JPS589070A - 免疫分析用装置及びキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は免疫分析用の新規な装置、その製造方法、及
びその用途特に多重を因子抗体分析及び。

交雑腫瘍（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　）形成モノクローン
抗体のスクリーニングに対する用途に関する。

患者の血清中の抗体を直接または間接に測定する試験は
臨床的診断に広く用いられている。問題となっている個
々の抗体により、試験は確定した原理に従って、すなわ
ち免疫沈殿物の形成単独でまたは拡散及び（または）電
気泳動と組合せて・抗体−抗原コンプレツクスによる補
体の固定により、抗体による赤血球の凝集により、また
は抗体の抗原に対する結合を直接測定することにより日
常的に使用されている。これらの原理は全て過去または
現在の病気の診断用に商業的に入手し得るキットとして
種々用いられている。従って特殊試験用キットはウィル
ス、バクテリア、菌類または寄生虫に感染した結果とし
て生ずる抗体の検・出抜たは測定のために製造される。

各試験用キットは特異抗体用に特別に作られる。

上述の予め作られた診断用キットに固有の障害は、病気
に関係しない偽陽性反応が採用される操作の高感度のた
めに起ることである。陽性の結、果は通常抗体力価の変
化が病気の進行中に検出することができる場合にのみ意
義がある。このことは迅、速に結論を出すことを妨げる
。公知の試験用キットを用いる場合には特殊な病気に先
立って抗体の基礎的レベルを患者のために入手すること
は不可能である。このことは、医者が日常的な健康管理
業務として個人的にまたはヘルスセンターで十分実施す
ることができるほどシステムが重線であり、同時に現在
臨床的に関心があるか将来臨床的に関心が持たれる可能
性があるあらゆる抗体の基礎的レベルを確立することが
できるに十分なほどシステムが融通性のある場合にのみ
可能となるであろう。このような試験では・現在臨床土
間らかに関連のない抗体に関するデータが収集される。

しかし、抗体は極め°て特異的ではあるが完全に特異的
ではないので、思いがけない交差反応が起ることがある
。これは思いがけない抗原交差反応によるか、または理
゛由はわからないが、病気が免疫システムに悪性の作用
を及ぼして意外な抗体を生成するかすることによる。従
って、徊えばリウマチ熱におけるバクテリア感染に対す
る抗体は心筋組織と交差反応するおそれがあり；伝染性
単核症（１ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｌｏ
ｓｉｓ）においては・交差反応を起して、ウマのような
他種の赤血球を凝集させる異原抗体が診断用キットとし
′Ｃ１いられる。

この発明は以下に更に詳しく説明するように、抗体検出
に基づく現存の分析用抗原試験についてのこれらすべて
の欠点を除去するものである。本発明は前記の思いがけ
ない交差反応性の発見と意外な抗体の生成の発見を促進
するであろう。

この発明は極めて牟純で計画性があり、かつ例えば病気
の診断において身体自身の病気一監視システムからの情
報を最大限利用する詳細な“抗体プロフィール”を確立
することのできる試験用キットの提供を目的とする０こ
のキットは本質的な特徴としては、例えば薬剤やホルモ
ンのような任意の抗体と抗原の両方の免疫分析または検
出用に適した抗原または免疫グロブリンのための固体支
持体の形態での装置からなる０ 本明細書では”抗体”の字句は、血液の免疫、グロブリ
ンフラクションまたは免疫システムから導かれる培養細
胞により分秘され、この明細書でパ抗原”と呼ぶ相当す
るりガントと特異的に反応する特徴を有する特殊な蛋白
質分子を表わすものである。

第一に、この発明は１以上の抗原または免疫グロブリン
の溶液または懸濁液の分別量を支持体に直接接触させて
適用することにより得られる、抗原及び（ｆたは）免疫
グロブリンの境界を定めて吸着させた領域のあらかじめ
選択された（　ｐｒｅ　−５ｅｌｅｃｔｅｄ　）配列を
含む多孔性固体支持体からなる免疫分析用の新規な装置
に関する。

前記固体支持体上の抗原または免疫グロブリンの吸着さ
れた領域は、分析する必要のある例えば血清のような液
体中に・含まれる抗体ま々は抗原それぞれと適当な状態
で反応させるために１支持体を乾燥、貯蔵して保持する
ことができるＯこの発明は従って特に前記の乾燥状態の
仕掛を提供するものであるｏしかし・所望の免疫−検定
（ｉｍｍｕｎｏ　−ａｇｓａｙｇ）を実施する前に、適
用する抗原または免疫グロブリンによってカバーされな
い領域内の多孔性支持体表面上での蛋白質の全ての吸着
可能場所とその領域の内側は、非特異蛋白質またはその
蛋白質を含む血清により表面を処理して飽和する必要が
ある。またこの処理中は最初に適用された抗原ま−たは
免疫グロブリンは抗原−抗体反応を維持するように元の
状態に保たれ、乾燥及び貯蔵中もそのままに保たれる。

本発明の第二の特色は、従って１以上の抗原または免疫
グロブリンの溶液または懸濁液の分別量を支持体に直接
接触させて適用することにより得られ、かつ吸着表面の
残りの吸着可能場所の全てを封鎖するために過剰の非特
異蛋白質で処理した抗原及び（または）免疫グロブリン
の境界を定めて吸着された領域のあらかじめ選択された
配列を含む多孔性固体支持体からなる装置である。非特
異蛋白質とは分析する血清中にあると考えられる特異抗
体と交差反応をせず、かつ多孔性支持体に適用される抗
原とも異なるような蛋白質を意味する。このようにして
得られた、特に乾燥状態で１、製造後貯蔵されて長期間
使用することのできる免疫検定−で直接用いられる装置
は特に重要なもので７　ある。

本発明の第三の特色は前記の両方の装置を用いることか
らなる新しい免疫学上の分析法である。

本発明の第四の特色は１以上の抗原及び（または）免疫
グロブリンの溶液才たは懸濁液を分別して支持体に直接
接触させて適用することからなる、前記の装置の製造法
である。

本発明の第五の特色は上記の固体支持体の形態での装置
と免疫学上の検定を実施するために調製された薬剤と装
備とを組合せたキットの製造に関するものである。

この発明は・抗原または免疫グロブリンがそれらを含有
する液体を固・体長孔性支持体に直接接触させて適用さ
れ、境界の定められた吸着領域を得ることができ、その
領域は所望により適用される液体の容量を適当に制限す
ることによって出来るだけ小さいものとできるという発
見；そのようにして得られた領域は表面上を広がらない
という発見；及び抗原または免疫グロブリンは多孔性表
面に極めて堅固に固着されて、実際上無制限の期間変化
せずに保持することができ、生物学的液体中にある抗体
との反応または抗原との反応にそれぞれ適してお一〇、
また公知の任意の免疫学的検定法による検出に適してい
るという発見に基づくものである。例えば、装置が固体
支持体に結合した抗原からなる場合には、結合した抗体
は（インジケータ）抗体を用いて、すなわち例えば放射
能で標／ 識化された（インジケータ）抗体または呈色反応する酵
素と結合する（インジケータ）抗体を用いて検出される
。“インジケータ”（Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ　）とは、そ
れに結合した基、すなわち一定の条件下で検出すること
ができ、かつ測定することのできる信号を発生する基を
有する分子を意味するＯこれらの免疫学上の検定は抗原
または免疫グロブリンの非常に小さな点（ドツト、ｄａ
ｔ）でも、施された種々の抗原または免疫グロブリンと
試験溶液中に含まれる第三物質との間で干渉を起すこと
な〈実施することができる０この発見は先行、技術で知
られている種々の免疫学的検定法、特に上述の検定法に
比べると確かに驚くべきことである。

この発明による簡拳な装置とその適用法は極めて一般的
に応用でき、実際上例えば蛋白質、核酸、炭水化物、脂
質・及び関連物質、及びあらゆる種類の免疫グロブリン
を含む全ての抗原物質に対して用いることができること
は特に驚くべきことである。

この発明に先行する技術の状態（ま、エレクトロフェロ
グラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）の模写物
上で抗体結合検定を実施するのに微少多孔性シートを用
いて決定的な進歩を果したＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　中で以下に述べた記事にある発見は
別として・米国特許第４，２００，６９０号及びヨーロ
ッパ特許出願第２７００８号、に例示されている。米国
特許には、ニトロセルロースの学位面積あたり本来備わ
っている高い結合性に気づかずに種々の複雑なコーティ
ング法によりニトロセルロース微細多孔性支持体の結合
容量を増加させる方法が記載されている。更に、先のヨ
ーロッパ特許出願に総括されている初期の多数の特許に
は、渦巻、穴、挿入物等を有するプラスチック表面の種
々の幾何図形を用いて結合容量を増大させることが記載
されている。それらの表面から過剰の試薬を完全に除去
することは困難であると述べられている０この発明の本
質的な特徴は微細多孔性シートの高い結合容量を・例え
ば洗液をプラスチック製びん等により簡単に施して過剰
の試薬を注ぎ出すことにより、容易に十分に洗浄するこ
とと組合せたものである。

前記のヨーロッパ特許出願第２７００８号には、同一の
液体試料と接触しているコーティングされたチューブと
挿入物とを用いて多重抗体−抗原反応を行う方法が記載
されている。その特許出願の発明では同時に複数の検定
ができるとされておりそのような多重検定の利点と必要
性が広範囲に記載されているが、２つを同時に検定する
例のみが記載され、２以上については実際には殆ど実施
されなかった。その発明の重要な特徴は反応後チューブ
と挿入物とを物理的に分けて、結合した放射能を別々に
算えることである０その発明で実施することのできる検
定数はラジオイムノアッセイ（同位元素標識免疫定量法
）と多重同位元素法（ｍｕｌｔｉｐｌｅｉｓｏｔｏｐｅ
　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　）を用いることにより増やす
ことができるが・実際上は放射能測定が面倒なため２以
上の同位元素を用いて日常的な使用で検定数を増やすこ
とはできないことは明らかである。この方法では最大で
同時に４つの分析が行われている。挙げられている例は
専らラジオイムノアッセイにおける用途に対するもので
ある。←方、この発明は微細多孔性支持体に本質的に備
わっている高い分析力（ｈｉｇｎｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
）と組合せて、単位面積当りの高い容量を利用して同時
に検定できる数を制限なく増加することができるように
するものであ°る０更に、ヨーロッパ特許出願第２７０
０８号の例は、相当する抗原を測定するために、支持体
に結合した特異抗体を使用するものに限られている。こ
の発明では本質的に制限のない数の種々の抗原を用いて
対応する抗体を測定するためにシステムを使用すること
ができる。

また抗体用の支持体を用いて、次に対応する特異抗原を
結合させること、及び抗原−抗体コンプレツクス、例え
ば補体成分を同定する特殊試薬を用いることもできる。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、ＵＳＡ、　
Ｖｏｌ、　７６　、Ｎ１９　。

４３５０〜４３５４頁、　１ｑ７９年９月発行−（１”
）−Ｅｌｅｃｔ　−ｒｏｐｈｅｒｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙ
ａ　−ｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌａ　ｔｏ　ｎ１ｔｒ
ｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ　：Ｐｒｏｃｅｄ
ｕｒｅ　ａｎｄ　ｓ″ｏｍｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ　’　（蛋白質のポリアクリルアミドゲルからニトロ
セルロースシートへの電気泳動による輸送：操作と応用
〕とＧ）う題名の記事には、蛋白質のゲルから多孔性シ
ー。

ト入の電気泳動による輸送法とその蛋白質の抗体が関与
する免疫検定法による検出が記載されてＧする０蛋白質
の電気泳動による輸送ではニトロセルロースシート上の
ゲル中に含まれる原図型の正確な模写物が得られるＯこ
のように模写されたエレクトロフェログラム（ｃｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｓ　ｒｏｇｒａｍ、電気泳動法）を用いる抗
体分析は、ニトロセルロースシートの残留吸着容量を非
特異蛋白質によって浸漬することにより飽和させた後行
われ、この特色は本発明でも採用されるものである。電
気泳動により輸送された蛋白質を用いる上述の免疫検定
は、電気泳動により吸着された特異蛋白質と支持体の残
留容量を封鎖するのに用いた非特異蛋白質との間にり換
が起らないという事実によって可能になるものである。

残留吸着場所の封鎖（背景部吸着）に用いる一非特異蛋
白質の部分ではいかなる障害からも結合した抗原が元の
状態で保存され、そして抗原及び（または）免疫グロブ
リンを直接、すなわち電場のない状態で適用する場合に
も長期間抗体検定ができるという本発明の発見は、新し
０装置の開発とその抗体分析への利用に対する決定的な
要因である０また更に抗血清及びインジケータ抗体によ
りインキュベ・−ジョンした場合に障害となる副反応、
例えば吸着された非特異蛋白質基こよる交換は起らない
ことも驚くべきことである。更に、先に述べた電気泳動
法が改良されて抗原を簡単に直接適用することによって
定量分析の基礎となることは期待され得なかった０抗原
の多数の微少ドツトを備えた支持体に応用した時、この
新しい方法は高い解像力を有するために・また同時に極
めて操作が簡拳なために、無限にプログラミングが可能
である。本発明の免疫学的な抗体分析を定量的なものに
する場合には免疫グロブリンを所望により抗原と共に多
孔性支持体に施すことができる；免疫グロブリンの既知
量を固体支持体に抗原と共に適用する；この免疫グロブ
リンはインジケータ抗体と検出しうる反応を起し、この
反応が抗原に結合した免疫グロブリンの対応する反応と
比較するベースとして用いられる゛０本発明の免疫学的
分析法は、従って例えば人免疫グロブリン等の既知量を
ベースとした適当な内部標準を用いて目盛づけすること
ができる。この方法は抗体を多数同時に測定することが
できるので、他の抗原と交差反応を起したり、病気によ
りもたらされ、以前には知られていなかった、偶発的に
引出される抗体が容易に検出される。更に・個々の抗体
の測定に依存している従来の全ての診断試験を普遍的な
１つの試験に統合することができる。

本発明の装置上に形成される配列に関して使用された「
あらかじめ選択された（　ｐｒｅ　−ｓｅｌ　ｅｃｔｅ
ｄ　）Ｊなる語は吸着された抗原または免疫グロブリン
の領域の外面的形態（ｇｅｏｍｅｔｒｙ’）が意図され
た免疫学的分析の目的のために役立つようになっている
ことを意味するものである。

多孔性支持体は十分な多孔度を持ち免疫グロブリンが接
近でき、適当な表面親和力があり抗原と結合する任意の
材料である。微細多孔性の構造が一般に好ましいが水利
状態のゲル構造を有する材料をも使用することができる
０化学的な性質に関して、この材料は： Ａ）　ａ）寒天、アガロース；架橋アルギン酸；置換ま
たは架橋グワーガム、架橋デキストランポリマー及びデ
ンゾ・ン ｂ）再生セルロース；セルロースエステル特に硝酸及び
カルボン酸とのエステぞし；混合セルロースエステル、
セルロースエーテル特に低級脂肪族アルコールとのエー
テル、 Ｂ）蛋白質及び誘導体、例えば架橋または修飾（ｍｏｄ
　ｉｆ　ｉｅｄ　）ゼラチンのような含窒素天然ポリマ
ー、 Ｃ）ラテックス及びゴムのような天然の炭化水素ポリマ
ー、 Ｄ）　ａ）ビニルポリマー類、例えばポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢
酸ビニル及びその部分加水分解誘導体、ポリアクリレー
ト、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、 ｂ）前記のビニルモノマーそれ自体ノ間ノ・及−び他の
モノマーとのコポリマー及びターポリマー、 Ｃ）ポリエステル、ポリアミドのようなポリ縮″合物、 ｄ）ポリウレタンまたはポリエポキシドのような付加ポ
リマー。

Ｅ）アルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩または
炭酸塩例えば硫酸バリウム・硫酸カルシウム、炭酸カル
シウム、炭酸マグネシウム・またはアルカリ金員及びア
ルカリ土類金属及び、（または）アルミニウム及び（ま
たは）マグネシウムのケイ酸塩、及びアルミニウムまた
はケイ素の酸化物または水酸化物例えば粘土、アルミナ
、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲル、ガラス
のように適当に多孔性のある状態で調製することのでき
る無機材料、 Ｆ）上記の混合物またはコポリマー、例えば予め存在す
るポリマーに合成ポリマーを開始剤重合して得られるグ
ラフトコポリマーであるＯこれらの材料は全て適当な形
状、例えばフィルム、シート、プレート、シリンダー等
の形状で用いられるか、適当な不活性キャリア、例えば
紙・ガラス、プラスチックフィルム、金属箔、織物等に
コーティングさ屯るか、または接着されるか、またはラ
ミネートさ°れる０この装置は好茎しくはシート状であ
り、その厚さは約０．０１ｗ〜０．５　ｍ、囲で変えら
れるが、好ましいのは約０．０２５〜１５μ、特に約０
．１５〜１５μであるＯ これら支持体の表面は抗原及び（または）免疫グロブリ
ンが支持体と共有結合を生ずる化学的方法によって活性
化させることができる。しかし、抗原または抗体の不可
逆結合は一般に、十分理解されてはいない疎水力による
多孔性材料への吸着によって達成される。微細多孔性セ
ルロースエステル、例えばセルロースと炭素原子数が１
〜７のアルカルボン酸（酢酸、プロピオン酸、任意の酪
酸または吉草酸等）のような脂肪族カルボン酸とのエス
テルを用いるのが゛好ましい。しかしながら、ニトロセ
ルロースのシート、すなわちセルロースの硝酸エステル
のシートを所望により前記のカルボン酸セルロースエス
テルのいずれかと混合して用いるのも有利である。従っ
て純粋のニトロセルロースエステルは炭素原子数６個に
対して約３個の硝酸基を持つセルロースエステルの構成
で用いることができる。本発明による装置を作成するた
めの二）ａセルロースをベースとする優れた材料は商標
名″″Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ”（米国、マサチューセッツ
州、ベッドフォード、ミリポア社製）で市販されており
、その孔の大きさは０．４５μである。、抗原または免
疫グロブリンは前記の固体支持体に直接接触させて適用
される。直接接触とは任意の機械または手による移送、
例えば毛細管またはピペットまたは注射器を用いるか、
またはスプレーのような液体あるいは気体発射薬によっ
て、例えば適当な方向性のある空気流または気体流によ
るか、またはミクロエレクトロニクスで通常実施されて
いる石版印刷等を用いる方法により小型化されたテンプ
レート（型板）またはアプリケータによるか、才たは高
速篭手印刷におけるような“チャーシトドロップ”（ｃ
ｈａｒｇｅｄ　ｄｒｏｐ　）推進力による移送を意味す
る。試料は適当な幾伺図形、即ち形成される吸着領域が
点（ｄａｔＩ８）、はん点（５ｐｏｔｓ＋　）または線
の形態、または適当な任意の他の配置を与えるよ゛う・
に適用される０その配列は多数の抗原を含むものでも、
または少数、または単一の抗原を含むものでもよい。抗
原性液体または血清は少量、例えば１μｔより小さい、
特に０．ｌμを以下の分別量を適当するのが好ましい。

このようにして微小点が多孔性表面に得られる。例えば
径が２鰭より小さい、特に０．５Ｉｕより小さい微小点
は最大数の抗原及び（または）免疫グロブリンを二次元
の領域または配列で詰め込むために最も適している；例
えば幅が約２ｍｍ以下、例えばｌ藺の線は結果を容易に
判別することができるか・またはある種の機械的な走査
装置により定量することができるので抗原数または抗体
数が一層制限されている場合に最も適している。平行な
線状の配列は次に試験システムの大量生産にかなう多く
の細片（８ｔｒｔｐ８　）にある程度まで切断される。

血清の抗体分析のための本発明による代表的な試験装置
は例えば添付−面に示す形態のものであり、その図面は
分析する種々の血清中に浸漬後展開され、基質と呈色反
応することのできる酵素に結合したインジケータ抗体と
の反応により可視化された点を示す。スタンダー）、１
−３は適当な希釈液中の正常なヒト血清である。この型
の装置は“多重パラメーター抗体”分析を行うのに役立
つ０固体多孔性支持体上に施゛された単一の抗原を有す
るキットのケースはモノクロン抗体を作る交雑腫瘍のス
クリーニングのために特に重要である０新しいキットの
システムは、所望数の抗原、または抗原の組合せ、また
は免疫グロブリンを単一の試験法に組み込んで、単一の
操作で分析することができるので、制限や限定なくプロ
グラムすることができる。更にこの発明は例えば通常固
有ではあるが、病理学上の状況により変わり得る抗体の
濃度を監視するために、または病理学上の状況でのみ見
出される抗体を検出して定量するために用いられる０支
持体の多孔性材料としてニトロセルロースを、好ましく
はシート状で用いる場合には驚くほどシステムの分析力
が高い０試料をミクロ−毛細管で適用すると、ドツトは
きわめて小さく、ミリメーター以下の範囲になり、その
ドツトはその後の処理及び°反応中広がりはしない０そ
のような微少点状の抗原シートはヒト血清中の極めて広
い範囲の抗体の検出と定量に用いることができる。

固体多孔性支持体の上に選択された抗原及び（または）
所望により免疫グロブリンを上述のようにしていったん
施すと直ちに、その装置は免疫検定に使用する前に多孔
性材料の過剰な結合場所を封鎖するために、更に処理す
る必要がある。この処理は抗原または免疫グロブリン配
列を含む固体支持体を非特異蛋白質によりまたはそのよ
うな蛋白質の混合物により、または全血清により・また
はこれらの成分のみを任意に組合せるか、その後の免疫
検定段階の成分と一緒に合せてインキュベーションする
ことにより行われる。唯一の制限は前記の蛋白質が免疫
検定において抗体または抗原それぞれを妨げたり、それ
らと交差反応してはならないこと、及び勿論その蛋白質
は支持体上に施された蛋白質と異なるものであることで
ある。

この残留吸着場所の封鎖は段階的に行うこともできる０
従って予備的段階においては、固定された抗原または抗
体を含む支持体をウシ血清アルブミンによりインキュベ
ートすることができる。そのような蛋白質は生理食塩水
で繍釈すると都合がよく、アセンブリーをそれらの蛋白
質で、好ましくは少し温度を上げて、例えば３０℃〜５
０℃、好ましくは４０℃でインキュベートし、生理食塩
水で洗浄する。この予備的な処理後には、また完全には
封鎖されていない蛋白結合場所が存在する可能性がある
が、これも免疫検定を実施する時には封鎖しなければな
らない。もし結合場所の残存か非特異蛋白質の交換によ
る背景部の吸着があると、第一の抗血清によるインキュ
ベーション及び同一の非特異蛋白質の継続的な存在下で
の、更には試験抗体様以外の種（５ｐｅｃｉｅｓ　）か
ら導かれるキャリアとしての全血清の存在下でのインジ
ケータ抗体によるインキュベーションを行うことにより
・それが妨げられる。これらの蛋白質混合物が継続的に
存在すると両者は残存結合場所を封鎖し、抗体の非特異
場所に予め結合した蛋白質による交換または免疫グロブ
リン・によるあらレクチ種類の非特異的相互作用を、競
争によって妨げようとする。

従って用いられるキャリア血清はインジケータ抗体と交
差反応する免疫グロブリンを含む種からのものであって
はならない。

抗体を検出するための免疫分析の場合には、上述のよう
にして調製される装置は、例えば予想される抗体濃度、
すなわち通常は封鎖溶液中で１：１００〜ｌ　：　１０
０００の範囲の濃度に従って希釈された分析する抗血清
により、例えば２時間から一夜室温でインキュベートし
、次いで生理食塩水で十分に洗浄して過剰の未結合の抗
体を除去する。

インジケータ抗体は、放射能で標識化されるか・螢光性
であるか、冷光性であるか、または螢光性物質と結合さ
れているか、またはその基質と呈色反応を起すことので
４きる酵素と結合されている。

インジケータ抗体は通常上記に挙げた封鎖溶液の混合物
中で約１０００倍に希釈され、例えば２時間インキュベ
ートされ、再び生理食塩水で洗浄される０ これらの方法はそれ自体公知の方法によりブドウ状球菌
蛋白質Ａ　（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　Ａ　）を含む公知のインジケータを用いて実施
される。

従って、例えば　　Ｉ　で標識化された免疫グロブリン
はオートラジオグラフ法において用いることができ、螢
光発光と結合された免疫グロブリンはフルオフトリ法で
、またワサビダイコン（ｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉ　ｓｈ　
）ペルオキシダーゼと結合された免疫グロブリンは呈色
反応を引出すためのペルオキシダーゼの基質としての過
酸化水素の存在下でＯ−ジアニシジンを用いて酵素免疫
法で用いることができ、呈色反応生成物は不溶性で形成
場所に動かずにとどまる。

患者のあらゆる種類の抗体含有液、例えば血清、血漿、
脳を髄液、初乳、リンパ液、乳、唾液、尿・糞便等は本
発明の新しいキットにより分析することができる。

多孔性支持体上の抗原の横用は、上述のように適当なイ
ンジケータ抗体により、または補体系の一成分により、
または抗原−抗体反応に敏感、な結合酵素系により行う
でとができる。この指示薬抗体は、ヒトまたは動物の免
疫グロブリンと特異的に反応する任意の抗体であるか・
またはＩｇＧ　。

ＩｇＭ　、　ＩｇＡ　、　ＩｇＤのような所望の一つの
抗体クラス（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｃｌａｓｓ）とのみ反
応するクラス特異抗体（ｃｌａｓｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ
　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　）であるか、またはそのよう
な特異免疫クロプリンの所望の組合せである。ＩｇＭ抗
体は最近あるいは現在の感染であるアレルギーのＩｇＢ
の特徴を示す１こめに特に興味染いものである。

インジケータ抗体と結合される酵素は、使用時には放射
性、螢光性、冷光性生成物または可視或いは視外領域に
特性吸収または反射スペクトルを持つ生成物を形成する
ことによって局在化し、定量できるようなものであり、
唯一の要件は検出試薬ま１こ（、ま反応生成物が抗原−
抗体コンプレックスの場所に局在化して残ることである
。補体を結合抗原−抗体コンプレックスの検出に用いる
場合には、補体それ自身を上述のいずれかの方法で標識
化することができ、または上述のいずれかの方法で標識
化した特異抗−補体抗体により順次検出することができ
る〇 本発明の装置は直接抗原を適用した後に得られるような
、例えばニトロセルロース等の固体多孔性支持体の形態
である。このような装置は乾燥され・もし脱水した状態
で保持するならば室温で、いつまでも貯蔵することがで
きる０しかし、本発明、の装置は残留吸着容量を封鎖、
するための蛋白質により、一段階または多段階でインキ
ュベーションした後に得られるような形態のものが好ま
しい。

また、この場合には支持体は乾燥すると、湿気から保護
するならば前記の温度でいつまでも保管することができ
、このような形態は商業上特に重要である。

免疫検定に本発明の装置を用いる方法においては、非特
異蛋白質で処理した後抗原及び（または）免疫グロブリ
ンを含む支持体（第二の装置）を分析する液体、例えば
動物またはヒトの患者または日常的なヘルスケアをうけ
る人の血清や血漿中に浸漬し、次いで分析する液体状の
動物種の免疫グロブリン例えば酵素反・応生成物が不溶
性である酵素結合抗体のような抗−ヒト免疫グロブリン
に対向するインジケータ抗体の希釈された溶液または懸
濁液中に浸す。最終工程は結合した第二抗体を可視化す
るものであり、好ましい反応は４−クロロ−１−ナフト
ールの酸化による不溶性着色物の生成反応である０最終
の工程は医者が個人的に使用して実施できるほど十分に
簡争なものであり・まだすみやかなものである（全体の
操作は３時間以内で実施することができる。）。

場合によっては抗原の適用後多孔性支持体を十分乾燥す
ることが得策であるか・または必要である。この支持体
は室温で最小１時間好ましくは風乾することができる。

焼成は核酸類の場合に必要であるが、他の抗原について
は随意に行うことができ、これにより有害な影響を受け
ることはな（１）Ｑ従って本発明の一つの特色では、抗
原を直接適用して得られるキットが、更に処理を施す前
に、特に核酸の抗原がプログラムの一部として含まれて
いる場合に焼成される。焼成は約６Ｃ℃〜約１２０℃、
好ましくは約８０℃の温度範囲で約５分〜約１２時間、
例えば１時間行うのが好都合である。

変性された核酸がそのような条件下でニトロセルロース
に結合することが当該技術から知られてＧ）る０天然の
ＤＮＡが前記の条件下で結合することも、任意の核酸が
結合されて残り抗体分析の条件下で減成されないことも
予想することはできなかったことである。

本発明のキットによる免疫検定を実施する基本的操作は
以下のとおりである：装置は上述のように固体支持体に
抗原を適用することによって組立られる０基本的に２つ
の異形がある。一つは“学−ドツト法”であって、この
方法は抗原を１つた“ト法”であって１以上の抗原を適
用して１以上の抗体を試験するものである０“多重ドツ
ト法”においては、多孔性支持体、例えばニトロセルロ
ースシート上の抗原の配列は既に指摘したように一次元
状でも二次元状でもよい０最終の配列が一次元状のもの
である場・合には・試料は一組の平行線として適用され
、例えば全免疫グロブリンの既知濃度の内部標準が同じ
ようにして適用される。゛支持体の残留結合容量は支持
体例えばシートラ緩衝塩溶液に６封鎖溶液＃（例えば１
０％のウマ血清）を加えたものの中に、例えば４０℃で
２時間浸し、次に乾燥して封鎖される。試験用支持体は
この状態で乾燥して、または例えば抗原のラインに対し
て垂直な個々の試験用細片を切離した後に貯蔵して送り
出される。この細片は実用的な程度の細さにできるが、
巾が３ｉｕ＋以上であってはならない。実際の試験では
全ての試薬は適当な分別量の凍結乾燥状態で容易に貯蔵
し、試験のために元に戻すことができる。調査する血清
は封鎖溶液を含む塩水で適当に希釈される。希釈率１：
１００゜１：　１０００及び１：　１００００が通常用
いられる。

細片は、例えばオートメーション化した微量滴定濃度溶
液装置ｉ　（ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ
　ｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ）のために用意されているよう
な使いすてのできる挿入容器（ｗｅｌｌ　１ｎｓｅｒｔ
　）　ｓすなわち例えば微量滴定濃度プレートの容器に
等しい多数の試料を同時に適用するための貯蔵器として
用いられる装置等の中にある１つの希釈溶液中に浸され
る。個々の容器は通常長さ１０ｃｒｎ、巾４藺、深さ１
ｍである。細片はこの希釈溶液中で例えば２時間〜−夜
室温で緩和に攪拌しながらインキュベートされる〇過剰
の血清を次に緩衝塩溶液で例えば３回充分洗うことによ
り洗浄する。洗浄の時期は重要ではなＧ）。次にインジ
ケータ抗体の試料を加える。これは通常ペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗〜ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖＋Ｌ鎖）であり、処理
は２時間つづけられる。希釈も一般に同一の封鎖溶液で
行われる０インジケ一タ抗体を次に同じ手順により、例
えばｌＯ分間３回充分に洗い出す。インジケータ抗体を
次に、螢光発光、オートラジオグラフイオたは結合酵素
に対する適当な基質のような適当な方法により可視化す
る。ペルオキシダーゼの場合には基質は過酸化水素の存
在下でのＯ−ジアニシジンマタはクロロナフトールでよ
い。呈色反応を次に例えば３０分間〜２時間展開させる
。個々の抗体の滴定濃度（タイタ・−１、ｔｉｔｅｒｓ
）が次いで元の血清の最良の希釈率を選び、標準のもの
との着色濃度を比較することによって読み取られる０着
色濃度はまた細片を適当な屈折率の媒体中に浸してそれ
を透明にして透過率を読取るか、または反射強度を測定
するように設計された装置を用いるかすることによって
、デンジメトリー装置を用いて直接読取ることができる
。薄層クロマトグラムで着色濃度を測定するために用い
られるような装置が後者の目的に適しており、同じ装置
は螢光発光強度をも測定′することができる。インジケ
ータ抗体が螢光性標識を有するか酵素の螢光性基質であ
る場合にも、そのような装置により定量することができ
る。

タイター（滴定濃度）が、例えば正常なヒト血清または
純粋なヒト免疫グロブリンの内部標準で目盛づけされた
ものを用いて測定される場合には・そのユニットは特異
抗体種の形態の全免疫グロブリンのフラクションである
か、またはオリジナル血清の単位容積あたりのマスユニ
ットのような抗体の単一濃縮物である。このユニットは
異なる個体からの血清または血漿を比較する上で、広い
有用性をもち、また異なる検定システムを用いる場合に
も有用である０ 誘発朗による免−疫検定を実施する、更に詳しく好まし
い方法を、発明の範囲を限定することなく以下に記載す
るＯ Ａ）単一ドツト法（Ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｔ　ｍｅｔｈｏ
、ｄ　）　：（１）シートの調製 長方形の格子（グリッド）を各辺が４１１Ｊ以下のニト
ロセルロースのシート上につけるか、または３’Ｘ３Ｉ
Ｉｊのグリッドを前以ってプリントしたニトロセルロー
ス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使用する。このシート
を蒸留水で５分間洗浄しｔ室温に放置して乾燥／する０
その後の処理では、シートを先が丸いピンセットで取扱
う。洗浄は常に必要とは限らない。

（２）　　ドツティング（点描、　ｄｏｔｔｉｎｇ　）
フィルターが乾燥した後、抗原溶液の小滴を各四角辺の
シートにのせる。その濃度は抗原によって異なる。コ、
ンＪプレックス抗原では０．１〜１、Ｏｆ／ｄ　　が適
当であるが、コンプレックスのより少ない混合物ではそ
れに応じて濃度を下げることができる０乾燥すると結合
が安定化するので、この段階でフィルターを十分乾燥す
ることが有利な場合が多い。核酸の結・合は８０℃で２
時間必要である。抗原をドツティングしたシートは活性
を失うことなく室温でいつまでも乾燥して貯蔵される０
　ドツトはできるだけ小さい方がよい。２０μｔのトン
ティングにはミクロピヘツァング装置が便利であり、ま
た５μｌＤｒｕｍ−ｍｏｎｄ　　のミクロディスペンサ
ーが０．５μｔをドツティングするのｉこ用いられ、更
にＨａｍｉｌｔｏｎ　　の注射器が０．１μｔをドツテ
ィングするのに用いられる０抗原が非常に希薄である場
合には、同一場所に連続的に投与して適用してもよいが
、フィルターは各適用量時に乾燥する注意が必要である
０このフィルターは次にＴＢＳ　（すなわち、０．１５
〜０．２Ｍ　ＮａＣ４，０，０１−０，０５Ｍ　　トリ
ス−ＨＣｌ　、ｐＨ７，４−７，８）中で洗浄する。個
々の四角送形シートはニトロセルロースがまだ湿ってい
る間か、または乾燥状態で裁断することができる０湿時
には外科用のメスで裁断され、または裏打の紙がある場
合（これは裁断中にひび割れするのを防ぐ）にはその紙
も一緒にハサミにより裁断される。四角送形のシートは
９ｑ容器のミクロ滴定濃度面（Ｃｏ５ｔａｒ　Ｉｎｃ、
ケンブリッジ・マサチューセッツ州）の容器内で上に向
けて置かれる。

（３）封鎖（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　） 各容器にはウシの血清アルブミン、全血清または任意の
組成物からなる１５０μｔの封鎖溶液を加える。（ウシ
の血清アルブミンは３％であり、ウサギ、ウマまたはヤ
ギの全血清は１−１０％である。）シばしば封鎖システ
ムを５６℃で３０分間加熱して補体を分離することが必
要である。封鎖は室温〜４０℃で１５分間〜２時間行わ
れる。このようにして調製されたフィルターも活性を失
わずにいつまでも貯えることができる。

（４）−次インキュ、１−ジョン（Ｐｒ　ｉｍａｒｙ　
１ｎｃｕｂ−ａｔｉｏｎ　） 封鎖溶液は吸引ラインに取付けられた例えばパスツール
・のピペットのようなピペットにより吸出され、抗体試
験溶液（−次抗体）が加えられる。１容器あたり１５０
μｔで確かに十分であるが、半分の量でも足りるであろ
う０インキユベーシヨンの時間は抗体によって異なる。

多くの場合には２−４時間で十分であるが、−晩のイン
キュベーションで１０倍以上の感度が得られる０抗体の
希釈液は封鎖溶液中で作るべきである。

（５）　　洗浄（ｗａｓｈ　） 試験抗体溶液は容器から、例えば注ぎ出して除去され、
支持体は少なくとも４回、好ましくはＴＢＳ溶液を用い
て洗浄される０洗浄時間は数分から数時間の任意である
０ （６）二次インキュベーション（５ｅｃｏｎｄａｒｙ　
ｉｎｃ　−ｕｂａｔｉｏｎ　） 支持体は、例えばワサビダイコン（ｈ＆ｅｒａｄ−ｉｓ
ｈ　）ペルオキシダーゼ結合抗−１−次スビーシーズ免
疫グロブリン１００〜１５０μを中で、室温にて緩和に
振盪しながらインキュベートする。ここで“−次スビー
シーズ“は試験する抗体のものである。例えば、−次抗
体がマウスで育成された場合には、オランダ、Ｔｉｌｌ
ｂｕｒｇ％のＮｏｒｄｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
等のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＱｓまた
はデンマーク、−１ＣｏｐｅｎｈａｇｅｎのＤＡＫＯ等
からのウサギ抗−マウスＩｇＧが用いられる。ウサギま
たはヒト血清が分析される場合にも、例えば上述の会社
からの相当する二次（インジケータ）抗体を用いること
ができる。抗体の特異クラスを検出するためには、これ
も上記の北欧の会社等から得られるＩｇＧ　、　ＩｇＡ
　、　ＩｇＭ　、　ＩｇＤ　、　ＩｇＥに特異的なりラ
ス特異二次抗体を使用することができる。抗体液（好ま
しくは封鎖溶液中で用いられるが、他の希釈液をも用い
ることができる。）の濃度は抗体のバッチにより変わる
が、封鎖中の抗体液Ｖ１ｏｏｏ　が好ましい。

（７）　　（５１に記載した洗浄が、ここで第二の抗体
を除去するために繰返される。

（８）展開（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　）４−クロロ−
１−ナフトール（Ｍｅｒｃｈ社製）。

０−ジアニシジンまたは３，３−ジアミノベンジジンを
ペルオキシダーゼの発色性基質とじて用いることができ
る０４−クロロ−１−ナフトールがメタノール中で３η
増の貯蔵溶液として調製されるが、この溶液は暗所で冷
蔵して１週間貯えられる。使用直前に・この溶液はＴＢ
Ｓの５−３０容量により希釈され、Ｈ２Ｏ２（通常３０
％水溶液として入手可能）については０．０１−０．０
３％に作られる。約１ｏｏＬ１５ｏμｔの展開溶液が各
容器毎に必要である。陽性の呈色反応は２分後に現れは
じめ、２時間後にはそれ以上の色の展開はみられない。

反応が完了した後、支持体を蒸留水または水道水で洗浄
する。

（９）貯蔵（Ｓｔｏｒａｇｅ　） ニトロセルロースのシートを、好ましくは湿っている間
に写真のマウンティングに用いられているゴムセメント
を用いてマウントすることができる。乾燥後は暗所に貯
蔵する必要があるＯＢ）多重ドツト法（Ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅ　ｄｏｔ　ｍｅｔｈｏｄ　）　：以下のように変更し
て同じステップを行う：抗原をグリ°ノド上で平行な列
で適用し、封鎖は裁断前にシート全体について行う、シ
ートを簡単番ζ洗浄し、乾燥し、その状態で貯蔵する。

使用前にノートをＴＢＳで再び湿らせ、抗原の列に直角
に適当な数の細片に切断して・各細片が各抗原の１つを
含むようにする。その細片をＤｙｎａｔｅｃｈ　（Ａｌ
ｅｘａｎｄ　−ｒｉａ　、　ウ７−　’）ニア州）によ
り製造されたプラスチック皿の樋、すなわち゛使いすて
できる貯蔵器挿入物”中の血清希釈液１−１．５−の中
に入れる。

これらは微量滴定濃度プレート（ｍＩｃｒｏ口ｔｅｒｐ
ｌ−ａｔｅｓ）及び多重ピペッティング装置（例えば・
Ｆｉｎｐｉｐｅｔｔｅ　Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ　Ｐ
ｉｐｅｔｔｅ　）と同一の寸法を持つ。皿は同時に８ま
たは１２の試料を希釈するために使うことができる。８
チヤンネルインサートに対しては３２までの異なる抗原
が長さｌ。

αのニトロセルロース細片上で用いられる。洗浄につい
てはｔ液体を・ま、ず皿から注ぎ出し、残りを除去する
。洗浄液は洗浄ビンで樋を充たすことにより適用される
。二次抗体についても１−１．５　ｍ用いられる。

Ｃ）定量 定量は純粋の免疫グロブリンの内部標準のシリーズを用
いるか、既知量の全免疫グロブリンを含む全血清を用い
て行われる。着色度は肉眼によって標準の着色度と比べ
るか、または走査装置を用いて定量される。反射率の測
定は薄層クロマトグラフィーの走査器を用いて行われ、
動的な３０の範囲（ａ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｒａｎｇｊ　
ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｄｅｃａｄｅａ　）で正確な定量が
行われる。

元の血清中の抗体濃度は免疫グロブリン量との関係を示
す標準曲線から計算される〇 本発明の抗体分析法はインジケータ抗体として上に挙げ
たものを用い、かつその他め条件が規準化されている場
合には再現性の高い呈色反応を示す。呈色反応は血清ま
たは血漿が適当に希釈される場合には抗体滴定濃度の定
量的な尺度である。

更に、例えば純粋のヒトＩｇＧの標準化量を、非特異的
な場所が上記の方法におって封鎖される前に微少多孔性
支持体に適用することによって、ヒト免疫グロブリン濃
度の内部標準シリーズを採用することにより分析は定量
化される。これにより試験後標準着色シリーズが得られ
、未知の血清や血漿によるか、または他の原因によるい
かなる変動をも自動的に補償する。変動の発生源の１つ
は・個々の血清が非特異的結合場所を封鎖するのに用い
る蛋白質に対して背景部で異なる結合反応をすることか
、または封鎖の処置を回避する微細多孔性シート上の非
特異的場所と背景部で異なる結合反応をすることである
。この背景は理由はわからないが個々の血清により異な
り、それ自体診断上有用である。しかし、スポット状で
適用された抗原の存在により抗体の存在の有無を直接感
度よく肉眼で測定することができる。

このように微少な差異を、例えば異なる容器にあるよく
似た試料を比較するような微量滴定濃度板の使用に依存
している通常の酵素−結合抗体検定において肉眼でみ、
る、ことは困難である。微細多孔性シート上の背景部の
上に抗原を物理的に並置したために、そうしない場合に
は肉眼でも分光光度法でも測定することが不可能な重要
な差異を検知することができることは全く予想外である
。

上述の定量的な呈色反応と内部標準の゛使用とにより個
々の抗体の滴定濃度（タイター）の定量的測定に器械を
用いることができるようになる。このことは電気泳動分
析やクロマトグラム分析に通常用いられているような任
意のデンシトメータにより行うことができる。光学密度
は、着色した反応生成物も・また微少多孔性シートラも
溶かさない適当な屈折率を有する溶媒に浸すことによっ
て微少多孔性シートを透明にして測定することができる
。放射能のシンチレーションカウンティングにおける用
途からトルエンがこのようにしてニトロセルロースを透
明にすることが良く知られている。実際上、トルエンも
キシレンもまたグリセリン−水混合物も０−ジアニシジ
ン酸化生成物の色を溶解せずに支持体を透明性にする。

更に、抗体滴定濃度に対する定量的な応答は抗原を飽和
する濃度の１０００倍以下の範囲内の抗体により得られ
る。詳細な希釈シリーズは従って必要′でなく、本発明
は日常的な使用に極めて適したものになる〇ある種の疾
患、特に慢性感染症においては、反応性が未知の、一定
クラスの抗体の不均一個体群濃度が大きく増大すること
が知られている。これらはポリクローン性ガンモパシイ
（ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ　）と呼ばれている。多数の無
差別に選ばれた抗原を持つそのような患者の血清または
血漿の試験によりそのような疾患の診断が促進される。

例えば、伝染性単核症患者の血清は用いた１７の抗原の
うち、対照（コントロール）抗原に対するものをも含む
１０の抗原に対して、予想に反して高い抗体滴定濃度を
示す（例３参照）。特に高いのはハシ力ウイルスに対す
る抗体滴定濃度であり、このハシ力ウイルスは抗原的に
は無関係であり、全体的に無関係なウィルスによる感染
に基づく伝染性単核症の病因とは関係があることは以前
には述べられていないものである。この滴定濃度は商業
的にハシ力に、陽性なヒト血清コントロールとして入手
できる血清中よりも幾分高いものである。ハシ力ウイル
スに対するこの予想外に高い滴定濃度の発見は伝染性単
核症の診断に有用である。

更に・詳細な抗体のプロフィールはポリクローン性ガン
モパシイ（ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ）によりもたらされる
病気の診断のための重要な新しい手段となるであろう。

本発明による上述の装置は抗体分析に対する用途に限定
されない：これらの装置は、天然に存在する巨大分子状
の動物または植物組織の有機物質・例えば天然に存在す
るか、人工的に作られる蛋白質、天然に存在する蛋白質
結合物（グリセロ蛋白質、リボ蛋白質または蛋白質−核
酸コンプレックス等）を含む生化学及び免疫学において
、前述のように多孔性固体支持体に適用することができ
る限りは分析的特性の目的に適い得るものである０免疫
グロブリンは前記の支持体にも結合するであろうが、こ
のことが前述の試験において、非特異的な背景部結合を
免疫学的検定を実施する前に除（必要があることの理由
である。リボ核酸及びデオキシリボ核酸は本発明の新し
いキットによる検定にも使用することができ、後者は自
己免疫病を試験するプログラムに含める場合に特に重要
なものである。

本発明による装置は、またリューマチ因子犀び循環免疫
コンプレックスの検出にも適している０このような免疫
グロブリンまたは抗原−免疫グロブリンコンプレックス
は、慢性炎症の状態にある患者、特に結合組織病の患者
の血清にしばしば認められる。リューマチ因子の場合に
は、ウサギ等の動物スピーシーズのＩｇＧを、上述のよ
うにして封鎖溶液によりインキュベートし、次いでヒト
血清等の分析する血清によりインキュベートしたニトロ
セルロース等の多孔性支持体に適用する０リユーマチ因
子はキット上のＩｇＧに結合し、形成されたコンプレッ
クス及び結合されたリューマチ因子は、分析する血清ス
ピーシーズに対向するインジケータ抗体によって認識す
ることができ、例えばウサギ−抗−七、ト等の抗−ヒト
抗体であるＯインジケータ抗体は、通常適当な基質と着
色反応生成物を形成しつつ酵素に結合する。ヒト抗−リ
ューマチ因子のようにスピーシーズに特異的でないリュ
ーマチ因子を検出すべくセットする場合にはｔ封鎖溶液
中に存在するウマ等の他のスピーシーズの大過剰のＩｇ
Ｇによってスピーシーズに特異的でない抗体のクラスが
競争反応を起してしまうことが予想された。しかし驚く
べきことに、このようなことは起らない。

２免疫−コンプレックス検定の場合には、蛋白質Ｃｔｑ
はニトロセルロースに施し、たときにも特異的に抗原−
抗体コンプレックスに結合する能力を維持する。このこ
とはその蛋白質がよく知られているように不安定である
。ことからみて極めて驚くべきことである。それは支持
体上で乾燥された状態では室温において安定性である〇 本発明の新しいキットにより、例えば免疫検定を実施す
るのに使用することのできる抗原のグループは極めて広
範囲のものであり１例えばヒト生検物質、哺乳動物の組
織または細胞、体液、マイコプラズマ、後生動物寄生・
体、菌類、バクテリア、原生動物、ウィルス、またはこ
れらのものから誘導される標品が挙げられる。例に説明
した抗原は別として、下記に挙げるものが本発明におい
て使用するのに適当である：ウイルスまたはそれから調
製される抗原類：インフルエンザ菌株（、ｉｎ［１ｕ−
ｅｎｚａ　ａｔｒａｉｎａ　）、これにはＡ、Ａ、Ａ２
．Ｂ、Ｃが含まれる、パラインフルエンザ菌株１．．２
又は３・リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルろ（ｌｙｍｐｈｏ
ｃｙｃｔｉｃｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ　ｖｉ
ｒｕｓ　）　ｓ流行性耳下腺炎（Ｍｕｍｐｓ　）、Ｑ熱
すケッチア（Ｑ　ｆｅｖｅｒ　Ｒｉｃｋｅｔｔ　−８１
ａＬ狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）、呼吸系多核性ウィルス（
Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒ
ｕｓ　）　ｓロタウィルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ　）　
、風疹（Ｒｕｂｅｌｌａ　）　ｓアデノウィルス（Ａｄ
ｅｎｏｖｉｒｕｓ　）％エプスタイン・パル・ウィルス
（Ｂｐｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ　）　ｓプ
ルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ　）、ヘパテイテイスＢ　（
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ）、コクサソキ（Ｃｏｃｈ−ｓ
ａｃｋｉｅ　）　Ｂｌ　−Ｂ　６　、　Ａ９　、ポリオ
（Ｐｏ１ｉｏ　）　１　、２または３、レオ（Ｒｅｏ）
、エコ（Ｅｃｈｏ　）　１−３３　：菌類の抗原：ヒス
トプラスモサ・カプスラタム（、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍ
ｏｓａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）。

コエシデオイデス・イミテイス（Ｃｏｅｃｉｄｉｏｉｄ
ｅｓｉｍｍｉｔｉｓ　）　、プラストマイセス・デルミ
テイテイデイス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｒｍａ
ｊｉｔｉｄｉｓ）　、アスペルギルス・フーミガタス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊｕｍｉｇａｔｕｓ）、フラ
バス（ｆｌａｖｕｓ　）またはカル不ア（ｃａｒｎｅａ
　）　：後生動物抗原：エンテメバ・ヒストリティ力（
Ｅｎｔｅｍｅｂａ　ｈｉ　５ｔｐｌｙｔｉ　ｃａ　）、
トリバッフ’　７１１クルチ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ
　ｃｒｕｚｉ　）　ｓエキノコツカス・グヌロシス（Ｅ
ｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ　）　
ｓシストシマ０マンソニ（８ｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｍ
ａｎ＋５ｏｎｉ　）　：バクテリア抗原：スピＯヘート
・ライター（８ｐｉｒｏｃｂ−ｓｔｅ　ｒａｆｔｅｒ）
　ｓ　　トレポネマ拳パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅ−ｍｓ
　ｐａｌｌｉｄｕｍ　）　ｓニスケリチア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉ−。

ｃｈｉｎ　ｃｏｌｉ　）、レプトスピラ（Ｌｅｐｉｏｓ
ｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉ５ｔｅｒｉａ　）、サル
モ不う（８ｕ１ｍｏｎｅｌｉａ）、シゲラ（８ｈｉｇｅ
ｌｌａ）、ブドウ状球菌（８ｔａ−ｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｉ　）　ｓ連鎖状球菌（８ｔｖｅｐｔｇｃｏｃｃ　ｉ　
）、レギオネラ・ニュモフイラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
　ｐｎｅｕｍｏｐｈ　−１１ｍ　）　：自己−１抗原：
核ＲＮＰ　、補体フラクション・ヒト血清蛋白質、リウ
マチ因子、インシュリン、インシュリン受容体、甲状腺
刺激ホルモン受容体・アセチルコリン受容体及びその他
の′ホルモンまたは受容体；じその信金ての抗原類、す
なわちイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａ＠）の抗原、例えばダ
クタイリス・グロメラタ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ’ｇｌｏｍ
ｅｒａｔａ　）−ツ°エストウカ・エラティオア（Ｆｅ
５ｔｕｃａ　ｅｌａｔｉｏｒ　）　ｓロリウム・ペレネ
（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ　）、ツリウム・プラ
テンス（ｐｈｌｅｕｍ　ｐｒａｔｅｎｓｅ　）、ポア・
プラテンシス（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉａ　）　％ア
グリステイス・ストロニフエラ（Ａｇｒｉａｔｉｓ　５
ｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）、セカーレｅシアリアル（８ｅ
ｃａｌｅ　ｃｅｒｅａｌｓ　）等１薬用植物類の抗原、
例えばアルテミシア・ヴルカリス（Ａｒｔｅｍｉｓ−ｉ
ａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　）　ｓクリサンテマル・ロイカ
ンテマム（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ　ｌｅｕｃａｎ
ｔｈｅｍｕｍ　）　ｋヶノポデウム・アルバム・（Ｃｈ
ｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ａｌｂｕｍ　）　ｓタラキサム・
プルガレ（Ｔａｒａｘｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　）　ｓソ
リダゴψバガウレア（、８ｏ１ｉｄａｇｏ　ｖｉｒｇａ
ｕｒｅａ　）％アンプロシア書トリフイダ（Ａｍｂｒｏ
ｓｉａ　ｔｒｉｆｉｄａ）等、衡木類の抗原、例えばオ
レア・ヨーロピア（０１ｅａ　＠ｕｒｏ　−ｐ＠＠　）
　、　：ｘ、ガラシス、・、カリホルニカ（Ｊｕｇａｌ
ａｎｓｃａｌｉｆｏｒｎｉ’ｃａ　）　、ウムマスーア
メリカナ（Ｕ１ｍｕ鄭ａｍｅｒｉｃａｎａ　）　％コリ
ラス・アビラーナ（Ｃｏｒｙｌｕｓａｖｅｌｌａｎｓ＋
　）、ブラタナス・アセリホリア（Ｐｌａｔａ−ｎａａ
　ａｃｅｒｉｆｏｌｉａ　）等、菌類例えばペニシリウ
ム・ツタタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎｏｔａｔｕ
ｍ　）　ｓ　’クラドスポリウム・ヘルバラム（Ｃｌａ
ｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　Ｆｅｒｂａｒｕｍ　）　ｓアスペ
ルギラス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕ
ｍ　−ｉｇａｔｕｓ　）、動物類の上皮（ａｎｉｍａｌ
ｓ　ｅｐｉｔｈｅｌｉ’ａ　）例えばネコ、ウマ、ウシ
、イ辰またはギアナブタの上皮等、食物の抗原例えばミ
ルク、麦、アーモンド、カニ、フレベット（ｃｒｅｖｅ
ｔｔｅｓ　）等、チーズダニ（ｍ１ｔｅｓ　）の抗原、
塵埃（Ｄｕｓｔ）の抗原、昆虫類例えばミツバチやスズ
メバチの抗原及び医薬例工ばペニシリンＧ、ペニシリン
■、シナクセン（５ｙｎａｃｔｈｅｎ　）　１１　ステ
ロイドの抗原等。

免疫学上の操作−は、また特殊な薬剤を検出し、監視す
る場合にも極めて重要である。例えば疾患の処置の過程
においてモノクローン性抗体の使用をヘースとするこの
ような試験は特異抗体を多孔性支持体に適用し、上述の
原理に従って免疫検定の逆の操作により特異抗原を検出
し、定量するものである。特異的に抗原−抗体錯体に結
合する補体蛋白質の性質は、ここに記載したようなキッ
トにおいて、特異抗原、例えば薬剤その他の薬理学上の
試薬、またはホルモンのような特異抗原−才たはそのよ
うな抗原類の任意の組合せを直接または間接的に可視化
して定量するために用いることができる。従って本発明
は、相当する特異性又はモノクローン性抗体を本発明の
固体支持体に適用し、例えば補体ｃｔｑ等の補体による
か、または抗体−抗原相互作用に組合された酵素反応に
より抗原−抗体コンプレックスを検出することによって
、あらゆる種類の抗原・例えば薬剤及びホルモンをも分
析する免疫学上の方法を含むものである。診断のために
生物学上の液体中の特殊薬剤やホルモン類を監視するこ
とは、いわゆる“均−抗体検システム”（Ｈｏｍｏｇｅ
ｎｅｏｕｓ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｓａａｙ　ｓｙｓｔ
ｅｍ＋＋）（５ｙｖａ社　（カリホルニア）の商標ＥＭ
ＩＴ）によって近年促進されている。この分析システム
モは他の免疫検定システム、Ｔ：必要とされる十分な洗
浄の必要性はなく、その結果操作は簡単で・かつ迅速に
なる。均一抗体検定は、問題にする薬剤またはホルモン
、及びその薬剤またはホルモン分子と信号分子とのアダ
クツに対して特異的な抗体を使用することに依存してい
る。信号分子ア夛クンは測定し得る信号が特異抗体に結
合したときに発生しないアダクツである。後者の結合が
問題にする薬剤やホルモンの存在によって禁止されると
き、生物学上の液体中にある薬剤やホルモンに関連する
陽性の信号が生ずる。信号分・子はインジケータ酵素自
体、またはインジケータ酵素、亨いは測定し得る信号中
に生ずる酵素の結合シリーズに対する、基質、共因子ま
たは補欠分子団であるＯＤ、Ｌ４Ｍｏｒｒｉｇ、　Ｐ、
ＢＪｌｌｉｓ、　Ｒ，Ｊ、Ｃａｒｒｉｃｏ、　Ｆ、Ｍ。

Ｙｅａｇｅｒ、　Ｈ，ＲｏＳｃｈｒｏｅｄｅｒ、　Ｊ、
Ｐ、Ａｌｂａｒｅｌｌａ、　Ｒ，Ｃ。

Ｂｏｇｕｌａｓｋｉ、　Ｗ、Ｅ、Ｈｏｒｎｂｙ及びＲ，
Ｄａｗｓｏｎ　　によるＪｏｕｒｎａｌ　＠Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　”　５３巻、６５８
−６６５頁（１９８１年）の［ホモジニアス比色免疫分
析における標識としてのフラビンアデニンヌクレオチド
ｊ　（Ｆｌａｖｉｎ　Ａｄｅｎｉｎ　Ｄｉｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ　ａｓ　ａＬａｂｅｌ　ｉｎ　Ｈｏｍｏｇｅｎ
ｅｏｕｓ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　
−ａｓｌｌａｙ８）という標題の最近の文献には、分析
する分子（Ａｎａｌｙｔｅ　）が酵素グルコースオキシ
ダーゼの補欠分子団であるフラビンアデニンヌクレオチ
ドアダクツに共有結合される方法が記載されている０特
異抗体に結合したときには、分析する分子（Ａｎａｌｙ
ｔｅ　）とフラビンアデニンヌクレオチドとのアダクツ
はグルコースオキシダーゼを活性化することはできない
。アダクツが分析する分子の存在によって特異抗体に対
する結合を妨げられるとグルコースオキシダーゼは活性
化される。そしてこの活性化は未知の薬剤またはホルモ
ンの量に関係する。活性化されたグルコースオキシダー
ゼは反応生成物−とじてＨ２Ｏ２を生じ、このＨ２０□
はペルオキシダーゼに対する基質であり・発色性物質と
共に用いて呈色反応を起こすことができる。

均一抗体検定システムは誘発１明の方法により固体支持
体上で用いるように容易に適応させること−ができる。

特異抗体及び信号システムの巨大分子成分、例えばグル
コースオキシダーゼやワサビダイコンペルオキシダーゼ
は所望の配置、好ましくは同一場所で・画体多孔性支持
体上に直接適用して施すことができる。そこで結合酵素
反応は物理学的合致法（ｐｂｙｓｉｃａｌ　ｃｏｉｎｃ
ｉｄｅｎｃｅ　）からの利益を受けることができるであ
ろう。本発明方法によれば多数の抗体と信号システムの
インジケータ酵素とを同一の支持体上に施して同時に多
重抗原検定を容易に行うことができる。このアプローチ
は例えば薬剤誤用分析キット（ｄｒｕｇ　ａｂｕｓｅ　
ａｓｓａ、ｙｋｉｔｓ）や特異的バクテリア抗原同定キ
ットにおいて大きな用途があるであろう。

この発明は例えば免疫学の分野で分析のために使用され
る新しい装置を作ること及び上述のように免疫分析にそ
のような装置を使用することを目的にする限り、そのよ
うなプロセスの単一の各工程をも含むものである。

更にこの発明は、固体支持体の形態の上記装置に加えて
、皿及び分析において固体支持体を処理するのに必要な
道具類、並びに乾燥状態で調製された試薬類例えば予め
量を測定したキャリア血清インジケータ抗体、ペルオキ
シダーゼ基質等からなるキットにも部体するものである
。そのようなキットハ例工ばニトロセルロースシートま
たは細片の形態の本発明の装置と上記の任意の付属品と
を含む装備の形のものである。特に皿は多数９）凹部が
あるプラスチック製の皿の形を取ることができ、゛乾燥
試薬はインジケータ抗体、塩類、緩衝剤、キャリア血清
または蛋白質の凍結乾燥混合物であり・インジケータ酵
素の着色試薬は発色基質例えば４−クロロ−１−ナフト
ール、塩類、緩衝剤及び予め測定した量の液体物質例え
ば過酸化水素を入れたアンプルの予め秤量した分別薬で
ある。

この発明は特に検出と定量を計算かオートラジオグラフ
ィによって行う放射能で標識化したインジケータ抗体か
らなるか；または検出と定量をフルオーリメトリーによ
って行う螢光インジケータと結合されているか；または
検出と定量をデンシトメトリーまたは肉眼で行う適当な
基質との反応で呈色反応することのできる酵素と結合き
れているか；または抗原−抗・体コンプレックスに結合
した補体蛋白質をベースとし・その補体は上記の３種の
方法のいずれかにより、ままたは別の特異的な抗補体抗
体（これも上記の３種の方法のいずれかにより標識化さ
れている。）により標識化されているインジケータ抗体
からなるキット及び（または）装置を含むものである〇 更に本発明は特に、下記のａ）　ｌ　ｂ）及びＣ）・す
なわち ａ）固体支持体が、１以上の特異抗体と、抗原−抗体反
応が測定し得る信号を生ずる試薬との配列を含み、信号
システムはインジケータ酵素または酵素の結合シリーズ
のための基質、補因子または補欠分子団からなるか、ま
たは抗原と信号分子との共有結合アダクツからなる。酵
素または結合酵素システムは固体支持体に対して、特異
抗体と一緒か、または別個に適用するご′とができる；
しかし支持体には酵素または結合システムを全熱適用す
る必要はないし、溶液の状態で用いてもよい。

ｂ）固体支持体上の配列が人または動物の免疫グロブリ
ン、またはそれらのフラグ・メントをリウマチ因子の検
出及び定量のために含む。

Ｃ）固体支持体上の配列が、特に循環免疫コンプレック
スとして知られている循環抗原−抗体コンプレックスの
検出及び定量のための補体単白質を含む。

のキット及び（または）装置をも含むものであるＯ本発
明は更に、特に人間または動物の病気の診断、監視及び
予後の免疫検定法による、特異抗原または特異抗体また
はこの両方を検出及び定量するための、及び研究と開発
におけるモノクロン及び他の抗体または抗原の検出及び
定量のための、並びに未知の抗原を固体支持体に適用し
て、公知の抗体を用いる免疫検定法により検出と定量を
行うための、上述のような全てのキット及び装置に関係
するものである。

下記の例は本発明を説明するものである０例１：　ドツ
トサイズの変化 ヒト全血清を直接Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　（孔のサイズ、
０．４５μｍ）シートに適用する０その中のＩｇＧはペ
ルオキシダーゼ−結合ヤギ−抗ヒトＩｇＧにより染色さ
れたものである０適用容量をミクロドツト（ｍ１ｃｒｏ
ｄｏｔ　）の可能な最小のサイズを決めるために変化さ
せる０正常ヒト血清を、２％ウシ血清アルブミンを含む
ＴＢＳ　（０，１５Ｍ　ＮａＣＬ　、　０．０２ＭＴｒ
ｉｓ　−ＨＣｔ、　ｐＨ７，４）−中で１．：１０００
（７）容量比に希釈する０この溶液の分別量を次に３ｍ
Ｘ１００ＵのＭｉ　１１１ｐｏｒｅ細片上に０．１μｔ
ずつ変化させてマイクロシリンジ（ハミルトンのマイク
ロシリンジが好ましい）を用い直接スポットする。シー
トを次に乾燥し、１０％（Ｖ／Ｖ）ウマ血清を含むＴＢ
Ｓに浸して４０℃にて２時間インキュベートしてＭｉｌ
ｌｉｐｏｒｅシート上の非特異蛋白質の結合場所を封鎖
する。シート１ＴＢｓで洗浄し、次いで製造業者（Ｎｏ
ｒｄｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｔｉｌｂｕｒ
ｇ、オランダ）の仕様書に従って蒸留水に溶解したペル
オキシダーゼ結合ヤギ抗−ヒ）　ＩｇＧ　１−に浸し、
１０％ウマ血清を含むＴＢＳ中で１　：　１０００に希
釈した。処理は使い捨てのできる８樋の挿入容器の入れ
物（ｗｅｌｌ）　（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　　アレグサンドリア市、ヴアージニア州
、米国〕中で行われる。

ペルオキシダーゼ結合抗体によるインキュベーションは
室温で２時間静かにかきまぜながら行われる。過剰の抗
体をＴＢＳで充分に洗浄して除去する。

最後に勉ペルオキシダーゼ基質混合物をＴＢＳ５ｍ、３
０％Ｈ２Ｏ２水溶液１μＬｓｏ−ジアニシジン（１％Ｗ
／Ｖメタノール中）と調合し、この溶液】−を前記の樋
に加える。次に反応を暗所にて２時間進める。過剰の試
薬を脱イオン水で洗い出し、細片を室温で風乾し、スポ
ットの大きさをバーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ　）測径器に
て測定し、下記の結果を得る。

血清量　　　スポットの直径 ０．８μｔ　　　　　１，５　Ｍ ０．６μＬ　　　　　　１，３　＋ｕ ０．４μＬ　　　　　１．Ｏｗ ０．２　ｐＬ　　　　　Ｏ，６ｍ ｏ、１μｔ　　　　　Ｏ，３藺 微少点（ミクロドツト）の直径はＯ−０，２μｔの範囲
では適用した容量に関して直線性がある。量が多くなる
と直線性からずれるが、これは適用点における吸着によ
るものき考えられる。更に・グリッドを有するＭｉｌｌ
ｉｐｏｒｅシートを以上に広がらない程度に疎水性であ
る。ミクロドツトシステムの本質的な分析能力は、通常
のピペット装置で適用することができる最小量のサイズ
以下、すなわち（０，３ｍで極めて良好である。標準的
な長さ１００ｍの、”樋挿入容器″の入れ物に適合させ
た細片には、ここで用いられているように一次元配列で
スポットされた３００個の抗原を含めることができた。

二次元配列のドツＨ−使用する場合には１Ｏｃｒｎの四
角透影は１０５個までの試験薬を含むことができる。

標準のインフルエンザウィルス菌株の１シリーズを、赤
血球凝集反応標準試験に用いるように・Ｆｌｏｗ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｏツクピル市・メリーランド
州、米国）から入手する０製造業者から入手できるプリ
ントされたグリッドのあるＭｉｌｌｉｐｏｒｅシート（
孔のサイズ０．４５μｍ）の３ＩＩＪＩＸ３ｍａ四角辺
中にウィルス抗原懸濁物をスポットする０適用した試料
は希釈しない物質０．５μｔである。インフルエンザワ
クチン（８ａｎｄｏｚ″５ａｎｄｏｖａｃ”も同様にス
ポットする０試料は線状の配列でスポラｔ−ａれ、各線
は全く同一のスポット（複数）のみを含み、処理後にシ
ートを裁断して細片とし、各細片は抗原の完全なセット
である１つのドツトを含む。シートを−次いでウマ血清
により非、特異的結合場所を封鎖するために例１に記載
したようにして処理し、乾燥する０試験装置は乾燥され
ていると、活性を失うことなく室温でいつまでも貯蔵す
ることができる。血清は約３週間前ζこ上記のワクチン
により免疫化した個体から取られたものである。この血
清の希釈シリーズはＴＢＳ　１０％ウマ血清中で作られ
・まず１００倍に希釈され、次いで５倍ずつ希釈された
ものである。細片のシリーズは上述のようにして試験装
置から裁断される０ 細片は室温で一夜静かにかきまぜながら血清の希釈液中
に浸し、次、にＴＢＳで十分に洗浄する。結合された抗
体を次いで例１で述、べたのと全く同様にしてインジケ
ータペルオキシダーゼ結合ヤギ−抗ヒ）ＩｇＧにより着
色する０抗体の滴定濃度（タイター）を、着色を観察す
ることができる最大希釈液として終点法により記録し、
タイターをこの希釈率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏ
ｒ　）の逆数として表現する０下記の結果を得る。

Ａ／ブラジル／１１／７８ Ａ／／インコック／ｌ／７９　　　　　　　　　　　　
　　６２５，０００Ａ／シンガボ一ル／２２２／７９ Ｆｌｏｗ赤血球凝集反応試験抗原 Ａ／ＰＲ−８／３４　　　　　　　　　　　　　　２，
５００Ａ−１／ＦＭ−１７４７１２，５００ Ａ−２／ホンコン／６８　　　　　　　　　　　　　　
　　　　＜１００Ａ−２／英国／４２／７２　　　　　
　　　　　　　　　＜１０ＯＡ−２／日本／１７０／６
２　　　　　　　　　　　　　　＜１００Ｂ／　Ｌｅｅ
／　４０　　　　　　　　　　　　　　　　５００Ｂ／
Ｍａ！１ａ／３／６６　　　　　　　　　　　　　　５
００陰性ウイルスコントロール　　　　　　　　　　く
１００この表は個体をワクチン接種した抗原に対しては
血清は抗体の非常に高いタイターを持つが、ある種のヒ
ストリカルなインフルエンザ菌株に対しては滴定濃度が
著しく変化し・ウィルスを有今゛ないコントロール抗原
標品に対しては滴定１度は検出されない。従って全ての
インフルエンザ菌株は牟−の操作で個体の血清に対して
容易にタイターが決められる。この方法は才た極めて敏
感である：高い滴定濃度（タイター）の抗体については
終点は濃度（Ｃ）が１０６−倍希釈液であり、必要な血
清は極めて少量であり；最低の希釈液については媒質１
−中１０μｔである。この方法は個体検定法に各々抗原
を必要とする通常の赤血球凝集抑制試験または補体結合
試験よりもすぐれている。細片は結果を永久的に記録し
、いつまでも保管することができる。

装置は例２と同様Ｉζ商業上入手できる抗原をスポット
することにより構成される。下記の抗原を最大の応答が
得ら仙るに十分な、希釈率で使用する。抗原は全てＴＢ
Ｓ中で希釈する。

抗原に関する記載　　　　　　　　使用した希釈液Ｂｅ
ｈｒｉｎｇ　　： 螢光性抗体試験キットからのトキソプラズマ　　　希釈
せずハシ力（Ｍｅａａｌｅａ　）赤血球凝集抑制試験　
　　　　　１／２５オルニドシス（Ｏｒｎ　１ｔｈｏａ
ｉｓ　）補体結合試験　　希釈せずＦｌｏｗ： アデノウイルス型４ウィルス補体結合試験　　　　　　
１１５Ｓａｎｄｏｚ　　： ３ａｎｄｏｕｃインフルエンゼワクチン　　　　　　　
希釈せずこれらの例は診断キットの要素としての陽性コ
ントロールヒト血清の入手のしやすさに基づＧ１て選択
されたものであるｏしかし、最初の何カ）ら嬰らかなよ
うに１試験あたりの抗原の数は所望によりはるかに多い
数に増やすことができる０試料と、入手できる場合には
陰性フントロール抗原とが例２と同様にプリントされた
グリッドを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅシートにスポット
され、非特異的場所はウマ血清で封鎖され、乾燥されて
前述の例と同様に保管される。個々の細片は例２のよう
−にシートから裁断され、前記の表に挙げたキットと同
様にして陽性及び陰性コントロール抗血清により試験さ
れる０血清゛は全てＴＢＳ　−１０％ウマ血清中で１：
１００に希釈され、関連の試験細片は例２のようにして
処理される０このシリーズにおいては、各血清に対する
各抗原について結果を陽性（プラス）または陰性（マイ
ナス）として記録し、下記の表に総括する。

どの場合に（、丸で囲んであるように相当する試験抗血
清と試験抗原との組合せについてはスポットは陽性であ
る。

陰性コントロール血清は全て取得されたキット中に供給
される抗原に対しては陰性であるが、それぞれは他の種
々の抗原に対しては陽性である。

陰性コントロール抗原も供給される血清に関しては陰性
であるが、しばしば他の血清はそれらの標品に対向する
抗体を持つ。本発明の方法では従ってそれを構成してい
るキットの場合と同じ弊異性が得られる。

これらの試験の多くは単純性庖疹（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉ
　−ｍｐｌｅｘ　）　ｓ水痘帯状庖疹（Ｖａｒｉｃｅｌ
ｌａ　ｚｏｓｔｅｒ）　４たはアデノウィルスのような
固有ウィルスに対する抗体のためのものである。従って
これらの抗原に対して陽性であるように特異性をもたら
さない多くの血清中でそのような固有の抗体を見出すこ
とは驚くべきことではない。実際上、そのような抗体の
完全な欠如は個体の免疫防御システムにおける欠陥を示
すものであり、問題にしている居応物によって極めて感
染しやすいことを示すものである。実際には、通常使用
されている多くの血清学上の手法に関しては、滴定濃度
のみを変えることが現実の感染の診断に有用である。単
核症血清は明らかに関係のない広範囲な抗原に対して一
定のに体を有する。ハシカウィルスに対する抗体の滴定
濃度は特に高い。ある種の陰性コントロール抗原標品に
対するものをも含めて、明らかに無関係な抗体の広いス
ペクトルの出現はポリクローン性ガンモパシイ（ｇａｍ
ｍｏｐａｔｈｙ　）を示すものであり・感染性単核症の
診断に有用である。

感染性単核症血清のほかに、他の数種の血清がインフル
エンザコントロール抗原に対し抗体を与える。この説明
は純粋でない抗原の最悪の場合についてのものである。

０インフルエンザ抗原はワクチンとして人間に用いられ
るように高度に精製されたウィルス標品であるが、これ
に対しコントロール抗原は卵蛋白質を不純物として含む
はるかに精製度の低い標品である０どのようなケースで
もこのコントロールに対する抗体の滴定濃度はウイルス
抗原に対する滴定濃度よりも常に低い。不純物に対して
そのような抗体が存在することは・血清を採取した患者
が通常用いられているワクチン標品中の不純物に対して
アレルギー性であったことを示すものである。別の場合
としては、その患者が卵にアレルギー性であったことを
示すものかもしれない。実際上、そのような抗体を監視
することは、ワクチン、環境及び食料のアレルギーの制
御に有用であろう。

アレルギーは通常ＩｇＥ型の循環抗体の存在と関連して
いる。ここに記載したようにペルオキシダーゼ結合ヤギ
抗−ヒトエｇＧのインジケータ抗体による検定により、
用いられるヤギ抗体がＨ鎖及びＬ鎖の双方と反応するの
で、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体が検知されるｏ　ＩｇＧやＩ
ｇＭｓ又は例えばＩｇＦｉに特異的な抗体を用いて、更
に特異的な試験を組立てることができる。

この装置は例３で用いたのと同一の抗原により・自己免
疫疾患を表示する抗原を加えて構成され６０下記に述べ
るように純粋な変性核酸類、及び典型的な非分化性ヒト
細胞系統から採取できかつ容易に多量に培養される、ヘ
ラ細胞より導かれるサブ細胞（５ｕｂｃｅｌｌｕｌａｎ
　）フラクションが用いられるＯアクチンとミオシンも
抗原として用いられる（ウサギ：　Ｓｆｇｍａからのも
の）０ サケ（鮭）精子ＤＮＡ　（５ｅｒｖａ　ｓハイデルベル
ク）を１Ｍグリオキサールの存在下で１００℃にて２分
間加熱し、次いで急速に冷却して変性する０エスケリキ
ア・コリ（大、腸菌）リポソームＲＮＡを公知の手順に
よって大リポソームサブユニットから調製する［　Ｇｏ
ｒｄｏｎ、　Ｒａｍｊｏｕｅ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８３　、７６３−７６６（
１９７７）参照〕０ヘラ細胞は培養さ・れ、サブ細胞フ
ラクション１〔核、ミトコンドリア、仁、ポリソーム及
びサイトソール（ｃｙｔｏｓｏｌ　）フラクション〕は
既知の方法によりヘラ細胞から調製される（　ｐ６ｎｍ
ａｎ。

８、Ｊ９Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　Ｌ７　、１１７−１２５
（１９６６））。

蛋白質濃度が１−ｘｏ虻−の範囲の上記の全ての抗原に
ついて０．５μｔの分別量を例３に記載し１こようにし
て、下記の２段階でＭｉｌｌｉｐｏｒｅシート上にスポ
ットする０ １）　　ＲＮＡ及び変性ＤＮＡをニトロセルロースに不
可逆的に結合させる公知の操作（Ｐ、Ｓ、、Ｔｈｏｍａ
ｓ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ　７７．５
２０１−５２０５（１９８０）参照〕に従って、核酸を
直接スポットし、８０℃にて２時間シートを焼成して結
合させる。天然のＤＮＡもこのようにして結合すること
は以前には知られていなかった。

２）このように゛処理したＭｉｌｌｉｐｏｒｅシート上
に、残りの他のすべての蛋白質、細胞またはサブ細胞フ
ラクションをスポットする。

次いで先述の例に記載したようにして装置を調製し、自
己免疫疾患に苦しむ患者の個々の血清といくつかのコン
トロールの患者血清とを試験するために細片を裁断する
。血清はＴＢＳ　−１０％−ウマ血清中でのｌ／ｌｏｏ
　、　’／１０００　及び１／１００００倍の希釈液で
試験し、前例のように処理する。更番こ、装置は試験に
おけるＩｇＧ内部標準として正常ｔｉ）血清の０．５μ
ｔのスポットを含ｔｌ’。

これらはＴＢＳ　、　１１ＮＩ／ＩＲｔウシ血清アルブ
ミンの１／１ｏｏｏ　、　’／２０００　、　’／４６
００及び／５ｏｏｏ希釈液である。

疾患はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎの基準によって診断され
る０結果を下記の表番こ総括する。

この表では、抗体滴定濃度は正常な個体の血清または表
に示した疾患に罹っている個体の血清からのものである
。血清は１−２０の番号を付されている。滴定濃度は特
異抗体ＸＩＯ”−’としての全免疫グロブリンのフラク
ションで表示されている。

抗体が意味のある量検出されない場合には、記載はなさ
れていない。意味のある量の抗体があっても標準の範囲
外である場合には結果はくｌまたは〉５００として示さ
れている。

ＳＩＪ　＝全身性紅斑性波ｆｌｌ　（ｓｙｓｔｅｍｉｃ
　ｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ　） 貼　−リウマチ様関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒ
ｔｈｒｉｔｉｅ） ＭＣＴＤ　＝　　混合結合組織病（ｍ１ｘｅｄ　ｃｏｎ
ｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕ＠ｄｉｓｅａｓｅ　） ＭＳ　　＝　　複合硬化病（’ｍｕｌｔｉｐｌｅ　５ｃ
ｌｅｒ＠ｓｉｓ　）ＩＣＤ＝免疫コンプレックス疾患（
ｉｍｍｕｎｅ　、　ｏｏｍ−ｐｌｅｘ　ｄｉｓｅａｓｅ
　） ＡＥ　　＝アンギオニウロテイク浮１１ｉ　（ａｎｇｉ
ｏｎｅｕｒ　−ｏｔｉｃ　ｅｄｅｍａ　） かなりの数の自己抗体が自己免疫血清に認められる２１
例では天然のＤＮＡに対して特異抗体であるが変性ＤＮ
Ａとは反応しないものであり、他の例では全細胞、細胞
小蕗官等に対して特異抗体であるものがあり、それから
蛋白質のみでなくより広い抗原スペクトルに対１て試験
が感度８有することが明らかである。２００の個体ＳＩ
Ｊ血清の収集において、抗−天然ＤＮＡ及び抗−変性Ｄ
ＮＡの滴定濃度は異なる個体間で広範囲に変わり、互に
独立していることが認められている。このことは検定が
特異的であることを示している０場合によっては・血清
が既に処置を受けた患者からのものであるために自己免
疫抗体がもはや存在しないこともありうる。前に述べた
ように他の場合には、卵蛋白質に向けられた抗体は°し
ばしばインフルエンザウィルスコントロール中に検出さ
れる。

この検定システムは、自己免疫疾患の診断についての既
存の方′法論よりもすぐれた下記のような利点を有する
：関心のある全ての抗体が別個の方法よりもむしろ１つ
の方法で測定することができる。副細胞コンパートメン
ト（５ｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｏｍ　−ｐａｒｔｍｅ
ｎｔｓ　）に対する特異抗体は通常螢光顕微鏡により測
定される０これは退屈なものであり、主観的であり・ま
た長時間を要するが、本発明の方法は簡争であり、自動
的に殖量することができる０ウサギのアクチンとミオシ
ンは商業的に入手できるために加えられる。この方法が
それらの蛋白質に対する抗体を検出できることは明らか
である。

しかし、自己免疫疾患を診断するために、それらを相当
するヒト蛋白質に置換することが可能であり、また同様
にヒトコラーゲンに置換することも可能である０更に・
特殊化し１こ蛋白質を作る種々の分化細胞も含むことが
できるし・またここで用いられている未分化のヘラ細胞
をも含むことができる。このキットは、免疫抑制剤によ
る自己免疫疾患の処置の過程で患者を監視するために使
用することができるという別の利点を有する０その場合
には病理学上の抗体の消失を監視し、固有な良性の抗体
の抑制を避けるように処置を°制御し・患者の免疫系を
全体的に損わないようにすることが一亘一 純粋なヒトＩｇＧの標準希釈液シリーズを例１のように
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシート上にスポットする。次にシー
トを例２で使用したのと同じ血清のＶｌｏ　ｏ希釈液を
用いて例２と全く同じように処理する。

スポットの反射率をＣａｍａｇ社（Ｍｕｔｔｅｚ　、ス
イス）により製作された薄層クロマトグラムスキャナー
を用いて定量する。下記の結果が得られる。

０５４ ２３．３　　　　　　　　　４９ １０．８　　　　　　　　　４１．８ ５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３７２．３３
　　　　　　　　２２ １．０８　　　　　　　　１４ ０．５　　　　　　　　　１０ ０．２３　　　　　　　　　　　　　　　　７反射率の
測定により結合した抗体量が３０以上の動的範囲以上（
ｄｙｎａｍｉ−ｃ　！ｐｎ３ｅ　ｏｆ　ｇ’ｒｅａｔｅ
ｒ　ｔｈａｎｔｈ　ｒｅｅ　ｄｅ　ｃａｄｅ　）　　で
抗体を定量でき、結合した抗体量が０，５ｒ＋ｌＦ以下
で検出できることが表から理解できる。

西に　種々のペルオキシダーゼ基質の比較例５の抗体分
析を２回繰返す：第１の場合には・例５と全く同じ操作
を行い、第２の場合には以下の変更が行われる：Ｔｎｓ
ｓ−１Ｈ２ｏｗ　（水中３０％ｗ／ｗ　）　１０μを及
び０−ジアニシジンの代わりにメタノール中の４−クロ
ロ−１−ナフトール０．３％ｗ／ｖ　（Ｍｅｒｃ４に社
）０．３ｍを用いる。着色感度は等しいが、０−ジアニ
シジンは４−クロ０−１−ｆフトールよりもわずかに高
い背景濃度を与える。

ジアミノベンジジンも同様に用いることができる。

４−りＤロー１−ナフトールが発ガン物質であることは
知られていないので、商業上それを用いるのが好ましい
。

交雑腫瘍細胞系統（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　１
ｉｎｅｓ％）の調製においては、関心のある特異抗体を
作る可能性のある多数のクローンを選別する必要がある
。

もし複数の別個の抗原に対する抗体についての各クロー
ンを選別することを欲する場合には前述の例の方法論を
殆ど変更せずに使用することができる。もし争−の抗原
に対する抗体を選別することを望む場合には下記の手法
を用いることができる＝Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅシートを４
１１ａ以下の四角片にマークするか、または既にプリン
トされた四角辺を有する・前例で用いたような市販品を
入手できるＭｉｌｌｉｐｏｒｅシートを使用する。予め
蒸留水でＭ目１ｉｐｏｒｅシートヲ洗浄すると有利な場
合がＪい０ラツト脳シナプトソーマル原形質膜（Ｒａｔ
　ｂｒａｊｎ　ａｙｎａｐｔｏａｏｍｅ　−ｒｌ　　ｐ
ｌａｓｍａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　　（Ｔｏｎｅｓ、Ｄ、
Ｈ，、Ｍａｔｕｓ。

Ａ、１．、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ１６ｐｈｙｓ、　Ａ
ｃｔａ　３５６．２７６７２８７（１９７４））が蛋白
質濃度０．１−１岬／−の範囲で抗原として用いられる
。これらの抗原の標品０．５μｔを例２に記載したよう
にＭｉ　１１１ｐｏｒｅシートにスポットする。必要な
らば、局部的濃度は適用毎に乾燥しながら同ｄのスポッ
トに繰返し適用することにより高やることができる。次
にシートをＴＢＳで洗浄し、所望により前例で述べたよ
うにウマ血清の封鎖溶液で処理し、乾燥、して保存する
。個々の四角片を裁断しＣｏ’ａｔａｒ皿（ケンブリッ
ジ、マサチューセソッ州、米国）の容器に入れる０各容
器を３％ウシ血清アルブミン１５０μｔ、ＴＢｓ中１％
正常ヤギ血清で室温にて振盪しながら１５分間処理する
。別の場合として、Ｍｉ　１１１ｐｏｒｅシートが封鎖
溶液で処理されたときに１ま容器＆ｌ別々に被覆するこ
とができる。被覆された皿とフィルターはその状態でも
保管することができる。

マウスをラット脳シナプトソーマル原形質膜標品で免疫
化し、牌臓を除去し、骨髄腫細胞で交雑化し、選定した
媒質中の２００の容器に分けて、公知の方法（Ｇ、ＫＨ
ｈｌｅｒ、　Ｃ６Ｍ１ｌａｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅυ
５６，４９５−４９７（１９７５））　　により交雑腫
瘍、を育成する０ １０日後、容器からの上澄液を分別して四角片を含むＣ
ｏａｔｅｒ　　プレート容器に入れるか（容器１個につ
き７５−１５０μｔ）％またはそれからｅ希釈液を封鎖
溶液に入れ、抗体結合反応を、抗体の一活性によって２
時間から一部続ける。媒質を次に除去し、過剰の抗体を
ＴＢＳで十分に洗浄して除く。

次いで結合した免疫グロブリンを前記の例と同様に処理
してペルオキシダーゼ結合ヤギ−抗マウスＩｇＧにより
特異的に着色させる。４８０の容器のうち１７０につい
て陽性が検出される。

この操作は任意の抗原または抗原の混合物に対する交雑
腫瘍を、スクリ°−ニングするためのキットの調製に用
いることができる。シートや四角片で免疫化する場合に
は、通常のプラスチック琴皿で免疫化する場合よりも抗
原を容易に取扱い貯賦できる利点があり、Ｃｏ５ｔａｒ
　　皿の全容器を抗原でコーティングする場合よりも少
ない抗原ですますことができ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ上の
背景部の着色と抗原に結合してい多抗体とを直接比較で
きるので高い識別感度が得られると共に背景部の高い反
応性による偽陽性を除去する”ことができる。

モノクローン抗体を例７と同様にして得る。このモノク
ローン抗体を種々のラット組織からの粗ホモジエネート
中のＭＩＴ−２’３抗原の検定に用いる。各側において
・ホモジエネートを１．０シー量でドツト（点描）する
。組織としては肝臓、小脳１前脳、腎臓、−胸腺、横紋
筋、心筋を用いる。抗原ＭＩＴは小脳及び前脳に存在す
るが、他の組織では検出されない。ドツト中の抗原濃度
を段階的に減少させた実験では、、ＭＩＴ−２３は小脳
ホモジエネートの５０ｐｆ／−で゛検出されるが１０μ
〃−では検出されず、組織パネルの陰性メンバーは小脳
中で認められるＭＩＴが５％以下のものであることを示
すものである。

の測定 リウマチ因子は他種のＩｇＧをも含むＩｇＧに結合する
血清中に認められる免疫グロブリンとしで定義される。

循環免疫コンプレックスはある種の異８−Ｃ，□□、あ
。。□ＫＭ−’にオ、７ス。

マウスである。これらは共に結合組織疾患の診断の一部
でしばしば測定される。ウサギＩｇＧ（Ｎｏｒｄ−ｉｃ
）がリウマチ因子の試験として用いられ、ヒトＣ１ｑが
免疫コンプレックスの試験として用いられる。

ウサギＩｇＧ及びＣ１ｑをＴＢＳ中に１シー溶かし、０
．５μｔのスポットをニトロセルロースに適用する。

次にシートを前記の例と同様にしてＴＢＳ　−１０％ウ
マ血清により封鎖するヒト自己免疫血清（ｓｔ、ｇ：例
７の階７、ＭＣＴＤ：例４の階１１及び正常コントロー
ル）、先天的に自己免疫疾患に敏感な近文系株ＭＲＬの
マウス血清、及び非自己免疫ＢＡＩ４／［３：のコント
ロールを全てＴＢＳ中の１０％ウマ血清で１００．１０
００及び１００００倍に希釈し、シートをこれらの希釈
液の、存在下で室温にて一部インキユベーションする。

次に試料をＴＢＳで洗浄し１ヒト血清につい、ではペル
オキシダーゼ結合ウサギ抗−ヒト免疫グロブリンの、ま
たマウス血清についてはウサギ抗−マウス免疫グ０プリ
ンの、ＴＢ８−１０％ウマ血清中の”／１０００希釈液
を用いてインキユベーションする。後者の２つの検出抗
血清はＤＡＫＯ（コペンハーゲン、デンマーク）カラ得
たものである。次に試料を更に２時間室温でインキュベ
ーションする。次いで過剰の検出抗体をＴＢＳで洗出さ
せ、結合抗体を例５のようにしてクロロナフトール反応
により検出する。着色を更に２時間展開させて結果を判
読する。

ヒト自己免疫血清は二つとも１　：　１０００の希釈液
まで意味のある量のりウマチ因子を示すが・コントロー
ル血清ではどの希釈液にもリウマチ因子は認められない
。マウス自己免疫血清は１　：　１００００の希釈液ま
で陽性の反応を示すがコントロールマウスでは１００倍
希釈血清が陽性反応を検出できるボーダーラインである
。従ってこの検出では疾患のあるヒト及びマウスの血清
中の高滴定濃度の抗−ウサギＩｇＧの存在が検出される
。免疫コンプレックスはコントロール血清の約１０倍の
滴定濃度の病理血清においても検出される。高滴定濃度
の循環コンプレックスは、自己免疫マウス血清、ヒトＭ
ＣＴＤ　及びＳｌ、Ｅ血清中で認められる。２４）０の
ヒ）　ＳＬＥ血清の収集及びその生存中採取しり２０個
のＭＲＬマウスの血清試料に関する例でも以上の結果が
支持される。

従って、この例に記載した条件は臨床的診断及び動物モ
デルシステムの両方においてリウマチ因子と免疫コンプ
レックスを検出−するための実際的なシステムを提供す
るものである。

種々の多孔性受持体材料を用い・抗原の試料０．５μｔ
を前記の例と同様にして適用する：支持体： （１１Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｏ
ｒ、、　、（ボストン、マサチューセッツ州、米国）の
−Ｇｅｎｅ　８ｃｒｅｔｎ　’（多孔性ボリア、ミド） （２１Ｇｅｌｍａｎ　（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅ
　Ｉｎｃ、、アンアーノ望、ミシガン州、米国）テフロ
ンＨＴ４５０（０，４５μ）高温で使用する芳香族ポリ
スルホンコポリマー （３）　　ＧｅｌｍａｎＭｅｔｒｉｃｅｌＧＮ６″混合
セルロースエステル”（０，４５μ） （４１Ｇｅｌｍａｎ　Ｍｅｔｒｉｃｅｌ　ＧＮ６　　セ
ルローストリアセテ　−　）（０，４５μ　） （５１５ｃｈｌｅｉｃ’ｈｅｒ　＆　　５ｃｈｕｅｌｌ
　　（５ｅｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈ−ｕｅ　ｌ　
Ｉ　ＧｍｂＨ，ダソセル（Ｄａｓｓ−ｅｌ　）　ｙ西ド
イツ）ニトロセルロース、（０，１５μ）　ＢＡ　８０
／１（６）　　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ
ｌｌ　　ニトロセルロース、（０，１５μ　）ＢＡ　　
８０／１ （力　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　　
ニトロセルロース（０，８μ　）　Ａｍ　　９１／１ （８３５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ｋ　８ｃｈｕｅｌｌ　　
ニトロセルロース（１２μ　）ｉｌｏｏ （９）　　８ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｅｈｕｅｌｌ
　　セルロースアセテート　（０，４５μ　）ＯＢ６７ ＱＩ　　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　
　再生セルロース（０，４５μ　）　　ＲＣ５７ ａυ　ＦＭＣ（ロックランド、メイン州、米国）アガロ
ース＠ｌ５ｅａ　ｐｌａｑｕｅ　” Ｑ３　　Ｄｉｆｅｏ　Ｎｏｂｌｅアガー（ａｇａｒ　）
（ＤｉｆｃｏＬａｂｏ　−ｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｃ、、テ
トロイト１ミシガン州＼米、国） 後の２つはＦＭＣコーポレーションの”　Ｇｅｔ　Ｂａ
ｎｄ　’の剛性プラスチック支持体上に、製造業者の指
示に従って施して０．５ｍｙ／−の層を得る。この最後
のものは５ｔＭの円内で、表面に溶融したアガー（寒天
）またはアガロースをｌ−適用し・赤外線ランプにより
乾燥する。アガーを再び水和すると多孔性構造となる。

以下の抗原を前記の例と同様にして０．５μｔの分別量
で適用し、風乾し、ヒト８ＬＥ血清を用いて・同一の処
方で処理す゛る（例４の１１ｋＬ７参照）：（４）天然
のＤＮＡ　（０，４繁省） （Ｂ）　　変性ＤＮＡ　（０，４１１？／＋ｄ）（Ｃ）
　　インフルエーンザウイルス混合物（希釈しない８ｏ
ｎｄｖａｃワクチ、７．） （９）　ヒトＩｇＧ　、　１４／ｓｄのウシ血清アルブ
ミン中ｌｐｙ／１ （２）　ヒトＩｇＧ　−１１９／−のウシ血清アルブミ
ン中ｌＯμｇ２乙ｄ （９）　ヒトｒｇａ　、　１ｗｑ／＊のウシ血清アルブ
ミン中１ｏｏｐｔ／ａｔ （１１ｙｖ／−ウシ血清アルブミン ＴＢＳを全ての溶媒に用いる。

ＤＮＡ試料を添加後、残りのものを添加する前に着色部
を８０℃にて２時間焼成する。

以下のような結果が孔サイズ０．４５μのＭｉｌｌｉ　
−ｐｏｒｅ　　を用いた標準システムと比較して得られ
る。

支持体　　　　　　　　　　　結　　果（１）　　Ａ、
Ｃ及びＦかすかに見える。他のドツトは陰性。　□ （２１Ａ、Ｂ及び（Ｃ）着色、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ陰性０ （３）　　　全てのドツトが陽性、Ｄ、Ｅ及びＦは着色
度が段階的に変化している。

（４）Ａ及びＣかすかに陽性・他の全ては陰性背景部は
やや高い。

（５）　　Ｍｉ　ｌ　ｌ　ｉ　ｐｏｒｅと有意の差はな
い。

（６）　　　同一の多孔度を持つＭｉ　１１１ｐｏｒｅ
と全く同じ０ （７）Ｄは着色しない０他はＭｉｌｌｉｐｏｒｅと同様
。

（８ン　　Ａ、Ｂ及びＣ着色、Ｄ、Ｅ、ＦはＭｉｌｌｉ
−ｐｏｒｅ　　よりも薄い。

（９）　　　Ａ、Ｃ及びＦはかすかに着色。他は陰性。

ＱＯＩＡ及びＢは陽性、Ｇは薄く他は陰性。

０υ　　Ａ、Ｂ及びＣは陽性であるが薄いＯＤ。

Ｅ、Ｆは観測できるボーダーラインである０ （Ｊ２１　　Ａ、Ｂ及ＵＣはｕ性、Ｄ、Ｅ及びＦは弱い
が陽性。

寒天は粗い支持体に容易にコーティングされるという長
所があり透明であるから、例５のように反射率を測定す
る代わりに透過によって定量するのに適している。

この例は、症状のみによって区別することが困難なグル
ープとし正診断のために通常必要とされている呼吸ウィ
ルスのグループをベースに抗原を選定したことを除いて
例３と同様である。このグループの抗原はＩｎａｔｊｔ
ｕｔ　Ｖｌｒｊｑｎ　（チューリソと）から得たもので
あり、前記の踏倒のようにプリントされたグリッドを有
するＭｉ　１１１ｐｏｒｅのニトロセルロース（０，４
５μ）に、前記の例と同種の配列にて、下記の抗原０．
５μｔとＴＢＳ中の希釈液（カッコ内に示した）を施す
。

（１）アデノウィルス（！／ｓ　）　、（２１クラミゾ
イア（１／２　）　、（３１サイトメガａウイルス（希
釈せず）・（３ａ）サイトメガロウィルスコントロール
陰性抗原（希釈せず）　、　（４）インフルエンザＡ　
（Ｖ４　’）　、　＋５１インフルエンザＢ’（’／２
　）　、（６）パラインフルエンザｌ（希釈せず）、（
７）パラインフルエンザ２（希釈せず）　、　（８）パ
ラインフルエンザ３（希釈せず）・（８ａ）インフルエ
ンザコントロール陰性抗原（希釈せず）、（９）ｌ：ｌ
プラ：Ｘ　７　（１／２　）　、　Ｑｌ）　Ｑ　熱（１
／２）。

ａυ呼吸多核ウィルス（Ｖ２）・及び更にＴＢ８Ｂ２Ｏ
３３，６５、２，１５及び１７１　ｆ／−のヒトＩｇＧ
　ＣＮｏｒｄｉｃ　）の４個の標準液並びにウシ血清ア
ルブミンＣｖ／ｄ　。

これらは次にペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ
　（Ｎｏｒｄｉｃ）の１　：　１０００希釈液を用いて
クロロナフトール法により、・ＴＢ８１０％ウマ血清中
１／１００　、１／１ｏｏｏ及び”／１００００に希釈
した血清により前記の例と同様にして検定する０陽性コ
ントロール血清としてＩｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｖｉｒｏｎ　
　により提供されたものについての結果をも以下の表に
挙げる〇陰性コントロールとして提供された抗原はどの
血清によっても陽性反応を示さない。

例１１と同じセントの血清について、Ｉｎ５ｔｉｔｕ−
ｔｅ　Ｖｉｖｏｎ　からの同じグループの抗原により、
補体結合について述べた物質と手法を用いて補体結合検
定を行う。血清は同一の滴定濃度にグループ分けし、次
いで滴定濃度が減少する順序で表に示す。下記の表中の
垂直線は滴定濃度によるグループ分けである。アンダー
ラインのある血清はその抗原に対する陽性コントロール
として供給されたものである。

Ｑ　熱　　　　　　　　呼吸多核ウィルス殆ど全ての場
合に陽性血清はほぼ同じランクｌど入っており、両検定
共に陽性として供給された血清は実際上陰性か、低い滴
定濃度を示すととが表から理解できる。全ての検定はか
なり良い相関を示している。例外的なものがある理由は
、２つの検定システムは異なる抗体のクラスを認識する
ものであり、抗原は２つの検定において非常に異なった
形態で抗体に提供されるからである。

ひな鳥肝臓からのリポソーム蛋白質に対するモノクロー
ン抗体を例８と同じ手法により調製し１抗体の特異性を
Ｔｏｗｂｉｎ　等が発表した方法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、、　７６、
４３５０−４３５４（１９７９）により決める。交雑腫
瘍培養物の上澄液について下記のドツト検定により抗体
のタイプを試験する。　Ｎｏ　ｒｄ　ｉ　ｃ　　からの
タイプ−特異ヤギ抗−マウス免疫グロブリン抗体を製造
業者の指示に従って溶かし、３０倍に希釈し、１μｔの
分別量をニトロセルロースにドツトし、細片を例１と叩
様にしてウマ血清により封鎖し、希釈しない交雑腫瘍上
澄液を用いて室温で一部インキユベートし、次いで例１
のようにして結合した抗体を免疫−ベルオキシダーゼ着
色により検出する。その結果を下記の表に示す。

抗−８６十　　　　　　　　　　　− 抗−Ｌ７　　　　　　−　　　　　　十抗−Ｌ　１８ａ
　　　　　　　　　　　十−抗−Ｐｌ／Ｐ２　　　　　
　　　　　　　＋抗−ｒＲＮＡ　　　　　　　　　　　
　　＋モノクローン抗体は、国際的に認められている命
名法により、それらが反応するり、ボソーム蛋白質によ
り表示される。０．抗（Ａｎｔｉ　）−ｒＲＮＡ　はリ
ポソームＲＮＡに対するものである。表中のタイプは抗
体をサクロース濃度を変えて分析した別個の実験により
確認されたものである：ＩｇＧは沈降定数７８であり、
ＩｇＭは１９Ｓ　　である。

この例は適当な検出システムを用いるならば、抗体がそ
れらに個有の抗原を検出できることを示すものである。

この検定法は臨床的な分析でしばしば必要とされている
ようにヒト血清中９個々の抗体クラスの量を定量するの
に有用であるＯこのシステムにより牟−の操作で全ての
クラスの抗体を分析し、定量するためのキットを組立て
ることができる。

例１４：　免疫学上の分析用キット 前記の鎖側の抗原を、０．５μを量ドツトして装置を組
立てる。抗原溶液は前例のようにプリントされたグリッ
ドを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅシート（孔サイズ０．４
５μ）上に平行な列になるようにドツトする０この場合
もシートを１０％ウマ血清で処理し、非特異的結合場所
を封鎖して風乾するＯシートを細片に裁断して、各細片
が１個の各抗原のドツトを含むようにし・グラ３門”ツ
ク―用紙中番こシー″する０免疫学的分析を行うための
試薬は以下のようにして調製する。

Ａ、　１０％ウマ血清を含むＴＢ８をｌＯ〇−のロフト
として凍結乾燥するＱ Ｂ、ヤギ抗−ヒト免疫グロブリンを１０％ウマ血清を含
むＴＢＳ中で１　：　１０００に希釈し１００−ロット
として凍結乾燥する０ Ｃ０ＴＢＳｉ１００−ロットで凍結乾燥するＯＤ、　　
４−クロロ−１−ナフトールを蛋白質９町中に調合し、
アンプル中にシールする。

Ｂ、　　Ｈ２Ｏ，（３０％）を蛋白質０．１−中に調合
し、アンプル中にシールする０ 期限を定めずに貯蔵した後、前記の鎖側に従って血清中
の未知抗体を分析するために上記のキラ１トは以下のよ
うにして使用される。Ａ、Ｂ及び０６１部を蒸留水１０
０−を用いて元の状態に戻す０次に人を未知血清の希釈
液中で用い、Ｂをインジケータ抗体結合反応用番ご用い
、また元に戻しりＣの１０ツトはＤ及び、Ｅ、各々の１
アンプルと共に呈色反応混合物とするＯＣの他のロフト
は抗体結合の各段階での洗浄に必要なときに元の状態に
戻すＯ前踏の鎖側と同じ結果が得られる０

【図面の簡単な説明】

図面は血清の抗体分析において、個々の血清により試験
された細片を示す〇 若　　　林　　　　　　　忠 第１頁の続き 優先権主張　＠１９８２年１月１８日■イギリス（ＧＢ
）■８２０１２８９ 手　続　補　正　書　（方式） ％式％ １、事件の表示　昭和５７年　特許願　第７０！；７乙
号２、発明の名称 免疫分析用装置及びキット ３、補正をする者 事件との関係　　　出願人 チバーガイギー　アクチェンゲゼルシャフト−４１代理
人 住所　　東京都港区赤坂１丁目９番２０号ｊ補正命令の
日付 、昭和５７年７月９日（同年７月２７日発送）乙補正の
対象　　図　面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）抗原もしくは免疫グロブリンまたはそれら両方の
   １以上の溶液または懸濁液の分別量を支持体に直接接触
   させて適用することにより得られる・抗原または免疫グ
   ロブリンまたはそれら両方を境界を定めて吸着させた領
   域のあらかじめ選択された配列を含む多孔性固体支持体
   で構成される免疫分析用の装置、及びこのような装置で
   あって抗原または免疫グロブリン領域の外側または内側
   の残りの吸着場所は前記の抗原または免疫グロブリンと
   の反応性に関して非特異的である蛋白質の存在により飽
   和されている装置、並びにこれらの装置のいずれかを有
   するキットからなる群から選ばれ免疫分析用の新規な装
   置またはキット。 （２）残りの吸着場所の飽和が、所望により生理食塩水
   溶液また゛は他の適当な希釈剤、またはそぢらの両方で
   希釈された全血清で、所望番こより支持体を乾燥後・ま
   た必要により支持体を高温で焼成後、室温でまたは温度
   を上げて処理することによって行われる特許請求の範囲
   第１項に記載の装置。 （３）固体支持体中の抗原が・ヒトバイオプシイ物質、
   哺乳類組織または細胞、または体液、菌類、原生動物、
   後生動物寄生体、バクテリア、マイコプラズマ、ビール
   スまたはこれらの標品からなる群から選択される特許請
   求の範囲第１項に記載の仕掛。 （４）固体支持体がシート状である特許請求の範囲第１
   項に記載の装置。 （５）　　シートの厚さが約０．０１〜０．５ｕである
   特許請求の範囲第４項°に記載の装置。 （６）　　シートの厚さが約０．１ｍである特許請求の
   範囲第４項に記載の装置。 （７）　　固体支持体の材料が・ Ａ）　ａ）寒天、アガロース；架橋アルギン酸：置換ま
   たは架橋グワーガム１架橋デキストランボリマー及び°
   デンプン、 ｂ）再生セルロース、セルロースエステル、混合セルロ
   ースエステル、セルロースエーテルから選択される天然
   炭水化物ポリマー及びそれらの合成による部分的変性・
   架橋または置換誘導体、 Ｂ）蛋白質及びその誘導体からなる群から選択される窒
   素含有天然ポリマー、 Ｃ）ラテックス及びゴムからなる群から選択される天然
   炭化水素ポリマー、 Ｄ）ａ）ビニルポリマー及びその部分加水分解誘導体、
   ポリアクリレート、′ポリアクリルアミド、ポリメタク
   リレート、 ｂ）前記ビニル七ツマー間の、及び他のモノマー類との
   コポリマー及びターポリマー、Ｃ）ポリエステル及びポ
   リアミド、 ｄ）ポリウレタンまたはポリエポキシドからなる群から
   選択される、適当な多孔性構造を持つように調製される
   合成ポリマー、Ｅ）アルカリ土類金属及びマグネシウム
   の、詭酸塩または炭酸塩；アルカリ金属及びアルカリ土
   類金属及び（または）アルミニウム及び（または）マグ
   ネシウムのケイ酸塩；アルミニウムまたはケイ素の酸化
   物または水酸化物からなる群から選択される適当に多孔
   性のある状態で調製することのできる無機材料、Ｆ）上
   記の混合物またはコポリマーまたはグラフトコポリマー
   、 からなる群から選択されるものである特許請求の範囲第
   １項に記載の装置。 （８）固体支持体の材料が硝酸とセルロースのエステル
   または炭素原子数が１〜７の脂肪族カルボン酸トセルロ
   ースのエステル、またはそレラエステルの混合物である
   特許請求の範囲第７項に記載の装置。 （９）　　ニトロセルロースが硝酸セルロースエステル
   として用いられ、炭素原子６個につき硝酸基が約３存在
   する特許請求の範囲第７項に記載の装置０ ＣＩＱＩ　ｒ　ＭｉｌｌｌｐｃｉｒｅＪ　（ｒ　ｉＡＩ
   　ＪｆＪ　名ｊ）のニトロセルロースシートを含む特許
   請求の範囲第８項に記載の装置。 （１１）　　境界を定めた抗原または免疫グロブリンの
   領域がドツト（点）状である特許請求の範囲第１項に記
   載の装置。 ０湯　境界を定めた抗原または免疫グロブリンの領域が
   ２１１Ｊ以下の径を有する微小点状である特許請求の範
   囲第１項に記載の装置。 Ｏ３１境界を定めた抗原または免疫グロブリンの領域が
   幅２ｍ以下の線状である特許請求の範囲第１項に記載の
   装置。 α荀　配列が抗原または免疫グロブリンの単一のドツト
   からなる特許請求の範囲第１項に記載の装置０ Ｏ５抗原または免疫グロブリンがそれらを含む溶液また
   は懸濁液の分割量を支持体に機械的に接触させて適用さ
   れる特許請求の範囲第１項に記載の装置Ｏ ａｅ接触が手または機械によりピペットで行われるか・
   または液体あるいは気体の推進剤により行われる特許請
   求の範囲第１５項に記載の装、置００７）微小ドツトが
   １μを以下の容量を固体支持体に適用することによって
   形成される特許請求の範囲第１６項に記載の装置。 θ槌−核酸が固体支持体に適用され、次いでその支持体
   が６０℃〜１２０℃の温度で５分間〜１２時間焼成され
   る特許請求の範囲第２項に記載の装置。 Ｑ９　　抗原または免疫グロブリン及び所望により阻止
   蛋白質また５はそれらの組合せにより調製された固体支
   持体状の装置、免疫反応を行うために適当な装置、及び
   予め分別されるかまたは乾燥された形態のインジケータ
   システム用の試薬からなる特許請求の範囲第１項に記載
   のキット。 （至）検出と定量を計算またはオートラジオグラフィー
   によって行う°放射能でラベルしたインジケータ抗体か
   らなるか：または検出と定量をフルオリメトリーによっ
   て行う螢光インジケータと結合されているか；または検
   出と定量をデンシトメトリー或いは肉眼で行う適当な基
   質との反応で呈色し得る酵素と結合されているか：また
   は抗原−抗体コンプレックスに結合した補体蛋白質をベ
   ースとし、その補体は上記の３種の方法のいずれかによ
   り、または別の特異な抗補体抗体（これも上記の３種の
   方法のいずれかにより標識化されている）により標識化
   されている検出及び定量システムからなる特許請求の範
   囲第１９項に記載のキット。 （２１）　　免疫反応を行うための装置が、多数の空所
   部のあるプラスチック製の皿であり、試薬がインジケー
   タ抗体、塩類、緩衝剤、血清または蛋白質キャリアの凍
   結乾燥混合物、及び予め量を決められたインジケータ酵
   素発色性基質、塩類・緩衝剤、並びに予め測定した容量
   の、全て適当にパッケージされた液状の基質を含むアン
   プルからなる特許請求の範囲第１９項に記載のキットＯ ■　抗原−抗体反応が測定し得る信号で生ずる信号シス
   テム用の、１以上の特異抗体と試薬との配列を含む固体
   支持体からなる特許請求の範囲第１項に゛記載の装置ま
   たはキット。 （ハ）　信号システムが、インジケーター素または酵素
   の結合シリーズのための基質、補因子または補欠分子族
   からなる特許請求の範囲第２２項に記載の装置またはキ
   ット。 （２４Ｊ　　信号システムが抗原と信号分子との共有結
   合アダクツからなる特許請求の範囲第２３項に記載の装
   置またはキット。 （ハ）　酵素または酵素の結合シリーズが特異抗体と共
   に固体支持体に適用される特許請求の範囲第２３項に記
   載の装置またはキット。 （２６１酵素または酵素の結合シリーズが特異抗体とは
   別個に固体支持体に適用されるか、または全熱適用され
   ない特許請求の範囲第２３項に記載の装置またはキット
   。 （５）　固体支持体上の゛配列が人または動物の免疫グ
   ロブリン、またはそれらのフラグメントを、リューマチ
   因子の検出及び定量のために含む特許請求の範囲第１項
   に記載の装置またはキット。 弼　固体支持体上の配列が循環免疫コンプレックスとし
   て知られている循環抗原−抗体コンプレックスの検出及
   び定量のための補体蛋白質を含む特許請求の範囲第１項
   に記載の装置またはキット。 （ハ）特許請求の範囲第１項〜第２８項のいずれか１項
   に記載された装置またはキットを用いることを特徴とす
   る大または動物の病気の診断、監視及び予後の免疫検定
   法による、特異状態または特異抗体またはこの両者を検
   出及び定量するための方法。 （７）研究及び開発におけるモノクローン及び他の抗原
   または抗体のスクリーニング、検出及び定量をするため
   に用いる特許請求の範囲第２９項記載の方法。 ６υ　未知の抗原を固体支持体に適用して、公知の抗体
   を用いる免疫検定法により検出と定量を行うために用い
   る特許請求の範囲第２９項記載の方法。 ０４　　抗原もしくは免疫グロブリンまたはそれらの両
   方の１以上の溶液または懸濁液の分別量を直接接触によ
   り固体の多孔質支接体に適用してあらかじめ選択された
   配列を形成し、そして所望　　：ならば、かくして得ら
   れた装置を前記の抗原または免疫グロブリンとの反応性
   に関して非特異的である蛋白質で処理してその抗体また
   は免疫グロブリン領域の内側または外側の残りの吸着場
   所を飽和させることを特徴とする免疫分析用装置の製造
   方法。 （ハ）特許請求の範囲第１項〜第２８項のいずれか１項
   に記載された装置またはキットを非特異性蛋白質を含有
   するブロッキング溶液で適当に処理をして残りの結合場
   所を全て飽和させてのち検出すべき免疫学的因子を含有
   する試料と、好ましくはブロッキング溶液の存在下に・
   定温放置し、また所望により、洗浄後、インディケータ
   −抗体溶液または試料と一次定温放置により生成した免
   疫学的錯体を認識するためのいずれかの信号システムと
   ′・好ましくはブロッキング溶液の存在下に定温放置し
   、インディケータ−システムの展開および／または免疫
   因子の定量を行なうことを特徴とする免疫学的分析法０