JP2005504988A - 較正マイクロアレイ - Google Patents
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Abstract
本発明は、検量システムの正確性を改善するために、内部検量線をマイクロアレイの一部として用いることができるという認識に基づいている。内部検量線により、１つのマイクロアレイ内でアレイを検量すると同時に、サンプル中の標的アナライトの未知の濃度を特定することができる。
本発明の第１の態様によれば、支持材は、離散的な複数の第１の反応領域アレイであって、それぞれが固定化された第１のアナライトまたは第１のアナライトに対する親和性を有する分子を含む第１の反応領域アレイと、異なる既知濃度の第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域と、を備える。
本発明の第１の態様によれば、支持材は、離散的な複数の第１の反応領域アレイであって、それぞれが固定化された第１のアナライトまたは第１のアナライトに対する親和性を有する分子を含む第１の反応領域アレイと、異なる既知濃度の第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域と、を備える。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、診断的分析法、とりわけ定量的な免疫学的測定法（イムノアッセイ）で用いられるマイクロアレイの機能を改善する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
免疫学的測定法とは、リガンド結合分析法であって、アナライトの特定の結合領域に対する抗体の特異的な認識を利用している。免疫学的測定法は、通常、リガンド（抗体、他のたんぱく質、ハプテンなど）を固相（支持材）に固定化させることを含み、これは、特定すべきアナライトにより認識される。特異的に標識された検出剤を用いることにより、水性サンプル中のアナライトを検出し、定量化することができる。サンプル中に存在するアナライト量は、結合した標識検出剤の関数であって、競合アッセイに反比例し、非競合アッセイに正比例する。
【０００３】
さまざまな免疫学的測定法が報告されており、このときリガンドを含む固相は、プラスチックチューブ（米国特許第３，６４６，３４６号）、ディスク（J. Lab. およびClin. Med 70: 820,1967）、多孔質支持材（米国特許第４，７０８，９３２号および米国特許第４，４５９，３６０号）、およびビーズ（Clin Chem. 37: 1521, 1991）である。これらのシステムにおけるアナライトの定量化は、個々の外部の検量線、すなわち個々の固相ユニット中にある各アナライトの濃度を決定することにより実現される。特定のアナライトを測定する必要がある場合に、サンプルの実験を制御するために、検量線が記録され、利用される。
【０００４】
マイクロアレイに基づいた技術により、複数のアナライトを特定することの意義について、現在広く認識されつつある。これらのシステムによれば、より柔軟性に富み、汎用性が高く、収量および感度が良好である。複数のリガンドを支持材の表面上に配設することができ、それぞれは一定少量（ｐｌまたはｎｌ）の個別の離散的なテスト領域（ＤＴＲ）を構成し、１つのサンプルにおける複数のアナライトの同時の複合的な検出および定量化を実現することができる。分析に必要なサンプルの量は、同様に、実質的に低減させることができる。
【０００５】
英国特許公開公報第２３２４８６６号は、免疫学的測定法で用いられる好適なマイクロアレイを開示している。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、検量システムの正確性を改善するために、内部検量線をマイクロアレイの一部として用いることができるという認識に基づいている。内部検量線により、１つのマイクロアレイ内でアレイを検量すると同時に、サンプル中の標的アナライトの未知の濃度を特定することができる。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、支持材は、離散的な複数の第１の反応領域アレイであって、それぞれが固定化された第１のアナライトまたは第１のアナライトに対する親和性を有する分子を含む第１の反応領域アレイと、異なる既知濃度の第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域と、を備える。
【０００８】
異なる既知濃度の第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域により、検量線を確立することができ、これを用いて、第１の反応領域上で起こる反応を定量化することができる。
【０００９】
本発明の第２の態様によれば、サンプル中の第１のアナライトの量を測定する分析方法は、
（ｉ）第１のアナライトに対する親和性を有する第１のリガンドを含む１つまたはそれ以上の反応領域と、異なる既知濃度を有する固定化された第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域と、を備えたデバイスにサンプルを接触させるステップと、
（ｉｉ）結合しないすべての第１のアナライトを取り除くステップと、
（ｉｉｉ）検出可能に標識され、第１のアナライトに対する親和性を有する第２のリガンドを含むデバイスと、第２のアナライトに対する親和性を有する第３のリガンドとを接触させるステップと、
（ｉｖ）結合しない第２および第３のアナライトを取り除くステップと、
（ｖ）支持材に結合した第２および第３のリガンドを測定するステップと、を有し、
第３のリガンドの測定結果を用いて、検量線を決定し、サンプル中に存在する第１のアナライトの量を特定する。第１および第２のアナライトは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００１０】
本発明の第３の態様によれば、第１のアナライトとマイクロアレイデバイス上に固定化された第１のリガンドとの結合の検出を改良する方法は、異なる既知濃度の第２のアナライトを含むマイクロアレイデバイス上の一連の反応領域を用いて、検出を検量するステップを有する。
【００１１】
本発明の第４の態様によれば、一連の反応領域が支持材上に配設され、反応領域は、アナライトの異なる既知濃度を含み、これを用いて、結合アッセイ中の内部検量が制御される。
【００１２】
本発明によれば、簡易的で、便利で、有効な手法で、結合アッセイの検量を制御することができる。生物学的サンプル中の標的アナライトの存在を検出するために用いられる支持材と同じ支持材上に、検量制御反応を配置することにより、個別の支持材に対する必要性を低減し、すべての反応を同時に開始することができる。
【００１３】
（発明の説明）
図面を参照しながら本発明を説明する。
本発明は、従来式のマイクロアレイデバイスを利用する。これらは、通常、シリコン、プラスチック、セラミック、またはガラスなどの適当な支持材料を有し、その上に個別の反応領域が設けられ、各領域は固定化アナライト（検体、被分析物）を含む。適当なデバイスが英国特許公開公報第２３２４８６６号に開示されており、その内容が参考としてここに一体に統合される。
【００１４】
本発明で用いられる支持材料は、任意の適当な寸法または形状を有し、好適には２ｃｍ２未満で、より好適には約１ｃｍ２未満である。個々の反応領域を従来式の手法で配置してもよい。反応領域は、２００μｍ未満、より好適には１００μｍ未満、最も好適には１０〜１５μｍだけ離間している。支持材料は、好適には、平坦な平面表面を有し、その上にアナライトが固定化される。
【００１５】
アナライトは、従来式の手段を用いて、材料表面上に固定化してもよい。共有結合的な固定化が好ましい。同様に、受動的な吸着作用を用いてもよいが、この形態による固定化は、ｐＨ、温度、およびイオン強度の変化に対して影響を受けやすく、いくつかの例において、結合力の弱い分子が培養および洗浄ステップ中に放出されることがあり、再現性に劣ることがある。固定化処理された後は、当然に、分子は最大の活性を有することが好ましい。
【００１６】
一般に、所定の条件下で活性化できる化学反応するリンカ分子を用いるなど、従来式の手法を用いて、共有結合的な固定化を実現することができる。好適なリンカ分子の具体例は、英国特許公開公報第２３２４８６６号に開示されている。
【００１７】
検量システムにおいて用いられるアナライトは、アッセイ中のテストサンプルから特定すべきものと同じものであってもよいし、異なっていてもよい。アナライトは、特定のリガンドに対して親和性を有する任意の分子であってもよい。アナライトは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または機能的類似体などのポリヌクレオチドであってもよい。択一的には、例えば、酵素、抗体、受容体、またはホルモンなどのたんぱく質やペプチドを用いてもよい。また、この分子は、ウィルスまたは有機化合物であってもよい。
【００１８】
このデバイスは、好適には、抗体または抗原がアナライトである場合の免疫学的測定法（イムノアッセイ）において用いられる。免疫学的測定技術は、当業者により広く用いられており、これらを実現する方法は、明らかである。この文脈において、マイクロアレイは、検量システムを形成する既知濃度のアナライトを含む一連の（第２の）反応領域と、標的サンプル中に存在するアナライトに対して親和性を有する固定化リガンドを含む一連の（第１の）反応領域と、を有する。
【００１９】
固定化されたリガンドは、例えば、特定の抗体、抗原、またはテストサンプル中のアナライトにより標的とされた特定の酵素であってもよい。これらのすべては、従来式の技術に基づいて、当業者にとって自明である。
【００２０】
テストサンプル中のアナライトの検出、および／または検量システムの検出は、検出可能に標識され、アナライトに対する親和性を有する別のリガンドを追加することにより、実現される。例えば、アナライトが抗体ＩｇＥで、検出リガンドが蛍光ラベルで標識された抗−ＩｇＥであってもよい。この検出形態は、従来式の免疫学的測定法で用いられたものと同じものであり、そのステップを実現する手法は当業者にとって明らかである。
【００２１】
好適な標識は、従来式の検出システムに基づいて、当業者に明らかなものである。例えば、ラベルは、螢光、化学ルミネセンス、比色定量分析、または生物発光ルミネセンスであってもよい。
【００２２】
それぞれのデバイスは、既知量の異なるアナライトを含む一連の個別の反応領域を有する。これを用いて、内部検量線が得られる。
【００２３】
この文脈において、本発明で用いる上で必要な反応領域毎のアナライト濃度は、アナライトなどの特性に依存して、当業者により決定され得る。疑義を払拭するために、検量システムを構成する各反応領域は、同一の支持体上にあって、同一の流体サンプルと接触しないようにする壁または障壁により分離されない。
【００２４】
検量の制御のために用いられるアナライトの濃度範囲は当業者にとって明らかである。濃度範囲は、通常、アッセイ中に用いられる固定化アナライトの最大濃度を含む。好適な実施形態において、濃度は、２×１０−４ｎｇないし４０ｎｇの範囲にある。
【００２５】
必要な数の反応領域を有するマイクロアレイデバイス上で内部検量を調整することができる。通常、３ないし２０個の反応領域が用いられる。好適には４ないし１５個、最も好適には４ないし１０個の反応領域が用いられる。
【００２６】
一連の検量反応領域は、マイクロアレイデバイスの所定位置、通常、特定が容易な１つの角部に配置される。
【００２７】
以下の実施例により、本発明を説明する。
【００２８】
（実施例１）
＜１つのバイオチップ（マイクロアレイ）におけるヒトＩｇＭの上昇濃度の検出＞
この実験において、精製ヒトＩｇＭの上昇濃度を含む個別テスト領域（Discrete Test Region ＤＴＲ）毎に２０ｎｌ容量が、ｐＨ９．５で０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。適用された濃度範囲は、ＤＴＲ毎に、０、０．０７、０．１５、０．３０、０．６０、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０ｎｇが適用された。その後、検定剤、抗ヒトＩｇＭペルオキシダーゼ標識抗体が添加された。トリス緩衝剤、トゥィーン２０（Tween 20）洗浄剤を含む生理食塩水、および化学ルミネセンス現像液を用いて洗浄するステップの後、ヒトＩｇＭの検量線がバイオチップ上で検出される。図１は、実施例１を示す。グラフ表示（ａ，ｂ）および視覚的描写（ａ’，ｂ’）は、バイオチップ上の精製ヒトＩｇＭの（標準）検量線を示す。ａ，ａ’で指定されたものは、ＧＯＰＳ活性化表面を示し、ｂ，ｂ’で指定されたものは、ＩＣＰＴＥＳ活性化表面を示す（英国特許公開出願第２３２４８６６号）。相対発光量を縦軸に、ＤＴＲ毎のｎｇ単位の精製ヒトＩｇＭ量を横軸にプロットして、このグラフを得た。
【００２９】
（実施例２）
＜１つのバイオチップにおけるヒトＩｇＭの上昇濃度の検出＞
この実験においては、精製ヒトＩｇＭの増大濃度を含む、ＤＴＲ毎に１０ｎｌの容量が、ｐＨ９．５で０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。適用された濃度範囲は、ＤＴＲ毎に、０、０．０４２、０．０８５、０．１７、０．３４、０．６８、１．３６、５．４６、１０．９２、２１．８５ｎｇが適用された。ＴＢＳＴおよび化学ルミネセンス現像液による洗浄ステップの後、検定剤、抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体を添加して、バイオチップ上のヒトＩｇＧの検量線を得た。
【００３０】
図２は、実施例２の結果を示す。
グラフ表示（ａ）および視覚的描写（ａ’）は、１つのバイオチップ上のＧＯＰＳ活性化表面における精製ヒトＩｇＧに対する（標準）検量線を示す。
【００３１】
（実施例３）
＜１つのバイオチップにおけるヒトＦＳＨの上昇濃度の検出＞
この実験においては、ヒトＦＳＨの増大濃度を含む、ＤＴＲ毎に２０ｎｌの容量が、ｐＨ９．５で０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。濃度は、０、０．３２、０．６４、１．２８、２．６ｍＩＵ／ＤＴＲであった。ＴＢＳＴおよび化学ルミネセンス現像液による洗浄ステップの後、検定剤および抗ヒトＦＳＨペルオキシダーゼ標識抗体を添加すると、ヒトＦＳＨの４つの上昇濃度がバイオチップ上で同時に検出された。図３は、実施例３の結果を示す。
【００３２】
（実施例４）
＜バイオチップ上の１列のサンプルに含まれる高精製ヒトＩｇＥ検量用試料、総ＩｇＥ、および特異的ＩｇＥの同時検出＞
この実験においては、１０ｎｌの反応領域の２列がＤＴＲを構成する。第１列は、３つのＤＴＲからなり、特に対象となるアナライト、すなわちピーナッツおよび草木花粉混合物に対する総ＩｇＥ、および特異的ＩｇＥと結合するリガンドを含む。第２列の反応領域は、骨髄腫ヒトＩｇＥ検量用試料から精製され、ＤＴＲ毎に、０、５０、２００、７００、１０００、２０００ＩｇＥｋＵ／Ｌの増大濃度を有する６つのＤＴＲにより構成される。このリガンドおよびＩｇＥ検量用試料は、ｐＨ９．５で５０ｍＭのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに適用された。
【００３３】
患者のサンプルを培養し、トリス緩衝生理食塩水−トゥィーン２０を用いて洗浄した後、検定剤、抗ヒトＩｇＥペルオキシダーゼ標識抗体を添加した。免疫反応が完了した後、非結合反応物を除去するために、他の洗浄ステップを行った。化学ルミネセンス現像液を用いると、マイクロアレイ化されたバイオチップ上において、同時の検定、視覚化（表象化）、検量、および総ＩｇＥと特異的ＩｇＥの測定することができた。
【００３４】
アレルギ患者から総ＩｇＥと特異的ＩｇＥに対する結果が、この装置を用いて、同時に定量化された。
サンプル１：草木花粉およびピーナッツ陽性サンプル：
総ＩｇＥ：９６８ｋＵ／Ｌ
草木花粉ＩｇＥ：８８ｋＵＡ／Ｌ
ピーナッツＩｇＥ：６２ｋＵＡ／Ｌ
サンプル２：ピーナッツ陽性サンプル：
総ＩｇＥ：７１７．５ｋＵ／Ｌ
草木花粉ＩｇＥ：０ｋＵＡ／Ｌ
ピーナッツＩｇＥ：９９．５ｋＵＡ／Ｌ
サンプル３：草木花粉陽性サンプル：
総ＩｇＥ：８８３ｋＵ／Ｌ
草木花粉ＩｇＥ：１２８ｋＵＡ／Ｌ
ピーナッツＩｇＥ：０ｋＵＡ／Ｌ
サンプル４：樹木花粉陽性サンプル：
総ＩｇＥ：４１５ｋＵ／Ｌ
草木花粉ＩｇＥ：０ｋＵＡ／Ｌ
ピーナッツＩｇＥ：０ｋＵＡ／Ｌ
図４は、実施例４の結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、マイクロアレイ上に存在するＩｇＭの測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、マイクロアレイ上に存在するＩｇＧの測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、マイクロアレイ上に存在する卵胞刺激ホルモンの測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、草木花粉およびピーナッツ（ａ／ａ’）、ピーナッツ（ｂ／ｂ’）、草木花粉（ｃ／ｃ’）および樹木花粉（ｄ／ｄ’）に関するＩｇＥの測定結果を示すグラフであって、水平軸がＤＴＲ毎のｋＵ／Ｌ単位のＩｇＥ濃度を示し、垂直軸が相対発光量（ＲＬＵ）を示す。
（技術分野）
本発明は、診断的分析法、とりわけ定量的な免疫学的測定法（イムノアッセイ）で用いられるマイクロアレイの機能を改善する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
免疫学的測定法とは、リガンド結合分析法であって、アナライトの特定の結合領域に対する抗体の特異的な認識を利用している。免疫学的測定法は、通常、リガンド（抗体、他のたんぱく質、ハプテンなど）を固相（支持材）に固定化させることを含み、これは、特定すべきアナライトにより認識される。特異的に標識された検出剤を用いることにより、水性サンプル中のアナライトを検出し、定量化することができる。サンプル中に存在するアナライト量は、結合した標識検出剤の関数であって、競合アッセイに反比例し、非競合アッセイに正比例する。
【０００３】
さまざまな免疫学的測定法が報告されており、このときリガンドを含む固相は、プラスチックチューブ（米国特許第３，６４６，３４６号）、ディスク（J. Lab. およびClin. Med 70: 820,1967）、多孔質支持材（米国特許第４，７０８，９３２号および米国特許第４，４５９，３６０号）、およびビーズ（Clin Chem. 37: 1521, 1991）である。これらのシステムにおけるアナライトの定量化は、個々の外部の検量線、すなわち個々の固相ユニット中にある各アナライトの濃度を決定することにより実現される。特定のアナライトを測定する必要がある場合に、サンプルの実験を制御するために、検量線が記録され、利用される。
【０００４】
マイクロアレイに基づいた技術により、複数のアナライトを特定することの意義について、現在広く認識されつつある。これらのシステムによれば、より柔軟性に富み、汎用性が高く、収量および感度が良好である。複数のリガンドを支持材の表面上に配設することができ、それぞれは一定少量（ｐｌまたはｎｌ）の個別の離散的なテスト領域（ＤＴＲ）を構成し、１つのサンプルにおける複数のアナライトの同時の複合的な検出および定量化を実現することができる。分析に必要なサンプルの量は、同様に、実質的に低減させることができる。
【０００５】
英国特許公開公報第２３２４８６６号は、免疫学的測定法で用いられる好適なマイクロアレイを開示している。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、検量システムの正確性を改善するために、内部検量線をマイクロアレイの一部として用いることができるという認識に基づいている。内部検量線により、１つのマイクロアレイ内でアレイを検量すると同時に、サンプル中の標的アナライトの未知の濃度を特定することができる。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、支持材は、離散的な複数の第１の反応領域アレイであって、それぞれが固定化された第１のアナライトまたは第１のアナライトに対する親和性を有する分子を含む第１の反応領域アレイと、異なる既知濃度の第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域と、を備える。
【０００８】
異なる既知濃度の第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域により、検量線を確立することができ、これを用いて、第１の反応領域上で起こる反応を定量化することができる。
【０００９】
本発明の第２の態様によれば、サンプル中の第１のアナライトの量を測定する分析方法は、
（ｉ）第１のアナライトに対する親和性を有する第１のリガンドを含む１つまたはそれ以上の反応領域と、異なる既知濃度を有する固定化された第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域と、を備えたデバイスにサンプルを接触させるステップと、
（ｉｉ）結合しないすべての第１のアナライトを取り除くステップと、
（ｉｉｉ）検出可能に標識され、第１のアナライトに対する親和性を有する第２のリガンドを含むデバイスと、第２のアナライトに対する親和性を有する第３のリガンドとを接触させるステップと、
（ｉｖ）結合しない第２および第３のアナライトを取り除くステップと、
（ｖ）支持材に結合した第２および第３のリガンドを測定するステップと、を有し、
第３のリガンドの測定結果を用いて、検量線を決定し、サンプル中に存在する第１のアナライトの量を特定する。第１および第２のアナライトは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００１０】
本発明の第３の態様によれば、第１のアナライトとマイクロアレイデバイス上に固定化された第１のリガンドとの結合の検出を改良する方法は、異なる既知濃度の第２のアナライトを含むマイクロアレイデバイス上の一連の反応領域を用いて、検出を検量するステップを有する。
【００１１】
本発明の第４の態様によれば、一連の反応領域が支持材上に配設され、反応領域は、アナライトの異なる既知濃度を含み、これを用いて、結合アッセイ中の内部検量が制御される。
【００１２】
本発明によれば、簡易的で、便利で、有効な手法で、結合アッセイの検量を制御することができる。生物学的サンプル中の標的アナライトの存在を検出するために用いられる支持材と同じ支持材上に、検量制御反応を配置することにより、個別の支持材に対する必要性を低減し、すべての反応を同時に開始することができる。
【００１３】
（発明の説明）
図面を参照しながら本発明を説明する。
本発明は、従来式のマイクロアレイデバイスを利用する。これらは、通常、シリコン、プラスチック、セラミック、またはガラスなどの適当な支持材料を有し、その上に個別の反応領域が設けられ、各領域は固定化アナライト（検体、被分析物）を含む。適当なデバイスが英国特許公開公報第２３２４８６６号に開示されており、その内容が参考としてここに一体に統合される。
【００１４】
本発明で用いられる支持材料は、任意の適当な寸法または形状を有し、好適には２ｃｍ２未満で、より好適には約１ｃｍ２未満である。個々の反応領域を従来式の手法で配置してもよい。反応領域は、２００μｍ未満、より好適には１００μｍ未満、最も好適には１０〜１５μｍだけ離間している。支持材料は、好適には、平坦な平面表面を有し、その上にアナライトが固定化される。
【００１５】
アナライトは、従来式の手段を用いて、材料表面上に固定化してもよい。共有結合的な固定化が好ましい。同様に、受動的な吸着作用を用いてもよいが、この形態による固定化は、ｐＨ、温度、およびイオン強度の変化に対して影響を受けやすく、いくつかの例において、結合力の弱い分子が培養および洗浄ステップ中に放出されることがあり、再現性に劣ることがある。固定化処理された後は、当然に、分子は最大の活性を有することが好ましい。
【００１６】
一般に、所定の条件下で活性化できる化学反応するリンカ分子を用いるなど、従来式の手法を用いて、共有結合的な固定化を実現することができる。好適なリンカ分子の具体例は、英国特許公開公報第２３２４８６６号に開示されている。
【００１７】
検量システムにおいて用いられるアナライトは、アッセイ中のテストサンプルから特定すべきものと同じものであってもよいし、異なっていてもよい。アナライトは、特定のリガンドに対して親和性を有する任意の分子であってもよい。アナライトは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または機能的類似体などのポリヌクレオチドであってもよい。択一的には、例えば、酵素、抗体、受容体、またはホルモンなどのたんぱく質やペプチドを用いてもよい。また、この分子は、ウィルスまたは有機化合物であってもよい。
【００１８】
このデバイスは、好適には、抗体または抗原がアナライトである場合の免疫学的測定法（イムノアッセイ）において用いられる。免疫学的測定技術は、当業者により広く用いられており、これらを実現する方法は、明らかである。この文脈において、マイクロアレイは、検量システムを形成する既知濃度のアナライトを含む一連の（第２の）反応領域と、標的サンプル中に存在するアナライトに対して親和性を有する固定化リガンドを含む一連の（第１の）反応領域と、を有する。
【００１９】
固定化されたリガンドは、例えば、特定の抗体、抗原、またはテストサンプル中のアナライトにより標的とされた特定の酵素であってもよい。これらのすべては、従来式の技術に基づいて、当業者にとって自明である。
【００２０】
テストサンプル中のアナライトの検出、および／または検量システムの検出は、検出可能に標識され、アナライトに対する親和性を有する別のリガンドを追加することにより、実現される。例えば、アナライトが抗体ＩｇＥで、検出リガンドが蛍光ラベルで標識された抗−ＩｇＥであってもよい。この検出形態は、従来式の免疫学的測定法で用いられたものと同じものであり、そのステップを実現する手法は当業者にとって明らかである。
【００２１】
好適な標識は、従来式の検出システムに基づいて、当業者に明らかなものである。例えば、ラベルは、螢光、化学ルミネセンス、比色定量分析、または生物発光ルミネセンスであってもよい。
【００２２】
それぞれのデバイスは、既知量の異なるアナライトを含む一連の個別の反応領域を有する。これを用いて、内部検量線が得られる。
【００２３】
この文脈において、本発明で用いる上で必要な反応領域毎のアナライト濃度は、アナライトなどの特性に依存して、当業者により決定され得る。疑義を払拭するために、検量システムを構成する各反応領域は、同一の支持体上にあって、同一の流体サンプルと接触しないようにする壁または障壁により分離されない。
【００２４】
検量の制御のために用いられるアナライトの濃度範囲は当業者にとって明らかである。濃度範囲は、通常、アッセイ中に用いられる固定化アナライトの最大濃度を含む。好適な実施形態において、濃度は、２×１０−４ｎｇないし４０ｎｇの範囲にある。
【００２５】
必要な数の反応領域を有するマイクロアレイデバイス上で内部検量を調整することができる。通常、３ないし２０個の反応領域が用いられる。好適には４ないし１５個、最も好適には４ないし１０個の反応領域が用いられる。
【００２６】
一連の検量反応領域は、マイクロアレイデバイスの所定位置、通常、特定が容易な１つの角部に配置される。
【００２７】
以下の実施例により、本発明を説明する。
【００２８】
（実施例１）
＜１つのバイオチップ（マイクロアレイ）におけるヒトＩｇＭの上昇濃度の検出＞
この実験において、精製ヒトＩｇＭの上昇濃度を含む個別テスト領域（Discrete Test Region ＤＴＲ）毎に２０ｎｌ容量が、ｐＨ９．５で０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。適用された濃度範囲は、ＤＴＲ毎に、０、０．０７、０．１５、０．３０、０．６０、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０ｎｇが適用された。その後、検定剤、抗ヒトＩｇＭペルオキシダーゼ標識抗体が添加された。トリス緩衝剤、トゥィーン２０（Tween 20）洗浄剤を含む生理食塩水、および化学ルミネセンス現像液を用いて洗浄するステップの後、ヒトＩｇＭの検量線がバイオチップ上で検出される。図１は、実施例１を示す。グラフ表示（ａ，ｂ）および視覚的描写（ａ’，ｂ’）は、バイオチップ上の精製ヒトＩｇＭの（標準）検量線を示す。ａ，ａ’で指定されたものは、ＧＯＰＳ活性化表面を示し、ｂ，ｂ’で指定されたものは、ＩＣＰＴＥＳ活性化表面を示す（英国特許公開出願第２３２４８６６号）。相対発光量を縦軸に、ＤＴＲ毎のｎｇ単位の精製ヒトＩｇＭ量を横軸にプロットして、このグラフを得た。
【００２９】
（実施例２）
＜１つのバイオチップにおけるヒトＩｇＭの上昇濃度の検出＞
この実験においては、精製ヒトＩｇＭの増大濃度を含む、ＤＴＲ毎に１０ｎｌの容量が、ｐＨ９．５で０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。適用された濃度範囲は、ＤＴＲ毎に、０、０．０４２、０．０８５、０．１７、０．３４、０．６８、１．３６、５．４６、１０．９２、２１．８５ｎｇが適用された。ＴＢＳＴおよび化学ルミネセンス現像液による洗浄ステップの後、検定剤、抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体を添加して、バイオチップ上のヒトＩｇＧの検量線を得た。
【００３０】
図２は、実施例２の結果を示す。
グラフ表示（ａ）および視覚的描写（ａ’）は、１つのバイオチップ上のＧＯＰＳ活性化表面における精製ヒトＩｇＧに対する（標準）検量線を示す。
【００３１】
（実施例３）
＜１つのバイオチップにおけるヒトＦＳＨの上昇濃度の検出＞
この実験においては、ヒトＦＳＨの増大濃度を含む、ＤＴＲ毎に２０ｎｌの容量が、ｐＨ９．５で０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに直接的に適用された。濃度は、０、０．３２、０．６４、１．２８、２．６ｍＩＵ／ＤＴＲであった。ＴＢＳＴおよび化学ルミネセンス現像液による洗浄ステップの後、検定剤および抗ヒトＦＳＨペルオキシダーゼ標識抗体を添加すると、ヒトＦＳＨの４つの上昇濃度がバイオチップ上で同時に検出された。図３は、実施例３の結果を示す。
【００３２】
（実施例４）
＜バイオチップ上の１列のサンプルに含まれる高精製ヒトＩｇＥ検量用試料、総ＩｇＥ、および特異的ＩｇＥの同時検出＞
この実験においては、１０ｎｌの反応領域の２列がＤＴＲを構成する。第１列は、３つのＤＴＲからなり、特に対象となるアナライト、すなわちピーナッツおよび草木花粉混合物に対する総ＩｇＥ、および特異的ＩｇＥと結合するリガンドを含む。第２列の反応領域は、骨髄腫ヒトＩｇＥ検量用試料から精製され、ＤＴＲ毎に、０、５０、２００、７００、１０００、２０００ＩｇＥｋＵ／Ｌの増大濃度を有する６つのＤＴＲにより構成される。このリガンドおよびＩｇＥ検量用試料は、ｐＨ９．５で５０ｍＭのカーボネイト緩衝液中のバイオチップに適用された。
【００３３】
患者のサンプルを培養し、トリス緩衝生理食塩水−トゥィーン２０を用いて洗浄した後、検定剤、抗ヒトＩｇＥペルオキシダーゼ標識抗体を添加した。免疫反応が完了した後、非結合反応物を除去するために、他の洗浄ステップを行った。化学ルミネセンス現像液を用いると、マイクロアレイ化されたバイオチップ上において、同時の検定、視覚化（表象化）、検量、および総ＩｇＥと特異的ＩｇＥの測定することができた。
【００３４】
アレルギ患者から総ＩｇＥと特異的ＩｇＥに対する結果が、この装置を用いて、同時に定量化された。
サンプル１：草木花粉およびピーナッツ陽性サンプル：
総ＩｇＥ：９６８ｋＵ／Ｌ
草木花粉ＩｇＥ：８８ｋＵＡ／Ｌ
ピーナッツＩｇＥ：６２ｋＵＡ／Ｌ
サンプル２：ピーナッツ陽性サンプル：
総ＩｇＥ：７１７．５ｋＵ／Ｌ
草木花粉ＩｇＥ：０ｋＵＡ／Ｌ
ピーナッツＩｇＥ：９９．５ｋＵＡ／Ｌ
サンプル３：草木花粉陽性サンプル：
総ＩｇＥ：８８３ｋＵ／Ｌ
草木花粉ＩｇＥ：１２８ｋＵＡ／Ｌ
ピーナッツＩｇＥ：０ｋＵＡ／Ｌ
サンプル４：樹木花粉陽性サンプル：
総ＩｇＥ：４１５ｋＵ／Ｌ
草木花粉ＩｇＥ：０ｋＵＡ／Ｌ
ピーナッツＩｇＥ：０ｋＵＡ／Ｌ
図４は、実施例４の結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、マイクロアレイ上に存在するＩｇＭの測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、マイクロアレイ上に存在するＩｇＧの測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、マイクロアレイ上に存在する卵胞刺激ホルモンの測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、草木花粉およびピーナッツ（ａ／ａ’）、ピーナッツ（ｂ／ｂ’）、草木花粉（ｃ／ｃ’）および樹木花粉（ｄ／ｄ’）に関するＩｇＥの測定結果を示すグラフであって、水平軸がＤＴＲ毎のｋＵ／Ｌ単位のＩｇＥ濃度を示し、垂直軸が相対発光量（ＲＬＵ）を示す。
Claims (13)
- 支持材であって、
離散的な複数の第１の反応領域アレイであって、それぞれが固定化された第１のアナライトまたは第１のアナライトに対する親和性を有するリガンドを含む第１の反応領域アレイと、
支持材に固定化された異なる既知濃度の第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域と、を備えたことを特徴とする支持材。 - 請求項１に記載の支持材であって、
第１および第２のアナライトは、抗原または抗体であることを特徴とする支持材。 - 請求項１または２に記載の支持材であって、
第２のアナライトは、共有結合により支持材に固定化されたことを特徴とする支持材。 - 請求項１ないし３のいずれか１に記載の支持材であって、
第２のアナライトは、たんぱく質または抗体に結合可能なペプチドであることを特徴とする支持材。 - 請求項１ないし４のいずれか１に記載の支持材であって、
支持材は、約１ｃｍ２であることを特徴とする支持材。 - 請求項１ないし５のいずれか１に記載の支持材であって、
第２のアナライトの濃度は、２×１０−４ｎｇから４０ｎｇであることを特徴とする支持材。 - 請求項１ないし６のいずれか１に記載の支持材であって、
３ないし２０個の第２の反応領域があることを特徴とする支持材。 - 請求項１ないし７のいずれか１に記載の支持材であって、
５ないし１５個の第２の反応領域があることを特徴とする支持材。 - 請求項１ないし８のいずれか１に記載の支持材であって、
７ないし１０個の第２の反応領域があることを特徴とする支持材。 - 請求項１ないし９のいずれか１に記載の支持材の上で第２の反応領域を内部検量制御として使用する方法。
- 第１のアナライトとマイクロアレイデバイス上に固定化された第１のリガンドとの結合の検出を改良する方法であって、
異なる既知濃度の第２のアナライトを含むマイクロアレイデバイス上の一連の反応領域を用いて、検出を検量するステップを有することを特徴とする方法。 - サンプル中の第１のアナライトの量を測定する分析方法であって、
（ｉ）第１のアナライトに対する親和性を有する第１のリガンドを含む１つまたはそれ以上の反応領域と、異なる既知濃度を有する固定化された第２のアナライトを含む一連の第２の反応領域と、を備えたデバイスにサンプルを接触させるステップと、
（ｉｉ）結合しないすべての第１のアナライトを取り除くステップと、
（ｉｉｉ）検出可能に標識され、第１のアナライトに対する親和性を有する第２のリガンドを含むデバイスと、第２のアナライトに対する親和性を有する第３のリガンドとを接触させるステップと、
（ｉｖ）結合しない第２および第３のアナライトを取り除くステップと、
（ｖ）支持材に結合した第２および第３のリガンドを測定するステップと、を有し、
第３のリガンドの測定結果を用いて、検量線を決定し、サンプル中に存在する第１のアナライトの量を特定することを特徴とする方法。 - 請求項１２に記載の方法であって、
このデバイスは、請求項１ないし９のいずれか１に記載の支持材であることを特徴とする方法。
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