JP2000221192A - 被検体、その相互作用又は反応動力学を定量的又は定性的に測定する方法及びサンプルキャリア - Google Patents

被検体、その相互作用又は反応動力学を定量的又は定性的に測定する方法及びサンプルキャリア

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 少なくとも２つの異なる相を有する系内の被
検体又はその相互作用又は反応動力学を定量的又は定性
的に測定する方法並びに１つ以上のウエルを有する、特
に本発明による方法で使用するためのサンプルキャリヤ
を提供する。 【解決手段】 本発明の方法によれば、相の少なくとも
１つから少なくとも１つの測定信号を取り出すステップ
を有し、その場合異なる相は測定信号を取り出す際に並
列して存在しかつ各測定信号は少なくとも２つの相の１
つに帰属することを特徴とする。前記サンプルキャリヤ
は、１つ以上のウエルの少なくとも領域内のサンプルキ
ャリヤの少なくとも一部が蛍光クエンチング物質で被覆
されていることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、少なくとも２つの
相からなる系内での被検体の定量的測定方法に関する。
付加的に、本発明は、本発明を構成する方法を実施する
ために特に適当である試験サンプルキャリヤに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来の技術は、特定の分析サンプル内の
被検体の定量的測定のための多数の方法を記載してい
る。種々の検出反応は、異なった原理を基礎としてい
る。これらは分析すべき被検体の表示可能な物質への変
換を含み、この場合には、例えば着色化合物が生成され
かつ着色度合いが被検体の量の測定の問題となる。その
他の検出方法は、被検体と結合パートナーとの間の特異
的相互作用を基礎とする。これらは例えば抗原と抗体、
リガンドとその関連レセプタの間の特異的相互作用又は
相補的核酸分子のハイブリダイゼーションを利用する方
法を含む。このタイプの検出方法又はアッセイは、一般
にアフィニティーアッセイとも記載される。それらが基
礎とするアフィニティー反応では、被検体（例えばレセ
プタ、抗体）及び被検体（リガンド、抗原）に対して特
異的な結合パートナーから形成される化学量論的に規定
されるが、但し共有結合でない複合体の生成が行われ
る。しばしば、生体分子は蛋白質と同様に、これらの反
応に参加する。しかしまた、低分子物質、例えば低分子
レセプタリガンドと高分子物質、例えばレセプタとの間
の反応も存在するができる。このアフィニティーアッセ
イの特殊な変法は、抗体と抗原の間の特殊な相互作用を
利用するイムノアアッセイを基礎としている。核酸のレ
ベルで、特異的相互作用は、相互に相補的配列セグメン
トによって２つの異なる核酸分子間で行うことができ
る。相補的配列のハイブリダイゼーションによって、２
本鎖の核酸分子の形成が生ずる。
【０００３】引用したアッセイは、多数の技術分野に適
用される。これらは臨床分析／診断、環境分析、ゲノム
分析、活性内容物試験及びさらに遺伝子発現研究及び遺
伝子バンクスクリーニングを含む。しばしば数百のサン
プルが並列して単一サンプルキャリヤで試験される。い
わゆる“マイクロ・アレイ技術は”、今日では“ハイス
ループット・スクリーニング（high-throuhput screeni
ngs）”において重要性を増大している。
【０００４】被検体の化学的変換を基礎としたアッセイ
と比較した場合のアフィニティー反応を基礎としたアッ
セイの利点は、サンプルのより精巧な調製が一般に必要
とされないことにある。不所望の不純物からの被検体分
離は、むしろ適当な結合パートナーとの特異的相互作用
によって達成され、その際結合パートナーはいわば分析
サンプルから所望される被検体を慎重に選択する。
【０００５】イムノアッセイは、抗体及び抗原の特異的
相互作用を基礎とするアフィニティーの特に広範囲の変
法を構成する。いわゆるＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Im
muno-Sorbent Assay：固相酵素免疫検定法）の場合に
は、反応体の１つ（すなわち、被検体又は関連した結合
パートナーのいずれか）は、しばしばマイクロタイター
プレートを構成するサンプルキャリヤ内に固定された形
で存在する。該試験の過程において、該試験系の１つ以
上の成分は、固定された成分と複合体を形成する。形成
された複合体の量は、サンプル内の被検体の濃度の測定
値として提供される。この試験フォーマットの２つの一
般的変法は、“サンドイッチアッセイ”及び“競合アッ
セイ”から成り立つ。サンドイッチアッセイでは、例え
ば、被検体は２つのさらなる成分（しばしば２つの異な
った抗体）により複合体化されるので、サンプルキャリ
ヤの表面に三重複合体が生じる。競合アッセイでは、被
検体と標識成分、しばしば標識を有する被検体が、制限
された数の結合部位に対して競合する。
【０００６】不均質相における標準イムノアッセイはし
ばしば以下のプロセスからなる： −固体サンプルキャリヤの特異化； −分析サンプル及び検出試薬の投与； −結合平衡に達するまで待機； −結合しなかったセグメントの洗い流し； −結合したセグメントの測定。
【０００７】適応可能であれば、これらのステップを複
合プロトコルで数回繰り返す。全プロセスの終了時点
で、次に手順の過程でサンプルキャリヤに結合された全
材料の検出を行う。このためには、着色酵素反応、電気
化学的発光、蛍光、放射能等を信号トランスミッタとし
て使用することができる。
【０００８】若干のアッセイフォーマットは、例えばＦ
ＰＩＡ（Fluoresence Polarisationimmuno-assay：蛍光
偏光イムノアッセイ）のためには均質相内で作業する
が、しかし、これは多くの見地において複雑であるか又
は不均質相内でのアッセイより修正の過程で融通性が少
ない。
【０００９】引用した全てのアッセイに特に共通である
のは、測定する前に結合されなかった標識（活性、信号
測定）と結合した標識の信号分離を行わねばならないこ
とである。このことは一般に測定（測定信号を取り出
す）前に１回以上サンプルキャリヤを洗浄処理すること
により達成される。しかしながら、慣用の先行技術では
絶対的に必要とされるこれらの洗浄処理は欠点を伴う。
例えばマイクロタイタープレート又はナノタイタープレ
ートで起こるような、小さいスペース内で多数の検出を
行うことができるサンプルでは、“トランスファー”の
問題が存在する。即ち、サンプル活性が洗浄によって一
方のサンプル容量から他方のサンプル容量に移動せしめ
られる。非結合標識と結合標識（又は活性）の物理的測
定を行う方法のもう１つの欠点は、結合プロセスの時間
をずらした観察、ひいては相互作用又は反応動力学の試
験が不可能であるという事実からなる。
【００１０】結合した活性と結合しなかった活性の分離
のための前記に引用した洗浄の他に、フィルタストリッ
プを用いたアッセイでは、分離はフィルタにより形成さ
れた多孔質固相内への液相の拡散により結合しなかった
活性と結合した活性との間で行われる。このタイプのア
ッセイは、一般に単一サンプルのためにセットアップさ
れる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、もは
や前記の従来の技術の欠点を示さない、特に従来の技術
で必要とされた洗浄を回避する、被検体又はその反応又
は相互作用の定性的又は定量的測定方法を提供するとい
う技術的課題を解決することである。
【００１２】もう１つの課題は、マイクロアレイ装置内
で１μｌ未満のサンプル容量を分析することができる、
前記に引用したタイプの方法を提供することである。
【００１３】また、もう１つの課題は、本発明を構成す
る方法を実施するために適当であるサンプルキャリヤを
提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】前記の技術的課題は、本
発明により、少なくとも２つの異なる相を有する系内の
被検体又はその相互作用又は反応動力学を定量的又は定
性的に測定する方法において、相の少なくとも１つから
少なくとも１つの測定信号を取り出すステップを有し、
その場合異なる相は測定信号を取り出す際に並列して存
在しかつ各測定信号は少なくとも２つの相の１つに帰属
することにより解決される。
【００１５】本発明を構成する前記方法は、少なくとも
１つのこのような測定信号を取り出す前に結合しなかっ
た標識と結合した標識の間の物理的分離を行うことなく
被検体の前記測定を可能にする。
【００１６】該方法は、サンプル内の被検体の存在の定
性的検出のために適当である。さらに、化学反応の展開
において又は伴って結合平衡に達した際に測定信号を時
間的に連続して取り出すことにより、異なるプロセス動
力学を確立することができる。しかしながら、該方法は
むしろ分析サンプル内の定量的測定のために役立つ。
【００１７】一般的プロセスシナリオは、以下のように
記載することができる：分析すべきサンプルを、例えば
一例として被検体のための特異的結合パートナーで被覆
したナノタイタープレートのウエル内に投与した後に、
競合アッセイの場合には、規定量の標識被検体を加え
る。結合平衡に達した後に、少なくとも１つの測定信号
を液相の部分容量から取り出す。この際に、固相によっ
て発生した信号は実質的に取り出さない。１つの相、本
実施例の場合には：液相から取り出した測定信号を、次
いで該相内に含有される被検体の量の計算のためかつ最
終的には調査中のサンプル内に存在する被検体の量の測
定のために供給する。得られた測定信号の定量的評価
は、一定に保った測定条件下で、提供されかつ規定され
た被検体濃度の信号が計算されている、予め作成したキ
ャリブレーション曲線で行う。
【００１８】定性的分析も、この方法で可能である。例
えば、被検体をいわゆるサンドイッチフォーマットで検
出し、次いで例えば標識した第２の抗体だけを、被検体
が存在すれば固相内の標識されていない第１の標識しな
かった抗体に結合させることができる。従って、固相内
の信号の検出は、被検体がサンプル内に存在しなければ
ならないことを意味する。
【００１９】このようにして、例えば液相内の測定信号
の取り出しを時間シーケンスを介して追跡することがで
きる動力学を最終的に計算することができる。時間にわ
たる液相内の信号の修正は、調査中の反応又は相互作用
の動力学の尺度である。
【００２０】相の１つの特異的定量的単位の測定は、こ
の方法では測定装置の相応する調整により保証すること
ができる。従って、例えば分析サンプル内の蛍光標識を
刺激するために使用することができるレーザは、相、例
えば液相の特定の定量的セグメントだけがレーザビーム
によってヒットされかつビームの軌跡内の分子だけが励
起されて蛍光を発生するようにアレンジすることができ
る。この方法で得られた信号を、次いで存在する被検体
濃度の計算のために利用することができる。
【００２１】特に好ましい実施態様においては、該方法
をアフィニティーアッセイとして実施する。その場合に
は、被検体と１つの結合パートナーとの間の特異的相互
作用を利用する。被検体及び関連した結合パートナーの
例は、被検体としてのリガンド及び関連した結合パート
ナーとしてのレセプタ、被検体としての核酸及び結合パ
ートナーとしての相補的核酸、被検体としての基質及び
関連した結合パートナーとしての酵素、被検体としての
抗原及び相応する結合パートナーとしての抗体である。
アフィニティー分析の一般的方法の詳細な概要は、C.
P. Price & D. J. Newman (editors), “Principles an
d Practice of Immunoassay”, StocktonPress, New Yo
rk, 1991に記載されている。
【００２２】もう１つの好ましい実施態様では、該方法
をイムノアフィニティーアッセイとして実施する。この
種のアッセイでは、被検体の検出のために、抗原と抗体
の間の特異的相互作用を利用する。被検体の特異的検出
のための抗体としては、いわゆるモノクローナル並びに
ポリクローナル抗体を使用することができる。抗原とし
て役立つ分析物もまた抗体を構成することができる。
【００２３】もう１つの好ましい実施態様では、検出反
応が起こる容量が１μｌ以下であり、この際該容量は好
ましくは約５０〜１００ｎｌである。検出反応の容量
は、添加される試薬を含む利用されるサンプル容量に相
応する。従来の技術においては、このような小サンプル
容量を、特に該サンプルがナノタイタープレートにおけ
るようにマイクロアレイ内になければ、前記の測定の１
つで測定することができる方法は公知でない。
【００２４】さらに別の好ましい実施態様では、該方法
を競合アッセイとして実施する。この場合には、検出す
べき被検体を、制限された数の結合部位のために、一般
に標識を有する構造的に類似した化合物と競合させる。
被検体と競合する添加されかつ標識した物質は一定の量
で投与されるので、被検体により占有される結像部位の
数は被検体濃度において被検体によて占有される結合部
位の数に依存する。このことは、サンプル内に存在する
被検体が多ければ、標識した競合被検体により占有され
る結合部位は少ないことを意味する。このことはまた、
被検体濃度が上昇する程、液相内の結合されていない、
標識した競合体の量は増大することを意味する。このこ
とは結果として、サンプル内の被検体の容量の増加に伴
い増大する液相からの測定信号を生じる。競合アッセイ
は、従来の技術から当業者に長年来知られている。
【００２５】しかしながら、該方法は選択的に、サンド
イッチアッセイとして実施することができる。その際に
は、例えば、測定すべき被検体に２つの異なる抗体を与
える。この場合、第１の抗体は固相に結合させ、かつ第
２の抗体は標識を持ちかつ分析サンプルに投与する。相
互作用が完了すると、第１の抗体、被検体及び標識した
第２の抗体からなる三重複合体が形成される。この場合
には、固相内の信号は被検体濃度が上昇するに伴い増大
し、一方液相内の標識した第２の抗体濃度は被検体濃度
が上昇するに伴い低下する。液相の容量要素（volume e
lement）を検出において測定すれば、その際には信号強
度の減少が被検体濃度の上昇に伴い観察される。サンド
イッチアッセイ原理は、従来の技術から当業者によく知
られている。
【００２６】測定信号は、好ましくは被検体又は結合パ
ートナー（反応体）の成分として存在する標識から得ら
れる。適当な標識化は、従来の技術から当業者に知られ
ている。これらは放射能標識、例えば蛍光マーカーのよ
る標識化又は酵素活性での標識化のような放射線励起に
より発生される標識を含む。特に好ましい標識として
は、蛍光基が問題の分子内に導入される。この場合に
は、蛍光は例えばレーザビームにより励起される標識分
子を有することによって発生させることができる。この
技術もまた当業者に従来の技術から良く知られている。
【００２７】別の好ましい実施態様では、該方法を実施
する系が、固相を構成する第１の相及び液相を構成する
第２の相からなる。この場合には、固相は一般に検出す
べき被検体のための特異的結合パートナーを有し、一方
液相は被検体及び検出試薬を含有するサンプルによって
形成される。しかしながら、別の選択性において、第２
の相は気相であてもよく、一方第１の相は固相を構成す
る。最後に、相の組合せは、液相と気相との組合せであ
ってもよい。
【００２８】別の好ましい実施態様では、固相を固体サ
ンプルキャリヤ内のウエルの壁（walling）により形成
する。そうすれば、固体サンプルキャリヤを、単一のサ
ンプルを吸収するためにのみ好適であるように作ること
ができる。しかし、サンプルキャリヤは、数個のサンプ
ルを同時に吸収することができるように形成することも
できる。
【００２９】特に好ましい実施態様では、固体サンプル
キャリヤは市販のタイプのマイクロタイタープレートで
ある。ナノタイタープレートをサンプルキャリヤとして
使用するのが特に好ましい。それというのも、これは小
さいスペースでサンプルを吸収するための多数のウエル
を有するからである。固体サンプルキャリヤ内のウエル
は、異なった形状を有していてもよい。これらは正方形
又は円筒形の形状、角錐台又は円錐台の形状を含む。特
に好ましいのは、付加的に開口面が底面より小さい形状
である；これらは例としてはネガチブ切頭（negative t
runcated）角錐体及びネガチブ切頭円錘体を含む。この
実施態様では、固体キャリヤに結合された標識の部分で
の迷光／蛍光から測定結果の緩衝（mitigation）が、底
面が開口面よりも小さい相応する実施態様（例えばポジ
チブ切頭（positive truncated）角錐体及びポジチブ切
頭円錘体）と比較すると最小にされる。
【００３０】別の好ましい実施態様では、相に結合され
た標識からの緩衝効果をクエンチング物質を含有する相
により減少させる。このクエンチング物質は、クエンチ
ング物質に直接的に近接して配置された分子によって発
生された信号を吸収する。好ましくは、該クエンチング
物質は、系内に存在する分子がレーザにより励起される
と、得られた蛍光をクエンチするするように選択する。
好ましくは、該物質は、短い距離、好ましくは１００ｎ
ｍ以内の蛍光をクエンチする。好ましい物質としては、
金又は銀のような金属、並びに黒鉛又は“クエンチング
特性”を有する染料が考えられる。
【００３１】一例としては、固相はこのようなクエンチ
ング物質を含有することができる。この目的のために
は、サンプルキャリヤをクエンチング物質で被覆するこ
とができる。このことは溶液内に位置する分子の蛍光の
みを記録すべき場合には、特に有利である。
【００３２】存在する単一の発生相の１つだけからの測
定信号を受信することは、例えば立体的にずれた測定に
よって達成することができる。これはサンプルが位置す
る全ウエルを検知するレーザビームを用いることによっ
て行うことができ、かつ、その解像能に依存して、数個
の測定信号を得ることができる。個々の測定信号は各位
置で生じる蛍光の強度を表しかつ従って被検体の局所的
濃度の測定のために使用することができる。
【００３３】しかし基本的には、例えば液相の規定の容
量要素に相応する単一の測定信号を取り出せば十分であ
る。
【００３４】このことに加えて、例えばレーザビームで
サンプルを検知することにより相の数個の信号を取り出
すことにより、このような測定信号を平均化することに
より統計値を改善することができ、ひいては被検体の測
定又は相互作用もしくは反応動力学を被検体の測定にお
けるエラーと同様に改善することができるか、又は相互
作用もしくは反応動力学を減少させることができる。
【００３５】別の好ましい実施態様によれば、クエンチ
ング物質を、１つの相の放射が殆ど完全に抑圧されるよ
うに提供することができる。この実施態様によれば、相
応する相に帰属するために、少なくとも１つの測定信号
の立体的にずらした取り出しを行うことは不必要であ
る。例えば、サンプルキャリヤのウエルの壁及び／又は
床をクエンチング物質で被覆すれば、壁に結合された標
識から生じる蛍光を抑制し、かつ液相内の標識から由来
する蛍光を、空間的ずらしを必要とせずに取り出すこと
ができる。１つの好ましい実施態様では、４０μｍ以
下、好ましくは約２０μｍの直径を有するスポットを照
射しかつこ容量セグメントの発生した信号のみを測定す
る。
【００３６】サンプル容量セグメントの照射は、発生さ
れる信号が、レーザによって励起された蛍光団を有する
分子によって放出される蛍光であるレーザで実施するの
が好ましい。
【００３７】本発明によれば、１つ以上のウエルを有
し、かつサンプルキャリヤの少なくとも一部が蛍光クエ
ンチング物質で被覆されている１つ以上のウエルの少な
くとも領域内にあることを特徴とするサンプルキャリヤ
が提供される。
【００３８】このサンプルキャリヤは、１つの相の蛍光
放射を抑圧するために特に前記の方法において使用する
ことができる。もちろん、このようなサンプルキャリヤ
の適用は、前記の方法には制限されず、むしろ、このよ
うなサンプルキャリヤは、迷放射を減少させるために特
殊な領域において蛍光がクエンチされることを必要とす
る別の方法で使用することもできる。
【００３９】有利な実施態様によれば、蛍光クエンチン
グ物質は、例として金又は銀のような金属からなってい
てもよい。必要であれば、この金属はドーピングされて
いてもよい。
【００４０】単数又は複数のウエルは、有利には、床領
域及び／又は壁が要求に従って蛍光クエンチング物質で
被覆されていてもよい。
【００４１】さらに、方法と関連して既に記載した利点
は、ウエルの異なる形状により達成することができる。
従って、サンプルキャリヤ内に、正方形、円筒形、角錐
台、円錐台の形状を有するウエルを準備することができ
る。前記の述べたように、開口面が底面よりも小さいウ
エルを準備するのが特に有利である。これらは特に、ネ
ガチブの角錐台又はネガチブの円錐台の形状を有する。
【００４２】別の有利な実施態様によれば、サンプルキ
ャリヤは、マイクロタイタープレート、好ましくはナノ
タイタープレートの形状で成形されている。この方式
で、最小限の時間で多数のサンプルを分析することが可
能になる。
【００４３】
【実施例】今や以下に、本発明の有利な実施例及び本発
明を構成する方法の実施例を、添付図面を参照して説明
する。
【００４４】１．本方法を実施するための成分 ａ）サンプルキャリヤ 例えば、１μｌ以下の液体容量を吸収することができる
１個以上のウエルを有するプレナーサンプルキャリヤを
使用することができる。その表面は、短い距離（１００
ｎｍ未満）で蛍光を著しく減少させる（クエンチングす
る）物質で被覆されている。クエンチング物質は、好ま
しくは金属、金及び／又は銀であり、しかし黒鉛又はク
エンチング特性を有する染料であってもよい。さらに、
サンプルキャリヤの表面は、被検体のための結合パート
ナーで被覆されている。結合パートナーは、抗原又は抗
体であってよい。結合パートナーは、吸収により又はサ
ンプルキャリヤに対する共有結合により固定されていて
もよい。適当な被覆手順は、当業者に知られている。
【００４５】ｂ）試薬 １つの必須成分は、被検体に対して特異的に結合するこ
とができる、被検体（例えば抗体）に対して特異的な蛍
光標識したパートナーによって構成される。元来、結合
パートナーはサンプル内の遊離被検体並びにサンプルキ
ャリヤ上の固定された被検体に対して結合するための部
位に存在する。蛍光標識した抗体を操作するための方法
は、当業者に知られている。
【００４６】さらなる試薬として、サンプルキャリヤに
対する固体成分、即ち被検体又は結合パートナーの非特
異的結合を阻止もしくは減少させることができる物質を
使用することができる。この目的のためには、例えば蛋
白質又はデタージェントを挙げることができる。サンプ
ルキャリヤに対する非特異的結合を抑制するために好適
な物質は、当業者に知られている。
【００４７】ｃ）選別デバイス ウエル内に存在する蛍光標識した分子の刺激を行いかつ
放出された蛍光の検出を行うためにレンズデバイスを使
用する。この場合、蛍光は立体的にずらされた任意のウ
エルの内部を励起及び／又は検出することができる。こ
の方法では、溶液内に存在する蛍光団の選択的測定が、
結合した蛍光団と遊離蛍光団の選別を行うことなく可能
である。選択的測定は、測定デバイスの種々の変更によ
り実施することができる。溶液内の蛍光団だけが励起さ
れ、一方固相内の蛍光団は励起されないような状態に刺
激レンズを調節することが可能である。選択的に、検出
レンズを変更することにより、溶液中の分子によって放
出されるような蛍光のみを記録し、一方固相結合した分
子により放出される蛍光は記録されないようにすること
が可能である。最後に、サンプルキャリヤの変更により
元来溶液内に存在する分子から由来する蛍光のみを記録
することが可能である。このことは断面がネガチブな角
錐台を示すサンプルを吸収するためのウエルにより可能
になる。もちろん、記載した選択性の組合せにより、所
望の効果を達成することもできる。
【００４８】２．競合アッセイを用いた定量的測定 液体サンプル内の溶解した被検体の定量的測定のために
は、以下のステップを実施することができる： −１つ以上のウエルが試験系成分、例えば抗体で被覆さ
れたサンプルキャリヤを準備する。この被覆は、実際の
定量的測定の実施から時間的及び立体的に分離すること
ができる。付加的に、サンプルキャリヤを異なったウエ
ル内で異なった方法で変更することができる。
【００４９】−必要とされるサンプル及び試薬を、１つ
以上のウエル内に導入する。必要であれば、次いでウエ
ルをさらなる貯蔵のために適当な化学薬品でシールこと
ができる。
【００５０】−サンプルを、被検体と結合パートナーの
間の結合平衡が達成されるまで試薬でインキュベートす
る。
【００５１】−サンプル内に存在する分子の蛍光を、実
質的に溶液内の分子が励起されるか又は表面に結合され
た分子が励起される条件下で励起又は検出を行う。場合
によりサンプルキャリヤの格子形状検知により、両者の
相内に分配された蛍光分子の連続した刺激も可能であ
る。
【００５２】−記載の競合アッセイにおいては、サンプ
ル溶液内の蛍光信号は被検体濃度と共に上昇し、一方サ
ンプルキャリヤの壁上の蛍光信号は被検体濃度が上昇す
るに伴い減少する。被検体濃度の上昇に伴う蛍光信号の
減少は、サンプルキャリヤの表面が蛍光クエンチング基
質で被覆されていれば、強化される。得られた信号は、
通常の方法で参照測定値でキャリブレーションしかつ被
検体の濃度と相関させることができる。
【００５３】３．本方法を実施するための測定デバイス 図１は、図式的に可能な測定装置を示す。このような測
定装置は、例えば米国特許第５,３８１,２２４号明細書
（Dixonによる）から公知である。この測定装置は、レ
ーザ１０、大量生産の市販ビームエクスパンダ１１、セ
ンサ又はスキャナ１２、サンプルキャリヤ１４を確保す
るための特殊に設計された試験台１３、結像レンズ１５
並びに蛍光放射を検出ための検出デバイス１６、及び、
例えば１つ以上のホトマルチプライヤからなる。付加的
に、該システムは適当なフィルタ組合せ１７を有するこ
とができる。レーザ１０による蛍光刺激は、この場合に
は、ビームエクスパンダ１１、スキャナ１２及びサンプ
ル上の、例えばダイクロイックミラーの形のビームスプ
リッタ１８を介して行われる。サンプルによって放出さ
れた蛍光放射１９ａは、反射方向で、ビームスプリッタ
１８で捕捉され、結像レンズ１５で検出デバイス１６内
に送られる。スキャナ１３の制御される調整から知られ
る、レーザビーム１９ｂの位置から、全ての光信号を、
明白にサンプルキャリヤ１４の地点、ひいては測定すべ
きサンプル又はサンプル容量に帰属させることができ
る。検出デバイス１６で得られた信号の強度は、サンプ
ル内の被検体のための定量的測定値として利用される。
【００５４】４．サンプルキャリヤの配置 使用されるサンプルキャリヤは、少なくとも１つのウエ
ルを有し、しかし一般には２個以上のウエルからなるべ
きである。この場合、サンプルキャリヤとしては、マイ
クロタイタープレート並びにナノタイタープレートの両
者を使用することができる。
【００５５】図２には、角錐台の形状のウエル２１を有
するマイクロタイタープレート２０部分図が示されてい
る。該マイクロタイタープレート２０は、例えば金及び
／又は銀からなる、蛍光クエンチング被膜２２で被覆さ
れている。クエンチング物質として金を有するサンプル
キャリヤの被覆は、真空金属化ユニット（Edwards 30
5）を用いて金の熱蒸着により実施することができる。
サンプルキャリヤをまず実験室洗浄剤（Extran, Merk）
で洗浄し、乾燥しかつ次いで金属化チャンバに入れる。
１０-6バールを越える真空で、金の５００ｎｍ〜１００
０ｎｍの被膜厚さが使用可能であることが判明した。
【００５６】図２によれば、マイクロタイタープレとの
全表面が被覆されている。このことは被膜の製造におい
て簡略化を伴う。しかしながら、マイクロタイタープレ
ートの完全な被覆は必要とされない。むしろ、特殊な分
析から発生する特殊な条件に依存して、ウエルの床２３
及び／又は壁２４のみを被覆することもできる。図２に
示されたサンプルキャリヤは、シリコン基体を異方性湿
式酸洗い（wet-pickling）のような異なる湿式酸洗い技
術でウエルの形状により酸洗しかつ該シリコン基体に引
き続き床２９を設けることにより製造される。
【００５７】図２では、さらに壁及び床に結合された蛍
光団２５が存在し、かつ溶液内の蛍光団２６が示されて
いる。
【００５８】得られる測定信号の品質にとって極めて重
要なことは、ウエルの仕上げ（fashioning）である。集
束レーザ光ソースでの立体的に制限された刺激に基づ
き、最初に溶液内の一次分子が検出される。固相に結合
された分子の蛍光刺激を減少させるために、図３の左側
の図面に示されているように、垂直な壁３２をウエル３
１内で使用することができる。このような垂直な壁は、
正方形又は円筒形に成形されたウエルで見られる。
【００５９】壁に結合された分子の蛍光刺激の殆ど完全
な排除のために、開口面３６が床面３７よりも小さい特
殊なウエルが好適である。図３の右側の図面には、例え
ばこのようなウエル３５の断面が示されている。このウ
エル３５は、角錐台又は円錐台の形状を有する。これら
の変更形状では結果として、壁に結合された分子の直接
的蛍光刺激が行われず、かつ、さらに液相内の迷光によ
り開始せしめられる残留蛍光の検出も行われない。従っ
て、この形状のウエルを用いると、液相内の分子での蛍
光が特に排他的に測定される。
【００６０】５．農薬の定量的測定 実験において、置換されたＳ−トリアジンの部類からの
農薬誘導体を測定した。このような被検体のための結合
パートナーとしては、抗体を使用した。
【００６１】ポリクローナル羊抗体を、分画化硫安沈殿
法により血清から富化しかつアフィニティーカラム（Se
phadex column、免疫源を含有）を介して単離した。
【００６２】モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養
残分（血清不含培養）から単離しかつ蛋白質Ｇカラムを
介して精製した。
【００６３】蛍光標識化のために、市販の反応性蛍光染
料（ＣＹ５−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Amersh
am-Pharmacia-Biotech）を使用した。抗体の標識化は、
製造元の仕様に基づき実施した。標識抗体をスピン透析
により精製した（Amicon Concentrators, Amico）。標
識化度を分光光度計で測定した。
【００６４】牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とハプテンの
複合体を、以下のようにして製造した：トリアジンカル
ボキシル誘導体（アトラジンカプロン酸）から、ＤＭＦ
中でジイソプロピルカルボジイミド（シグマ）及びＮ−
ヒドロキシ−スクシンイミド（シグマ）を用いて製造し
た。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）１００ｍＭ中のＢＳＡ
１ｍｇを過剰の活性エステルと配合しかつ室温で１時間
インキュベートした。複合体をスピン透析により精製し
た（Amicon Concentrator, Amico）。標識化度を分光光
度計で測定した。
【００６５】サンプルキャリヤのクエンチング物質での
被覆を、真空金属化ユニット（Edwards 305）内で金の
熱蒸着によって実施した。サンプルキャリヤを実験室清
浄剤（Extran, Merck）で清浄にし、乾燥しかつ金属化
チャンバーに入れた。１０-6より良好な真空で、５００
ｎｍ〜１０００ｎｍの金で金属化した。比較目的のため
にそれぞれの場合、サンプルキャリヤの一部を金属化中
にカバリングした。金属化後に、金被膜をエタノール中
で０．２％のメルカプトプロピオン酸の溶液中で１日間
酸洗いし、エタノールで洗浄しかつ乾燥した。
【００６６】サンプルキャリヤ、例えばマイクロタイタ
ープレート（Greiner Labortechnik）又はナノタイター
プレート（ＧｅＳＩＭ、カップの容積：深さ４００μｍ
で６００μｍ×６００μｍ、容量約５０ｎｌに等しい、
角錐台形状のウエル、シリコン内で異方性酸洗いした）
を、以下のようにして複合体で被覆した：表面をリン酸
塩で緩衝した塩水、ｐＨ７．４中の複合体の溶液で１時
間インキュベートした。引き続き、表面を洗浄しかつ非
特異的結合部位の飽和により除くためにＢＳＡ１ｍｇ／
ｍｌの溶液で付加的に１時間インキュベートした。被膜
を安定化するために、１時間グルタルアルデヒド（シグ
マ）０．５％の溶液をインキュベートした。引き続き、
サンプルキャリヤを洗浄しかつ直ちに使用するか又は乾
燥しかつ４℃で貯蔵した。比較実験のために、表面をＢ
ＳＡだけで、但しＢＳＡ農薬複合体を用いずに被覆し
た。
【００６７】５．１ 結合及び遊離抗体の機械的分離を
伴うハプテンとしてのアトラジンの定量的測定 実験で、前記のアトラジン被覆マイクロタイタープレー
トを使用した。該実験は、アトラジンに向けられた抗体
の定量的測定を説明するものであり、この場合には溶解
した画分内の抗体を固相からの分離後に測定した。
【００６８】前記のように、アトラジン誘導体を有する
マイクロプレートの各ウエルに、まずアトラジン溶液１
００μｌ、引き続き蛍光標識したアンチ−アトラジン抗
体の溶液１００μｌを入れた。溶液中のアトラジンの最
終濃度は、０．００３μｇ／ｌと１０００μｇ／ｌの間
で変動した。抗体濃度は、それぞれの場合５００ｎｇ／
ｍｌの値にした。室温での１時間のインキュベーション
時間後に、マイクロタイタープレートのそれぞれのウエ
ルから、溶液１５０μｌを取り出しかつ乳白色の蛍光マ
イクロタイタープレート（Perkin Elmer）のウエルに投
入した。蛍光をマイクロタイタープレートホトメータ
（ Perkin Elmer LSR 2000、６７０ｎｍで刺激、７００
ｎｍで検出）で測定した。図４は１つのモノクローナル
抗体のために得られたキャリブレーショングラフを示
し、図５は１つのポリクローナル抗体のために得られた
キャリブレーショングラフを示す。蛍光強度は、任意の
単位で記入されている。両者のキャリブレーショングラ
フは、蛍光の強度と被検体（アトラジン）の濃度との間
の明白かつ重大な関連を示す。
【００６９】モノクローナル抗体を使用する場合並びに
ポリクローナル抗体を使用する場合の両者において、ア
トラジンの定量的測定は、１μｇ／ｌ未満の濃度で可能
であった。
【００７０】５．２ 小型化サンプルキャリヤでの立体
的蛍光分布の測定 この実験では、サンプルキャリヤの壁への結合蛍光標識
分子の沈殿は、必然的に蛍光信号の立体的分布を伴うこ
とが証明される。この際、このような分布は明白かつ測
定可能な形式で壁に対する結合標識分子の沈殿が行われ
ない立体的分布からずれる。
【００７１】ＧｅＳＩＭサンプルキャリヤを前記のよう
に処理しかつ一方の半分をＢＳＡだけでかつ他方の半分
をＢＳＡアトラジン複合体でカバリングした。各ウエル
に、ピエゾマイクロドロップシステム（MICRODROP）を
用いて卵アルブミン１００μｇ／ｍｌを有するリン酸塩
で緩衝した塩水（ｐＨ７．４）内の蛍光標識アンチ−ア
トラジン抗体の溶液５０ｎｌを投入した。抗体濃度は、
０．２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／
ｍｌであった。引き続き、プレートを透明な粘着テープ
（Adhesive Research）でシールしかつ室温で３０分間
インキュベートした。引き続き、プレートの蛍光の強度
の立体像を、レーザスキャナを用いてサンプルキャリヤ
を線毎（line-for-line）で検知する（６３２ｎｍでの
粘着テープにより刺激、６９０ｎｍでのホトマルチプラ
イヤでの検出）ことにより形成した。使用した構造にお
いて、約２０μｍの直径を有するスポットをサンプルキ
ャリヤ上のレーザで照射した。コンピュータアシステッ
ドデータ記録装置を用いて、蛍光強度分布の像を、任意
の単位で５０μｍの立体解像度でスケッチした。これに
より各ウエルのために約１０×１０画素の像が生じた。
【００７２】評価のために、それぞれの正方形のウエル
のための蛍光の強度を、全部で１００個の属性化画素に
亙る刺激により測定した。この総和の結果は、図６に示
されている。図６において、“アトラジン”はアトラジ
ン蛋白質複合体で被覆したウエルからの信号に関する。
“ＯＶＡ”は、もっぱら卵アルブミンで被覆したウエル
に関する。両者、即ちアトラジン蛋白質複合体で被覆し
たウエル並びにもっぱら卵アルブミンで被覆したウエル
のための全蛍光は、抗体濃度に伴い増大する。
【００７３】蛍光の立体的分布を測定するために、各ウ
エルの中央における４×４画素の平方のための画素当た
りの平均強度（Ｉ4）を測定した。その際、全ウエル
（１０×１０画素）のための平均強度（Ｉ10）を測定し
た。これらの２つの読取りから、商Ｉ4／Ｉ10を決定し
た。これの結果は、図７に示されている。
【００７４】図７において、この場合も“アトラジン”
はアトラジン蛋白質複合体で被覆したウエルからの信号
及び“ＯＶＡ”はもっぱら卵アルブミンで被覆したウエ
ルに関する。壁に抗体の結合が行われないウエル（ＯＶ
Ａ；図８の左側の図参照）のためには、平均蛍光は、壁
に抗体が結合しているウエル（アトラジン：図８の右側
の図参照）と比較すると増大している。この効果は、殆
ど濃度とは無関係である。
【００７５】この関係において注目すべきことは、レー
ザビームは液体サンプルに入射する際に液体メニスカス
の凹面によって拡大されることである。このこと及びウ
エル内での反射により、刺激の局所的選択性は制限され
る。本発明を構成するような記載のサンプルキャリヤ、
並びに刺激及び／又は検出装置の変更により、極めて良
好な信号プロフィールを達成することができる。使用さ
れる抗体の全ての濃度に関して、予測されるように、蛍
光非対称における減少、即ち壁に対する抗体の深い結合
手段の少ない強調が起こった。
【００７６】５．３ 蛍光クエンチング物質で被覆した
小型化したサンプルキャリヤの壁に対する蛍光標識した
結合分子での蛍光信号のクエンチング 該実験は、サンプルキャリヤの金被覆壁への蛍光標識し
た結合分子の沈殿は必然的に蛍光信号のおける著しい低
下を生じることを立証するために役立ち、前記低下は、
該方法を定量的測定のために可能にする何らかの手段、
即ち被検体を液相に投与することにより防止することが
できる。
【００７７】ＧｅＳＩＭサンプルキャリヤに金を蒸着
し、前記のように、さらに処理しかつ一方の半分をＢＳ
Ａだけでかつ他方の半分をＢＳＡアトラジン複合体でカ
バリングした。各ウエルにピエゾマイクロドロップシス
テム（MICRODROP）を用いて卵アルブミン１００μｇ／
ｍｌを有するリン酸塩で緩衝した塩水（ｐＨ７．４）内
の蛍光標識アンチ−アトラジン抗体（１μｇ／ｍｌ）の
溶液５０ｎｌを投入した。ウエルの一部には、付加的に
１００ｎｇ／ｍｌの濃度を有するアトラジン誘導体を投
入した。以下の表は、１０個のウエルのそれぞれのため
の平均値を示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】抗体の蛍光は、壁に結合すると約３３％減
少する（“アトラジン誘導体を有しない”）。アトラジ
ン誘導体を添加した際の相応する高い蛍光は、抗体結合
部位のブロッキングにより説明がつく。このようにし
て、抗体はサンプルキャリヤの蛍光クエンチング壁に密
接して結合されない。ＢＳＡだけで被覆したサンプルキ
ャリヤを使用した場合には、匹敵する効果は見られなか
った。該方法の再現性は、満足されかつ蛍光の修正の定
量化を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を構成する方法を実施するための装置の
略示図である。
【図２】本発明の１実施例に基づくサンプルキャリヤの
ウエルを示す図である。
【図３】本発明の別の実施例に基づくサンプルキャリヤ
のウエルを示す図である。
【図４】本発明を構成する方法の第１実施例に基づくモ
ノクローナル抗体を使用した場合の被検体（アトラジ
ン）の濃度の関数としての蛍光強度を示すキャリブレー
ショングラフである。
【図５】本発明を構成する方法の第２実施例に基づくポ
リクローナル抗体を使用した場合の被検体（アトラジ
ン）の濃度の関数としての蛍光強度を示すキャリブレー
ショングラフである。
【図６】被検体の濃度と蛍光の強度との間の関係を説明
するための図である。
【図７】本発明を構成する方法の別の実施例に基づく立
体的蛍光分布を説明するための第１の図である。
【図８】本発明を構成する方法の別の実施例に基づく立
体的蛍光分布を説明するための第２の図である。
【符号の説明】
１０ レーザ、 １１ ビームエクスパンダ、１２ セ
ンサ又はスキャナ、１３ 試験台、 １４ サンプルキ
ャリヤ、 １５ 結像レンズ、 １６ 検出デバイス、
１７ フィルタ組合せ、 １８ ビームスプリッタ、
１９ａ 蛍光放射、 １９ｂ レーザビーム、 ２０
マイクロタイタープレート、 ２１，３５ 角錐台ウ
エル又は円錐台ウエル、 ２２ 蛍光クエンチング被
膜、 ２３ 床、 ２４ 壁、 ２５，２６ 蛍光団、
２８ シリコン基体、 ３１正方形ウエル、 ３６
開口面、 ３７ 床面
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アンドレアス ブレヒト ドイツ連邦共和国 ヴァルトブロン アイ ヒェンヴェーク 18 (72)発明者 ギュンター ガウグリッツ ドイツ連邦共和国 テュービンゲン パノ ラマシュトラーセ 54 (72)発明者 ミヒャエル シュタインヴァント ドイツ連邦共和国 オーヴィンゲン バル トロメーウス−モーザー−ヴェーク ４

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも２つの異なる相を有する系内
    の被検体又はその相互作用又は反応動力学を定量的又は
    定性的に測定する方法において、相の少なくとも１つか
    ら少なくとも１つの測定信号を取り出すステップを有
    し、その場合異なる相は測定信号を取り出す際に並列し
    て存在しかつ各測定信号は少なくとも２つの相の１つに
    帰属することを特徴とする、被検体、その相互作用又は
    反応動力学を定量的又は定性的に測定する方法。
  2. 【請求項２】 アフィニティーアッセイとして実施す
    る、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 被検体が核酸を構成する、請求項１又は
    ２記載の方法。
  4. 【請求項４】 イムノアフィニティーアッセイとして実
    施する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 検出反応が起こる容量が１μｌ未満、好
    ましくは５０〜１００ｎｌの範囲内である、請求項１か
    ら４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 競合アッセイとして実施する、請求項１
    から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 サンドイッチアッセイとして実施する、
    請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 被検体又は反応体が標識を有し、それに
    より測定信号を発生させる、請求項１から７までのいず
    れか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 測定信号を標識の放射線励起により発生
    させる、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 標識として、蛍光標識を準備する、請
    求項８又は９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 第１の相を固相としてかつ第２の相を
    液相として準備する、請求項１から１０までのいずれか
    １項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 固相をサンプルキャリア内のウエルの
    壁により形成する、請求項１から１１までのいずれか１
    項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 サンプルキャリアをマイクロタイター
    プレート、好ましくはナノタイタープレートの形で準備
    する、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 正方形、円筒形、角錐台、円錐台の形
    状を有するウエルを準備する、請求項１２又は１３記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 開口面が床面より小さいウエルを準備
    する、請求項１２又は１３項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 角錐台又は円錐台形状を有するウエル
    を準備する、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 クエンチング物質を少なくとも２つの
    相の１つの測定信号を抑制するために相に結合させる、
    請求項１から１６までのいずれか１項記載の方法。
  18. 【請求項１８】 壁及び／又は床がクエンチング物質、
    好ましくは蛍光クエンチング物質で被覆されたウエルを
    準備する、請求項１１から１７までのいずれか１項記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】 少なくとも１つの測定信号を立体的に
    ずれた測定によって得る、請求項１から１８までのいず
    れか１項記載の方法。
  20. 【請求項２０】 標識被検体又は標識反応体を含有する
    サンプル量に標識の刺激のために光ビームで照射しかつ
    標識の反応放射を測定信号として取り出す、請求項９か
    ら１９までのいずれか１項記載の方法。
  21. 【請求項２１】 サンプル容量内の刺激光ビームが４０
    μｍ未満、好ましくは約２０μｍのビーム直径を有す
    る、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 複数の測定信号を取り出すための励起
    光ビームをサンプルを介して通す、請求項２０又は２１
    記載の方法。
  23. 【請求項２３】 刺激をレーザで行いかつ測定信号とし
    てレーザビームにより励起された標識の蛍光を取り出
    す、請求項２０から２２までのいずれか１項記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】 １つ以上のウエル（２１）を有する、
    請求項１から２３までのいずれか１項記載の方法で使用
    するためのサンプルキャリヤ（２０）において、１つ以
    上のウエル（２１）の少なくとも領域内のサンプルキャ
    リヤの少なくとも一部が蛍光クエンチング物質で被覆さ
    れていることを特徴とするサンプルキャリヤ。
  25. 【請求項２５】 蛍光クエンチング物質が金属からな
    る、請求項２４記載のサンプルキャリア。
  26. 【請求項２６】 金属がドープされている、請求項２５
    記載のサンプルキャリア。
  27. 【請求項２７】 金属が金及び／又は銀からなる、請求
    項２５又は２６記載のサンプルキャリア。
  28. 【請求項２８】 前記領域が１つ以上のウエル（２１）
    の床（２３）及び／又は壁（２４）からなる、請求項２
    ４から２７までのいずれか１項記載のサンプルキャリ
    ア。
  29. 【請求項２９】 １つ以上のウエルが正方形（３１）、
    円筒形（３１）、角錐台（２１，３５）、円錐台（２
    １，３５）の形状を有する、請求項２４から２８までの
    いずれか１項記載のサンプルキャリア。
  30. 【請求項３０】 ウエルがウエルの床面（３７）より小
    さいを開口面（３６）を有する、請求項２４から２９ま
    でのいずれか１項記載のサンプルキャリア。
  31. 【請求項３１】 ウエル（３５）が角錐台又は円錐台
    （３５）の形状を有する、請求項３０記載のサンプルキ
    ャリア。
  32. 【請求項３２】 サンプルキャリアがマイクロタイター
    プレート、好ましくはナノタイタープレートの形で設計
    されている、請求項２４から３１までのいずれか１項記
    載のサンプルキャリア。
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