NO854545L - Analysemetode for paavisning av medikamentmisbruk. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår detektering og semikvantitativ determi-nering av misbruksmedikamenter. Det spesielle medikament, f.eks. morfin, kokain, amfetamin, osv., eller en metabolitt derav, påvises ved å bringe kroppsvæske, f.eks. urin, i kontakt med en immunologisk spesifikk prøvepinne som har en indikatorpute og en referansepute.

Mange prosedyrer, teknikker og reagenser er angitt for detektering av spesille ligander i kroppsvæsker. Blant de viktige anvendelser av prinsip-pene involvert i detektering av ligander, er detektering av misbruksmedikamenter både av medisinske og legale grunner. Ligander som har vært påvist ved bruk av det som generelt kan kalles immunokjemiske teknikker inkluderer forskjellige medikamenter som har et antall fysiologiske virkninger. Slike medikamenter inkluderer narkotika, hypnotika, sedativer, analgetika, antipyretika, anestetika, psykotogene medikamenter, muskelrelakserende midler, nervesystemstimulanter, antikolinesterase midler, parasympatomimetiske midler, sympatomimetiske midler, neuromuskulære midler, histaminer, antihistaminer, kardiovaskulære medikamenter, antiarytmiske medikamenter, antihypertensive midler, vasodilatormedikamenter, diuretika, antibiotika, hormoner, vitaminer, tumorceller, bakterielle og virale proteiner, toksiner, blodproteiner og deres metabolitter.

Inkludert blant disse medikamenter som er spesielt interessante er alkaloider, steroider, polypeptider og proteiner.

Ligander kan være heller små, f.eks. lavmolekylvektsorganiske forbindelser, eller meget store, med molekylvekter helt opptil 100.000 eller mer. Ligander av interesse ved foreliggende analyse inkluderer antigener og, meget viktig, haptener. Haptener er substanser som når de injiseres som enkle kjemikalier, ikke gir grunn til antistoffer. Imidlertid kan antistoffer dannes mot haptener når de konjugeres til antigeniske bærere før de brukes for immunisering. Noen ligander av interesse ifølge oppfinnelsen er beskrevet i US-PS 4.067.774. US-PS 4.067.774 inkluderer også en spesifikk og utstrakt beskrivelse av misbruksmedikamentene, i patentet kalt ulovlige medikamenter, som er av spesiell interesse for foreliggende oppfinnelse. Disse medikamenter inkluderer opiater slik som morfin og heroin, meperidin og metadon. Andre medikamenter av spesiell interesse inkluderer amfetaminer, narcein, epinefrin, efedrin og L-Dopa. I det nevnte patent finner men en utstrakt diskusjon av de forskjellige ligander som kan bestemmes i henhold til foreliggende oppfinnelses prinsipper.

I patentet beskrives dannelsen av enzymbundne ligander av spesiell sammensetning.

US-PS 3.817.837 beskriver en metode for gjennomføring av en homogen enzymimmunoanalyse som kan anvendes ved påvisning av misbruksmedikamenter.

US-PS 4.069.105 beskriver andre enzymkonjugater med forskjellige ligander, spesielt lidokain. Kokainderivater konjugeres med forskjellige enzymer og med andre forbindelser for å tilveiebringe reagenser for immunoanalyseteknikker i henhold til de teknikker som er beskrevet i US-PS 4.123.431.

US-PS 4.190.496 beskriver en metode for å påvise ligander og reseptorer av interesse ifølge foreliggende oppfinnelse ved bruk av prinsippet med reduksjon av enzymatisk aktivitet for en enzymbundet ligand.

Spesielle malatdehydrogenasekonjugater for enzymimmunoanalyser er beskrevet i US-PS 4.191.613.

Andre systemer og preparater som er egnet for bruk ved detektering av misbruksmedikamenter og andre ligander av interesse i foreliggende oppfinnelse er beskrevet i US-PS 4.193.983, 4.197.237, 4.199.559, 4.203.802, 4.208.479 og 4.233.402. I dette sistnevnte patent beskrives en metode for enzymkanalisering. Andre beskrivelser av interesse er US-PS 4.235.969, 4.299.916, 4.328.311, 4.376.825, 4.423.143 og 4.435.504.

Av generell interesse da det angår enzymforbundne immunoanalysemetoder er US-PS 3.654.090.

Det finnes et stort antall sett og prøvestrimler som involverer enzymforbundne immunoanalyseprinsipp. Den mest pertinente beskrivelse i forhold til foreliggende oppfinnelse og som man kjenner til er av Litman et al., "An Internally Referenced Test Strip Immunoassay for Morphine", Clinical Chemistry, vol. 29, nr. 9, s. 1598-1603 (1983). Den her beskrevne prøvestrimmel er beskrevet som bestående av to aktive overflater, hver av hvilke inneholder koimmobulisert glukoseoksydase og antistoff. Indikatorputen inneholder antistoff rettet mot medikamentet og fargen som utvikles på overflaten inhiberes av nærværet av medikamentet i prøven. Referanseputen inneholder antiperoksydase og benyttes for å sette analysedetekteringsgrensen, og normalisere for varianter i temperatur, tid og prøveinterferens. Ved å justere antiperoksydaseoppfyllingen kan fargen som utvikles på referanseputen gjøres lik den som dannes på indikatorputen når analyttkonsentrasjonen er lik detekteringsgrensen for analysen. Denne prøvestrimmel er beskrevet med spesiell anvendelse for detektering av morfin.

Mens denne prøvestrimmel har enkelte åpenbare fordeler, lider den av en vesentlig mangel idet det er ekstremt vanskelig, så å si umulig i produksjonsomgivelser, å gi konsistent antiperoksydaseoppfylling på referanseputen. Dette krever meget snever kvalitetskontroll og vil uunngåelig resultere i en stor mengde avvist produkt.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en intern referansepute, men overvinner vanskelighetene som patentet bringer. Foreliggende oppfinnelse anvender de enzymforbundne immunoanalyseteknikker som generelt er beskrevet i den angitte kjente teknikk og et stort volum publisert litteratur og patenter, og skiller seg fra den kjente teknikk i at problemet med kontroll av oppfyllingen på referanseputen er overvunnet ved den apparatur, de metoder og teknikker som beskrives nedenfor.

Oppfinnelsen er rettet mot en apparatur for bruk ved påvisning av nærværet av en ligand. Apparaturen omfatter et referansefast bærerareal omfattende en første komponent av et referansekoplingspar som er i stand til kopling med en andre komponent av et referansekoplingspar. Den andre komponent av referansekoplingsparet er merket med en del som kan detekteres og måles. Denne andre komponent kalles referansekonjugatet. Et prøvefast bærerareal er også inkludert i apparaturen og prøvearealet omfatter en reseptor av et immunokjemisk bindende par. Den andre komponent av det immunokjemisk bindende par omfatter liganden som skal påvises, dvs. prøveliganden. Reseptoren er i stand til immunokjemisk å binde prøveliganden og en immunokjemisk identisk ligand merket med den samme del benyttet for å merke referansekonjugatet. I en foretrukket form omfatter referansekoplingspar et avidin og biotin, og det immunokjemisk bindende par omfatter et par valgt blant gruppen av par bestående av (a) et antigen og et antistoff mot antigenet, (b) et hapten og et antistoff mot haptenet og (c) et protein og et antistoff mot proteinet.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter å innføre en prøveapparatur som omfatter referanse- og prøvearealet som beskrevet ovenfor, inn i en prøveoppløsning som man mistenker for å inneholde prøveliganden, f.eks. morfin. Referansekonjugat og ligandkonjugat av det immunokjemisk bindende par i kjente mengder tilsettes til prøveoppløsningen. Prøveopp-løsningen og apparaturen inkuberes eller tillates på annen måte å reagere i et tidsrom tilstrekkelig til å bevirke immunokjemiske bindingsreaksjoner og kjemiske bindingsreaksjoner mellom henholdsvis de immunokjemiske koplingspar og referansekoplingsparet. Referansearealet inneholder etter den ovenfor angitte reaksjon referansekonjugatet fra prøveoppløsningen. Prøvearealet inneholder prøveliganden og ligandkonjugat. Prøveligandene og merkede ligander på prøvearealet er proporsjonale med mengden prøveligand og ligandkonjugat i prøveoppløsningen. Prøveapparaturen fjernes, vaskes hvis nødvendig, og den merkede del fremkalles hvis nødvendig og detekteres. Ethvert signal som fremkalles, f.eks. en farge, må forbli der den dannes og ikke oppløses eller dif fundere bort (det vil således måtte være en viss affinitet mellom det fargede element og den faste bærer). I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er merkelappen et enzym som ved fremkalling gir en distinktiv farge som forblir der den fremkalles. Radiomerkelapper eller fluorescente merkelapper kan imidlertid også benyttes hvis de er stabile der de dannes. I den foretrukne utførelsesform hvori en enzymmerkelapp benyttes, sammenliknes fargen på prøvearealet med fargen på referansearealet for derved å gi et semikvantitativt mål på mengden prøveligand som er tilstede i prøveopp-løsningen.

I en spesielt foretrukket form omfatter oppfinnelsen en prøvestrimmel eller pinne som har to arealer, for hensiktsmessighetens skyld her kalt puter, en referansepute og en prøvepute. Referanseputen består i det vesentlige av en komponent av et referansekoplingspar slik som avidin. Prøveputen består i det vesentlige av en immobilisert reseptor for prøveliganden.

I en annen foretrukket utførelsesform omfatter prøvepinnen en enkelt referansepute og indikatorputer for detektering av to forskjellige prøveligander.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsens fremgangsmåte tillates prøveapparaturen i form av en strimmel eller en pinne å reagere med en oppløsning man mistenker for å inneholde prøveliganden, hvortil det er satt kjente konsentrasjoner av referansekonjugatet og av den interessante ligand hvortil det samme enzym som benyttes i referansekonjugatet er konjugert, dvs. ligandkonjugatet. Den kjente mengde ligandkonjugat konkurrerer om seter på prøveputen med prøveliganden, mens referansekonjugatet uavhengig reagerer med første komponent av referanseparet på referanseputen uten interferens av prøveliganden. I den grad reak-sjonstider, temperaturer, konsentrasjoner, interfererende bestanddeler og andre variabler påvirker analysen, er virkningen omtrent den samme for både ligandkonjugat og referansekonjugat. Enzymet fremkalles for å oppnå den karakteristiske farge. Fargen på referanseputen er standarden og er en funksjon av det tilgjengelige referansekonjugat. Fargen på prøveputen er en funksjon av andelen tilgjengelige seter på prøveputen som opptas av ligandkonjugat og omvendt proporsjonal med mengden prøveligand i prøven.

Foreliggende oppfinnelse overvinner en av hovedvanskelighetene man tidligere sto overfor i systemer som benyttet en referansepute. I tidligere analyser var det nødvendig å kontrollere med stor nøyaktighet den mengde antistoff eller annen immunokjemisk reseptor som var på referanseputen. I produksjon er dette en så å si umulig og i visshet upraktisk prosedyre som med sikkerhet vil resultere i en høy andel kassert produkt. I henhold til oppfinnelsen er det ikke nødvendig å opprettholde en så høy presisjon ved fremstilling av prøvestrimmelen eller pinnen. Kontrollen legges på når det gjelder mengden referansekonjugat og ligandkonjugat som tilsettes til prøveoppløsningen. Det er meget enkelt å "finstemme" tilsetningen av disse stoffer til prøveoppløsningen. Mengdene er lette å kontrollere og stor nøyaktig er lett å oppnå.

Oppfinnelsen omfatter i en av sine mere foretrukne utførelsesformer et sett egnet til bruk ved prøving på nærvær av prøveligand i kroppsvæsker, f.eks. prøving på morfin i urin. Settet omfatter en prøveapparatur som beskrevet ovenfor sammen med ligandkonjugat og referansekonjugat i på forhånd bestemte konsentrasjoner. Settet kan også inkludere beholdere og andre apparaturer for å gjennomføre prøven. Det ligger innenfor oppfinnelsens ramme å inkludere mer enn en referansepute og/eller mer enn en prøvepute i samme apparatur.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til de ledsagende tegninger. Figur 1 er et diagram som viser responsen av prøve- og referanseputer på forskjellige konsentrasjoner morfin ved bruk av ALP-morfin som ligandkonjugat, ALP-biotin som referansekonjugat og avidin på referanseputen. Figur 2 er et diagram som viser responsen av prøvereferanseputer på forskjellige konsentrasjoner av morfin ved bruk av ALP-DNP som referansekonjugat og immobilisert murinmonoklont anti-DNP på referanseputen. Figur 3 er et diagram som viser responsen av prøve- og referanseputer på forskjellige konsentrasjoner av vitamin H (biotin) ved bruk av ALP-DNP som referansekonjugat og immobilisert murinmonoklont anti-DNP på referanseputen. Figurene 4 og 5 er henholdsvis front- og sideriss av en enkel dyppe-pinnekonsentrasjon omfattende referansepute eller -areal og indikatorpute eller -areal. Figur 6 er en alternativ form av oppfinnelsen med en referanse- og to

prøveputer.

De følgende uttrykk benyttes i beskrivelsen og skal defineres for forståelsens skyld: Ligand: Uttrykket ligand benyttes her i immunokjemisk betydning og inkluderer komponenter av et hvilket som helst par som bindes sammen ved eller som resultatet av immunokjemiske determinante strukturer. Ligander inkluderer hapten-antistoff- og antigen-antistoff-par og både polyklone og monoklone antistoffer. Uttrykket "antigent i denne definisjon benyttes generelt for å inkludere ethvert stoff som induserer en antistoffreaksjon i dyr.

Reseptor: En reseptor slik uttrykket benyttes her, betyr et stoff som immunokjemisk binder en ligand under spesiell henvisning til liganden som skal bestemmes, og karakteristisk vil være antistoffet mot haptenet eller antigenet.

Referansekoplingspar: Referansekoplingspar (eller referansepar) henviser til et par forbindelser som har spesiell affinitet til hverandre. Affiniteten kan være kjemisk eller immunokjemisk. Typisk for koplingspar er: Avidin og biotin; hapten og antistoff mot hapten; polyanion og kation; eller polykation og anion.

Referansekonjugat: Referansekonjugater dannes ved konjugering av en del av referanseparet med en merkende del, f.eks. et merkende enzym. Ligandkonjugat: Ligandkonjugater dannes ved konjugering av ligander av immunokjemisk type som skal bestemmes med en merkende del.

Ligander av interesse med henblikk på foreliggende oppfinnelse inkluderer en hvilken som helst ligand som kan finnes i kroppsvæsker eller vev som er oppløslige i eller kan oppløseliggjøres i en prøveoppløsning.

Blant ligander av spesiell interesse er "misbruksmedikamentene". Misbruksmedikamenter inkluderer i vid forstand medikamenter med et antall fysiologiske reaksjon når de injiseres eller fordøyes. Blant de mest vanlige av disse misbruksmedikamenter er medikamenter som virker som narkotika, hypnotika, sedativer, psykotogene medikamenter, muskelrelakserende midler og nervesystemstimulanter. Spesielt viktige misbruksmedikamenter som oppfinnelsen er rettet mot er opiater slik som morfin, kokain, amfetaminer, barbiturater, fencyklidin, tetrahydrokannibinol (THC), metadon, valium (oksazepam) og disses metabolitter.

Opiater som kan detekteres ifølge oppfinnelsens prinsipp inkluderer morfin, heroin, hydromorfon, oksymorfon, metopon, kodein, hydrokodon, dihydrokodein, dihydrohydroksykodeinon, folokodin, dekstrometorfan, fenaksocin og dionin.

Katakolaminer og de beslektede forbindelser epinefrin, amfetaminer og andre beslektede forbindelser kan også bestemmes ved oppfinnelsens apparatur og metoder.

Barbiturater slik som veronal, medinal, luminal, prominal, soneryl, nembutal, amytal, dial, fenadorn, sekonal, evipan, fenobarbital og pentotal kan detekteres ifølge oppfinnelsens prinsipper.

Kokain, et medikament som nå misbrukes i meget stor grad, og analoger derav, og også marihuana, også sterkt misbruk, kan detekteres ved oppfinnelsens prinsipper.

Beroligende midler slik som meprobamat, og benzdiazocykloheptaner misbrukes også og kan også detekteres ifølge oppfinnelsen.

Aminosyrer, peptider og polypeptider er også gjenstand for detektering ifølge oppfinnelsen på samme måte som andre antigeniske stoffer og organismer hvortil det kan produseres spesifikke monoklone antistoffer.

Andre stoffer som kan detekteres ifølge oppfinnelsen inkluderer antibiotika slik som penicillin, klormycetin, aktinomyucetin, tetracyklin, terramycin, nukleinsyrer eller derivater slik som nukleosider og nukleo-tider, steroider, hormoner, insekticider, fungicider, bakteriocider og nematocider.

Et vidt spektrum merkende enzymer som kan benyttes i homogentype EIA (f.eks. Syva's Emit System) er rapportert i litteraturen. Typiske for slike enzymer er oksidoreduktaser og hydrolaser. Kriteriene for valget av slike enzymer er velkjent og har vært diskutert i US-PS 4.067.774. Kriteriet for valget av et enzym for bruk ifølge oppfinnelsen er imidlertid heller forskjellig enn de kriterier som ble diskutert i dette patent. For det første skulle enzym-ligandkonjugatet ikke sterkt inhiberes ved binding av antistoffet. Dette er også tilfellet for referansekonjugatet. For det andre må det fargede produktet som dannes av enzymet, binde til den faste bærer som benyttes ifølge oppfinnelsen. Spesielle enzymer som er egnet for bruk som merkelapper ifølge oppfinnelsen inkluderer pepperrot-peroksydase (HRP), g-galaktasidase, sur fosfatase og alkalisk fosfatase (ALP), som benyttes som eksempler på de mange tilgjengelige systemer.

Radioaktive merkelapper av hvilke et antall er velkjente og generelt brukt i denne teknikk, fluorescente merkelapper og katalytiske slike kan benyttes. Imidlertid er som diskutert, den foretrukne klasse merkelapper enzymene på grunn av den enkle og sikre måte de kan benyttes på uten behovet for spesialisert instrumentering eller spesielle sikkerhetsforholds-regler.

I enzymimmunoanalyser som benytter faste substrater, det være seg av sandwich-typen eller kompetitiv-typen enzymimmunoanalyse, er det vanligvis mulig å finne enzymsubstrater som danner uoppløselige produk-ter som binder sterkt til den faste matriks. F.eks. dannes 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat, et substrat for alkalisk fosfatase (ALP), et blått indigo-liknende fargestoff, som binder sterkt (eller avsetter seg selv) på papir. Papir (cellulose) og andre hydrogenbindingsdannende faste matrikser (nylon) er vanligvis gode valg for dette formål. Denne egenskap kan benyttes for hensiktsmessig å avslutte en analyse ved nettopp å fjerne den faste matriks fra substratoppløsningen og deretter å bringe matriksen til tørr tilstand, noe som resulterer i avbrutt enzymaktivitet og en oppvisning av sluttpunktfargen.

Videre er det nå mulig å gjennomføre "interne" referanseranser. Man kan i prøveoppløsningen sammen med den første faste matriks anbringe en andre hvorpå det er immobilisert en egnet mengde av et egnet stoff, og være i stand til å bestemme den relative konsentrasjon av den angjeld-ende analytt ved å sammenlikne fargen som vises på den første faste matriks med den på den andre, som alltid vil tilsvare en viss på forhånd angitt analyttkonsentrasjon, uansett hva prøven vil være.

Således er det ikke noe behov for å kjøre standarder sammen med prøvene (eksterne referanser). Således bør intern referanse være overlegen i forhold til ekstern referanse i de fleste tilfeller. Dette fordi: (i) prøvematrisene (spesielt urinprøver) varierer i stor grad, noe som kan påvirke både enzymaktivitet og den ikke-spesifikke vedhefting av enzymkonjugatene til den faste matriks; (ii) variasjoner i prøve-inkuberingstiden, vasketeknikken og substratinkubasjonstiden.

Et eksempel på intern referanse i forbindelse med en kompetitiv enzymimmunoanalyse er en dyppepinneanalyse for morfin som beskrevet av Litman et al., "Clinical Chemistry", 29^1598-1603 (1983). Denne dyppepinne har også to puter: Indikatorputen inneholder immobilisert antistoff mot morfin, mens referanseputen inneholder antistoff mot pepperrot-peroksydase (HRP). Dyppepinnen anbringes først i en urinprøve og så i en fremkalleroppløsning inneholdende HRP-morfinkonjugat. Systemet er slik konstruert at referanseputen vil vise farge tilsvarende ca. 300 ng/ml morfin og derfor indikerer en mindre intens blå farge på indikatorputen nærværet av mer enn 300 ng/ml morfin.

Ideen om å bruke anti-HRP på referanseputen i det ovenfor angitte eksempel er fin, bortsett fra at det vanligvis er en meget møysommelig oppgave å kontrollere (eller finstemme) mengden antistoff som immobiliseres på referanseputen slik at den viser farge tilsvarende en viss på forhånd satt analyttkonsentrasjon. Dette gjelder spesielt ved fremstilling av et produkt som dette. For det første kan man aldri være sikker på at en storskalaproduksjon gir nøyaktig det samme produkt som i et forsøks-opplegg i liten skala. Hvis det viser seg at referanseputen ikke passer til indikatorputen, må hele mengden reagenspapir for referanseputen enten kasseres eller legges til side for en andre tilpasningsrunde med en annen lott indikatorpapir. For det andre kan man som en korrollar til det ovenfor angitte aldri garantere at den samme lott av referanseputer vil passe til mer enn en lott indikatorpute og enzymkonjugat. Dette nødvendiggjør små prøveforsøk foran hver produksjonsrunde.

I henhold til oppfinnelsen er det oppnådd et system for å gi både elegant presisjonsfin avstemming av fargen på referanseputen til den ønskede analyttkonsentrasjon og en stor letthet og fleksibilitet i fremstillings-prosessen.

Oppfinnelsen involverer hovedsakelig konseptet "referansekonjugater". Et "referansekonjugat" er i den foretrukne form et enzym som er kjemisk modifiset til å inneholde en eller flere kovalent bundne grupper av identisk kjemisk struktur som ikke eksisterer på det opprinnelige enzymmolekyl og som ikke minner om stoffene som analyseres, og vil bli bundet av en bindesubstans som er immobilisert på et fast substrat, referansearealet eller -putene, som spesifikt erkjenner og binder gruppen. Ved enkel justering av konsentrasjonen av dette referansekonjugat kan man finavstemme fargen på referansearealet eller puten meget nøyaktig og mer stor letthet til det som tilsvarer det ønskede analyttkonsen-trasjonsnivå. Denne referanse er totalt uavhengig av analytten i prøven på grunn av den totale mangel på affinitet for bindesubstansen for analytten og derfor kan benyttes som intern referanse. En tabell over enkelte representative grupper og tilsvarende bindesubstanser som kan benyttes i dette system er vist nedenfor.

Forbindelser som hører til haptenkategorien er mange og potensielt mest brukbare. Man kan så å si velge en hvilken som helst struktur man ønsker og dyrke monoklone antistoffer mot det.

Nedenfor følger tre eksempler som angår bruken av referanseenzymet.

EKSEMPEL A

I. Reagenser:

(i) Enzymkonjugatcocktail: Inneholder 40 nM ALP-morfinkonjugat og 7 nM ALP-biotinkonjugat (referansekonjugatet) i konjugatbuffer. (ii) Dyppepinne: Referanseputen på 3/16" x 1/8" er festet til en ende av en plastpinne på 3/16" x 2 " og indikatorputen (3/16" x l/8#) er anbrakt ved siden av. Referanseputen inneholder avidin immobilisert på papir. Indikatorputen inneholder kanin-anti-morfin immobilisert på papir. (iii) Fremkalleroppløsning: 5 mM 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat i 0,3 M AMP-buffer ved pH 10,15 med 0,02% NaN3.

II. Analyseprosedyre:

(i) Pipetter 400 %1 prøve inn i et 10 x 50 mm glassrør.

(ii) Tilsett 100 %1 enzymkonjugatblanding. Rør.

(iii) Anbring dyppepinnen i oppløsning og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur.

(iv) Fjern dyppepinnen. Vask 20 sekunder under springvann.

(v) Anbring dyppepinnen i fremkalleroppløsning og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur.

(vi) Fjern dyppepinnen og avsett flekk på en ren papirduk.

(vii) Blåfarge kvantiteres ved avlesning av putene på et MacBeth-reflektansfotometer.

Figur 1 viser responsen for både indikator- og referansepute på prøver inneholdende forskjellige konsentrasjoner morfin. Mengden K/S anført på X-aksen henger sammen med reflektansen R via ligningen

K/S = (1-R)<2>/2R og er lineært proporsjonal med mengden blått fargestoff som er avsatt på putene. Man kan se at mengden blått fargestoff på indikatorputen synker med økende morfinkonsentrasjon, mens den på referanseputen forblir konstant på et nivå tilsvarende 75 ng/ml morfin. Derfor kan man uten overhodet å kjøre morfinstandarder bestemme hvis morfinkonsentrasjonen i prøven er større eller mindre enn 75 ng/ml kun ved å sammenlikne fargene på de to puter.

EKSEMPEL B

Dette tilsvarer eksempel A, bortsett fra at referanseenzymet er et alkalisk fosfatase-2,4-dinitrofenylkonjugat og referanseputen inneholder en immobilisert murinmonoklon anti-DNP. Figur 2 viser at man oppnår resultater tilsvarende de i eksempel A.

EKSEMPEL C

I eksemplene A og B ble oppfinnelsen benyttet i kompetitiv-type fastfase-enzymimmunoanalyser. Dette eksempel viser bruken av oppfinnelsen i en sandwich-type ELISA for å bestemme hCG-konsentrasjonen i en prøve. Enzymkonjugatblandingen består av ALP-anti-hCG-konjugat og ALP-biotin-konjugat (referansekonjugatet). Referanseputen inneholder immobilisert avidin. Konsentrasjonen av ALP-biotin-konjugat kan justeres slik at fargen på referanseputen tilsvarer en hCG-konsentrasjon på f.eks. 10 mIE/ml. En mere intens blåfarge på indikatorputen indikerer nærværet av mer enn 10 mIE/ml hCG i prøven. Dette eliminerer falske positive resultater fra analysen.

EKSEMPEL D

Liganden som skal påvises kan kvantitativt bestemmes over eller under konsentrasjonsnivået for referansekoplingsparet. Dette illustreres ved bestemmelsen av vitamin H (biotin) i henhold til det følgende eksempel. 400 pm prøve inneholdende vitamin H ved forskjellige konsentrasjoner ble pippettert inn i et 10 x 50 mm glassrør. 100 pm konjugat inneholdende 23 pikomol ALP-biotin og ALP-DNP i konjugatbuffer ble tilsatt til prøven. En dyppepinne ble innført i den resulterende oppløsning og inkubert i 15 minutter. Dyppepinnen var av den type som er vist figurene 4 og 5 og omfattet en plaststav på 3/16" x 2 " med en referansepute og en indikatorpute på hver 3/16" x 1/8" inneholdende murinmonoklont antistoff med DNP henholdsvis avidin immobiliset på papirputen. Etter inkubering ved romtemperatur ble dyppepinnen fjernet og vasket 20 sekunder under springvann og anbrakt i en oppløsning av 5 mM 5-brom-4-klor-3-indoyl-fosfat i 0,3 M AMP-buffer i 0,3 M AMP-buffer ved pH 10,15 med 0,02% NaN3. Etter 15 minutter i fremkalleren ved romtemperatur ble dyppepinnen fjernet og holdt mot et papirhåndkle. Blåfargen på de to puter ble avleste på et MacBeth-reflektansefotometer.

Som vist i figur 3, henger mengden K/S som er plottet på Y-aksen sammen med reflektansen R via likningen K/S = (1-R)<2>/2R, og er lineært proporsjonal med mengden blått fargestoff avsatt på putene. Mengden blått fargestoff på indikatorputen synker med økende konsentrasjon biotin i prøven, mens fargen på referanseputen forblir konstant ved et nivå tilsvarende 0,2 jjM biotin. Uten engang å kjøre biotinstandarder kan man således bestemme om biotinkonsentrasjonen i prøven er større eller mindre enn 0,2 pM referansenivå, ganske enkelt ved å sammenlikne fargene på de to puter.

Som angitt i figurene 4 og 5 kan apparaturen ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis, dog ikke nødvendigvis, ha form av en dyppepinne med en bærer, antydet med tallet 10, av tre, papir, plast eller et annet halvstivt materiale, en referanse fast substratpute angitt med 14, begge behandlet som angitt nedenfor.

En ytterligere raffinering ligger helt innenfor oppfinnelsens ramme, nemlig bruken av mer enn en referanse- og/eller mer enn en indikatorpute pr. pinne. En klar bruk av oppfinnelsen er å ha to eller flere referanseputer ved forskjellige referansenivåer. Ved bruk av det illu-strerende eksempel i det nettopp beskrevne eksempel 3, kan tre referanseputer tilsvarende 0,2 pM, 0,4 pM og 0,6 pM innarbeides på en enkelt pinne for derved å gi et meget bredt område for kvantitativ og semikvantitativ bestemmelse.

EKSEMPEL E

I dette eksempel har dyppepinnen tre puter som vist i figur 6. Referanseputen 22 på pinnen 20 er referansen for to puter 24 og 26 for antibarbiturat henholdsvis antimorfin.

Prøveputen 24 befinner seg i den ene ende av strimmelen og inneholder immobilisert kanin-antibarbiturat. Referanseputen 22 befinner seg nærmest prøveputen 24 og inneholder immobilisert kanin-anti-FITC. Anti-FITC er antifluorescein-isotiocyanat. Prøveputen 26 inneholder immobilisert kanin-antimorfin.

To 400 pl prøver ble tilsatt 100 pl ensymkonjugatblanding inneholdende ALP-barbiturat, ALP-morfin og ALP-FITC. En strimmel ble så anbrakt i oppløsningen og inkubert i 10 minutter, hvoretter den ble skylt under springvann i 25 sekunder og fremkalt i 10 minutter. Resultatene er vist i tabell II.

Man kan merke seg at. valget av gruppen som skal bindes til referanse-systemet er viktig. Ideelt bør det ikke minne om noe som muligens kunne være tilstede i prøven.

På grunn av den spesielle konstruksjon av referanseenzymet, kan man variere konsentrasjonen uavhengig uten å forstyrre den gjensidige påvirkning mellom hovedenzymkonjugat og indikatorsubstrat. Mengden bindesubstans som immobiliseres på referansesubstratet er derfor ikke vesentlig i det hele tatt på grunn av denne uendelige fleksibilitet med henblikk på å variere konsentrasjonen av referanseenzymet. Man kunne prøve å maksimalisere mengden immobilisert bindesubstans på referanseenzymet og finavstemningen av fargen på denne kunne så gjennomføres på lett og nøyaktig måte ved å variere konsentrasjonen av referanseenzymet. Dette problem som forelå ved tidligere kjent praksis eksisterer ikke lenger. Man kan tilpasse enhver lott indikatorpute, referansepute, referanseenzym og hovedenzymkonjugat ved ganske enkelt å variere konsentrasjonen av referanseenzymet, noe som altså er enormt enklere og hurtigere enn å gjennomføre prøveforsøk i liten målestokk for immobilisere forskjellige mengder antistoff på papir, en prosess som tar meget tid og energi.

Det er mange måter på hvilke oppfinnelsen kan benyttes med forskjellige reagenser. F.eks. behøver fargestoffet ikke være farget. Det kan være UV-absorberende, noe som krever et reflektansefotometer, eller fluorescerende. Det faste substrat, dvs. prøve- eller referansearealet eller -puten er heller ikke begrenset til papir. Alt som binder det egnede fargestoff gjør nytten.

Videre kan mer enn et referansesubstrat benyttes i et analysesystem. I dette tilfellet vil mer enn et referanseenzym og bindestoff være nødven-dig. Ved å bruke to referanseenzymer og deres tilsvarende bindesubstanser kan mari f.eks. for en analytt ha to referanseverdier. Således kan man f.eks. detektere laveste og høyese normalverdi for analytten eller den første og andre fase av en sykdom. For mer enn et referansesubstrat er det mulig å immobilisere mer enn en bindesubstans på det samme substrat, som binder alle relevante enzymer. Denne mulighet kan anvendes på to referansesystemer der et referansesubstrat inneholder bindesubstans A og den andre inneholder både A og B. Fordelen ved dette i forhold til et rent B substrat er at det er nødvendig med mindre referanseenzym B, noe som resulterer i mindre ikke-spesifikk bakgrunns-støy på de faste matrikser.

Innenfor oppfinnelsens ramme som nettopp beskrevet og her eksemplifisert er det selvfølgelig mulig å benytte et stort antall kombinasjoner av referansekonjugater og referansekoplingspar i forbindelse med forskjellige immunokjemisk bindende par. Det skal være klart at referansekoplingsparet kan binde til hverandre immunokjemisk. Uttrykket "referansekoplingspar" benyttes innenfor oppfinnelsens ramme imidlertid for å angi et par substanser som binder til hverandre selektivt, enten kjemisk eller immunokjemisk, som er forskjellige fra ligand- og reseptorparet som er gjenstanden for analysen. Derfor kan referansekoplingsparet omfatte et antigen hvortil en merkelapp, f.eks. en enzymmerkelapp, er konjugert for derved å utgjøre referansekonjugatet, og et antistoff til antigenet immobilisert på referansesubstratet eller -puten. Så lenge antigenet og antistoffet kjemisk og/eller immunokjemisk er forskjellig fra liganden som skal bestemmes, kan de tjene som referansepar.

En spesielt attraktiv gruppe av referansepar er det meget store antallet haptener og monoklone antistoffer mot haptenene. Fordelen ved å benytte et hapten-antihapten som referansekoplingspar er at koplingen mellom hapten og antihapten hyppig er meget spesifikk og ikke gjenstand for interferens eller kryssreaksjon med andre immunokjemiske arter.

Blant haptenene mot hvilke monoklone antistoffer kan tilveiebringes og som er egnet for bruk ifølge oppfinnelsen, er 2,4-dinitrofenyl som er eksemplifisert tidligere, og et antall fluorescerende fargestoffer, f.eks. fluorescein, substituert rhodamin, morfolinorhodamin og Texas-rød.

Som antydet tidligere er det ansett innenfor oppfinnelsens ramme å tilveiebringe differerende kvantitative verdier for referansekonjugater. Ved bruk av de stoffer og teknikker som er beskrevet og eksemplifisert ovenfor, kan det f.eks. tilveiebringes to referanseputer. En referansepute vil inneholde immobiliserte antistoffer til 2,4-dinitrofenyl (DNP), og den andre referansepute vil inneholde immobilisert avidin. Et første referansekonjugat i en på forhånd bestemt mengde, omfattende ALP-DNP-konjugat, og et andre referansekonjugat omfattende ALP-biotinkonjugat, tilsettes til prøveoppløsningen. Ved utvikling vil disse to referanseputer vise et påvisbart fargenivå av forskjellig intensitet der hver intensitet tilsvarer en forskjellig konsentrasjon. På denne måte kan liganden innklamres mellom eller nær to referansefarger.

Oppfinnelsen finner anvendelse i helsesektoren og spesielt ved diagnosti-sering. Oppfinnelsen egner seg som hjelpemiddel ved bestemmelse av nærværet av ligander. En spesiell anvendelse finnes også i forensisk diagnostikk for detektering av misbruksmedikamenter, f.eks. morfin, heroin, kokain osv. i et hvilket som helst fluid, spesielt kroppsvæsker.

Claims (11)

1. Apparatur for bruk ved detektering av ligander i oppløsning, karakterisert ved at den omfatter: et fast substratreferanseareal inneholdende en komponent av et referansekoplingspar av stoffer som binder spesifikt til en annen komponent i referansekoplingsparet; og et fast substratprøveareal inneholdende en reseptor for liganden som skal detekteres.

2. Apparatur ifølge krav 1, karakterisert ved at referansearealet inneholder avidin eller biotin, tilpasset til respektivt å binde biotinholdig referansekonjugat eller avidinholdig referansekonjugat.

3. Apparatur ifølge krav 1, karakterisert ved at prøvearealreseptoren omfatter monoklone eller polyklone antistoffer mot liganden som skal bestemmes.

4. Apparatur ifølge krav 3, karakterisert ved at prøvearealreseptoren omfatter antistoffer mot morfin eller barbiturat.

5. Sett for bruk ved detektering av en ligand i oppløsning, karakter isert ved at den omfatter: et fast substratreferanseareal inneholdende en komponent av et referansekoplingspar av stoffer som binder spesifikt til den andre komponent av koplingsparet, men ikke til en ligand som vanligvis finnes i oppløsningen; en på forhånd bestemt mengde av den andre komponent i referansekoplingsparet idet den andre komponent omfatter et referansekonjugat inneholdende en detekterbar merkelapp; et fast substratprøveareal inneholdende en reseptor for liganden som skal detekteres; og en på forhånd bestemt mengde ligand av den typen som skal detekteres, merket med en detekterbar merkelapp.

6. Sett ifølge krav 5, karakterisert ved at det videre inneholder et ytterligere prøveareal inneholdende en reseptor for minst en forskjellig ytterligere ligand som skal detekteres.

7. Sett ifølge krav 12, karakterisert ved at referansearealet inneholder avidin eller biotin, tilpasset til respektivt å binde biotinholdig referansekonjugat eller avidinholdige referansekonjugat.

8. Sett ifølgekrav 12, karakterisert ved at prøveareal-reseptoren omfatter monoklone eller polyklone antistoffer mot liganden som skal detekteres.

9. Fremgangsmåte for detektering av ligander i en prøveoppløsning antatt å inneholde prøveliganden som skal detekteres, karakterisert ved at den omfatter: å innføre i prøveoppløsningen et fast substratreferanseareal inneholdende en komponent av et referansekoplingspar av stoffer som binder spesifikt til hverandre, en på forhånd bestemt mengde av den andre komponent av referansekoplingsparet idet den andre komponent omfatter et referansekonjugat inneholdende en detekterbar merkelapp, minst to faste substrattestarealer inneholdende en reseptor for liganden som skal detekteres, og en på forhånd bestemt mengde antistoff mot liganden som skal detekteres, merket med en detekterbar merkelapp; fjerning av referansearealet og prøvearealet fra oppløsningen; og detektering av merkelappen på referansearealet og prøvearealet.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at referansearealet inneholder avidin eller biotin, tilpasset til respektivt å binde biotinholdig referansekonjugat eller avidinholdig referansekonjugat.

11. Apparatur for detektering av antistoffer mot misbruksmedikamenter, karakterisert ved at den omfatter en fast substrat-referansepute og minst to prøveputer for forskjellige misbruksmedikamenter, og en dyppepinne som bærer putene nær hverandre.