MXPA97004363A - Dispositivo para realizar uno o mas inmunoensayos competitivos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo y método relacionado para realizaruno o más inmuno ensayos para detectar la presencia de analitos respectivos en una muestra. El dispositivo involucra el uso de un material absorbente unitario que proporciona una o más trayectorias de flujo que tienen un sitio de origen común y una pluralidad de zonas de reactivo respectivas que proporcionan los reactivos necesarios para realizar un inmuno ensayo competitivo de lectura visual para la presencia del analito respectivo.

Description

DISPOSITIVO PARA REALIZAR UNO O MAS INMUNOENSAYOS COMPETITIVOS CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona al campo de inmunoensayos de diagnóstico y dispositivos relacionados para llevar a cabo dichos ensayos. En otro aspecto, la invención se relaciona a ensayos para análisis tales co o drogas de abuso o sus metabolitos. En otro aspecto, la invención se relaciona a dispositivos o medios para llevar a cabo simultáneamente múltiples ensayos para diferentes analitos en una sola muestra. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El uso de ensayos analíticos incluyendo aquellos empleados para determinar la presencia de drogas de abuso, ha crecido rápidamente en la última década. En 1993, el mercado de pruebas de drogas en los E.U.A. solo se estimaba que era al menos $ 500M. La industria de prueba de drogas está en constante mayor crecimiento como resultado de nuevos reglamentos federales de los E.U.A. que incrementarán significativamente el número de trabajadores sometidos a prueba por abuso de drogas y alcohol. En la actualidad, la mayoría de las pruebas es drogas involucran recolección de muestras seguido por análisis de laboratorio de "química húmeda" basado en instrumento. Sin embargo, el mercado en sitio o "punto de atención" ha crecido rápidamente en los últimos dos años. Aunque no hay disponibles cifras actuales, el mercado para equipos de prueba por abuso de drogas basados en inmuno ensayo sin instrumentos parece crecer a velocidad de 20 a 40 % por año. Actualmente, hay una cantidad de pruebas para diagnóstico de abuso de drogas basadas en inmuno ensayo de uso analito en el mercado. Esas incluyen pruebas producidas por Roche Diagnostic Systems, Hansen Hong Biomedical Co. Ltd., Drug Screening Systems, Edite , Inc., Hycor Biomedical, U.S. Drug Testing Inc., Ther edics Detection, Inc., y Fingerprint Biotek. Estos dispositivos en general funcionan bien para situaciones cuando se sospecha una droga específica. En muchos casos, sin embargo tal como en un ambiente e sala de emergencias, sería particularmente conveniente tener un ensayo autorealizado y rápido para una o más drogas que pueden estar presentes en un paciente determinado. Una variedad de equipos de ensayos se han descrito, que tienen la capacidad de realizar ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, una serie de patentes otorgadas a Olson (Patente de los E.U.A. Nos. 4,959,307; 4,963,468; 5,085,987; y 5,085,988) se relacionan a una tira de inmuno separación que tiene un material absorbente, un primer receptor ligado en forma no difusiva y un segundo receptor ligado en forma no difusiva. En cada modalidad sin embargo, el método de utilizar el dispositivo requiere la primer etapa de preparar una solución de prueba separada que contiene una muestra, anticuerpo para el analito y un conjugado de analito y una etiqueta. Una vez formada, la reacción competitiva avanza en la extensión deseada en la fase en solución. La solución luego se transfiere por el usuario a la porción de contacto del dispositivo analítico, en donde empieza a circular sobre la trayectoria (ver por ejemplo la Patente '987, columna 13, líneas 35-38 y columna 20, líneas 10-11). Otros han descrito el uso de equipos capaces de realizar dos o más ensayos incluyendo formatos en sitio de muíti analitos. Un equipo disponible de (marca "Triage") se dice que permite la detección diferencial de la presencia de varias drogas de abuso comunes en una sola muestra de orina o suero. Ver por ejemplo Clin. Chem. 38(9):1678 (1992). Al menos una desventaja de este dispositivo es la necesidad por agregar separadamente la muestra a una región que contiene los reactivos liofilizados, en donde se deja por un período de tiempo (por ejemplo 10 minutos) a fin de permitir que la muestra se reconstituya y equilibre con los reactivos. Estos y otros equipos de prueba de un solo y múltiples analitos actualmente en el mercado, tienen varias desventajas. Los actuales formatos tienden a ser bastante complejos con constantes de afinidad específicas que juegan un papel principal en las reacciones de enlace competitivo. Aún más, los formatos pueden sufrir por falsos resultados que el, paciente tiene altas dosis de la droga analito. También, actuales formatos típicamente requieren exactas concentraciones de reactivo (es decir proporciones de analito a anti-analito) que pueden comprometerse si un miembro del par ligando-receptores empieza a deteriorarse. Son particularmente problemáticos los equipos que se basan en el uso de un reactivo de enlace o anticuerpo inmovilizado, en donde la cantidad de este reactivo requiere controlarse rígidamente. La capacidad de enlace de receptores inmovilizados puede ser altamente dependiente de los métodos y condiciones de inmovilización particular. Esta dependencia provoca que la f bricación de estos ensayos sea inpronosticable y difícil de reproducir. La estabilidad a la duración en almacenamiento puede afectarse por igual. Lo que se requiere claramente es un equipo de prueba de analito que puede emplearse para una cantidad de diferentes drogas de abuso, y particularmente uno que puede emplearse simultáneamente para realizar una pluralidad de ensayos, en una forma que es más fácil de fabricar que es simple y confiable en uso. BREVE PESCRIPCIQH DEL DIBUJO En el dibujo: La Figura 1 ilustra un diagrama de una modalidad preferida de la presente invención que tiene un inmuno ensayo de un solo analito basado en formato de prueba en sitio.

La Figura 2 ilustra un diagrama de una modalidad preferida de la presente invención, que tiene un inmuno ensayo de múltiples analitos basado en formato de prueba en sitio. CQHPSNPIQ PE XA INVENCIÓN La presente invención proporciona un dispositivo y método relacionado para realizar uno o más inmuno ensayos competitivos para detectar la presencia de analitos respectivos en una muestra. El dispositivo puede proporcionarse como un dispositivo unitario, es decir en el cual sada una de las etapas y reactivos están auto contenidos en el dispositivo. De preferencia, cada una de las etapas son auto ejecutantes, es decir que proceden autónomamente ante la aplicación de una muestra. En una modalidad preferida particular, una vez que la muestra se ha aplicado al dispositivo, todo el ensayo (incluyendo reacción competitiva) avanza solamente por etapas que involucran flujo capilar desde cada sitio o zona al siguiente. Como resultado, este dispositivo puede emplearse sin necesidad por realizar separadamente una reacción de ensayo competitivo en una solución, o típicamente transferir la solución en una forma no capilar a un dispositivo o zona separada. En una modalidad preferida, el, dispositivo comprende un material absorbente que comprende una o más trayectorias de flujo, cada trayectoria de flujo comprende: (a) un sitio de origen para aplicación de una muestra fluida, (b) una pluralidad de zonas de reactivo que emanan del sitio de origen y que proporcionan los reactivos necesarios para realizar una lectura visual, de inmuno ensayo competitivo por la presencia del analito respectivo, las 2onas comprenden n orden y en la dirección de flujo: (i) una zona competitiva en comunicación fluida con el sitio de origen y que comprende un conjugado-analito detectable, y socio de enlace para el analito, ambos colocados de manera difusiva, de manera tal que el analito libre presente en la muestra sea capaz de ligar al socio de enlace en una forma competitiva con el conjugado de analito; (ii) una zona de retención, en comunicación fluida latente con la zona de competencia y que comprende una cantidad excesiva de un reactivo de captura ligado en forma no difusiva capaz de ligar al socio de enlace ligado o libre a fin de retirarlo de flujo continuo en la trayectoria de flujo; y (iii) una zona de lectura en comunicación fluida con la zona de retención que comprende un receptor ligado en forma no difusiva, capaz de ligar al conjugado-analito, pero no al analito no conjugado, en una forma detectable. En el curso de emplear un dispositivo como se describió anteriormente, la presencia de cantidades incrementadas de analito libre en una muestra corresponde con ligado decrementado de analito-conjugado al socio de enlace. A su vez, una cantidad incrementada de conjugado-analito libre es capaz de continuar hacia abajo de la trayectoria de flujo. Finalmente, el conjugado-analito libre se vuelve ligado en forma no difusiva con un socio de enlace correspondiente en la zona de lectura, y se detecta a fin de proporcionar una indicación positiva de la presencia del analito en la muestra original. En una modalidad preferida, el dispositivo y método pueden emplearse para realizar simultáneamente una pluralidad de inmuno ensayos para detectar la presencia de analitos respectivos en una muestra. En esta modalidad preferida de "múltiples analitos", el dispositivo comprende un material absorbente que comprende una o más trayectorias de flujo, cada trayectoria de flujo comprende: (a) un sitio de origen común en el material absorbente, para la aplicación simultánea de una muestra fluida, (b) una pluralidad de zonas de reactivo respectivas en comunicación fluida latente o activa con el origen, las zonas de reactivo de cada trayectoria de flujo proporcionan los reactivos necesarios para realizar una lectura visual, de inmuno ensayo competitivo por la presencia del analito respectivo, las zonas para cada trayectoria de flujo comprenden en orden y en la dirección de flujo: (i) una zona de competencia en comunicación fluida con el origen y que comprende un conjugado-analito detectable, y socio de enlace para el analito respectivo, tanto el conjugado como el socio de enlace se colocan de manera difusiva de manera tal que cualquier analito libre presente en la muestra sea capaz de ligar al socio de enlace en una forma competitiva con el conjugado-analito; (ii) una zona de retención en comunicación fluida latente con una zona de competencia respectiva y que comprende una cantidad excesiva de un reactivo de captura ligado en forma no difusiva, capaz de ligar a el socio de enlace ligado o libre a fin de retirarlo de flujo continuo en la trayectoria de flujo; y (iii) una zona de lectura en comunicación fluida con una zona de retención respectiva y que comprende un receptor ligado en forma no difusiva capaz de ligar al analito-conjugado, pero no al analito no conjugado en una forma detectable. Las trayectorias de flujo de preferencia adicionalmente, cada una comprenden uno o más zonas de control de procedimiento positivo y/o negativo y reactivo. En una modalidad preferida, el dispositivo además comprende un sitio terminal corriente abajo de las zonas de reactivo secuenciales y comprende un reactivo indicador para confirmar la terminación del ensayo respectivo.

En una modalidad preferida particular, el dispositivo comprende un soporte inerte que consiste de porciones superior y de fondo para soportar el material absorbente, la porción superior proporciona una abertura para acceso de muestra fluida al origen común así como aberturas para ver la lectura respectiva y sitios indicadores de terminal sobre cada trayectoria de flujo. En una modalidad, las trayectorias de flujo para una pluralidad de ensayos pueden proporcionarse en una forma traslapante y/o lado-por-lado, y en la misma dirección sobre el material absorbente. En una modalidad alterna, el dispositivo proporciona una trayectoria de flujo separada y discreta para sada analíto, las trayectorias de flujo se colocan para extenderse en una dirección radial desde el origen común. En una modalidad particularmente preferida, la presente invención proporciona un ensayo de múltiples analitos capaz de detectar diferencialmente la presencia de una o cuatro drogas en una sola muestra de orina o suero. Estos analitos incluyen tetrahidrocannabinol (THC), cocaína, opiatos, y anfeta inas, que se detectan sin interferencia de otros analitos. OBSCRIPCIPN ftT?TiTiftñ En la presente especificación, las siguientes palabras y frases tendrán el significado que se les adjudica: "Zona" se referirá a un sitio discreto que contiene uno o más reactivos y colocada sobre la trayectoria de flujo de un ensayo particular, cada zona o sitio tiene un área superficial menor que la del material absorbente; "corriente abajo" como se aplica a zonas, se referirá a una zona que está separada de manera fluida de la zona precedente, y en la dirección de flujo de una muestra. En una modalidad típica, por ejemplo cada zona estará en el orden de uno o más milímetros entre sí. Adicionalmente, puede haber dos o más regiones discretas dentro de zonas, tales como las regiones que transportan conjugado-analito y socios de enlace, respectivamente en la zona de competencia. En forma alterna con reactivos, zonas y/o regiones no interferentes dentro de zonas pueden colocarse ocasionalmente en una configuración traslapante con zonas precedentes y/o siguientes; "unitario" co o se aplica al material absorbente, significa que una sola muestra acuosa puede agregarse al origen y avance por flujo capilar latente o activo a través de cada una de las zonas sobre una trayectoria de flujo respectivas. "Absorbente" a su vez se refiere a un material, o combinación de materiales suficientes para permitir el flujo capilar de muestra desde el origen y a través de cada zona de reactivo.

"Simultáneo" significará que cada una de una pluralidad de ensayos en un dispositivo de múltiples analitos sean capaces de realizarse substancialmente al mismo tiempo y por la aplicación de una sola muestra al origen. "Competitivo" significará que la cantidad de analito-conjugado que se liga al socio de enlace libre, dependa de y se relacione con la presencia o ausencia de analito en la muestra. "Ligado en forma no difusiva" se empleará en forma intercambiable con la palabra "inmovilizado" para describir reactivos que son retenidos de manera estable en una zona particular bajo condiciones de uso. La presente invención proporciona un dispositivo y método para realizar simultáneamente uno o más inmuno ensayos para detectar la presencia de analitos respectivos en una muestra. Analitos convenientes incluyen aquellos capaces de proporcionarse en la forma de un conjugado. En forma alterna, el analito puede estar en la forma de un derivado o metabolito del compuesto de interés. En general, un analito es cualquier compuesto que se detectará capaz de ligarse por un receptor, y capaz de recuperarse en forma sintética y/o purificada suficiente para permitir que se conjugue y utilice en un ensayo competitivo con un analito de muestra y el receptor. Estos compuestos incluyen analitos mono epitópicos de peso molecular relativamente pequeño (por ejemplo, aproximadamente 100 a 2000), y antígenos poli-epitópicos de grandes pesos moleculares o de mayores pesos moleculares (por ejemplo mayores a aproximadamente 2000). Analitos representativos son aquellos descritos por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Nos. 4,299,916 y 4,275,149, las descripciones de ambas de las cuales aquí se incorporan por referencia. Ejemplos de analitos convenientes incluyen aunque no están limitados a, pesticidas y sus metabolitos y derivados (por ejemplo bifenilos polihalogenados, fosfato esteres, tiofosfatos, carbamatos, sulfonamidas polihalogenadas) y drogas y sus metabolitos y derivados (por ejemplo alcaloides, esteroides, lactamas, a inoalquiloencenos, benzheterocíclicos, purina, vitaminas, antibióticos, nucleósidos y núcleotidos, drogas derivadas de marihuana y drogas misceláneas). El dispositivo y método de la presente invención pueden emplearse con cualquier muestra conveniente. En general y de preferencia la muestra es una acuosa que se obtiene directamente de la fuente (por ejemplo orina o sangre). En forma alterna, la muestra puede prepararse al mezclar o extraer una muestra no acuosa (por ejemplo tejido) con un solvente acuoso (por ejemplo solución amortiguada). En general, la muestra es cualquier substancia que se sospecha contenga el compuesto o compuestos de interés. Este incluye el análisis de agua freática por contaminantes, los analitos de productos agrícolas para agentes tóxicos de origen natural tales como aflatoxina y semejantes. Ocasionalmente, análisis de este tipo requerirán una etapa de extracción en donde una muestra se mezcla con un medio de extracción líquido que puede ser acuoso, orgánico o mezclado acuoso/orgánico. Al extraer el material de interés, la solución de extracción misma puede emplearse como la muestra y puede ser evaluada directamente o concentrada, diluida, evaporada y reconstituida, etc, antes de evaluación en el presente dispositivo. Ejemplos adicionales de evaluaciones que requieren extracción incluyen residuos de pesticidas, metabolitos bacterianos u otros contaminantes en carne o pescado o mariscos y residuos dé herbicidas u otros contaminantes en muestras de tierra. Un dispositivo preferido de esta invención comprende un material absorbente unitario que proporciona una o más o trayectorias de flujo. De preferencia, aunque no necesariamente, el material absorbente de hecho se proporcionará en la forma de un material sencillo, integral. En forma alterna, el absorbente puede formarse al traslapar o confinar a tope otros materiales discretos. Ejemplos de materiales absorbentes convenientes incluyen (membranas de nitrocelulosa, membranas de nylon, u otras membranas comercialmente disponibles).

Materiales absorbentes útiles en el presente dispositivo incluyen materiales porosos que son susceptibles de ser recorridos por un medio acuoso en respuesta a fuerza capilar. Estos materiales en general son hidrofllicos o son capaces de volverse hidrofílicos e incluyen polvos inorgánicos tales como sílice y alúmina; materiales poliiriéricos naturales, particularmente materiales celulósicos tales como papel filtro, papel cromatográfiso y semejantes; polímeros sintéticos o de origen natural modificados tales como nitrocelulosa, acetato de c lulosa, poli (vinil cloruro) poliacrilamida, dextrano entrelazado, agarosa, etc,; ya sea empleados solos o en conjunto con otros materiales. Un material absorbente preferido incluye papel filtro a base de fibras de vidrio. El material absorbente puede conectarse a un soporte o puede proporcionarse con su propio soporte. El material absorbente puede contener grupos funcionales o ser capaz de funcionalizarse para permitir enlace covalente o receptores a otras porciones. Cuando dos o más trayectorias de flujo se emplean en un solo dispositivo, de preferencia cada trayectoria comprende un sitio de origen común en el material absorbente para la aceptación simultanea de una muestra fluida. Como puede verse, el origen es "común" ya que la aplicación de una sola muestra sirve para empezar el flujo de muestra simultáneamente en sada trayectoria de flujo.

Cada trayectoria de flujo en un dispositivo de la presente invención además comprende una pluralidad de zonas de reactivo respectivas en o dorriente abajo del sitio de origen. Las zonas de reactivo de cada inmuno ensayo proporcionan los reactivos necesarios para realizar una lectura visual, inmuno ensayo competitivo por la presencia de analitos respectivos. En una modalidad preferida, la zonas de reactivo proporcionan a cada uno de los reactivos necesarios, es decir sin tener que retirar o reaplicar físicamente reactivos (por ejemplo utilizando una pipeta) sobre la trayectoria o en el curso del ensayo. Las zonas de una trayectoria de flujo particular comprenden en orden y dirección de flujo, una zona de competencia que comprende analitos-conjugado y socio de enlace para el analito, ambos colocados de manera difusiva, de modo tal que cualquier analito libre presente en la muestra sea capaz de ligar al socio de enlace en un forma competitiva con el conjugado analito. La zona de competensia en sí puede servir somo el sitio de origen para la aplicación de muestra, o puede ser corriente abajo del origen mismo. Adicionalmente, los diversos reactivos presentes en la zona de competencia pueden estar escalonados o dispuestos en cualquier forma conveniente, a fin de alterar o afectar la cinética de la reacción de competensia.

Por ejemplo, el socio de enlace puede colocarse corriente arriba del conjugado analito, para permitir que el analito reacsione son el sosio de enlace antes de que el socio de enlace se exponga al conjugado analito. Este enfoque proporcionará al analito con una ventaja competitiva frente al conjugado para sitios de unión en el socio de enlace. A su vez, este enfoque puede emplearse para incrementar la sensibilidad de detección para un analito particular. El socio de enlace de preferencia es un receptor para el analito. Un receptor es cualquier compuesto o composisión sapaz de resonocer una organización polar y espacial particular del analito de interés. Receptores ilustrativos incluyen receptores de origen natural; por ejemplo anticuerpos, enzimas, lestinas y semejantes. Un reseptor preferido para el analitos es un anticuerpo para el analito. Un anticuerpo es una inmunoglobulina o derivado o fragmento del mismo que tenga un área en la superficie o en una savidad que espesífisa ente liga a y de esta manera se define somo somplementaria son la organizasión polar y espacial particular de esta molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse por tésnisas que son bien sonosidas en la espesialidad, tales somo inmunizasión de un huésped y resolessión o tesnología de línea selular híbrida o de suero.

En forma alterna, el reastivo de enlase en sí puede tomar la forma de un somplejo de olésulas, por ejemplo un somplejo de un primer antisuerpo para el analito y segundo antisuerpo específico para el primer anticuerpo. Los componentes de este complejo pueden proporcionarse separadamente ya sea en la zona de competencia y/o en cualquier ubicasión sonveniente que lleva a la zona de retensión. Estos somple os pueden ser útiles, por ejemplo para mejprar la separasión de reastivo de enlase en la zona de retensión al insrementar su tamaño o afinidad para el reastivo de saptura. El analito-^sonjugado en general se proporsiona en la forma de una etiqueta o trazador, por ejemplo un sataÜ2ador que utiliza una enzima sonjugada al analito. Una etiqueta puede ser sualquier olésula o sistema de molésulas ligadas o conjugadas son el analito que sean sapases de produsir una señal perceptible. Una etiqueta preferida consiste de una partícula de metal coloidal o partículas de SOL con color. Aquellos con destreza en la éspesialidad resonoserán que mushos elementos son sapases de funsionar somo una etiqueta, incluyendo sin limitación, radionúclidos, especies fluorescentes, especies fosforescentes, material quimioluminiscente, colorantes, enzimas, partículas sol, materiales poliméricos de color y semejantes. Con base en la cinétisas de enlase sonosidas de los antisuerpos antidroga monoclonales, pueden emplearse tésnisas standard para preparar conjugados de droga que tienen el epítooe corresto disponible para enlase de antisuerpo. Una trayectoria de flujo además comprende una 2ona de retención en comunisasión fluida latente son la zona de competencia. Por "coraunicasión fluida latente" se entiende que la somunisasión fluida entre la zona de so petensia y la zona de retensión puede retardarse sufisientemente y/o, e insrementar sufisientemente en la velosidad de reassión, a fin de permitir que avanse en una proporsión deseada la reasción de competensia. Además de insrementar el tiempo de reassión dentro de la zona de sompetensia, la extensión de reassión puede mejorarse por otros medios por igual, tales somo al elevar la temperatura de la reassión de enlase y/o al mejorar las sarasterístisas de mezslado de los reastivos (por ejemplo por efervessensia) . Los medios de retardo para lograr flujo sapilar latente pueden ser de naturaleza pasiva (es desir que osurren automátisa ente en el surso de uso) o de una naturaleza astiva (por ejemplo requiriendo alguna assión por parte del usuario) . Dada la presente dessripsión, aquellos son destreza en la espesialidad apreciarán la forma en la cual pueden proporsionarse medios de retardo y utilizarse en un dispositivo de la presente invensión. Ver por ejemplo Solisitudes PCT Nos. WO 92/21434 y WO 93/24231, las dessripsiones de las suales aquí se insorporan por referensia.

En un enfoque sonveniente, el tiempo de residensia de la solusión en la zona de sompetensia se insrementa al sonfigurar las zonas de sompetensia de retensión respestivas (y/o una interfase entre ellas) de manera tal que el flujo de solución de la zona de competensia se retarde en forma sontrolable. Ejemplos de medios de retardos sonvenientes insluyen aunque no están limitados a, el uso de una barrera físisa soluble, una barrera físisa permeable o un material puente expandible. Por ejemplo, una barrera porosa o soluble puede interdispersarse entre las zonas a fin de permitir que la solusión resida en la zona de sompetensia por un período de tiempo sufisiente antes que la barrera misma sea permeable o se disuelva. De manera semejante, la trayestoria de flujo capilar en sí puede hacerse que tome una ruta tortuosa entre las zonas, incrementando de esta manera el tiempo de reacsión efestivo para el ensayo. Aún otro ejemplo, un material hidratable, expandible (por ejemplo tipo esponja) puede emplearse en la zona de sompetensia, de manera tal que el material no esté inisialmente en sontasto físiso son la zona de retensión. Al hidratar, son la solusión de prueba y en el surso de permitir que osurra la reassión so petitiva, puede expanderse o hinsharse el material a un punto en donde haga sontasto físiso y permita somunisasión fluida son la zona de retensión.

En una modalidad preferida, el flujo sapilar latente entre las zonas de sompetensia o retensión puede inisiarse astivamente por el usuario, por ejemplo al manipular o liberar una barrera entre zonas,, formando un puente sapilar entre ellas, o solosar físisamente (por ejemplo prensando) zonas entre sí. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 4,826,759, la dessripsión de la sual aquí se insorpora por referensia. La zona de retensión somprende una santidad en exseeo de reastivo de saptura ligado en forma no difusiva, sapaz de ligar a un sosio de enlase libre o ligado a fin de retirarlo del flujo sontinuo en la trayestoria de flujo. Este reastivo de saptura es típisamente un reseptor sapaz de ligar al sosio de enlase. Un reastivo de saptura preferido es un antisuerpo sapaz de ligar al sosio de enlase. Ya que el sosio de enlase de preferensia es un antisuerpo al analito, el reastivo de saptura de preferensia es un antisuerpo sapaz de ligar al antisuerpo para el analito. Puede por ejemplo ser un antisuerpo que se desarrolle a una espesie diferente a la empleada para desarrolla el antisuerpo para el analito. El reastivo de saptura también puede ser un reseptor tal somo proteina A, que liga a un sitio partisular en la molésula de inmunoglobulina. En otra modalidad, el sosio de enlase puede asoplarse a una molésula tal somo biotina, y el rßastivo de captura puede ser especifiso para disha molésula, por ejemplo antibiotina o avidina. El enfoque de la presente nvension proporsiona una ventaja partisular frente a mushos ensayos sonvensionales que emplean receptores inmovilizados. Como se dessribió anteriormente, la sapacidad de enlace de estos receptores inmovilizados puede depender de los métodos y condislones de inmovilizasión, tales que la manufastura de estos ensayos sea inpronostisable y difísil de reprodusir. En la presente invension, el reastivo de saptura inmovilizado puede estar presente en una santidad en exceso, permitiendo de esta manera el desarrollo de un ensayo son carácterístisas de desempeño pronosticables. La inmovilización del reactivo de captura ee suficientemente estable a fin de evitar el desprendimiento de reastivo del material, lo que a su vez puede llevar a resultados falsos. Como una protessión adisional sontra error provosado por reastivo de saptura desprendido, aquellos son destreza en la espesialidad apresiarán la forma en la sual un reastivo adicional puede emplearse a fin de que el mismo se ligue y retenga reastivo de saptura desprendido. Un enfoque sonveniente involusra el uso de una segunda zona de retensión, por ejemplo en o entre la primer zona de retención y la zona de lestura, que tiene un segundo reastivo de saptura inmovilizado espesífiso para el primer reastivo de saptura (es desir, el reastivo de saptura es proporsionado en la zona de retensión) . Finalmente, la trayestoria de flujo además somprende una zona de lestura que somprende un reseptor ligado en forma difusiva sapaz de ligar al sonjugado-analito pero no al analito no sonjugado en una forma detestable. El reseptor ligado en forma no difusiva es sapaz de ligar al analito-sonjugado pero no al analito solo. Este reseptor se liga entonses ya sea a la porsión de etiqueta del sonjugado o a una porsión adisional que se suministra por el conjugado (por ejemplo en virtud del enlace de analito y etiqueta) pero ausente del analito solo. Un receptor ligado en forma no difusiva preferido es un anticuerpo capaz de ligar a la porción espaciadora que se emplea para sonjugar el analito son la etiqueta. En una modalidad partisularmente preferida, la lestura se proporsiona en la forma de ter inasión de un signo más "+" indisando la presensia de analito. En esta modalidad, la porción menos "-" de la lectura puede proporcionarse por cualquier medio conveniente. En una modalidad, la porción menos se proporciona por el uso de reactivos adicionales colosados sobre la trayestoria de flujo. Por ejemplo, un sonjugado detestable se solosa sobre la trayestoria de flujo y de preferensia en el origen mismo. La porsión menos de la lestura puede suministrarse en la forma de un anticuerpo ligado en forma no difusiva al conjugado detectable. por ejemplo, cuando un conjugado de oro-KLH está presente en forma difusiva, con un anticuerpo anti-KLH ligado en forma no difusiva que forma la porción menos de la zona de lectura. Finalmente, la trayectoria de flujo de preferencia además comprende un sitio de terminal sorriente abajo de la zona de reastivo sesuensial y somprende un reastivo indisador para sonfirmar la terminasión del ensayo respestivo. El reastivo indisador típisamente es un material que es sensible a la presensia de la muestra. En general es un material que sambiará colores en respuesta a la presencia de alguna porción en la solución muestra. Ejemplos de este reactivo incluyen colorantes indicadores de pH, colorantes sensibles a la presencia de proteínas y colorantes sensibles a sitios de hidratación. El dispositivo de la presente invención puede ser de cualquier forma y dimensiones convenientes, a fin de lograr el propósito deseado. En una modalidad preferida, el dispositivo se proporciona en la forma de un soporte inerte que comprende porciones superior y de fondo, para soportar el material absorbente. La porción superior proporciona una abertura para acseso de la muestra fluida al origen somún, al igual que aberturas para ver la lestura respestiva y sitios indisadores terminales sobre sada trayestoria de flujo.

La fabrisasión de un diseño típico del formato de prueba presente se describirá con referencia a los dibujos incluyendo la Figura 1 (formato de un solo analito), Figura 2 (formato de múltiples analitos). Para el usuario, la prueba de la Figura 2 aparecerá como un dispositivo de una sola prueba 10 que tiene trayectorias 12 que emanan y se leen en cada una de cuatro direcsiones. La muestra se agrega al pozo sentral 14 y la prueba se completará cuando las cuatro ventanas indicadoras de terminación 16 cambian color. Si el ensayo opera adecuadamente, la porción negativa 18 del signo aparece como un cambio de color por cada uno de los analitos. Si el paciente es positivo para la droga para cualquiera de los analitos, entonces la porción plus respectiva del signo de lectura 20 aparecerá por igual. Los dispositivos de las Figuras 1 y 2 muestran un formato preferido para la detessión de un solo analito o una pluralidad de analitos, respestivamente. Estos dispositivos pueden prepararse y emplearse en la siguiente forma. Oro-KLH. Keyhole lirapit hemosianina ("KLH") y oro soloidal se obtienen de una variedad de fuentes somersiales y sonjugan de asuerdo son métodos standard. Oro-ovalbúmina-droga. ovalbúmina se obtiene de una fuente somersial y asopla al analito deseado así sorao a oro soloidal. El etiquetado de la proteína portadora son oro soloidal se realiza por métodos standard. Se verifisan sondisiones de reassión a fin de asegurar que el oro soloidal no interfieran son la reassión de enlase de droga hapteno a antisuerpo anti-droga. Métodos químisos similares se emplean para preparar sonjugados para THC (mariguana), benzolllesgonina (sosaína), opiatos (morfina, morfina glusurónido) , anfentamina (an etamina y metanfetanina) . Reastivos ligados en forma no difusiva. Pueden inmovilizarse reastivos al material absorbente mediante sualquier tésnisa sonveniente somo será aparente a aquellos con destreza en la especialidad. Métodos de conexión directa incluyen adsorción no difusiva, absorción no difusión, conexión a micro partículas que en sí se atrapan en la posición apropiada, y enlace covalente, tal somo por el uso de bromuro de sianógeno, sarbonil diimida2ol o glutaraldehido. "No difusivo" somo se emplea en este aspesto, signifisa que el reastivo es sufisiente ente estable en su posisión bajo las sondisiones del ensayo. Reastivos solosados de manera difusiva. Métodos sonvensionales se emplean para impregnar substrato tales somo papel son bio-molésulas de química seca. Estos métodos son útiles para: (1) optimizar capasidad de substrato; (2) optimizar la humeotabilidad de reactivos secos; y (3) incrementar la estabilidad del reactivos secos.

Tira indisadora. Se emplean métodos sonvensionales para la preparasión de un indisador terminal, por ejemplo por el uso de un indisador de pH que sambiará solor suando está presente orina. En una modalidad del dispositivo, los reastivos solosados de manera difusiva se aplisan a la zona de sompetensia en las concentraciones apropiadas, tales que se genere una señal visible perceptual en la zona de lectura solo cuando la muestra aplicada al sitio de origen contiene analito en o sobre una consentrasión predeterminada. Cuando se detestan múltiples analitos de la misma muestra, esta concentración predeterminada puede ser diferente por cada analita. La operación del dispositivo puede evaluarse, por ejemplo al preparar muestras de droga sencilla sobresaliente en amortiguadores, utilizando diversas consentrasiones de sada droga. La reastividad cruzada limitada deberá probarse sontra otras substancias de abuso así como diversas drogas de receta somún. También se prueban muestras de múltiples drogas sobresalientes, son énfasis partisular en generasión de señal y posible interferensia de señal. La generasión de señal puede ser "salifisada" visüal ente contra un diagrama de solor standar .

En una modalidad, la orina humana normal se resalta son diversas dosis de las suatro drogas de abuso. Un total de sinso fuentes se emplean. La evaluasión insluye somparasión de y (1) generasión de señal visualmente marsada; (2) tiempo para terminar la prueba; y (3) la presensia de enlace no específiso. El método de la presente invensión somprende las etapas de proporsionar un dispositivo del tipo dessrito anteriormente, que somprende un material absorbente en la siguiente forma: y (a) aplisar una muestra asuosa al material absorbente en el sitio de origen de una o más trayestorias de flujo, (b) permitir que la muestra sirsule simultáneamente a través de sada trayestoria de flujo y sesuensial ente a través de una pluralidad de las zonas de reastivo respestivas proporsionando los reastivos necesarios para realizar un inmunoensayo competitivo de lectura visual, por la presencia de analito respectivo, las zonas comprenden en orden y en la direcsión de flujo: (i) una zona de sompetensia en somunisasión fluida son el sitio de origen y que somprende un conjugado-analito detestable, y un sosio de enlase para el analito, ambos solosados de manera difusiva, de manera tal que sualquier analito libre presente en la muestra sea sapaz de ligar al sosio de enlase en una forma competitiva son el sonjugado analito; (ii) una zona de retensión en comunicasión fluida latente con la zona de competensia y que somprende una santidad exsesiva del reastivo de saptura enlazado en forma no difusiva sapaz de enlazar son el sosio de enlase libre o, ligado a fin de retirarlo del flujo sontinuo en la trayestoria de flujo; y (iii) una zona de lestura en comunicación fluida con la zona de retención y comprende receptor ligado n forma no difusiva, capaz de ligar al analito-conjugado pero no al analito no conjugado en una forma detectable; (c) permitir que la muestra sirsule a través de un sitio de terminal sorriente abajo de la zonas de reastivo secuenciales y que comprende un reactivo indicador para confirmar la terminación del ensayo respectivo, (d) determinar la presencia de cada analito en la muestra al detectar la presencia de un analito-conjugado respestivo en sada zona de lestura, y estimar los sontroles positivo y negativo en sada trayestoria de flujo a fin de determinar el desempeño adesuado del ensayo respestivo.

Claims (19)

1. ¡RBIVIWPICACIQMBS 1.- Dispositivo para realizar un inmuno ensayo sompetitivo para proporsionar una lestura positiva por la presensia de un analito monoepitópiso en una muestra, el dispositivo somprende un material absorbente que somprende una o más trayestoria de flujo, sada trayestoria de flujo somprende: (a) un sitio de origen en el material absorbente para la aplisasión de una muestra fluida, (b) una pluralidad de zonas de reastivos que emanan del sitio de origen y que proporcionan los reastivos nesesarios para realizar una lestura visual, inmuno ensayo sompetitivo por la presensia de analito respestivo, las zonas somprenden en orden y en la diressión de flujo; (i) una zona de sompetensia en somunisasión fluida son el sitio de origen y que somprende un sonjugado-analito detestable, y socio de enlace para el analito, ambos colosados de manera difusiva, de manera tal que el analito libre presente en la muestra sea sapaz de ligar al sosio de enlase en una forma sompetitiva son el analito-sonjugado; (ii) una zona de retensión en somunisasión fluida latente son la zona de sompetensia y que somprende una santidad exsesiva de un reastivo de saptura ligado en forma no difusiva sapaz de ligar al sosio de enlase libre y ligado a fin de retirarlo de flujo sontinuo en la trayestoria de flujo; y (iii) una zona de lestura en somunisasión fluida son la zona de retensión y que somprende reseptor ligado en forma no difusiva, sapaz de ligar en una forma detestable a un sonjugado de analito y etiqueta, pero no sapaz de ligar al analito no sonjugado.
2. 2.- Un dispositivo de sonformidad con la reivindicasión 1, sarasterizado porque además somprende una o más zonas y reactivos de control de procedimiento negativo y/o positivo.
3. 3.- Un dispositivo de conformidad con la reivindisasión 2, sarasterizado porque la zona de sontrol positiva soraprende un sitio terminal sorriente abajo de las zonas de reastivos sesuensiales y que somprende un reastivo indisador para sonfirmar la terminasión del ensayo respestivo.
4. 4.- Un dispositivo de sonformidad son la reivindisasión 1, sarasterizado porque además somprende un soporte inerte que sonsiste de porsiones superior y de fondo para soportar el material absorbente, la porsión superior proporsiona una abertura para acceso de muestra fluida al origen común, asi como aberturas para ver la lectura respectiva y sitios de lectura e indicador de terminación respestivos sobre sada trayestoria de flujo.
5. 5.- Un dispositivo de sonformidad son la reivindisasión 1, sarasterizado porque además somprende medios para retardar el flujo sapilar de muestra desde la zona de sompetensia a la zona de retensión.
6. 6.- Un dispositivo de sonformidad son la reivindisasión 5, sarasterizado porque además somprende los medios de retardo se eligen del grupo que consiste de una barrera física soluble, una barrera física permeable y un material expandible.
7. 7.- Un dispositivo de conformidad con la reivindicasión 1, sarasterizado porque el analito se elige del grupo que sonsiste de tetrahidrosannabinol, sosaína, opiatos y anfetaminas.
8. 8.- Un método para realizar un inmuno ensayo sompetitivo para proporsionar una lestura positiva por la presensia de un analito monoepitópiso en una muestra, el método se sarasteriza porque somprende las etapas de: (a) proporsionar un dispositivo que somprende un material absorbente que tiene un sitio de origen y una o más trayestorias de flujo, sada zona respestiva de reastivo somprende el proporsionar los reastivos nesesarios para realizar un inmunoensayo sompetitivo de lestura visual por la presensia del analito respestivo, (b) y aplisar una muestra asuosa al sitio de origen, (s) permitir que la muestra sirsule simultáneamente a través de sada trayestoria de flujo y sesuensialmente a través de la zona de reastivo respestiva proporsionando los reastivos nesesarios para realizar un inmunoensayo sompetitivo de lestúra visual, para la presensia de analito respestivo, las zonas somprenden en orden y en la diressión de flujo: (i) una zona de sompetensia en somunisasión fluida son el sitio de origen y que somprende un analito- sonjugado detestable, y sosio de enlase para el analito, ambos solosados de manera difusiva de modo tal que sualquier analito libre presente en la muestra sea sapaz de ligar al sosio de enlase en una forma sompetitiva son el sonjugado analito; (ii) una zona de retensión en somunisasión fluida latente son la zona de sompetensia y que somprende una santidad exsesiva del reastivo de saptura ligado en forma no difusiva, sapaz de ligar a el sosio de enlase libre o, ligado a fin de retirarlo del flujo sontinuo en la trayestoria de flujo; y (iü) una zona de lestura en somunisasión fluida son la zona de retensión y que somprende reseptor ligado en forma no difusiva sapaz de ligar en una forma detestable a un sonjugado de analito y etiqueta, pero no sapaz de ligar al analito no sonjugado; (d) permitir que la muestra sirsule a través de un sitio de terminal sorriente abajo de la zonas del reastivo sesuensiales y que comprende un reactivo indicador para confirmar la terminación del ensayo respectivo, (e) determinar la presencia de cada analito en la muestra al detectar la presencia del analito-conjugado respestivo en sada zona de lestura, y estimar los sontroles positivo y negativo en sada trayestoria de flujo, a fin de determinar el desempeño adesuado del ensayo respestivo.
9. 9.- Un dispositivo para realizar simultáneamente una pluralidad de inmuno ensayos sompetitivos para proporsionar una lestura positiva por la presensia de analitos respestivos en una muestra, el dispositivo somprende un material absorbente unitario que proporsiona una o más trayestorias de flujo, sada trayestoria de flujo somprende: (a) un sitio de origen somún en el material absorbente para la aplisasión simultánea de una muestra de fluido, (b) una pluralidad de zonas de reastivos respestivas sorriente abajo del origen, las zonas de reastivo de sada inmuno ensayo proporsionan los reastivos nesesarios para realizar un inmunoensayo sompetitivo de lestura visual por la presensia del analito respestivo, las zonas somprenden en orden y en la diressión de flujo: (i) una zona de sompetensia que somprende un analito-sonjugado detestable, y un sosio de enlase para el analito, ambos solosados de manera difusiva de modo tal que sualquier analito libre presente en la muestra sea sapaz de ligarse al sosio de enlase en una forma sompetitiva son el sonjugado-analito; (ii) una zona de retensión que somprende una santidad en exseso de un reastivo de saptura ligado en forma no difusiva, sapaz de ligar al sosio de enlase libre y enlazado a fin de retirarlo del flujo sontinuo en la trayectoria de flujo; y (iii) una zona de lectura que comprende receptor ligado en forma no difusiva, capaz de ligar en una forma detectable a un conjugado de analito y etiqueta pero no capaz de ligar al analito no conjugado.
10. 10.- Un dispositivo de conformidad con la reivindicasión 9, sarasterizado porque además somprende una o más zonas y reastivos de sontrol de prosedimiento positivo y/o negativo.
11. 11.- Un dispositivo de sonformidad son la reivindisasión 10, sarasterizado porque la zona de sontrol positivo soraprende un sitio terminal sorriente abajo de las zonas de reastivos sesuensiales y somprende un reastivo indisador para sonfirmar la terminasión del ensayo respestivo.
12. 12.- Un dispositivo de sonformidad con la reivindicasión 9, sarasterizado porque además somprende un soporte inerte que somprende porsiones superior y de fondo para sostener el material absorbente, la porción superior proporciona una abertura para acseso a la muestra fluida al origen somún, así somo aberturas para ver la lestura respectiva y los sitios de lestura e indisadores de terminasión respestivos sobre sada trayestoria de flujo.
13. 13.- un dispositivo de sonformidad con la reivindisasión 9, sarasterizado porque el dispositivo proporsiona una trayestoria de flujo separada y dissreta para sada analito, las trayestorias de flujo se solosan para extenderse en una diressión radial desde el origen común.
14. 14.- Un dispositivo de conformidad con la reivindicación 9, carasterizado porque el ensayo es sapaz de detestar diferensialmente la presensia de dos o más drogas en una sola muestra de orina o suero.
15. 15.- Un dispositivo de sonformidad son la reivindicación 14, carasterizado porque los analitos se eligen del grupo que sonsiste de tetrahidrosannabinol, sosaína, opiatos y anfetaminas.
16. 16.- Un método para realizar simultáneamente una pluralidad de inmuno ensayos sompetitivos para detestar la presensia de analitos respestivos monoepitópicos en una muestra, el método se carasteriza porque somprende las etapas de proporsionar un dispositivo del tipo dessrito anteriormente y utilizar el dispositivo en la siguiente forma; (a) aplisar una muestra asuosa al material absorbente unitario en un sitio de origen somún de una o más trayestorias de flujo; (b) permitir que la muestra sircule simultáneamente a través de sada trayectoria de flujo y secuensialmente a traVés de una pluralidad de zonas de reastivos respestivos, proporsionando los reastivos nesesarios para realizar un inmunoensayo sompetitivo, de lestura visual para la presensia del analito respestivo, las zonas somprenden en orden y en la diressión de flujo: (i) una zona de sompetensia que somprende un analito-sonjugado detestable y socio de enlase para el analito, ambos solosados de manera difusiva de manera tal que sualquier analito libre presente en la muestra sea sapaz de ligar al sosio de enlase en una forma sompetitiva son el sonjugado analito; (ii) una zona de retensión que somprende una santidad exsesiva de un reastivo de saptura ligado en forma no difusiva, sapaz de ligar al sosio de enlase libre y ligado a fin de retirarlo del flujo sontinuo en la trayestoria de flujo; y (iii) una zona de lestura que somprende reseptor ligado en forma no difusiva sapaz de ligar en una forma detestable al analito-sonjugado pero no sapaz de ligar al analito no sonjugado.
17. 17.- Un método de sonformidad son la reivindisasión 16, sarasterizado porque el método es sapaz de realizar simultáneamente una pluralidad de inmuno ensayos para detestar la presensia de analitos respestivos en una muestra, en donde la presensia de santidades insrementadas del analito libre en una muestra, sonduse a ligar menos [anticuerpo-conjugado] analito-conjugado al socio de enlace.
18. 18.- Un dispositivo de conformidad con la reivindicasión 9, sarasterizado porque la porsión espasiadora se emplea para sonjugar el analito son la etiqueta y el reseptor ligado en forma no difusiva es sapaz de ligar a la porsión espasiadora.
19. 19.- Un dispositivo de sonformidad son la reivindisasión 18, sarasterizado porque la etiqueta somprende partísulas de metal soloidal.