JPS61221650A - 乱用薬物を測定する装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は乱用薬物の検出および半定量的測定に関する
。特定の薬物１例えばモルヒネ、コカイン、アンフェタ
ミン、等、またはそれらの代謝物質は１体液１例えば尿
を指示薬パッドと対照パッドを備える免疫学的に特定の
ディツプスティック（計量棒）に接触させることによっ
て検出される。

従来の技術 体液中の特定の配位子を検出するのに多くの方法、技術
および試薬が報告されてき九。配位子の検出に含まれる
原理の重要な応用の１つが、医学的および法律的理由の
ために乱用薬物の検出である。概括的に免疫技術として
説明されうることを用いて検出されてきた配位子は各種
の生理作用を有する種々の薬物を含む。かかる薬物とし
ては。

麻酔薬、催眠薬、鎮静薬、鎮痛薬、解熱薬、精神病発現
薬、筋弛緩薬、神経系刺激薬、抗コリンエステラーゼ剤
、副交感神経剤、交感神経剤、神経筋剤、ヒスタミン、
抗ヒスタミン、心血管薬抗不整脈薬、抗高血圧剤、血管
拡張薬、利尿薬、抗生物質、ホルモン、ビタミン、Ｐａ
瘍細龜、細菌およびウィルスのタンパク質、毒素、血液
タンパク質。

およびそれらの代謝物質１等が含まれる。

特に興味深い薬物の中に、アルカロイド、ステロイド、
ポリペプチドおよびタンパク質が含まれる。

配位子は極めて小さい、例えば低分子量、またはｌＯｏ
、０００以上の分子量を有する有機化合物である。本分
析における問題の配位子は抗原、そして極めて重要であ
るハプテンを含む。ハプテンは単純な化学物質として注
入される際に、抗体を産生させない物質である。しかし
ながら、それらを免疫のために使用する前にそれらが抗
原キャリヤに結合されると、ハプテンに対する抗体が産
生される。本発明における問題の配位子のあるものは１
９７８年１月ｌＯ日付けの米国特許第に０６７．７７１
４号（ＲｕｂｅｎａｚｅｉｎおよびＵｌｌｍａｎ）に記
載されていると共に、若干詳しく議論されている。米国
特許第４．０６７．７７ζ号も本発明において特に興味
のある乱用薬物（そこでは禁制薬物と呼んでいる）の特
定かつ集中的な記載をしている。これらの薬物ハモルヒ
ネ、ヘロイン、メペルジンおよびメタトンのようなアヘ
ン剤を含む。他の問題の薬物はアンフェタミン、ナルセ
イン、エビネフリ、ン、エフェドリンおよびＬ−ドパを
含む。米国特許第４、０６７．７７　ｍｌ　Ｋ見られる
これら乱用薬物およびそれらの化学的特性をこζに記載
し２本発明の原理に従って定量される種々の配位子をさ
らに包括的に検討するために該特許を引用する。

前記米国特許第１．０６７．７７１１号におイテＲｅｂ
ｅｎｓｔａｉｎとＵｌｌｍａｎは特定組成物の薄紫結合
配位子の生成を記載している。

米国特許第１８１７．８３７号は乱用薬物の検出に応用
される同種酵素免疫定量法を実施する方法を開示してい
る。

米国特許第４．０６　’ｌ　ｌ　０５号は種々の配位子
。

特にリドカインと他の酵素との抱合体を開示している。

コカイン誘導体は種々の酵素お工び他の化合物と結合し
て、１９７８年ｌＯ月３１、日付けの８ｏｆｆｅｒおよ
び５ｃｈｎｅｉｄｅｒによる米国特許第ｍｌ、　１２１
　ｕ　３１、号に開示され友方法に従つ九免疫定量法用
の試薬を提供する。

Ｒｅｂｅｎａ　ｔｅｉｎおよびＵｌｌｍａｎの米国特許
第４１９０，１４９６号は、酵素と結合し九配位子の酵
素活性における低減の原理を用いて１本発明における問
題の配位子および受容体の定量法を開示した。

酵素免疫定量用の特定のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ抱合
体はＵｌｌｍａｎおよびＲｕｂｅｎｓ　ｔｅｉｎによる
米国特許第１ｔ、　１９１．６１５号に開示されている
。

乱用薬物の検出用に適当である他の系および組成物、お
よび本特許における問題の他の配位子が。

Ｕｌｌｍａｎおよび９ｒｉｎｋｌｅ７による１９８０年
５月ＩＢ日付は米国特許第４．１９１９　Ｂ　５号；　
ＬｅｕｔｅおよびＢａ１ｚ　Ｋよる１９８０年４月８日
付は米国特許第４．１９７．２５７号；　Ｕｌｌｍａｎ
およびＳｃｈＷａｒｚｂｅｒｇによる１９８０年４月２
２日付は米国特許第１ｔ、　ｌ　９　’３５５９号；　
Ｒｕｂｅｎ３１、ｔｅｉｎおよびＵｌｌｍａｎによる１
９８０年５月２０日付は米国特許第４．２０１８０２号
；　ＺｕｋおよびＭａｇｇｉｏによる１９８０年７月１
７日付は米国特許創、２０ａｌ１７９号；　Ｍａ　ｇ　
ｇ　ｉ　Ｏ＊　Ｗ　ｌｆ　ｅ　　およびＵｌ　ｌ　ｍａ
ｎによる１９８０年１１月１１日付は米国特許第１ｔ、
　２３１　ｍｌ　０２号に開示されている。この後の特
許には酵素のチャンネル形成法が開示されている。他の
問題の開示は、　８１ｎｇｈおよびＰｉｒｉｏによる１
９８０年１１月２５日付は米国特許第１Ｉ、　２５５．
９６９号；ＬｉｔｍａｎおよびＵｌｌｍａｎによる１９
８１年１１月１０日付は米国特許第１４．２９　’ｌ　
９１６号；　ＷｒｏｌｅｙおよびＬｅ　ｕｎ　ｇによる
１９８２年５月４日付は米国特許第１４．５２８．３１
、１号；　ＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎおよびＵｌ　１　ｍａ
ｎによる１９８５年５月１５日付は米国特許第狐５７６
．８２５号ｉ　Ｒｕｂｅｎｓ　ｔｅｘｎおよびＵｌｌｍ
ｅｎによる米国特許第鳳与２１１繕５号；およびＺｕｋ
およびＬｉ　ｔｍａｎによる米国特許第４．すｒＡ５０
１１号を含む。

酵素結合の免疫定量法に関係した一般的に関心のあるの
は、　５ｃｈｕｕｒ６およびＶｅｎＷ６ｅｍｅｎによる
１９７２年４月４日付は米国特許第１６’ｌ、０９０号
である。

酵素を結合させる免疫定量法の原理を含む極めて多くの
キットおよび試験ストリップがある。本発明に関係する
ものとして最も関係のある開示は。

Ｌｉ　ｔｍａｎら（”Ａｎ　１ｎｔｅｒｎａｌｌｙ　Ｒ
ｅｆｅｒｅｎｃａｄＴｅｓｔ　５ｔｒｉｐ　Ｉｍｍｕｎ
ｏａｓａａｙ　ｆｏｒ　Ｍｏｒｐｈｉｎｅ’５Ｃ１ｉｎ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　Ｖｏｌｕｍｅ　２’
Ｌ　１ｍ　’Ｌｐａｇｅｓ　　１５９　Ｂ　−１６０５
（１９８３）　）によるものである。Ｌｉ　ｔｍａｎら
の内部比較の試験ストリップは２つの活性表面からなる
ものとして記載され、その各々は共に動けないグルコー
スオキシダーゼと抗体を含む。指示パッドは薬物へ向け
られる抗体を含み、その表面に功われる色が試料中の薬
物の存在によって抑制される。基準パッドは抗オキシダ
ーゼを含み１分析検出限度を設定し。

温度、タイミングおよび試料干渉における変量を規格化
するために使用される。抗ペルオキシダーゼの負荷を調
節することに工って、基準パッドに現われる色を分析濃
度が分析の検出限定に等しいときに指示パッドに現われ
る色に等しくませることができる。この試験ストリップ
はモルヒネの検出に応用できると記載されている。

発明が解決しようとする問題点 前記Ｌｉｔｍａｎらによる内部比較の試験ストリップは
いくつかの利点を有することは明白であるけれども、著
しい欠点を有し、基準パッドに終始変らない抗ペルオキ
シダーゼの負荷を提供する環境を作ることは極めて困−
であり、殆んど不可能である。これは厳格な品質管理を
必要とし、当然非常に沢山の不良品をも九らすであろう
。

問題点を解決する丸めの手段 本発明は前記Ｌｉｔｍａｎらの内部比較の試験ストリッ
プに存在する問題点を解消し九内部比較のパッドを提供
する。本発明は、引用し九曲記の先行技術、多くの刊行
物および特許に一般に記載されている酵素結合免疫法を
利用する。そして基準パッドの負荷を調節する問題が後
述の装置、方法お工び技術によって解決され次ことにお
いて先行技術と異なる。

本発明は配位子の存在を定量する装置に関する。

該装置は参照共役対の第２の成分と共役できる参照共役
対の第１の成分からなる参照固体支持部分からなる。参
照共役対の第２の成分は検出できかつ測定できる部分で
標識化される。該装置には試験固体支持部分も含まれ、
該試験部分は免役化学的に結合する対の受容体からなる
。免疫化学的に結合する対の他方の成分は検出せんとす
る配位子。

すなわち試験配位子からなる。受容体は、試験配位子お
工び参照共役体の標識化に使用される同一の部分で標識
化された免疫化学的に同一の配位子を免疫化学的に結合
することができる。望ましい形−態における参照共役対
はアビディンとピオチンからなり、免疫化学的に結合す
る対は、（ａ）抗原と該抗原に対する抗体は、（ｂ）ハ
プテンと該ハプテンに対する抗体、および（ｃ）タンパ
ク質と該タンパク質に対する抗体からなる対の群から選
んだ対からなる。

本発明の方法は、前記の参照および試験用支持部分から
なる試験装置を試験配位子、例えばモルヒネを含む疑い
のある試験溶液に挿入する工程からなる。既知量の免疫
化学的に結合する対の参照共役体お工び配位子共役体が
試験溶液に添加される。試験溶液訃よび装置は、免疫化
学的共役対と参照共役対間のそれぞれの免疫化学結合反
応と化学結合反応をさせるのに十分な時間湯量または反
応される。上記の反応後、参照部分は試験溶液からの参
照共役体を含む。試験部分は試験配位子と配位子共役体
を含む。試験部分上の試験配位子および標識化配位子は
試験溶液中の試験配位子および配位子共役体の量に比例
する。試験装置は必要ならば取シ出して洗浄する５そし
て必要ならば標識化部分を発生させて、検出する。発生
し良信号。

例えば着色体は生じた所に残って、溶解または拡散して
はならない（すなわち、着色体と固体支持体間にはある
程度の親和性がなければならない）。

本発明の望ましい態様において、標識は酵素であって、
それは産生時にその場所に残る独特な色を出す。しかし
ながら、生成される安定な部分上の放射性標識または螢
光標識を使用することができる。酵素標識が使用される
望ましい態様において。

試験部分の色を参照部分の色と比較して、試験溶液中の
存在する試験配位子の量を半定量的に測定する。

特に望ましい態様における本発明は５便宜的にパッドと
呼ぶ参照パッドと試験パッドの２つの部分を有する試験
ストリップまたはステイーツクからなる。参照パッドは
実質的にアビディンのような参照共役対の１成分からな
る。試験パッドは実質的に試験配位子用の不動受容体か
らなる。

もう１つの実施態様における試験スティックは単一の参
照パッドと２つの異なる試験配位子を検出する表示パッ
ドからなる。

本発明の望ましい態様の方法において、ス）　ＩＪツブ
またはスティックの形の試験装置は１周知濃度の参照共
役体お工び間吻の配位子（これに参照共役体に使用され
る同一の酵素が共役されている）すなわち配位子共役体
が添加される試験配位子を含む疑いのある溶液と反応さ
せられる。既知量の配位子共役体は試験パッドの部位に
対して試験配位子と競い、一方参照共役体は別に試験配
位子によって妨害されることなく参照パッド上の参照対
の第１の成分と反応する。反応時間、温度、濃度。

妨害成分および他の変数が測定に影響を与える。

その作用は配位子共役体および参照共役体に対して実質
的に同一である。特性色を発色させるために酵素が産生
される。参照パッド上の色が標準であって、利用する参
照共役体の関数である。試験パッドの色は配位子共役体
の占める試験パッド上の利用できる部位の部分の関数で
あって、試料中の試験配位子の量に逆比例する。

作用 本発明は参照パッドを使用する初期の装置で０面する主
たる問題点の１つヲ暖シ除く。初期の装置においては、
参照パッド上の抗体または′仲の免疫化学的受容体の量
を極めて精密に調節する必要があつ友。製造において、
これは殆んど不可能であり、確かに実施不可能な方法で
あって、不良品の比率が非常に高い。本発明に工り、試
験スティックまたはストリップの創造においてはかかる
高精密度を保つ必要がない。調節は試験溶液に添加され
る参照共役体および配位子共役休め量について行なう。

試験溶液へのこれら物質の添加を微調整することは極め
て容易である。その量は容易に調節されると共に、高精
度が容易に得られる。

望ましい態様における本発明は、体液中に試験配位子の
存在をテストする１例えば尿中のモルヒネをテストする
のに適当なキットである。そのキットは、予め決めた濃
度の配位子共役体および参照共役体と共に、帥述の試験
装置からなる。ま九。

キットは容器および試験をするための他の装置を含む。

同じ装置に１つ以上の参照パッドおよび／または１つ以
上の試験パッドを含むことは本発明の範囲内である。

用語の定義 本明細書で使用される次の用語は便宜上定義する。

「配位子」：　これは免疫化学の意味において使用され
、免疫化学的決定構造を介してまたはその結果として結
合する対の成分を含む。配位子はハプテン−抗体お１び
抗原−抗体の対、および多クローン性抗体または単クロ
ーン性抗体を含む。この定義における「抗原」は広く動
物における抗体反応を誘導する物質の全てを含むべく用
いられる。

「受容体」；これは配位子と、定量される配位子に対し
て特定の参照体（典型的にはハプテンまたは抗原に対す
る抗体である）とを免疫化学的に結合させる物質を意味
する。

「参照共役対」：これは、相互に特定の親和性を有する
一対の化合物を意味する。その親和性は化学的又は免疫
化学的の親和性である。典少的な結合対はアビジンとビ
オチン；ハプテンとハプテンの抗体；ポリアニオンとカ
チオン：またはポリカチオンとアニオンである。

「参照共役体（又は抱合体）」：これは参月対の−構成
員と標識部分１例えば標識酵素、と全共役させることに
１って生成される。

「配位子共役体（又は抱合体）」：これは沖１足される
免疫化学タイプの配位子と標識部分とｔ共役させること
によって生成される。

配位子 本発明に関して興味のある配位子は、試験溶液に可溶性
または該溶液中で可溶化できる体液ｔたは組織中に見ら
れる配位子を含む。

特に興味のある配位子の乱用薬物がある。乱用薬物は、
摂取または注入され次ときに種々の生理学的反応をする
広範囲の薬物を含む。これらの乱用薬物の中で最も普通
のものは、麻酔薬、催眠薬。

鎮籍薬、精神病発現薬、筋弛緩薬および神経系刺激薬で
ある。本発明が適用される特に重要な乱用薬物ハモルヒ
ネ、コカイン、アンフェタミン、バルビツレート、塩酸
フエンシクリジン、テトラヒドロカナピノール（ＴＨＣ
）、メタトン、バリウム（オキサセパム）、およびそれ
らの代謝物質のようなアヘン剤を含む。

本発明の原理に従って検出できるアヘン剤はモルヒネ、
ヘロイン、ヒドロモルホン、オキシモルホン、メトポン
、コディン、ヒドロコドン、ジヒドロコディン、ジヒド
ロヒドロキシコディン、フオロコデイン、デキストロメ
トルファン、ツェナキンシンおＬびジオ二インを含む。

カタコルア５ン、おＬびその関連化合物、エピネフリン
、アンフェタミン、お工び他の関連化合物も本発明の装
置および方法によって定量される。

ベルナール、メジナール、ルミナール、フロミナール、
ンネリル、ネムプタール、アミタール。

ジアール、フエナドルン、セコナール、エビパン、フエ
ノバルビタールお工びペントクールのようなバルビツレ
ートは本発明の原理に従って検出される。

コカイン、広（乱用されている薬物およびその類似物、
広く乱用されているマリファナも本発明によって検出す
ることができる・ メプロパメートおよびベンズジアゾシクロへブタンのよ
うなトランキライザも乱用されており、本発明によって
検出される。

アミノ酸、ペプチドおよびポリペプチドも、特定のモノ
クローナル抗体が産生される他の抗原物質および有機体
の１うに１本発明によって検出される。

本発明によって検出される他の物質は、ペニシリン、ク
ロロマイセチン、アクテノマイセテン、テトラサイクリ
ン、テラマイシンのような抗性物質、核酸、またはヌク
レオシドおよびヌクレオチドのような該導体、ステロイ
ド、ホルモン、殺虫薬、殺真菌薬、殺菌薬および線虫駆
除薬を含む。

酵素 均−型のＥＩＡ（エンザイムイムノアツセイ）に使用で
きる標識酵素は広範囲のものが文献に報告されている。

かかる酵素の代表的なものは酸化還元酵素および加水分
解酵素である。これら酵素を選ぶ基準は周知であって、
　Ｒｕｂｅｎａｔｅｉｎｊ？よびＵｌｌｍａｎによる米
国特許第４．０６７．７７　ｍ１号にある程度検討され
ている。しかしながら１本発明用の酵素を選ぶ基準はＲ
ｕｂｅｎａｔｅｉｎお工びυｌ１ｍａｎｌｃよシ検討さ
ｆ′Ｌｆｃ基準と著しく異なる。

第１に、酵素−配位子共役体は抗体との結合の際に大き
く抑制されるべきでない。これは参照共役体の場合に事
実である。第２に、酵素に１って生成された着色体は本
発明において使用される固体支持体に結合しなけｎばな
らない。本発明における標識として使用するのに適切な
酵素はセイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、
β−ガラクタシダーゼ、酸性ホスファターズおよび塩基
性ホスファターズ（ＡＬＰ）（これらは多くの利用可能
な酵素の一例である）を含む。

他の標識 放射性標識（それらの多くは周知であシ、技術的によく
使用されている）、けい光標識および触媒標識が使用可
能である。しかしながら、望ましい標識は、特定器械ま
たは特定の安全予防手段の使用がなく簡単で安全な方法
を採用できる叢点から酵素である。

固体基質を利用する酵素免疫測定法（サンドイッチ型ま
たはコンペテイテイプ型酵素免疫溜１法）において、一
般に固体マトリックスに強固に結合する着色不溶性生成
物を形成する酵累基を見つけることは可能である。例え
ば、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬｊ）用基質である
５−プロモー４−クロロ−５−インドリル・ホスフェー
トｈｔ色のインジゴイド染料を生成する。それ鉱紙に強
く結合する。紙（セルロース）および他の水素結合を形
成する固体マトリックス（例えば、ナイロン）は一般に
この目的によくかなうものである。この性質は、基質溶
液から固体マ）　ＩＪラックス去し。

次にそれぞれを吸い取って乾燥するだけで、測定を終了
させることができ、その結果酵素の活性が抑制され、終
点の色が表示される。試料溶液に第１図の固体マトリッ
クスと共に、第２の固体マトリックスを入れる（該第２
のマトリックス上に適当な物質が適当量固定される）、
そして第１の固体マトリックス上に示された色と第２の
固体マトリックス上の色とを比較することによって、試
料に無関係に予めセットし几被分析体濃度に常に対応す
る被分析体の相対的濃度を決定することができる。従っ
て、試料と共に標準実験（外部比較）を行う必要がない
。実際に、内部比較は殆んどの場合に外部比較よシ優れ
ている。これは、０）試料マトリックスが非常に大きく
変わシ（特に尿試料）それが酵素の活性お工び固定マ）
　ＩＪラックス対する酵素共役体の非特定付着性に影響
を及はすため；（１）試料のインキュベーション時間、
洗浄技術お工び基質のインキュベーション時間の変化の
ためである。

コンペテイテイブ式の酵素検定法に関係する内部比較の
例はりットマンら（Ｌｉｔｍａｎ、　ｅｚ　ａｌ。

Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉａｔｒｙ、　２９．　１
５９８−１１＞０５（１９ｇ５））によシ開示されたモ
ルヒネのディツプスティック・アッセイである。このデ
ィツプスティックも２つのパッドを有し１表示パッドは
モルヒネに対する固定化抗体を含み、一方参照パッドは
セイヨウワサビ（ＨＲＰ）のペルオキシダーゼｔａａｐ
）に対する抗体を含む＠ディツプスティックは最初尿試
料に入れ１次にＨＲＰ−モルヒネ共役体を含む膠色剤溶
液に入れる。その装置は、参照パッドが約：５００ｎｊ
ｌ／−のモルヒネに相当する色を示し、従って表示パッ
ド上に現われる弱い青色が５０ＯｎＩＩ／ｍｊ以上のモ
ルヒネの存在を示すように設計さｎている。

上記例において参照パッドに抗ＨＲＰＱ使用する考えは
、それが一般にある予め設定した被分析濃度に対応する
色を示すように、参照パッド上に固定され次抗体の量１
に制御（微調整）することが極めて骨の折れる仕事であ
ること以外は、すばらしい。これは、この工うな製品の
創造において特に真実である。第一に、大量生産が小規
模試験における場合と同一の製品を正確に創造すること
保証できない。もしも参照パッドが指示パッドに合わな
いことがわかれば、参照パッド用の試薬紙の全ロットを
捨てるか又は別のロットの指示パッドと合う第２ラウン
ドの九めに取って置かなければならない。第二に、前記
の結論として、同一ロットの参照パッドが１つのロット
の指示パッドおよび酵素共役体以上に合うことを決して
保証できない。これは、それぞれの生産の前に小規模の
試験操業を必要とする。

本発明に工り、所望の被分析体濃度に対応して参照パッ
ド上の色の微調整におけるすばらしい正確さおよび鯛品
プロセスにおける極めて容易さ並ひに融通性を授けるシ
ステムが工夫された。

実施例 本発明は主に参照共役体（又は抱合体）の概念を含む。

参照共役体は、好適な形態では、酵素でざる。この酵素
は化学的に変性されて元の化学構造に存在せず１分析さ
れる物質に但ていない同じ化学構造の共有結合基を１つ
以上含み、固体基質（参照部分１次はパッド）上に固定
されたバインダー物質によって結合される。この参照共
役体の濃度を単に調整することによって、参照パッド上
の色を被分析体の所望レベルに対応するものに極めて正
確に、かつ極めて容易に微調整することができる。この
比較は、被分析体に対するバインダー物質の親和性が全
くないから試料中の被分析体には全く無関係であり、従
って内部比較として行うことができる。このシステムに
使用することができる２、５の代表的な基および対応す
るノくインダー物質を下表に示す。

ビオチニル　　　　　　　アジピン ハプテン　　　　　　　　　単りローン抗ノ１ブテンポ
リアニオン（ポリカチオン）　　　カチオン（アニオン
）ハプテンの範ちゅうに属する化合物は美大であシ、潜
在的に殆んど有用である。所望のものそして単クローン
抗体を出す構造のものは殆んど全て選ぶことができる。

次に、参照酵素の使用に関する５つの例を示す。

例Ａ ！、試薬： （１）酵素共役体カクテル：共役体の緩衝液に恥ｎＭの
ＡＬＰ−モルヒネ共役体と７ｎＭ。

ＡＬＰ−ビオチン共役体（参照共役体）を含む。

（ＩＩ　　ディツプスティック：参照パッド（殉×羞）
ラプラスチックのハンドルの一端に取シする。参照パッ
ドは紙の上に固定され友アビジンを含む。指示パッドは
紙の上に一定され次ウサギの抗モルヒネを含む。

（ｉｔ）　　現（＃　（又は顕色）溶液：α０２％Ｎａ
Ｎ１のαうＭのＡＭＰ緩衝液（ｐＨ−１０１５）中５ｍ
Ｍの５−ブロモ−繕−クロロー５−インドリルリン酸塩
。

■０分析操作 （＋）　　試料のｂｏｏμｊｔ−１０Ｘ５０ｓ＊のガラ
ス管にピペットで移す。

（１）　　酵累共役体カクテルのＺｏｏμｊｔ−添加。

かくはん。

（ｉｎ）　　溶液にディツプスティックを入れて、室温
で１０分間培養。

（ｌｖ）　　ディツプスティックを取シ出す。水道水で
２０秒間洗浄。

（ｖ）顕色剤溶液にディツプスティックを入れて。

室温で１０分間培養。

（ｖｌ）ディツプスティックを取り出して、きれいなペ
ーノ寸−タオルに当てる。

υ１９　　ＭａｃＢｅｔｈ　　の反射光度計でパッドを
読むことによって、青色が定量される。

第１図は種々の濃度の“モルヒネを含む試料に対する指
示パッドお工び参照パッドの応答を示す。

Ｙ軸にプロットさｆ′した量に／Ｓは式に／５−（１−
Ｒｆ／２Ｒなる式によって反射率Ｒに関係し、パッド上
に析出される宵い染料の量に直線的に比例する。指示パ
ッド上の青色染料の量はモルヒネ濃度の増加と共に減少
するが、参照パッド上の値は７５ｎＩＩ／ｄのモルヒネ
に相当するレベルで一定のままであることがわかる。従
って１モルヒネの標準操作さえもすることなく、２つの
パッド上の色を比較するだけで試料中のモルヒネ濃度が
７５ｎｊｌ／−よシ高いか低いかを、決定することかで
きる。

例Ｂ 本例は、参照酵素がアルカリ性のホスファターゼ−２，
４−ジニトロ−フェニル共役体であること、および参照
パッドが固定化ムリン単りローン抗−〇ＮＰ’ｉ含むこ
とを除いて１例Ａに類仰する。

第２図は例Ａにおける場合と同様の結果が得られること
を示す。

例Ｃ 例ＡおよびＢにおいて１本発明はコンペテイテイブ型の
固相酵素イムノアッセイに使用された。

本例は、試料中のｈ　Ｃ０９度の測定するためにサンド
イッチｇＥＬＩ８Ａに本発明を使用することを示す。酵
素共役体カクテルはＡＬＰ−抗−ｈＣＧ共役体とＡＬＰ
−ビオチン共役体（参照共役体）　　　　　　−からな
る。参照パッドは固体アビジンを含む。

ＡＬＰ−ビオチン共役体の濃度は参照パッド上の色がｈ
ＣＧ濃度、例えば１０ｍＩＵ／ｄに対応するように調整
される。指示パッド上のさらに強い青色は試料にｌ　Ｏ
ｍ　ｒ　Ｕ／Ｍ１以上のｈＣＧが存在することを示す。

これは分析から不正な正の数を排除する。

例り 検出せんとする配位子は参照共役対の濃度値の上下を定
量的に分析することができる。これは次の例に従ってビ
タミンＨ（ビオチン）の分析に工って説明される。糧々
の濃度のビタミンＨを含む試料の１８００μｌ　ｆ　１
０　ｘ　５０　ｍガラス管にピペットで移し友。酵素共
役体Ｚｏｏμｊ（共役体緩衝液に２５ピコモルのＡＬＰ
−ビオチンお工びＡＬＰ−ＤＮＰ’ｉ含む）ｔ−試料に
添加した。ディツプスティックを得られた溶液に挿入し
て１５分間インキュベーションした。そのディツプステ
ィックは第４図と第３図に示す形式のものであって。

ＤＮＰに対するムリン単クローン抗体とペーパーパッド
上に固定されたアビジンをそれぞれ含む参照パッドと指
示パッド（翰×話インチ）を有するプラスチック・ハン
ドル（％５Ｘ２３Ａインチ）からなる。室温でのインキ
ュベーションに続いて、ディツプスティックを取り出し
、水道水で２０秒間洗浄し、α０２％ＮａＮ３のα５Ｍ
のＡＭＰ緩衝液（ｐＨ−１α５）中５ｍＭの５−プロモ
ー４−クロクー５−インドイルリン所塩溶液に入れ次。

室温で顕色剤液に１５分間入れ次後、ディツプスティッ
クを取り出して、ペーパータオルに当てた。

２つのパッドの青色１ｆｒＭａｃＢｅｔｈ　反射光度計
で読んだ。

第３図に示すように、Ｙ軸にプロットし友貴に／８は式
に／８−　（１−Ｒ）”／２　Ｒによって反射率Ｈに関
係し、パッドに析出さｎる青色染料の量に直線的に比例
する。指示パッド上の青色染料の量は試料中のビオチン
濃度の増加と共に減少するが、参卿パッド上の色はα２
％Ｍのビオチンに対応するレベルで一定のままである。

従って、ビオチンの標準を行なうことなく、単に２つの
パッド上の色を比較することによって試料中のどオテン
濃度がα２％Ｍの参照レベルよシ大きいか小さいかを決
定することができる。

第４図と第３図に示すように１本発明の装置は。

それぞれ齢述のように処理された木１紙、プラスチック
・ま几は他の半剛性材料の支持体１０と。

参照固体基質パッドｌｌｌ’ｉ有するディツプスティッ
クの形をとることが望ましい。

さらに改良、すなわち１つのスティック当９１つ以上の
参照パッドお工び／または１つ以上の指示パッドの使用
は本発明の範囲内である。本発明の明確な使用は異なる
参照レベルに２つ以上の参照パッドを有することである
。かくして、０．２％Ｍ、０１８％Ｍおよびα６％Ｍに
対応する５つの参照パッドを１つのスティックに組み込
んで、極めて広い範囲の定量的ま７’？＋は半定量的沖
１定をすることができる。

例Ｅ 本例のディツプスティックは第６図に示すように５つの
パッドを有する。スティック２０上の参照パッド２２は
それぞれ抗バルビッール酸塩および抗モルヒネに対する
２つのパッド２４と２６の基準である。

試験パッド２４はストリップの端部にあって。

固定されたウサギの抗バルビッール酸塩を含む。

参照パッド２２は試験パッド２ＩＪの次にあって。

固定化ウサギの抗Ｆ　Ｉ　ＴＣｔ−含む。試験パッド２
６は固定化ウサギの抗モルヒネを含む。

４００μノの試料にＡＬＰ−バルビッール酸塩。

ＡＬＰ−モルヒネおよびＡＬＰ−ＦＩＴＣｔ−含む酵素
共役体カクテル１００μｔｐ添加した。次にその溶液に
ストリップを入れて、１０分間インキュベーション、そ
れを水道水で２５秒間洗浄し。

ｌＯ分間顕色させた。そｎらの結果を第π表に示す。

１　　　＋ 殻　　へ　　殻 」１３Ｊ 検討 参照酵素に結合される基の選択が重要であることがわか
る。理想的には、試料中に存在する可能性のあるものと
類但すべきでない。

参照酵素の特殊設計のために、主酵素共役体と指示基質
問の相互作用を乱すことなく、別々にその濃度を変える
ことができる。従って、参照基質上に固定化されたバイ
ンダー物質の量は、参照酵素の濃度変化におけるこの無
限の融通性の友めに少しも重要でない。参照基質上に固
定化されたバインダー物質の量を最大にして、参照酵素
の濃度を変えることに工ってその上の色を容易かつ正確
に微調整することができる。従来の製造法において遭遇
した問題はもはや存在しない。参照酵素の濃度を変える
だけで、指示パッド、参照パッド。

参照酵素および主酵素共役体の全てのロツ）１−合わせ
ることができる。そしてそれは多くの時間と労力を要す
る紙の上に種々の量の抗体を固定化する小規模操業の試
みをするよシも非常に簡単かつ迅速である。

種々の試薬で本発明を用いることができる方法は沢山あ
る。例えば、染料は着色する必要はない。

例えば、紫外線の吸収ができる。従ってこの場合は反射
光度計または螢光を必要とする。固体基質。

すなわち試験または参照パッドは紙に限定されない。適
当な染料全結合するものであればなんでもよい。

さらに１分析装置には１つ以上の参照基質を使用するこ
とができる。この場合には、１つ以上の参照酵素とバイ
ンダー物質が必要である。例えば、２つの参照酵素とそ
ｎらに対応するバインダー物質を使用して、２つの参照
値を被分析体にセットすることができる。従って１例え
ば、被分析体の正常値工りも商いおよび低い値、または
第１および第２相の病気を検出することができる。１つ
以上の参照基質に対して、同一の基質に１つ以上のバイ
ンダー物質を固定化することができる。この方法は２つ
の参照系に応用することができ、１つの参照基質がバイ
ンダー物質へを含み、他方の参照基質がＡ、！ｌ：Ｂの
両方を含む。純粋なり基質に優る利点は少量の酵素Ｂで
よいこと、従って固体マトリックス上の非特定バンクグ
ラウンド・ノイズが小さくなることである。

以上の説明１例示お工び検討において示し九本発明の原
理内で、種々の免疫化学的結合対に関連して参照共役体
と参照共役対との極めて多くの組合せを用いることがで
きる。参照共役対は免疫化学的に相互に結合できること
が理解さｎる。しかしながら１本発明に関連して、用語
「参照共役対」は相互に選択的に、化学的または免役化
学的に結合する一対の物質を含むように使用さｎている
が、それは分析の主題である配位子および受容体とは異
なる。従って１例えば参照共役対は、標識１例えば酵素
標識が共役されて参照共役体を形成する抗屏と、参照基
質またはパッドに固定化された抗原に対する抗体からな
る。抗体および抗原が測定せんとする配位子と化学的お
工び／ｉ７ｔは免疫化学的に異なる限り、それらは参照
カップルとして作用する。

特に興味のある参照カップルのグループに極めて多数の
ハプテンとハプテンに対する単クローン抗体である。参
照共役対としてハプテン−抗ハゲテンを使用する利点は
、ハプテンと抗ハプテン間の共役がしばしば極めて特異
であって、他の免疫化学種と干渉または交差反応を受け
ないことである。

単クローン抗体に成長し１本発明における利用に適当で
あるハプテンの中に前に例示した２、１４−ジニトロフ
エニルと、多数の螢光染料、例えば、　　フルオルスセ
イン、置換ローダミン、モルホリノローダミンおよびテ
キサス・レッドがある。

前述のように１本発明の範囲内で異なる量値の参照共役
体を提供することを意図している。例えば、前記の材料
および方法を使用して、２つの参照パッドが提供さｎる
。１つの参照パッドは２゜キージニトロフェニル（ＤＮ
Ｐ）に対する固定化抗体を含み、第２の参照バンドは固
定化アビジンを含む。所定量のＡＬＰ−ＤＮＰからなる
第１の参照共役体と、ＡＬＰ−ピオチン共役体からなる
第２の参照共役体が試験溶液に添加される。現像時に、
２つの参照パッドは種々の濃度に対応するそれぞれの強
さの色の検出値を示す。この手段によって、配位子音２
つの参押色の間（または近く）に分類することができる
。

本発明は健康診断産業、特に診断学に利用さｎる。本発
明は配位子の存在を検定する補助器具として適する。ま
た、液体、特に体液中の乱用薬物。

例えばモルヒネ、ヘロイン、コカイン等の検出するため
の法延診断にも利用される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、配位子としてＡＬＰ−モルヒネ、参撓共役体
としてＡＬＰ−ピオチンお工び参照パッド上のアビジン
を使用して種々の濃度のモルヒネに対する試験パッドお
よび参照パッドのレスポンスを示すグラフ。第２図は、
参照共役体としてＡＬＰ−ＤＮＰおよび参照パッド上の
固定化ムリン単りローン抗−ＤＮＰ＠使用して種々の濃
度に対する試験および参照パッドのレスポンスを示すグ
ラフ。第３図は、参照共役体としてＡＬＰ−ＤＮＰお工
び参照パッド上の固定化ムリン単りローン抗ＤＮＰを使
用して種々の濃度のビタミンＨ（ピオチン）に対する試
験および参照パッドのレスポンスを示すグラフ。第４図
および第３図はそれぞれ参照パッドまたは指示パッドを
含む簡単なディツプスティックの正面図と側面図。第６
図は１つの参照パッドと２つの試験パッドを有する本発
明の別の実施態様を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、参照共役対の物質の他方の成分と特定的に結合する
   １成分を含む固体基質参照部分と、検出せんとする配位
   子用受容体を含む固体基質試験部分からなることを特徴
   とする溶液中の配位子の検出装置。 ２、前記参照部分が、参照共役体を含むビオチンまたは
   参照共役体を含むアビデインとそれぞれ結合するのに適
   したアビデインまたはビオチンを含む特許請求の範囲第
   １項記載の装置。 ３、前記試験部分の受容体が測定せんとする配位子に対
   する単クローン性抗体または多クローン性抗体からなる
   特許請求の範囲第１項記載の装置。 ４、前記試験部分の受容体がモルヒネまたはバルビツレ
   ートに対する抗体からなる特許請求の範囲第３項記載の
   装置。 ５、前記参照部分が、参照共役体を含むビオチンまたは
   参照共役体を含むアビデインとそれぞれ結合するのに適
   したアビデインまたはビオチンを含む特許請求の範囲第
   ３項記載の装置。 ６、前記参照部分が、参照共役体を含むビオチンと結合
   するのに適したアビデインを含む特許請求の範囲第４項
   記載の装置。 ７、前記参照部分がハプテンに対する単クローン性抗体
   を含む特許請求の範囲第１項記載の装置。 ８、前記参照部分が２，４−ジニトロフエニル共役体を
   含む特許請求の範囲第１項に記載の装置。 ９、前記参照部分がハプテンに対する抗体を含む特許請
   求の範囲第３項記載の装置。 １０、前記参照部分が、２，４−ジニトロフエニル共役
   体を含む特許請求の範囲第４項記載の装置。 １１、検出せんとする第２の異なる配位子用受容体を含
   む第２の参照部分をさらに含む特許請求の範囲第１項記
   載の装置。 １２、溶液中に普通見出される配位子ではなくて、参照
   共役対物質の他方の成分に特定的に結合する物質の参照
   共役対の１成分を含む固体基質参照部分と、 検出可能な標識を含む参照共役体からなり、予め決めた
   量の前記参照共役対の他方の成分と、 検出せんとする配位子用受容体を含む固体基質試験部分
   と、 検出可能な標識で標識された型の予め決めた量の検出せ
   んとする配位子からなることを特徴とする溶液中の配位
   子の検出用キツト。 １３、検出せんとする少なくとも１つの異なる別の配位
   子用受容体を含む少なくとも１つの別の試験部分をさら
   に含む特許請求の範囲第１２項に記載のキツト。 １４、前記参照部分が、参照共役体を含むビオチンまた
   は参照共役体を含むアビデインをそれぞれ結合するのに
   適したアビデインまたはビオチンを含む特許請求の範囲
   第１２項記載のキツト。 １５、前記試験部分の受容体が測定せんとする配位子に
   対する単クローン性抗体または多クローン性抗体からな
   る特許請求の範囲第１２項記載のキツト。 １６、前記試験部分の受容体がモルヒネに対する抗体か
   らなることを特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の
   キツト。 １７、前記参照部分がアビデインを含み、前記参照共役
   体が標識化ビオチンである特許請求の範囲第１６項記載
   のキツト。 １８、前記参照部分がハプテンに対する抗体を含む特許
   請求の範囲第１２項記載のキツト。 １９、前記参照部分が２，４−ジニトロフエニル共役体
   に対する抗体を含む特許請求の範囲第１８項記載のキツ
   ト。 ２０、前記参照部分がハプテンに対する抗体を含み、試
   験部分がモルヒネに対する抗体を含み、キツトがモルヒ
   ネの検出に適した特許請求の範囲第１２項記載のキツト
   。 ２１、前記参照部分が抗−ＤＮＰ抗体を含む特許請求の
   範囲第２０項記載のキツト。 ２２、試験溶液中に普通見出された成分と結合しないで
   特定的に相互に結合する物質の参照共役対の１成分を含
   む固体基質参照部分と、検出可能な標識を含む参照共役
   体からなり前記参照共役対の予め決めた量のもう１方の
   成分と、検出せんとする配位子用受容体を含む固体基質
   試験部分と、検出可能な標識で標識化された検出せんと
   する型の予め決めた量の配位子とを試験溶液に導入し； 前記試験溶液から前記参照部分と試験部分とを除去し； 前記参照部分および試験部分上の標識を検出することか
   らなることを特徴とする、検出せんとする試験配位子を
   含む疑いのある試験溶液中の配位子の検出方法。 ２３、前記参照部分が、前記参照共役体を含むビオチン
   または前記参照共役体を含むアビデインにそれぞれ結合
   するのに適したアビデインまたはビオチンを含む特許請
   求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、前記試験部分受容体が測定せんとする配位子に対
   する抗体からなる特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２５、前記参照部分がアビデインを含み、前記参照共役
   体が標識化ビオチンである特許請求の範囲第２２項記載
   の方法。 ２６、前記参照部分がハプテンに対する抗体を含み、前
   記参照共役体が標識化ハプテンである特許請求の範囲第
   ２２項記載の方法。 ２７、前記参照部分が２，４−ジニトロフエニルに対す
   る抗体を含み、前記参照共役体が標識化２，４−ジニト
   ロフエニルである特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２８、試験溶液中に普通見出される成分と結合しないで
   、相互に特定的に結合する物質の参照共役対の１成分と
   ； 検出可能な標識を含む参照共役体からなり、前記参照共
   役対の予め決めた他方の成分と；検出せんとする配位子
   用受容体を含む固体基質試験部分と； 検出可能な標識で標識化された検出せんとする配位子に
   対する予め決めた量の抗体からなることを特徴とする溶
   液中の配位子の検出用キツト。 ２９、前記参照部分が、参照共役体を含むビオチンまた
   は参照共役体を含むアビデインにそれぞれ結合するのに
   適したアビデインまたはビオチンを含む特許請求の範囲
   第２８項記載のキツト。 ３０、前記試験部分の受容体が検出せんとする配位子に
   対する単クローン性抗体からなる特許請求の範囲第２８
   項記載の方法。 ３１、前記試験部分の受容体がモルヒネに対する単クロ
   ーン性抗体からなる特許請求の範囲第２８項記載のキツ
   ト。 ３２、前記参照部分がアビデインを含み、前記参照共役
   体が標識化ビオチンを含む特許請求の範囲第２８項記載
   のキツト。 ３３、前記参照部分がハプテンに対する単クローン性抗
   体を含む特許請求の範囲第２８項記載のキツト。 ３４、前記参照部分が２，４−ジニトロフエニル共役体
   に対する単クローン性抗体を含む特許請求の範囲第２８
   項記載のキツト。 ３５、前記参照部分がハプテンに対する単クローン性抗
   体を含み、前記試験部分がモルヒネに対する単クローン
   性抗体を含み、キツトがモルヒネ検出に適している特許
   請求の範囲第２８項記載のキツト。 ３６、特定的に相互に結合する物質の参照共役対の１成
   分を含む固体基質参照部分と、検出可能な標識を含む参
   照共役体からなり前記参照共役対の予め決めた量の他方
   の成分と、検出せんとする配位子用受容体を含む少なく
   とも２つの固体基質試験部分と、検出可能な標識で標識
   化された予め決めた検出せんとする抗体とを試験溶液に
   導入し； 前記試験溶液から参照部分と試験部分を除去し； 前記参照部分および試験部分上の標識を検出することか
   らなることを特徴とする、検出せんとする試験配位子を
   含む疑いのある試験溶液中の配位子の検出方法。 ３７、前記参照部分が、参照共役体を含むビオチンまた
   は参照共役体を含むアビデインにそれぞれ結合するのに
   適したアビデインまたはビチオンを含む特許請求の範囲
   第３６項記載の方法。 ３８、前記参照部分がアビデインを含み、前記参照共役
   体が標識化ビオチンである特許請求の範囲第３６項記載
   の方法。 ３９、前記参照部分がアビデインを含み、前記参照共役
   体が標識化ビオチンである特許請求の範囲第３６項記載
   の方法。 ４０、前記参照部分がハプテンに対する単クローン性抗
   体を含み、前記参照共役体が標識化ハプテンである特許
   請求の範囲第３６項記載の方法。 ４１、前記参照部分が２，４−ジニトロフエニルに対す
   る単クローン性抗体を含み、前記参照共役体が標識化２
   ，４−ジニトロフエニルである特許請求の範囲第３６項
   記載の方法。 ４２、固体基質参照パツドと、異なる乱用薬物に対する
   少なくとも２つの試験パツドと、互に隣接する前記パツ
   ドを支持するデイツプステイツクからなることを特徴と
   する乱用薬物に対する抗体の検出装置。