "좌", "우", "수직", "수평", "내측", "외측", “일면”, “타면” 등이 지시한 방위 또는 위치 관계는 도면에서 나타낸 방위 또는 위치 관계, 또는 평소에 본 발명 제품을 사용할 시 배치하는 방위 또는 위치관계에 기초한 것이고, 본 발명의 설명과 간략한 설명을 위한 것일 뿐, 표시된 장치 또는 소자가 반드시 특정된 방위를 가지고 특정된 방위로 구성되거나 조작되어야 하는 것을 제시 또는 암시하는 것이 아니므로 본 발명을 제한하는 것으로 이해해서는 아니 된다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 설명하고자 한다. 도면상의 동일한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 사용하고 동일한 구성요소에 대해서 중복된 설명은 생략한다.
본 발명은 기판에 일정 배열로 시료들, 시료 용적들 또는 반응 용적들을 탑재하기 위한 구조이며, 보다 구체적으로는 기판 내의 각각의 반응 위치들의 일정한 배열로 시료들을 탑재하는 것에 관한다.
다양한 실시예들에서, 대량의 작은 용적 시료들에서 타겟들을 검출하기 위해 사용되는 물품 내에 시료들을 탑재하기 위한 장치, 기기, 시스템, 및 방법들이 제공된다. 이러한 타겟들은 임의의 적절한 생물학적 타겟일 수 있지만, DNA 서열(무 세포 DNA를 포함함), RNA 서열, 유전자, 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotides), 분자, 단백질, 생체표식(biomarkers), 세포(예, 순환 종양 세포), 또는 다른 적당한 타겟 생체 분자를 포함하는 것들로서, 그들로 한정되지 않는다. 다양한 실시예들에서, 이러한 생물학적 성분들은 태아 진단, 다중화 dPCR, 바이러스 검출, 및 정량 표준화, 유전자형(genotyping), 서열 검증, 돌연변이 검출, 유전자 생물, 희귀 대립 유전자 검출, 및 복제 수 변화 검출 등의 응용들에서 다양한 PCR, qPCR, 및/또는 dPCR 방법 및 시스템과 연관하여 사용될 수도 있다.
일반적으로, 대량의 시료들이 처리되는 정량 중합 효소 연쇄 반응(qPCR)에 적용가능하지만, 임의의 적절한 PCR 방법은 본 명세서에 기재된 다양한 실시예들에 따라 사용될 수도 있음을 인식해야 한다. 적절한 PCR 방법들은, 예를 들어, 디지털 PCR, 대립 유전자 특이 PCR, 비대칭 PCR, 결합 매개(ligationmediated) PCR, 다중 PCR, 맞춤형(nested) PCR, qPCR, 캐스팅 PCR, 게놈 워킹(genome walking), 브리지(bridge) PCR을 포함하지만 그들로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 다양한 실시예들에 따른 후술되는 바와 같이, 반응 위치들은 예를 들어 관통 구멍, 시료 보유 영역, 우물, 요홈(indentations), 지점(spots), 공동, 및 반응 챔버들을 포함하지만 그들로 제한되지 않는다.
여기에 설명되는 다양한 실시예들은 특히 디지털 PCR(dPCR)에 적합하다. 디지털 PCR에서, 타겟 폴리 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열의 상대적으로 적은 수를 내장하는 용액을 각각의 시료를 대량의 작은 시료들로 더 분할할 수도 있으며, 그에 의해 각 시료는 일반적으로 타겟 뉴클레오타이드 서열의 한 분자를 포함하던가 또는 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않을 수도 있다. 연이어, 시료들이 PCR 프로토콜, 절차, 또는 실험에서 열적으로 순환되는 경우, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료가 증폭되어 양의 검출 신호를 생성하는 반면 어떠한 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 시료들은 증폭되지 않고 검출 신호를 생성하지 않는다. 푸아송 통계(Poisson statistics)를 사용하여, 원래 용액에서 타겟 뉴클레오타이드 서열들의 숫자를 양의 검출 신호를 생성하는 시료들의 개수와 상관할 수도 있다.
전형적인 dPCR 프로토콜, 절차, 또는 실험을 위해서, 간단하여 비용에 효과적인 방법으로 수만 또는 수십만의 시료들에, 즉 각각 수 나노리터, 1 또는 대략 1 나노리터, 또는 1 나노리터 미만의 용적을 갖는 시료들에 초기 시료 용액을 분할할 수 있는 이점이 있다. 타겟 뉴클레오타이드 서열의 수를 매우 작게 할 수 있기 때문에, 초기 용액의 전체 내용물이 복수의 반응 위치들을 고려하여 내장하는 그러한 환경들에서도 중요할 수도 있다.
본원에서 설명되는 실시예들은 이들 및 기타 dPCR 설계 제약들을 초기 시료 용액을 복수의 반응 위치들에 시료 용액의 모두, 또는 필수적인 것들 모두를 고려하는 방식으로 분배함으로써 해결한다.
높은 처리량의 PCR 분석들 및 dPCR 방법들 때문에, 한번에 수행되는 반응들의 수를 증가시키면서 액체시료의 반응 용적을 감소시키기 위해 배열 형식을 사용하는 전략이 적용될 수도 있다. 액체시료의 반응 용적들의 배열은 복수의 반응 위치들을 갖는 기판 일 수도 있다. 반응 위치들은 관통 구멍들, 우물들, 요부들, 지점들, 공동들, 반응실들, 또는 본 명세서에 기재된 다양한 실시예들에 따른 시료를 보유할 수 있는 임의의 구조들일 수 있으며, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 관통 구멍 또는 우물들은 지름이 테이퍼질 수도 있다.
주어진 영역 내에서 더 많은 반응이 수행될 수 있도록 액체시료의 반응 용적을 줄이면 반응 용적들의 밀도를 더 높일 수도 있다. 예를 들어, 기판 내의 관통 구멍들을 통해 300 ㎛의 직경으로 구성되는 일정 배열의 반응 위치들은 약 30 nL의 반응 용적을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 배열 내의 각 관통 구멍의 사이즈를 직경 60 내지 70 ㎛로 줄임으로써 예를 들어 각 반응 용적은 100 pL의 액체시료일 수도 있다. 본원에 기재된 다양한 실시예들에 따른 반응 용적들은 약 1 pL 로부터 30 nL까지의 액체시료일 수도 있다. 더욱이, 동적 범위는 액체시료의 희석액을 1이상 사용하여 증가될 수도 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은,
액상의 분석대상 시료가 저장되는 미소유체 챔버;
상기 미소유체 챔버의 저면에 부착되고 상기 미소유체 챔버로부터 상기 분석대상 시료를 공급받는 웰 어레이; 및
상기 웰 어레이의 저면에 위치하고 상기 웰 어레이에 마련되는 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영하는 CMOS 포토센서 어레이를 포함하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는 것일 수 있다.
이하, 도 1 내지 도 23을 참조하여, 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 이용되는 디지털 실시간 PCR용 카트리지에 대해서 설명한다.
도 1은 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. 도 2는 도 1에 도시된 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 분해 사시도이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 일실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 카트리지 타입의 검사 모듈로서 어퍼 케이스(110), 바텀 케이스(120), 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(160)를 포함한다. 본 실시예에서, 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 디지털 실시간 PCR 장비의 리더 시스템에 탈착 가능하도록 결합될 수 있다. 본 실시예에서, 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 이미지 센서(150) 및 PCB(160)는 PCR 모듈을 정의할 수 있다.
어퍼 케이스(110)는 중심 영역에 형성된 어퍼홀을 포함하는 도우넛 형상의 커버 몸체와 상기 어퍼홀에 배치된 윈도우 부재를 포함한다. 어퍼 케이스(110)는 바텀 케이스(120)에 체결된다. 본 실시예에서, 어퍼 케이스(110) 및 바텀 케이스(120)는 납작한 원통 형상인 것을 도시하였으나, 다양한 형상이 가능하다. 상기 윈도우 부재는 투명 재질을 포함할 수 있다. 상기 윈도우 부재는 PDMS 재질을 포함할 수 있다.
바텀 케이스(120)는 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(160)를 수용하고, 어퍼 케이스(110)에 체결된다. 바텀 케이스(120)와 어퍼 케이스(110)는 후크 방식으로 체결될 수 있다.
미소유체 챔버(130)는 상향으로 돌출된 멤브레인 스위치, 상기 멤브레인 스위치의 일측에 형성되어 액체시료의 주입을 위한 인렛을 포함한다. 미소유체 챔버(130)의 하부 에지 영역은 PCB(160)의 에지 영역에 접한다. 미소유체 챔버(130)의 하부 중앙 영역에는 PCB(160)에 탑재된 CMOS 포토센서 어레이(150) 및 웰 어레이(140)를 수용하기 위해 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 미소유체 챔버(130)는 PDMS와 같은 재질로 구성될 수 있다. 미소유체 챔버(130)는 유연성, 투명성, PCR 호환성 및 낮은 자가 형광성을 갖고서, 사출 성형이 가능하다.
웰 어레이(140)는 미소유체 챔버(130)의 하부 면에 부착되고, CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치된다. 웰 어레이(140)는 에칭된 실리콘 재질로 구성될 수 있다. 웰 어레이(140)는 PCR 반응 위치의 역할을 수행하는 복수의 마이크로 웰(대략 1,000개~100,000개)을 포함한다.
도 3은 도 2에 도시된 웰 어레이 형상의 일례를 개략적으로 설명하기 위한 사시도이다. 도 3에서 마이크로 웰의 형상이 원형상인 것을 도시하였으나, 육각형, 사각형 등과 같이 다양한 형상이 가능하다.
도 3을 참조하면, 상기 마이크로 웰의 형태, 크기 및 부피는 조절이 가능하다. 상기 마이크로 웰은 상하부가 관통된 형상을 갖는다. 본 실시예에서, 상기 마이크로 웰은 700um미만의 두께와 150um 미만의 피치를 가질 수 있다. 상기 마이크로 웰은 육각 형상, 원형상 등과 같은 다양한 형상을 가질 수 있다. 웰 어레이(140)는 친수성 코팅으로 처리될 수 있다. 웰 어레이(140)는 플라즈마 또는 열 또는 UV 경화 접착제에 의해 미소유체 챔버(130)에 부착될 수 있다.
도 1 및 도 2를 다시 참조하면, CMOS 포토센서 어레이(150)는 웰 어레이(140) 아래에 배치되고, 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰에서 PCR 반응 산물을 실시간으로 촬영한다. 구체적으로, CMOS 포토센서 어레이(150)는 PCB(160)에 형성된 기판홀에 대응하도록 배치되어 웰 어레이(140)에서 방출되는 광을 수용하여 PCR 장치에서 수행되는 PCR 반응 산물을 도 4a에 도시된 바와 같이, 측정한다. 측정된 PCR 반응 산물은 도 4b에 도시된 바와 같이, 그래프 등의 방식으로 분석될 수 있다.
도 4a 및 도 4b는 디지털 실시간 PCR 결과를 보여주는 도면들이다. 특히, 도 4a는 웰 어레이에서 PCR 양성/음성 결과를 표시한 사진이고, 도 4b는 각 마이크로 웰에서 실시간으로 형광을 측정하여 해당 웰이 양성인지 음성인지를 판별하게 하는 그래프이다.
도 1 및 도 2를 다시 참조하면, CMOS 포토센서 어레이(150)의 상부면에는 밀봉후 마이크로 웰의 바닥을 형성하기 위해 PDMS와 같은 물질의 얇은 층이 코팅될 수 있다.
PCB(160)는 CMOS 이미지 센서(150)를 수용한다. 상기 인렛을 통해 투입된 액체시료가 웰 어레이(140)에 빠르게 제공되도록, PCB(160)에는 진공 처리를 위한 통풍구(152)가 형성될 수 있다. 통풍구(152)는 CMOS 포토센서 어레이(150)와 웰 어레이(140) 사이의 공간과 도통한다.
본 실시예에서, 디지털 실시간 PCR용 카트리지는 열 순환을 위해 히터(170)를 더 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 열 순환은 열 순환기(thermal cycler), 등온 증폭, 열 관습(thermal convention), 적외선 매개 열 사이클링(infrared mediated thermal cycling), 또는 헬리카제 의존 증폭(helicase dependent amplification)을 사용하는 단계를 포함할 수도 있다. 일부 실시예들에서, 칩이 내장된 가열 소자와 통합될 수도 있다. 다양한 실시예들에서, 칩은 반도체들과 통합될 수도 있다. 다양한 실시예들에 따른 타겟의 검출은 예를 들어, 형광 검출, 양 또는 음 이온 검출, 산도(pH) 검출, 전압 검출, 또는 전류 검출을 단독 또는 조합할 수도 있지만, 그들로 한정되지 않는다.
도 5a는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)를 개략적으로 설명하기 위한 정면 사시도이고, 도 5b는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)를 개략적으로 설명하기 위한 배면 사시도이고, 도 5c는 도 2에 도시된 미소유체 챔버(130)의 분해 사시도이다.
도 2 내지 도 5c를 참조하면, 본 실시예에 따른 미소유체 챔버(130)는 사각 형상의 베이스부재(132)와 베이스부재(132) 위에 배치되는 사각 형상의 탑부재(134)를 포함한다. 본 실시예에서, 베이스부재(132)와 탑부재(134)는 물리적으로 분리된 것을 도시하였으나, 일체형으로 구성될 수도 있다.
베이스부재(132)는, 사각 형상의 제1 플랫부(132a), 제1 플랫부(132a)의 중심영역에 형성된 사각 형상의 지지홀(132b), 제1 플랫부(132a)의 모서리 영역에 형성된 원형상의 플랫홀(132c)을 포함한다. 지지홀(132b)에는 중심 영역으로 돌출된 가이드 돌기들이 형성되어 사각 톱니 형상을 정의할 수 있다.
탑부재(134)는 사각 형상의 제2 플랫부(134a), 접시 형상의 멤브레인 스위치(134b) 및 페루프 형상의 인렛부(134c)를 포함한다. 제2 플랫부(134a)는 제1 플랫부(132a)의 상부면에 밀착된다. 멤브레인 스위치(134b)는 제2 플랫부(134a)의 중심영역에 배치되고 상향으로 돌출된다. 멤브레인 스위치(134b)의 하부 영역은 베이스부재(132)의 지지홀(132b)에 대응한다. 이에 따라 미소유체 챔버(130)의 바닥부에는 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 후퇴된 공간에는 CMOS 이미지 센서(150)와 웰 어레이(140)가 수용될 수 있다.
인렛부(134c)는 울타리 형상(fence shape)을 갖고서, 멤브레인 스위치(134b)의 일측에 상향으로 돌출되어 액체시료가 외부로 유출되는 것을 차단한다. 인렛부(134c)의 중심영역에는 베이스부재(132)의 수직 방향으로 인렛(134d)이 형성된다.
인렛부(134c)의 인렛(134d)과 멤브레인 스위치(134b)의 바닥 에지 영역을 연결하는 영역에는 마이크로 유로(134e)가 형성된다. 인렛부(134c)의 인렛(134d)에 투입된 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 통해 멤브레인 스위치(134b)의 바닥 에지 영역까지 도달된다.
탑부재(134)는 멤브레인 스위치(134b)의 타측에 관찰자 관점에서 상향으로 돌출된 그립부(134f)를 더 포함할 수 있다. 그립부(134f)는 멤브레인 스위치(134b)를 기준으로 인렛부(134c)와 마주하도록 배치된다. 그립부(134f)의 높이는 인렛부(134c)의 높이보다 높을 수 있다. 인렛부(134c)의 높이와 멤브레인 스위치(134b)의 높이는 동일하다.
이상에서 설명된 바와 같이, 미소유체 챔버(130)에서 인렛(134d)과 마이크로 유로(134e)는 서로 도통된다. 인렛(134d)을 통해 액체시료가 투입되면, 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 통해 멤브레인 스위치(134b)의 아래에 형성된 공간으로 낙하한다. 또한 멤브레인 스위치(134b)가 눌려지는 경우, 마이크로 유로(134e)를 통해 노출된 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰 각각에 액체시료가 완전 충전될 수 있다.
도 6은 도 2에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 단면도이다. 도 7은 도 6에 도시된 PCR 모듈을 개략적으로 설명하기 위한 분해 단면도이다.
도 2 내지 도 7을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 PCR 모듈은 미소유체 챔버(130), 웰 어레이(140), CMOS 포토센서 어레이(150) 및 PCB(150)을 포함한다.
미소유체 챔버(130)의 바닥 영역에는 PCB(150)에 배치된 CMOS 포토센서 어레이(150) 및 웰 어레이(140)를 수용하도록 후퇴된 형상의 공간이 형성된다. 미소유체 챔버(130)는 도 5a 내지 도 5c에서 설명하였으므로 그 설명은 생략한다.
웰 어레이(140)는 미소유체 챔버(130)의 하부 면에 부착된다. 웰 어레이(140)는 CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치되고, PCB(150)에 형성된 기판홀에 삽입되어 배치된다. 웰 어레이(140)는 복수의 마이크로 웰(142)을 포함한다. 마이크로 웰(142)의 형상이나, 치수, 개수 등은 다양할 수 있다. 복수의 마이크로 웰(142) 각각에는 분말시료 또는 액체시료와 같은 분석시료가 수용될 수 있다. 상기 분석시료는 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분이다. 즉, 상기 분석시료란 특정한 생물학적 물질, 예를 들어 단백질, DNA, RNA 등의 정량 또는 정성 분석을 위한 성분으로서, 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, DNA 또는 RNA 중합효소 등을 의미하며, 특히 실시간 중합효소연쇄반응, 정온 효소반응 또는 LCR(Ligase Chain Reaction) 등을 수행하기 위해 필요한 성분을 의미한다.
CMOS 포토센서 어레이(150)는 웰 어레이(140)의 아래에 배치되고, 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰(142)에서 수행되는 PCR 반응 산물의 영상을 실시간으로 촬영한다. CMOS 포토센서 어레이(150)는 PCB(150)에 형성된 기판홀에 삽입되어 배치된다. CMOS 포토센서 어레이(150)는 방출되는 광을 수용하여 PCR 장치에서 수행되는 PCR 반응 산물을 실시간으로 촬영한다. 즉, CMOS 포토센서 어레이(150)는 여기 광선에 의하여 다수의 프로브에서 발생하는 형광(emission light)을 검출한다. 상기한 형광의 검출은 시간 분리 방식에 의해 이루어질 수도 있고, 파장 분리 방식에 의해 이루어질 수도 있다.
상기한 시간 분리 방식의 경우, 형광물질이 여기광에 응답하여 방출광을 발현함에 따라, 형광센서 어레이 또는 어레이를 구성하는 단일 센서는 이미션 필터를 통과하는 방출광을 검출하고 검출된 방출광의 시상수를 구하여 형광을 감지한다.
상기한 파장 분리 방식의 경우, 형광물질이 여기광에 응답하여 방출광을 발현함에 따라, 형광센서 어레이 또는 어레이를 구성하는 단일 센서는 이미션 필터를 통과하는 방출광을 검출하고 검출된 방출광의 스펙트럼 분석을 통해 형광을 감지한다.
PCB(150)는 미소유체 챔버(130) 아래에 배치되고, 탑재되는 CMOS 포토센서 어레이(150)를 수납한다. PCB(150)는 미소유체 챔버(130)의 바닥 에지 영역에 접하도록 배치된다. 미소유체 챔버(130)의 바닥 에지 영역에 접하는 PCB(150)의 일부 영역에는 통풍구(vent hole)(152)가 형성된다. 통풍구(152)는 CMOS 포토센서 어레이(150)와 웰 어레이(140) 간의 공간과 도통된다.
액체시료가 인렛(134d)에 투입되면, 통풍구(152)에 연결된 진공 장치(미도시)를 통해 공기가 펌핑된다. 공기의 펌핑에 따라, 인렛(134d)에 투입된 액체시료는 미소유체 챔버(130)에 형성된 마이크로 유로(134e)를 경유하여 웰 어레이(140)의 일부 영역, 상기 일부 영역의 상부 영역 및 상기 일부 영역의 하부 영역에 제공된다.
본 실시예에서, 미소유체 챔버(130)에 형성된 마이크로 유로(134e)의 바닥을 형성하는 스티커(180)를 더 포함할 수 있다. 스티커(180)의 부착에 따라 마이크로 유로(134e)에 유입된 액체시료는 다른 영역으로 유출되지 않고 웰 어레이(140)에 온전하게 제공될 수 있다. 스티커(180)의 두께는 웰 어레이(140)의 두께와 동일할 수 있다.
본 실시예에서, 상기 PCR 모듈은 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰(142) 각각에 수용된 프로브를 향해 여기 광선(excitation light)을 조사하도록 배치된 광 제공부(미도시)를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 광 제공부는 LED(Light Emitting Diode) 광원, 레이저 광원 등과 같이 광을 방출하는 광원을 포함할 수 있다. 광원으로부터 방출된 광은 웰 어레이(140)의 마이크로 웰(142)을 통과하거나 반사하고, 이 경우 핵산 증폭에 의해 발생하는 광신호를 CMOS 포토센서 어레이(150)가 검출할 수 있다.
본 실시예에서, 상기 PCR 모듈은 미리 결정된 파장을 갖는 광을 선택하는 역할을 수행하는 이미션 필터(미도시)를 더 포함할 수 있다. 상기 이미션 필터는 CMOS 포토센서 어레이(150) 위에 배치될 수 있다.
그러면, 이하에서, 본 발명의 실시예에 따른 디지털 실시간 PCR용 카트리지의 사용 방법을 순차적으로 나타낸 도면들을 이용하여 설명한다. 설명의 편의를 위해, 어퍼 케이스(110; 도 2에 도시됨) 및 바텀 케이스(120; 도 2에 도시됨)에 대한 도시는 생략한다.
도 8 내지 도 16은 액체시료가 웰 어레이(140)에 주입되는 과정을 나타내는 단면도이다.
도 8을 참조하면, 빈 상태의 PCR 모듈을 평평한 위치에 배치한다.
도 9을 참조하면, 액체시료를 미소유체 챔버(130)의 인렛(134d)에 피펫한다. 인렛(134d)에 피펫되는 액체시료의 양은 웰 어레이(140)와 미소유체 챔버(130) 사이의 공간 및 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰(142)에 채워질 수 있는 양인 것이 바람직하다. 인렛(134d)에 피펫된 액체시료는 마이크로 유로(134e; 도 3b에 도시됨)에 존재하는 공기의 저항에 의해 마이크로 유로(134e)에 흐르지 못한다.
도 10, 도 11, 도 12 및 도 13을 참조하면, 인렛(134e)에 액체시료가 피펫된 후 통풍구(152)에 연결된 진공 장치(미도시)로 음압을 형성한다.
이에 따라, 공기는 통풍구(152)를 통해 펌핑되고, 인렛(134e)에 피펫된 액체시료는 마이크로 유로(134e)를 따라 웰 어레이(140)에 제공된다. 웰 어레이(140)에 제공된 액체시료는 마이크로 유로(134e)의 종단부에 근접한 마이크로 웰(142)을 통해 CMOS 포토센서 어레이(150) 위까지 도달한다. 이러한 진공 장치의 펌핑을 통해 복수의 마이크로 웰에 액체시료가 보다 빠르게 제공될 수 있다. 또한, 진공 장치의 펌핑을 통해 웰 어레이의 코너나 에지 영역에 존재할 수 있는 공기를 보다 용이하게 제거할 수 있다.
도 14, 도 15 및 도 16을 참조하면, 통풍구(152)에 연결된 진공 장치는 작동이 정지된다. 상기 진공 장치에 의한 음압이 해소됨에 따라, 웰 어레이(140)의 하부 공간에 도달된 액체시료는 모세관 힘에 의해 웰 어레이(140)의 상부 공간까지 점진적으로 끌어 올려진다.
이에 따라, 액체시료는 웰 어레이(140)와 미소유체 챔버(130) 사이의 공간 및 웰 어레이(140)의 복수의 마이크로 웰(142)에 채워진다.
도 17, 도 18, 도 19, 도 20 및 도 21을 참조하면, 사용자의 가압 또는 기계류의 가압에 따라 어퍼 케이스(110)의 중심 영역에 배치된 윈도우 부재가 눌려지면, 복수의 마이크로 웰(142) 각각에 채워진 액체시료를 갖는 웰 어레이(140)는 CMOS 포토센서 어레이(150)에 눌려진다.
이에 따라, 웰 어레이(140)의 코너나 에지 영역에 에어 포켓이 생성되는 것을 차단할 수 있다. 상기 에어포켓은 PCR 과정 중의 온도변화에 의해 팽창하거나 수축하여 시험결과에 오류가 발생한다. 하지만, 본 발명에 따르면 진공 장치의 펌핑을 통해 PCR 용액을 이동시키고 그 용액이 반응공간을 채울 때, 반응 공간인 웰 어레이의 코너나 에지 영역에서 에어 포켓의 생성이 차단되므로 PCR 시험결과에서 에어포켓에 의한 시험결과에 오류가 발생되는 것을 방지할 수 있다. 또한 CMOS 포토센서 어레이 위에 웰 어레이가 위치하므로 실시간 PCR 반응을 측정할 수 있다.
이상에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따르면, PCR 모듈의 웰 어레이에 시약이 내장된 상태로 출시되기 때문에, 시약을 셋팅하기 위한 별도의 절차가 불필요하여 오염가능성이 획기적으로 저하되고 검사 준비를 위한 별도의 절차가 필요하지 않다.
또한 디지털 실시간 PCR의 경우, 반응 공간인 웰 어레이의 복수의 마이크로 웰의 크기가 매우 작고 그 숫자가 매우 많더라도 반응 공간들 각각에 시료를 투입하는 것이 가능하다.
또한 시료가 웰 어레이의 코너나 에지 영역까지 주입되어, 반응 공간인 웰 어레이의 코너나 에지 영역에 에어포켓이 생성되는 것이 방지되고, 시험결과의 신뢰성이 향상된다.
이하에서는, 상술된, 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는, 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 대해서 설명한다.
도 22에 도시된 바와 같이, 본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은,
상기 미소유체 챔버의 상기 분석대상 시료를 상기 복수의 분획 각각에 주입하는 시료 주입 단계(S10);
상기 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 상기 CMOS 포토센서 어레이를 통해 실시간으로 촬영하여 원시 데이터를 획득하는 원시 데이터 획득 단계(S20);
상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대한 복수의 Ct(cycle threshold) 값을 추출하는 Ct 추출 단계(S30);
상기 복수의 Ct 값을 근거로 상기 복수 분획 각각에 대한 복수의 타겟 수를 산출하는 개별 분획 타겟 수 산출 단계(S40); 및
상기 복수의 타겟 수를 근거로 상기 분석대상 시료에서의 타켓 농도를 산출하는 최종 산출 단계(S50)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 시료 주입 단계(S10)에서, 상기 미소유체 챔버는 PDMS(polydimethylsiloxane) 소재로 마련되는 것일 수 있다. 복수의 분획은 상술된 복수의 마이크로 웰(142)에 대응할 수 있다. 즉, 하나의 분획은 하나의 마이크로 웰일 수 있다. 분석대상 시료는 상술된 액체시료일 수 있다. 상기 도 7 내지 도 21에 도시된 바와 같이, 상기 시료 주입 단계(S10)는 상술된 과정들을 거쳐 분석대상 시료는 복수의 분획에 주입될 수 있다. 이때, 엠프티웰 알고리즘을 통해 상기 복수의 분획에 분석대상 시료가 주입이 완료됨을 확인할 수 있다. 분석대상 시료가 도달함이 확인된 이후부터 획득된 이미지를 원시 데이터로서 활용될 수 있다.
즉, 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)는 모든 상기 복수의 분획에 상기 분석대상 시료가 채워짐을 확인한 후 수행되고, 상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 복수의 분획에 대한 이미지를 상기 원시 데이터로서 획득하는 것일 수 있다.
상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 원시 데이터는 적어도 사이클 당 1회 이상 수집되는 것일 수 있다. 사이클은 변성(Denaturation), 결합(Annealing), 신장(Elongation) 단계를 반복하기 위해 제공되는 온도컨트롤 시간 주기일 있다.
상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 컨투어(contour) 알고리즘를 통해 분획과 분획 간의 영역을 구분할 수 있다. 즉, 컨투어 알고리즘를 통해 마이크로 웰과 마이크로 웰 사이의 벽을 구분할 수 있다.
상기 Ct 추출 단계(S30)에서, 복수의 분획 각각에 대한 이미지 영역의 색변수를 추출하여 형광 세기 값을 산출할 수 있다. 형광 세기 값은 시계열(사이클 수) 데이터로 획득될 수 있다. 즉, 복수의 분획 각각에 대한 형광 세기 값은 실시간 데이터로(사이클 주기마다) 획득될 수 있다. 색변수는 명도, 채도, 색상, 대비, 컬러 코드 중 적어도 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 분획 이미지를 보색 이미지로 가공하고, 각 픽셀에 대비 값을 부여하여 색변수로 추출할 수 있다. 다른 예를 들어, 각 픽셀의 채도 값을 색변수로 추출할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 각 픽셀에 명도 값, 채도 값, 색상 값, 대비 값을 추출하고 각 변수에 독립적인 가중치를 둔 선형 함수 값을 색변수로 추출할 수 있다.
상기 Ct 추출 단계(S30)에서, 복수의 분획 각각에 대해서 형광 세기를 종속 변수로 하고, 시간(사이클 수)을 독립 변수로 하는 형광 세기 함수가 획득될 수 있다. 상기 형광 세기 함수는 원시 데이터로부터 추출되는 것일 수 있다. Ct 값은 형광 세기 함수를 시간(또는 사이클 수)으로 2차 미분한 값이 최대인 지점(시간 또는 사이클 수 값)일 수 있다. 형광 세기 함수는 피팅 함수일 수 있다.
상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서, 타겟 수는 분석대상 시료에서의 타겟 유전자의 카피 수일 수 있다. 상기 복수 분획 각각에 대한 상기 복수의 타겟 수 각각은, 상기 수학식 1로 산출되는 것일 수 있다.
[수학식 1]
Ni는 i번째 분획에서의 타겟 수이다.
Cti는 i번째 분획의 Ct 값이다.
Ctref는 Ct를 측정하기 위해 필요한 앰플리콘(amplicon) 수, 프로브의 형광 효율 중 적어도 하나 이상에 의해서 결정되는 것이다.
a는 상수로서 PCR 효율에 의해서 결정되는 상수이다. PCR 효율은 PCR 반응에 의해 타겟 유전자가 증폭되는 비율을 나타내는 것일 수 있다. 예를 들어, PCR 효율 100%는 PCR 반응 사이클 마다 타겟이 2배씩 증폭되는 것을 의미하고, PCR 효율 90%는 PCR 반응 사이클 마다 타겟이 1.8배씩 증폭되는 것을 의미한다. a와 PCR 효율 Ep간 하기 수학식 4와 같을 수 있다.
[수학식 4]
,
일반적으로 PCR 효율은 90% 내지 110%로 설정될 수 있으며, 따라서 a는 -3.103 내지 -3.587일 수 있다.
상기의 수학식 1은 하기의 수학식 5로부터 도출되는 것일 수 있다.
[수학식 5]
,
상기 수학식 5의 좌변은 상기 Ct 추출 단계(S30)에서 획득된 값일 수 있다.
본 발명의 디지털 실시간 PCR 분석 방법은 표준 시료를 통해 Ctref의 값을 획득하여 종래에 분석이 불가능한 초고농도의 시료에 대해서도 분석이 가능할 수 있다.
상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서, 상기 Ctref는 하기 수학식 2로 산출되는 것일 수 있다.
[수학식 2]
,
Vunit는 한 분획의 부피이다. 예를 들어, 하나의 마이크로 웰의 용적을 의미할 수 있으며, 실질적으로는 복수의 마이크로 웰의 평균 용적일 수 있다.
Ct0는 표준 시료로부터 획득되는 Ct값일 수 있다. 구체적으로, Ct0는 복수의 분획 전체에 최초 타겟 수가 1일 때 PCR 증폭하여 얻어지는 Ct 값이다. 예를 들어, 분획 수가 20,000이라면 20,000 X Vunit의 부피에 타겟 수가 1일 때 PCR 증폭하여 얻어지는 Ct 값일 수 있다. Ct0는 알려진 농도의 표준 시료를 단계 희석 후 측정하여 획득되는 값이다.
상기 표준 시료의 농도는 107 copies/rxn 내지 108 copies/rxn 인 것일 수 있다. 상기 표준 시료는 국제표준물질 및 자체제작표준물질일 수 있다. 예를 들어, 표준 시료는 WHO biological reference materials(WHO international standards and reference materials)일 수 있다.
상기 최종 산출 단계(S50)에서, 상기 분석대상 시료의 농도 Con은 하기 수학식 3으로 산출되는 것일 수 있다.
[수학식 3]
,
n은 상기 복수의 분획의 총 개수이다.
상기 최종 산출 단계(S50)에서, 상기 Con 값을 근거로 상기 분석대상 시료의 음성 또는 양성을 판단하는 것일 수 있다.
이상에서 본 발명에 따른 실시예들이 설명되었으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 분야에서 통상적 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 범위의 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 다음의 특허청구범위에 의해서 정해져야 할 것이다.
110 : 어퍼 케이스 120 : 바텀 케이스
130 : 미소유체 챔버 132 : 베이스부재
134 : 탑부재 132a : 제1 플랫부
132b : 지지홀 132c : 플랫홀
134a : 제2 플랫부 134b : 멤브레인 스위치
134c : 인렛부 134d : 인렛
134e : 마이크로 유로 134f : 그립부
140 : 웰 어레이 150 : CMOS 포토센서 어레이
152 : 통풍구 160 : PCB
170 : 히터 180 : 스티커

Claims (11)

  1. 액상의 분석대상 시료가 저장되는 미소유체 챔버;
    상기 미소유체 챔버의 저면에 부착되고 상기 미소유체 챔버로부터 상기 분석대상 시료를 공급받는 웰 어레이; 및
    상기 웰 어레이의 저면에 위치하고 상기 웰 어레이에 마련되는 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 실시간으로 촬영하는 CMOS 포토센서 어레이를 포함하는 디지털 실시간 PCR용 카트리지를 이용하는 디지털 실시간 PCR 분석 방법에 있어서,
    상기 미소유체 챔버의 상기 분석대상 시료를 상기 복수의 분획 각각에 주입하는 시료 주입 단계(S10);
    상기 복수의 분획에 충진된 상기 분석대상 시료의 반응 영상을 상기 CMOS 포토센서 어레이를 통해 실시간으로 촬영하여 원시 데이터를 획득하는 원시 데이터 획득 단계(S20);
    상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대한 복수의 Ct(cycle threshold) 값을 추출하는 Ct 추출 단계(S30);
    상기 복수의 Ct 값을 근거로 상기 복수 분획 각각에 대한 복수의 타겟 수를 산출하는 개별 분획 타겟 수 산출 단계(S40); 및
    상기 복수의 타겟 수를 근거로 상기 분석대상 시료에서의 타켓 농도를 산출하는 최종 산출 단계(S50)를 포함하는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시료 주입 단계(S10)에서,
    상기 미소유체 챔버는 PDMS(polydimethylsiloxane) 소재로 마련되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 시료 주입 단계(S10)에서,
    상기 복수의 분획 각각에 상기 분석대상 시료가 주입되면 상기 웰 어레이를 상기 CMOS 포토센서 어레이에 완전히 밀착시키는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 원시 데이터 획득 단계(S20)는 모든 상기 복수의 분획에 상기 분석대상 시료가 채워짐을 확인한 후 수행되고,
    상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서, 상기 복수의 분획에 대한 이미지를 상기 원시 데이터로서 획득하는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 원시 데이터 획득 단계(S20)에서,
    상기 원시 데이터는 적어도 사이클 당 1회 이상 수집되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 Ct 추출 단계(S30)에서,
    상기 원시 데이터로부터 상기 복수의 분획 각각에 대해서 형광 세기를 종속 변수로 하고, 시간 또는 사이클 수를 독립 변수로 하는 형광 세기 함수가 획득되고,
    상기 Ct 값은 형광 세기 함수를 2차 미분한 값이 최대인 시간 또는 사이클 수 값인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서,
    상기 복수 분획 각각에 대한 상기 복수의 타겟 수 각각은,
    상기 수학식 1로 산출되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법:
    [수학식 1]
    ,
    Ni는 i번째 분획에서의 타겟 수이고,
    Cti는 i번째 분획의 Ct 값이며,
    Ctref는 Ct를 측정하기 위해 필요한 앰플리콘(amplicon) 수, 프로브의 형광 효율 중 적어도 하나 이상에 의해서 결정되는 것이고,
    a는 상수로서 PCR 효율에 의해서 결정되는 상수이다.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 타겟 수 산출 단계(S40)에서,
    상기 Ctref는 하기 수학식 2로 산출되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법:
    [수학식 2]

    Vunit는 한 분획의 부피이고,
    Ct0는 표준 시료로부터 획득되는 Ct값이다.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 표준 시료의 농도는 107 copies/rxn 내지 108 copies/rxn 인 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 최종 산출 단계(S50)에서,
    상기 분석대상 시료의 농도 Con은 하기 수학식 3으로 산출되는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법:
    [수학식 3]
    ,
    n은 상기 복수의 분획의 총 개수이다.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 최종 산출 단계(S50)에서,
    상기 Con 값을 근거로 상기 분석대상 시료의 음성 또는 양성을 판단하는 것인 디지털 실시간 PCR 분석 방법.
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