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Technischer
Bereich
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Die vorliegende Erfindung betrifft
den Bereich von diagnostischen Immunoassays und verwandten Vorrichtungen
zur Ausführung
solcher Assays. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Assays
für Analyten,
zum Beispiel Drogen für
Mißbrauch
oder deren Metabolite. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung
Vorrichtungen oder Mittel zur gleichzeitigen Durchführung von
vielen Assays für
verschiedene Analyten innerhalb einer einzelnen Probe.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die Verwendung von analytischen Assays, einschließlich denjenigen,
die dazu verwendet werden, um die Anwesenheit von Drogen für Mißbrauch nachzuweisen,
ist über
die letzte Dekade hinweg schnell angestiegen. 1993 wurde der U.S.
Drogen-Testmarkt allein als mindestens auf 500 Millionen Dollar
geschätzt.
Die Drogentestindustrie ist für ein
weiteres Wachstum als ein Ergebnis der neuen U.S. Bundes-Regulierungen
bereit, die die Zahl von Arbeitern signifikant erhöhen wird,
die Tests auf Drogen und Alkoholmißbrauch unterzogen werden.
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Im Augenblick schließt das meiste
Testen auf Drogen eine Probensammlung ein, gefolgt durch Instrumenten-basierte "Nasschemie"-Laboranalyse. Jedoch
ist der "on-site" oder "point of care"-Markt über die
letzten zwei Jahre hinweg stark gewachsen. Obwohl keine augenblicklichen
Zahlen erhältlich sind,
scheint der Markt für
nicht-instrumentierte Immunassay basierte Drogenmißbrauchs-Testkits
mit einer Rate von 20–40%
pro Jahr zu wachsen.
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Im Augenblick gibt es eine Zahl von
Einzel-Analyt-Immunassay-basierten Mißbrauchsdrogen diagnostische
Tests auf dem Markt. Diese schließen durch Roche Diagnostic
Systems, Hansen Hong Biochemical Co. Ltd., Drug Screening Systems,
Editek, Inc., Hycor Biomedical, U.S. Drug Testing Inc., Thermedics
Detection, Inc., und Fingerprint Biotek hergestellte Tests ein.
Solche Vorrichtungen funktionieren im allgemeinen gut in Situationen,
in denen eine spezifische Droge vermutet wird. In vielen Fällen, wie
zum Beispiel in Notfallaufnahmeumgebungen wäre es jedoch besonders wünschenswert,
einen schnellen, selbst durchführbaren
Test auf eine oder mehrere Drogen zu haben, die in einem bestimmten
Patienten vorhanden sein können.
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Eine Vielzahl von Assaykits wurden
beschrieben, die die Fähigkeit
aufweisen, diagnostische Assays durchzuführen. Zum Beispiel betrifft eine
Serie von Patenten, die für
Olson erteilt sind (U.S. Patente Nrn. 4,959,307; 4,963,468; 5,085,987 und
5,085,988) einen Immunoabtrennstreifen, der ein saugfähiges Material,
einen nicht diffundierbar gebundenen erstem Rezeptor und einen nicht
diffundierbaren gebundenen zweiten Rezeptor aufweisen. In jeder
Ausführungsform
erfordert das Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung jedoch den
ersten Schritt der Herstellung einer getrennten Testlösung, die
die Probe, den Antikörper
für den
Analyten und ein Konjugat von Analyt und einen Marker enthält. Sobald
gebildet, schreitet die kompetitive Reaktion in der Lösungsphase
in gewünschtem
Ausmaß fort.
Die Lösung
wird dann durch den Verwender auf den Kontaktteil der analytischen
Vorrichtung transferiert, wo sie ihren Fluß entlang des Pfades beginnt
(siehe, z. B., das '987
Patent; Spalte 13, Zeilen 35–38
und Spalte 20, Zeilen 10–11.).
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Andere haben die Verwendung von Kits
beschrieben, die in der Lage sind, zwei oder mehrere Assays durchzuführen, einschließlich multi-Analyt on-site-Formate.
Ein von Biosite erhältlicher
Kit ("Triage"-Marke) wird als
den differenziellen Nachweis der Anwesenheit von mehreren gebräulichen
Drogen des Mißbrauchs
in einer einzelnen Urin- oder Serumprobe ermöglichend beschrieben. Siehe,
z. B., Buechler, et al., Clin. Chem. 38(9): 1678–1684 (1992). Mindestens ein
Nachteil dieser Vorrichtung ist das Erfordernis, getrennte Proben
zu einer Region hinzuzufügen,
die lyophilisierte Mittel enthält,
wo sie für
eine Zeitdauer (z. B. 10 Minuten) belassen werden, um es der Probe
zu ermöglichen,
sich mit den Reagenzien zu rekonstituieren und zu äquilibrieren.
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Diese und andere Einzel- und Multi-Analyttestkits,
die sich augenblicklich auf dem Markt befinden, weisen verschiedene
Nachteile auf. Die augenblicklichen Formate neigen dazu relativ
komplex zu sein, wobei spezifische Affinitätskonstanten eine Schlüsselrolle
in den kompetitiven Bindungsreaktionen spielen. Darüber hinaus
können
die Formate an falschen Ergebnissen leiden, falls der Patient auf
hohen Dosen der Analytdroge ist. Auch erfordern die vorliegenden
Formate typischerweise exakte Reagenzkonzentrationen (d. h. Verhältnisse
von Analyt zu anti-Analyt), die beeinträchtigt sein können, falls ein
Mitglied des Liganden-Rezeptorpaares
anfängt, sich
zu zersetzen.
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Schwierigkeiten werfen Kits insbesondere auf,
die auf der Verwendung eines immobilisierten Antikörpers oder
Bindungsreagenz beruhen, wobei die Menge des Reagenz streng kontrolliert
werden muß.
Die Bindungskapazität
von immobilisierten Rezeptoren kann stark von den bestimmten Immobilisierungs-Verfahrensbedingungen
abhängig
sein. Diese Abhängigkeit
bewirkt, daß die
Herstellung von solchen Tests unvorhersehbar und schwierig zu reproduzieren
ist. Die Lagerstabilität
kann ebenfalls beeinträchtigt
sein.
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Europäische Patentanmeldung Nr. 02761652
beschreibt eine orthographische Flußimmunoassay-Vorrichtung, wobei
eine Probe, die analysiert werden soll, eine saugfähige Matrix
in einer ersten Ebene durchquert und der Flußweg in eine zweite Ebene an
einer Bindungsstelle umgeleitet wird, wobei ein Signal in Relation
zu der Anwesenheit eines Analyten erzeugt wird. Eines der mit einer
solchen Vorrichtung assoziierten Probleme ist, daß, nachdem
die Probe aufgetragen wurde, der Verwender eine Zahl von anschließenden Handlungen durchzuführen hat,
um den Test zu vervollständigen und
ein ablesbares Ergebnis zu erhalten.
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Was klar benötigt wird, ist ein Analyt-Testkit, der
für eine
Zahl von verschiedenen Mißbrauchsdrogen
verwendet werden kann und insbesondere einer, der gleichzeitig dazu
verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Assays auf eine Weise
durchzuführen,
die leichter herzustellen ist und bei der Verwendung einfach und
verläßlich ist.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnung
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In der Zeichnung:
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stellt 1 ein
Diagramm einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung dar, die ein Einzelanalyt-Immunoassay-basiertes
on-site-Testformat aufweist.
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stellt 2 ein
Diagramm einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung dar, die ein multiples Analyt-Immunoassay-basiertes
on-site-Testformat aufweist.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt
eine Vorrichtung und ein verwandtes Verfahren zur Durchführung eines
oder mehrerer kompetitiver Immunoassays zur Verfügung, um die Anwesenheit von
jeweiligen Analyten in einer Probe nachzuweisen. Die Vorrichtung kann
als eine einheitliche Vorrichtung zur Verfügung gestellt werden, d. h.
wobei jeder der Schritte und Reagenzien auf der Vorrichtung selbst
enthalten sind und jeder der Schritte selbst-durchführend ist,
d.h. sie schreiten selbständig
nach der Auftragung einer Probe fort. Sobald die Probe auf die Vorrichtung
aufgetragen wurde, schreitet der gesamte Test (einschließlich der
kompetitiven Reaktion) einfach durch Schritte fort, die einen kapillaren
Fluß von
jeder Stelle oder Zone zu der nächsten
enthalten. Als ein Ergebnis kann eine solche Vorrichtung ohne den
Bedarf verwendet werden, getrennt eine kompetitive Assayreaktion
in einer Lösung
durchzuführen
oder die Lösung
auf eine nicht-kapillare Weise physikalisch zu einer getrennten
Vorrichtung oder Zone zu transferieren.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
die Vorrichtung ein saugfähiges
Material, das einen oder mehrere Flußwege vorsieht, wobei jeder Flußweg umfaßt:
- (a) eine Ausgangsstelle für die Auftragung einer flüssigen Probe,
- (b) eine Vielzahl von Reagenzzonen, die von der Ausgangsstelle
ausstrahlen und die erforderlichen Reagenzien zur Durchführung eines
kompetitiven Immunoassays mit visueller Ablesung auf die Anwesenheit
eines jeweiligen Analyten hin zur Verfügung stellen, wobei die Zonen
in der Reihenfolge und in Flußrichtung
umfassen:
- (i) eine Kompetitionszone in Fließverbindung mit der Ausgangsstelle
und umfassend ein nachweisbares Analyt-Konjugat und einen Bindungspartner
für den
Analyten, wobei beide auf solche Weise diffusiv angeordnet sind,
daß in
der Probe vorhandener freier Analyt in der Lage ist, in einer kompetitiven
Weise mit dem Analyt-Konjugat an den Bindungspartner zu binden;
- (ii) eine Rückhaltezone
in latenter Fließverbindung
mit der Kompetitionszone und umfassend eine Überschußmenge eines nicht-diffusiv
gebundenen Fangreagenz, das in der Lage ist, an einen freien oder
gebunde nen Bindungspartner zu binden, um ihn aus dem fortwährenden
Fluß in
dem Flußweg
zu entfernen; und
- (iii) eine Ablesezone in Fließverbindung mit der Rückhaltezone
und umfassend einen nicht-diffusiv gebundenen Rezeptor, der in Lage
ist, auf eine nachweisbare Weise an ein Konjugat von Analyt und
Marker zu binden, der jedoch nicht in der Lage ist, an unkonjugierten
Analyten zu binden.
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Bei der Durchführung der Verwendung einer Vorrichtung
wie oben beschrieben, entspricht die Anwesenheit von ansteigenden
Mengen von freiem Analyten in einer Probe der abnehmenden Bindung von
Analyt-Konjugat an den Bindungspartner. Umgekehrt ist eine erhöhte Menge
von freiem Analyt-Konjugat in der Lage, entlang des Flußweges fortzufahren.
Zuletzt wird das freie Analyt-Konjugat in der Ablesezone nicht diffundierbar
an einen entsprechenden Bindepartner gebunden und wird dort nachgewiesen,
um eine positive Anzeige der Anwesenheit von Analyt in der Originalprobe
zur Verfügung
zu stellen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Vorrichtung und das Verfahren dazu verwendet werden, um
gleichzeitig eine Vielzahl von Immunassays durchzuführen, um
so die Anwesenheit von jeweiligen Analyten in einer Probe nachzuweisen.
In solch einer bevorzugten "Multianalyt"-Ausführungsform
umfaßt
die Vorrichtung ein saugfähiges
Material, das einen oder mehrere Flußwege zur Verfügung stellt,
wobei jeder Flußweg
umfaßt:
- (a) eine gemeinsame Ausgangsstelle auf dem saugfähigen Material
zur gleichzeitigen Auftragung einer flüssigen Probe;
- (b) eine Vielzahl von jeweiligen Reagenzzonen in aktiver oder
latenter flüssiger
Verbindung mit der Ausgangsstelle, wobei die Reagenzzonen jedes Flußweges die
zur Durchführung
einer visuellen Ablesung kompetitiven Immunoassays auf die Anwesenheit
des jeweiligen Analyten erforderlichen Reagenzien zur Verfügung stellen,
wobei die Zonen für
jeden Flußweg
in der Reihenfolge und der Richtung des Flusses umfassen:
- (i) eine Kompetitionszone in Fließverbindung mit der Ausgangsstelle
und umfassend ein nachweisbares Analyt-Konjugat und einen Bindungspartner
für den
Analyten, wobei beide auf solche Weise diffusiv angeordnet sind,
daß in
der Probe vorhandener freier Analyt in der Lage ist, in einer kompetitiven
Weise mit dem Analyt-Konjugat an den Bindungspartner zu binden;
- (ii) eine Rückhaltezone
in latenter Fließverbindung
mit der Kompetitionszone und umfassend eine Überschußmenge eines nicht-diffusiv
gebundenen Fangreagenz, das in der Lage ist, an einen freien oder
gebundenen Bindungspartner zu binden, um ihn aus dem fortwährenden
Fluß in
dem Flußweg
zu entfernen; und
- (iii) eine Ablesezone in Fließverbindung mit der Rückhaltezone
und umfassend einen nicht-diffusiv gebundenen Rezeptor, der in Lage
ist, auf eine nachweisbare Weise an ein Konjugat von Analyt und
Marker zu binden, der jedoch nicht in der Lage ist, an unkonjugierten
Analyten zu binden.
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Die Flußwege umfassen bevorzugterweise weiterhin
jeder eine oder mehrere positive und/oder negative Verfahrenskontrollzonen
und Reagenzien. In einer Ausführungsform
umfaßt
die Vorrichtung weiterhin eine ?stelle, stromabwärts von den aufeinanderfolgenden
Reagenzzonen und umfassend ein Indikatorreagenz zur Bestätigung der
Vervollständigung
des jeweiligen Assays.
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In einer besonderes bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
die Vorrichtung eine inerte Haltevorrichtung, umfassend obere und
untere Bereiche zur Unterstützung
des saugfähigen
Materials, wobei der obere Bereich eine Öffnung für einen Zugang einer flüssigen Probe
zu dem gemeinsamen Ausgangspunkt zur Verfügung stellt, sowie Öffnungen zum
Betrachten der jeweiligen Anzeige und terminale Anzeigestellen entlang
jedes Flußweges.
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In einer Ausführungsform können Flußwege für eine Vielzahl
von Tests auf eine überlappende und/oder
Seite-an-Seite-Weise und in derselben Richtung entlang des saugfähigen Materials
zur Verfügung
gestellt werden. In einer alternativen Ausführungsform stellt die Vorrichtung
einen getrennten diskreten Flußweg
für jeden
Analyten zur Verfügung, wobei
die Flußwege
so angeordnet sind, um sich in einer radialen Richtung von dem gemeinsamen
Ausgangspunkt zu erstrecken.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
stellt die Erfindung einen multi-Analytassay
zur Verfügung
der in der Lage ist, getrennt die Anwesenheit von einer bis vier
Droge(n) in einer einzelnen Probe von Urin oder Serum nachzuweisen. Solche
Analyten schließen
Tetrahydrocannabinol (THC), Kokain, Opiate und Amphetamine ein,
die ohne Interferenz mit den anderen Analyten nachgewiesen werden.
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Genaue Beschreibung
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In der vorliegenden Spezifikation
werden die folgenden Worte und Ausdrücke die ihnen zugeschriebene
Bedeutung haben:
"Zone" wird sich auf eine
diskrete Stelle beziehen, die eine oder mehrere Reagenzien enthält und entlang des
Flußweges
eines bestimmten Assays angeordnet ist, wobei jede Zone oder Stelle
einen Oberflächenbereich
von weniger als dem des saugfähigen Materials
aufweist;
"Stromabwärts", wenn auf Zonen
angewendet, wird eine Zone betreffen, die flußfähig getrennt von der vorangehenden
Zone und in der Richtung des Flußes einer Probe vorliegt. In
einer typischen Ausführungsform
wird zum Beispiel jede Zone in einer Größenordnung von einem oder mehreren
Millimetern voneinander vorliegen. Zusätzlich kann es zwei oder mehr diskrete
Regionen innerhalb der Zonen geben, wie zum Beispiel die Regionen,
die jeweils Analyt-Konjugat und Bindepartner in der Kompetitionszone
tragen. Alternativ können
bei nicht-interferierenden Reagenzien, Zonen und/oder Regionen innerhalb
von Zonen gegebenenfalls in einer überlappenden Konfiguration
mit vorhergehenden und/oder nachfolgenden Zonen positioniert sein.
"Einheit", wenn auf das saugfähige Material
angewendet bedeutet, daß eine
einzelne wäßrige Probe auf
den Ausgang aufgetragen werden kann und durch aktiven oder latenten
Kapillarfluß durch
jede der Zonen entlang eines bestimmten Flußweges fortschreitet. "Saugfähig" betrifft umgekehrt
ein Material oder Kombination von Materialien, das ausreichend ist,
um den Kapillarfluß einer
Probe von dem Ausgang und durch jede Reagenzzone zu ermöglichen.
"Gleichzeitig" wird bedeuten, daß jeder
einer Vielzahl von Assays auf einer multi-Analytvorrichtung in der Lage ist, bei
im wesentlichen derselben Zeit und durch die Auftragung einer einzelnen
Probe auf den Ausgangspunkt durchgeführt werden zu können.
"Kompetitiv" wird bedeuten, daß die Menge
von Analyt-Konjugat, die an freien Bindepartner gebunden wird abhängig ist
von und in Bezug steht mit der Anwesenheit oder Abwesenheit von
Analyt in der Probe.
"Nicht-diffusiv
gebunden" wird austauschbar
mit dem Wort "immobilisiert" verwendet, um Reagenzien
zu beschreiben, die in einer bestimmten Zone unter Gebrauchsbedingungen
stabil zurückgehalten
werden.
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Die vorliegende Erfindung stellt
eine Vorrichtung und Verfahren zur gleichzeitigen Durchführung von
einem oder mehreren Immunoassays zur Verfügung, um die Anwesenheit von
jeweiligen Analyten in einer Probe nachzuweisen. Brauchbare Analyten schließen diejenigen
ein, die in der Lage sind, in Form eines Konjugats zur Verfügung gestellt
zu werden. Alternativ kann der Analyt in Form eines Derivats oder
Metaboliten der Verbindung von Interesse vorliegen.
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Im allgemeinen ist ein Analyt jede
nachzuweisende Verbindung, die in der Lage ist, durch einen Rezeptor
gebunden zu werden und in der Lage ist, in synthetischer und/oder
gereinigter Form ausreichend zurückgehalten
zu werden, um es so zu ermöglichen, daß sie konjugiert
wird und in einem kompetitiven Assay mit Probenanalyt und Rezeptor
verwendet wird. Diese Verbindungen schließen mono-epitopische Analyten
von relativ kleinem Molekulargewicht (z. B. ungefähr 100 bis
2000) und poly-epitopische Antigene von größerem Molekulargewicht (z.
B. größer als ungefähr 2000)
ein. Repräsentative
Analyten sind diejenigen, die zum Beispiel in U.S. Patenten Nrn. 4,299,916
und 4,275,149 beschrieben werden.
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Beispiele von geeigneten Analyten
schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf, Pestizide und ihre Metaboliten und
Derivate (z. B. polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate,
Carbamate, polyhalogenierte Sulfonamide) und Wirkstoffe und deren
Metabolite und Derivate (z. B. Alkaloide, Steroide, Lactame, Aminoalkylbenzole,
Benzheterozyklen, Purine, Vitamine, Antibiotika, Nukleoside und
Nukleotide, von Marihuana abgeleitete Drogen und verschiedene Wirkstoffe).
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Die Vorrichtung und das Verfahren
der vorliegenden Erfindung können
mit jeder geeigneten Probe verwendet werden. Im allgemeinen, und
bevorzugt, ist die Probe wäßrig, die
direkt aus der Quelle erhalten wurde (z. B. Urin oder Blut). Alternativ
kann die Probe durch Mischen oder Extrahieren einer nicht-wäßrigen Probe
(z. B. Gewebe) mit einem wäßrigen Lösungsmittel
(z. B. gepufferter Lösung)
präpariert
werden. Im allgemeinen ist die Probe jede Substanz von der vermutet
wird, daß sie
die Verbindung oder Verbindungen von Interesse enthält. Dies schließt die Analyse
von Grundwasser auf Verunreinigungen, die Analyse von landwirtschaftlichen
Produkten auf natürlich
auftretende toxische Mittel, wie zum Beispiel Aflatoxin und Ähnliche
ein.
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Gelegentlich werden die Analysen
dieses Typs einen Extraktionsschritt erfordern, in dem eine Probe
mit einem flüssigen
Extraktionsmedium gemischt wird, das wäßrig, organisch oder ein wäßriges/organisches
Gemisch sein kann. Nach Extraktion des Materials von Interesse kann
die extrahierende Lösung
selber als eine Probe verwendet werden und kann vor der Evaluierung
in der vorliegenden Vorrichtung direkt evaluiert werden oder konzentriert, verdünnt, abgedampft
und rekonstituiert, usw. werden.
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Weitere Beispiele von Evaluierungen,
die eine Extraktion erfordern, schließen Pestizidrückstände, bakterielle
Metaboliten und andere Verunreinigungen in Fleisch oder Meeresfrüchten und
Herbizidrückstände oder
andere Verunreinigungen in Bodenproben ein.
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Eine bevorzugte Vorrichtung dieser
Erfindung umfaßt
ein Einhefts-saugfähiges
Material, das einen oder mehrere Flußwege zur Verfügung stellt. Bevorzugterweise,
obwohl nicht erforderlich, wird das saugfähige Material aktuell in Form
eines einzelnen, integralen Materials zur Verfügung gestellt. Alternativ kann
das saugfähige
Material durch Überlappen
oder Aneinanderfügen
von ansonsten diskreten Materialien gebildet werden. Beispiele solcher brauchbaren
saugfähigen
Materialien schließen
(Nitrozellulose-Membranen, Nylon-Membranen oder andere käuflich erhältliche
Membranen) ein.
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In der vorliegenden Vorrichtung brauchbare saugfähige Materialien
schließen
poröse
Materialien ein, die empfindlich dafür sind, von einem wäßrigen Medium
in Antwort auf Kapillarkraft durchquert zu werden. Solche Materialien
sind im allgemeinen hydrophil oder in der Lage hydrophil gemacht
zu werden und schließen
anorganische Pulver, wie zum Beispiel Silica und Alumina, natürliche Polymermaterialien,
insbesondere Zellulose-Materialien, wie zum Beispiel Filterpapier,
chromatographisches Papier und ähnliches,
synthetische oder modifizierte natürlich auftretende Polymere,
wie zum Beispiel Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Poly-(Vinylchlorid),
Polyacrylamid, kreuzvernetztes Dextran, Agarose usw., entweder allein
oder in Verbindung mit anderen Materialien verwendet, ein. Ein bevorzugtes
saugfähiges Material
schließt
Glasfaser-Filterpapier ein. Das saugfähige Material kann an einen
Träger
angebracht werden oder seinen eigenen Träger zur Verfügung stellen.
Das saugfähige
Material kann funktionelle Gruppen enthalten oder in der Lage sein,
funktionalisiert zu werden, um eine kovalente Bindung oder Rezeptoren
für andere
Gruppen zur ermöglichen.
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Wenn zwei oder mehr Flußwege in
einer einzelnen Vorrichtung verwendet werden, umfaßt bevorzugterweise
jeder Weg auf dem saugfähigen
Material eine gemeinsame Ausgangsstelle für die gleichzeitige Auftragung
einer flüssigen
Probe. Wie gesehen werden kann, ist dieser Ursprung "gemeinsam", in das die Auftragung
einer einzelnen Probe dazu dient, den Fluß von Probe gleichzeitig auf
jedem Flußweg zu
beginnen.
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Jeder Flußweg in der Vorrichtung der
vorliegenden Erfindung umfaßt
weiterhin eine Vielzahl von jeweiligen Reagenzzonen an oder stromabwärts von der
Ausgangsstelle. Die Reagenzzonen jedes Immunoassays stellen die
Reagenzien zur Verfügung,
die für
die Durchführung
eines visuellen Ablese-, kompetitiven Immunoassays auf die Anwesenheit
des jeweiligen Analyten hin erforderlich sind. In einer bevorzugten
Ausführungsform
stellt die Reagenzzone jedes der erforderlichen Reagenzien zur Verfügung, d.
h. ohne das Erfordernis, Reagenzien entlang des Weges oder während des
Verlaufs des Tests physikalisch zu entfernen und wieder aufzutragen
(z. B. unter der Verwendung einer Pipette).
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Die Zonen eines bestimmten Flußweges umfassen,
in der Reihenfolge und der Richtung des Flusses, eine kompetitive
Zone, die Analyt-Konjugat und Bindungspartner für den Analyten umfaßt, wobei beide
diffusiv auf solch eine Weise angeordnet sind, daß jeder
freie Analyt, der in der Probe vorhanden ist in der Lage ist, an
den Bindepartner auf eine kompetitive Weise mit dem Analyt-Konjugat
zu binden.
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Die kompetitive Zone selber kann
als die Ausgangsstelle für
die Auftragung der Probe dienen oder sie kann stromabwärts von
dem Ausgang selber liegen. Zusätzlich
können
die verschiedenen Reagenzien, die in der kompetitiven Zone vorhanden sind,
versetzt oder auf jede geeignete Weise angeordnet sein, um die Kinetiken
der Kompetitionsreaktion zu verändern
oder zu beeinträchtigen.
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Zum Beispiel kann der Bindepartner
stromaufwärts
des Analyt-Konjugats positioniert werden, um es dem Analyten zu
ermöglichen,
mit dem Bindepartner zu reagieren, bevor der Bindepartner gegenüber dem
Analyt-Konjugat ausgesetzt wird. Dieser Ansatz wird dem Analyten
einen kompetitiven Vorteil über
das Konjugat um die Bindungsstellen auf dem Bindepartner zur Verfügung stellen.
Im Umkehrschluß kann
dieser Ansatz dazu verwendet werden, um die Sensitivität des Nachweises
auf einen bestimmten Analyten hin zu erhöhen.
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Der Bindepartner ist bevorzugterweise
ein Rezeptor für
den Analyten. Ein Rezeptor ist jede Verbindung oder Zusammensetzung,
die in der Lage ist, eine bestimmte spatiale und polare Organisation
des Analyten von Interesse zu erkennen. Beispielhafte Rezeptoren
schließen
natürlich
auftretende Rezeptoren, z. B. Antikörper, Enzyme, Lectine und ähnliches ein.
Ein bevorzugter Rezeptor für
den Analyten ist ein Antikörper
gegen den Analyten. Ein Antikörper
ist ein Immunglobulin oder Derivat oder Fragment davon, das einen
Bereich auf der Oberfläche
oder in einer Kavität
aufweist, der spezifisch bindet und dadurch als komplementär mit einer
bestimmten spatialen und polaren Organisation eines anderen Moleküls definiert
ist. Der Antikörper
kann monoklonal oder polyklonal sein und kann durch Techniken hergestellt werden,
die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie zum Beispiel der
Immunisierung eines Wirtes und die Abnahme von Seren oder Hybridzellinientechnologien.
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Alternativ kann das Bindereagenz
selber die Form eines Komplexes von Molekülen annehmen, zum Beispiel
ein Komplex von einem ersten Antikörper für den Analyten und einem zweiten
Antikörper, der
spezifisch für
den ersten Antikörper
ist. Die Komponenten solch eines Komplexes können getrennt entweder in der
kompetitiven Zone und/oder an jeder geeigneten Stelle, die zu der
Rückhaltezone
führt, zur
Verfügung
gestellt werden. Solche Komplexe können zum Beispiel bei der Verbesserung
des Entfernens von Bindereagenz in der Rückhaltzone durch Erhöhen seiner
Größe oder
der Affinität
für das
Fangreagenz brauchbar sein.
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Das Analyt-Konjugat wird im allgemeinen
in der Form einer Markierung oder Markers, zum Beispiel eines Katalysators,
gewöhnlicherweise
eines Enzyms, das an den Analyten konjugiert ist, zur Verfügung gestellt.
Eine Markierung kann jedes Molekül oder
System von Molekülen
sein, das an den Analyten gebunden oder konjugiert ist, das in der
Lage ist, ein empfangbares Signal zu produzieren. Eine bevorzugte
Markierung besteht aus kolloidalen Metallpartikeln oder Solpartikeln,
die gefärbt
sind. Der Fachmann wird erkennen, daß viele Elemente in der Lage sind,
als eine Markierung zu wirken, einschließlich, ohne Begrenzung, Ra dionuklide,
fluoreszente Spezies, phosphoreszente Spezies, chemilumineszente Materialien,
Farbstoffe, Enzyme, Solpartikel, gefärbte Polymermaterialien und ähnliches.
Basierend auf dem bekannten Bindungskinetiken der monoklonalen anti-Wirkstoffantikörper, können Standardtechniken verwendet
werden, um Wirkstoffkonjugate herzustellen, die das für die Antikörperbindung
verfügbare
korrekte Epitop aufweisen.
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Ein Flußweg umfaßt weiterhin eine Rückhaltezone
in latenter flüssiger
Verbindung mit der kompetitiven Zone. Mit "latenter flüssiger Verbindung" ist gemeint, daß die flüssige Verbindung
zwischen der Kompetitionszone und der Rückhaltezone ausreichend verzögert werden
kann und/oder die Reaktionsrate ausreichend erhöht werden kann, um es der kompetitiven
Reaktion zu ermöglichen,
bis zu einem gewünschten
Ausmaß fortzuschreiten.
Zusätzlich
zur Erhöhung
der Reaktionszeit innerhalb der kompetitiven Zone kann das Ausmaß der Reaktion
auch durch andere Mittel verbessert werden, wie zum Beispiel durch
Erhöhen
der Temperatur der Bindungsreaktion und/oder durch Verbesserung
der Mischcharakteristika der Reagenzien (z. B. durch Aufschäumen).
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Die verzögernden Mittel zum Erhalt eines
latenten kapillaren Flusses können
von passiver Natur (d. h. automatisch während der Verwendung auftretend)
oder von einer aktiven Natur (z. B. einiges Handeln auf der Seite
des Verwenders erfordern) sein. Unter Bezug der vorliegenden Beschreibung
wird der Fachmann die Weise erkennen, auf die die Verzögerungsmittel
zur Verfügung
gestellt werden können und
in einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden
können.
Siehe, zum Beispiel, PCT-Anmeldungen Nrn. WO 92/21434 und WO 93/24231.
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In einem geeigneten Ansatz wird die
Verweildauer der Lösung
in der kompetitiven Zone durch konfigurieren der jeweiligen Kompetitions-
und Rückhaltezone
(und/oder einer Schnittstelle zwischen ihnen) auf solche Weise erhöht, daß der Fluß von Lösung von
der kompetitiven Zone kontrollierbar verzögert wird. Beispiele von geeigneten
Verzögerungsmitteln
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, die Verwendung einer löslichen
physikalischen Barriere, einer permeablen physikalischen Barriere
oder einem expandierbaren Überbrükkungsmaterial.
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Zum Beispiel kann eine poröse oder
lösliche Barriere
zwischen die Zonen zwischengelagert sein, um es der Lösung zu
ermöglichen,
in der kompetitiven Zone für
eine ausreichende Zeit dauer zu verbleiben, bevor die Barriere selber
durchdrungen oder gelöst
wird. Ähnlich
kann der kapillare Flußweg
selber so gemacht werden, daß er
eine gewundene Strecke zwischen den Zonen nimmt, wodurch die effektive Reaktionszeit
für den
Assay erhöht
wird. Als noch ein weiteres Beispiel kann ein hydratisierbares,
expandierbares (z. B. Schwamm-ähnliches)
Material in der kompetitiven Zone verwendet werden, auf solch eine Weise,
daß das
Material anfänglich
nicht in physikalischen Kontakt mit der Rückhaltezone ist. Nach Hydratisierung
mit der Restlösung
und im Verlauf des Ermöglichens
des Auftretens der kompetitiven Reaktion kann das Material sich
bis zu einem Punkt ausdehnen oder quellen, wobei es in physikalischen Kontakt
mit der Rückhaltezone
kommt und eine flüssige
Verbindung ermöglicht.
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In einer alternativen Ausführungsform
kann der latente kapillare Fluß zwischen
den Kompetitions- und Rückhaltezonen
aktiv durch den Verwender initiiert werden, z. B. durch Manipulieren
oder Lösen einer
Barriere zwischen den Zonen, wodurch eine kapillare Brücke zwischen
ihnen gebildet wird, oder durch physikalisches Zusammenbringen (z.
B. Zusammenheften) der Zonen. Siehe, z. B. U.S. Patent Nr. 4,826,759.
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Die Rückhaltezone umfaßt eine Überschußmenge eines
nicht diffusiv gebundenen Fangreagenz, das in der Lage ist, an freien
oder gebundenen Bindepartner zu binden, um ihn aus dem weiteren Fluß im Flußweg zu
entfernen. Dieses Fangreagenz ist typischerweise ein Rezeptor, der
in der Lage ist, an den Bindepartner zu binden. Ein bevorzugtes
Fangreagenz ist ein Antikörper,
der in der Lage ist, an den Bindepartner zu binden.
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Weil der Bindepartner bevorzugterweise
ein Antikörper
gegen den Analyten ist, ist das Fangreagenz bevorzugterweise ein
Antikörper,
der in der Lage ist, an den Antikörper für den Analyten zu binden. Es
kann zum Beispiel ein Antikörper
sein, der in einer verschiedenen Spezies erzeugt wurde, als diejenige,
die dazu verwendet wurde, den Antikörper für den Analyten zu erzeugen.
Das Fangreagenz kann auch ein Rezeptor, wie zum Beispiel Protein
A sein, das an eine bestimmte Stelle auf dem Immunglobulin-Molekül bindet.
In einer anderen Ausführungsform kann
der Bindepartner an ein Molekül,
wie zum Beispiel Biotin, gekoppelt sein und das Fangreagenz kann
für ein
solches Moleküls
spezifisch sein, zum Beispiel, Antibiotin oder Avidin.
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Der Ansatz der vorliegenden Erfindung
stellt einen besonderen Vorteil über
viele herkömmliche Assays
zur Verfügung,
die immobilisierte Rezeptoren verwenden. Wie oben beschrieben, kann
die Bindungskapazität
von solch immobilisierten Rezeptoren von dem Immobilisierungsverfahren
und den Bedingungen abhängig
sein, so daß die
Herstellung von solchen Assays unvorhersehbar und schwierig zu reproduzieren
ist. In der vorliegenden Erfindung kann das immobilisierte Fangreagenz
in einer Überschußmenge vorhanden
sein, was daher die Entwicklung eines Tests mit vorhersagbaren Performance-Charakteristika
ermöglicht.
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Die Immobilisierung von Fangreagenz
ist relativ stabil, um die Dissoziierung des Reagenz von dem Material
zu verhindern, die im Umkehrschluß zu falschen Ergebnissen führen könnte. Als
eine weitere Absicherung gegen Fehler, die durch dissoziiertes Fangreagenz
hervorgerufen werden, wird der Fachmann die Weise erkennen, in der
ein weiteres Reagenz verwendet werden kann, um selber zu binden und
dissoziiertes Fangreagenz zurückzuhalten.
Ein brauchbarer Einsatz umfaßt
die Verwendung einer zweiten Rückhaltezone,
z. B. bei oder zwischen der ersten Rückhaltezone und der Ablesezone,
die immobilisiertes zweites Fangreagenz aufweist, das für das erste
Fangreagenz spezifisch ist (d.h. dem in der Rückhaltezone zur Verfügung gestellten
Fangreagenz.
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Zuletzt umfaßt ein Flußweg weiterhin eine Ablesezone,
die nicht diffusiv gebundenen Rezeptor umfaßt, der in der Lage ist, auf
eine nachweisbare Weise an Analyt-Konjugat zu binden, jedoch nicht
an nicht-konjugierten Analyten.
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Der nicht-diffusiv gebundene Rezeptor
ist in der Lage, an das Analyt-Konjugat zu binden, jedoch nicht
an den Analyten allein. Dieser Rezeptor bindet dann entweder an
den Markierungsteil des Konjugats oder an eine weitere Gruppe, die
durch das Konjugat zur Verfügung
gestellt wird (z. B. durch die Bindung von Analyt und Markierung),
jedoch dem Analyten allein fehlt. Ein bevorzugter nicht diffusiv
gebundener Rezeptor ist ein Antikörper, der in der Lage ist,
an die Spacer-Gruppe zu binden, die dazu verwendet wird, den Analyten
an die Markierung zu konjugieren.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird die Ablesung in Form der Vervollständigung eines Plus ("+")-Zeichens zur Verfügung gestellt, das die Anwesenheit
von Analyt anzeigt. In solch einer Ausführungsform kann der Minus ("–")-Teil der Ablesung durch jedes geeignete
Mittel zur Verfügung
gestellt werden.
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In einer Ausführungsform wird der Minusteil durch
die Verwendung von zusätzlichen
Reagenzien zur Verfügung
gestellt, die entlang des Flußweges positioniert
sind. Zum Beispiel wird ein nachweisbares Konjugat entlang des Flußweges,
und bevorzugterweise an der Ausgangsstelle selber, positioniert. Der
Minusteil der Ablesung kann in Form eines nicht diffusiv gebundenen
Antikörpers
gegen das nachweisbare Konjugat zur Verfügung gestellt werden. Zum Beispiel,
wenn ein Konjugat von Gold-KLH in diffusiver Form vorhanden ist,
mit einem nicht diffusiv gebundenen anti-KLH-Antikörper, der
den Minusteil der Ablesezone bildet.
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Zuletzt umfaßt der Flußweg bevorzugterweise weiterhin
eine terminale Stelle stromabwärts
von den aufeinanderfolgenden Reagenzzonen und umfassend ein Indikatorreagenz
zur Bestätigung
der Vervollständigung
des jeweiligen Assays. Das Indikatorreagenz ist typischerweise ein
Material, das auf die Anwesenheit von Probe sensitiv ist. Es ist
im allgemeinen ein Material, das seine Farbe in Antwort auf die
Anwesenheit von einigen Gruppen in der Probenlösung verändern wird. Beispiele eines
solchen Reagenz schließen
pH-Indikatorfarbstoffe, Farbstoffe, die auf die Anwesenheit von
Proteinen sensitiv sind und Farbstoffe, die gegenüber Hydrationszuständen sensitiv
sind, ein.
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Die Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung kann in jeder geeigneten Form und Dimension vorliegen,
um den gewünschten
Zweck zu erreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Vorrichtung
in der Form eines inerten Halteapparates zur Verfügung gestellt,
der obere und untere Teile zur Unterstützung des saugfähigen Materials
umfaßt,
wobei der obere Teil eine Öffnung
für Zugang
von flüssiger Probe
zu dem gemeinsamen Ausgangspunkt zur Verfügung stellt, sowie Öffnungen
zur Betrachtung der jeweiligen Ablesung und terminale Indikatorstellen
entlang jedes Flußweges.
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Die Herstellung eines typischen Aufbaus
des vorliegenden Testformats wird im Bezug auf die Zeichnung, einschließlich 1 (Einzelanalytformat) und 2 (Multianalytformat) beschrieben.
Dem Verwender würde
der Test von 2 als eine
Einzel-Testvorrichtung 10 erscheinen, die Wege 12 aufweist,
die sich in jede der vier Richtungen erstrecken und abgelesen werden.
Die Probe wird auf den zentralen Tüpfel 14 aufgetragen
und der Test wäre
vollständig,
wenn die vier Vervollständigungs-Indikatorfenster 16 ihre
Farbe verändern.
Wenn der Test geeignet funktioniert, erscheint der negative Teil 18 des Zeichens
als eine Farbveränderung
für jeden
der Analyten. Falls der Patient auf einen der Analytenwirkstoffe
positiv ist, dann werden die entsprechenden Plusteile des Ablesezeichens 20 ebenfalls
erscheinen.
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Die Vorrichtungen von 1 und 2 zeigen ein bevorzugtes Format für den Nachweis
jeweils eines einzelnen Analyten oder einer Vielzahl von Analyten.
Solche Vorrichtungen können
auf die folgende Weise hergestellt und verwendet werden.
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Gold-KLH. Keyhole-limpit-Hämocyanin ("KLH") und kolloidales
Gold werden von einer Vielzahl von kommerziellen Quellen erhalten
und gemäß Standardverfahren
konjugiert.
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Gold-Ovalbumin-Wirkstoff. Ovalbumin
wird von einer kommerziellen Quelle erhalten und an den gewünschten
Analyten, sowie an kolloidales Gold gekoppelt. Die Markierung des
Trägerproteins
mit kolloidalen Gold wird durch Standardverfahren durchgeführt. Die
Reaktionsbedingungen werden überwacht, um
sicherzustellen, daß das
kolloidale Gold nicht mit der Bindungsreaktion von Wirkstoff-Hapten
an anti-Wirkstoff-Antikörper
interferiert. Ähnliche
chemische Verfahren werden zur Herstellung von Konjugaten für THC (Marihuana),
Benzoylecgonin (Kokain), Opiate (Morphin, Morphinglucuronid), Amphetamin (Amphetamin
und Methamphetamin) verwendet.
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Nicht diffusiv gebundene Reagenzien.
Die Reagenzien können
an das saugfähige
Material über jede
geeignete Technik immobilisiert werden, wie dem Fachmann ersichtlich
sein wird. Direkte Anbringungsverfahren schließen nicht diffusive Adsorption, Anbrindung
an Mikropartikel, die selber an der geeigneten Position gefangen
werden und kovalente Bindung ein, wie zum Beispiel durch die Verwendung von
Cyanogenbromid, Carbonyldiimidazol oder Glutaraldehyd. "Nicht diffusiv" wie in dieser Hinsicht verwendet,
bedeutet, daß das
Reagenz unter den Bedingungen des Tests ausreichend stabil in seiner Position
ist.
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Diffusiv positionierte Reagenzien.
Konventionelle Verfahren werden zur Imprägnierung von Substraten, wie
zum Beispiel Papier mit trockener Chemie-Biomolekülen verwendet.
Diese Verfahren sind brauchbar für:
1) Optimieren der Substratkapazität; 2) Optimieren der Durchnässbarkeit
von trockenen Reagenzien; und 3) Erhöhen der Stabilität von getrockneten
Reagenzien.
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Indikatorstreifen. Herkömmliche
Verfahren werden zur Herstellung eines terminalen Indikators, zum
Beispiel durch die Verwendung eines pH-Indikators, der die Farbe
verändern
wird, wenn Urin vorhanden ist, verwendet.
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In einer Ausführungsform der Vorrichtung werden
die diffusiv positionierten Reagenzien auf die kompetitive Zone
in den geeigneten Konzentrationen aufgetragen, so daß ein sichtbares
Signal in der Ablesezone nur dann erzeugt wird, wenn die Probe,
die auf die Ausgangsstelle aufgetragen wurde, Analyten bei oder
oberhalb einer vorbestimmten Konzentration enthält. Wenn mehrere Analyten aus
derselben Probe nachgewiesen werden, kann diese vorbestimmte Konzentration
für jeden
Analyten verschieden sein.
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Die Funktion der Vorrichtung kann
zum Beispiel durch Herstellen von markierten Einzelwirkstoffproben
in Puffern unter der Verwendung von variierenden Konzentrationen
für jeden
Wirkstoff evaluiert werden. Eine begrenzte Kreuzreaktivität sollte
gegen andere mißbrauchte
Substanzen sowie verschiedene herkömmlich verschriebene Wirkstoffe
getestet werden. Markierte multi-Drogenproben werden ebenfalls getestet,
mit besonderer Betonung auf die Signalerzeugung und mögliche Signalinterferenz.
Die Signalerzeugung kann visuell gegen eine Standardfarbtafel "bewertet" werden.
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In einer Ausführungsform wird normales menschliches
Urin mit variierenden Dosen der vier Mißbrauchsdrogen markiert. Eine
Gesamtzahl von fünf
Quellen wird verwendet. Die Evaluierung schließt den Vergleich von: 1) visuell
bewerteter Signalerzeugung; 2) Zeit zur Testvervollständigung;
und 3) die Anwesenheit von nicht-spezifischer Bindung ein.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Schritte
von zur Verfügung
stellen einer Vorrichtung des oben beschriebenen Typs, umfassend
ein saugfähiges
Material in der folgenden Art, und:
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- (a) Auftragen einer wäßrigen Probe auf das saugfähige Material
an der Ausgangsstelle eines oder mehrerer Flußwege;
- (b) Ermöglichen
der Probe, gleichzeitig durch jeden Flußweg und nacheinander durch
die jeweiligen Reagenzzonen hindurchzufließen, wobei die zur Durchführung eines
kompetitiven Immunoassays mit visueller Ablesung auf die Anwesenheit des
jeweiligen Analyten erforderlichen Reagenzien zur Verfügung gestellt
werden, wobei die Zonen umfassen, in der Reihenfolge und der Richtung
des Flusses:
- (i) eine Kompetitionszone in Fließverbindung mit der Ausgangsstelle
und umfassend ein nachweisbares Analyt-Konjugat und einen Bindungspartner
für den
Analyten, wobei beide auf solche Weise diffusiv angeordnet sind,
daß jeder
freie in der Probe vorhandene Analyt in der Lage ist, an den Bindungspartner
auf eine kompetitive Weise mit dem Analyt-Konjugat zu binden;
- (ii) eine Rückhaltezone
in latenter Fließverbindung
mit der Kompetitionszone und umfassend eine Überschußmenge eines nicht-diffusiv
gebundenen Fangreagenz, das in der Lage ist, an gebundenen oder
freien Bindungspartner zu binden, um ihn aus dem fortwährenden
Fluß in
dem Flußweg
zu entfernen; und
- (iii) eine Ablesezone in Fließverbindung mit der Rückhaltezone
und umfassend nicht-diffusiv gebundenen Rezeptor, der in der Lage
ist, auf eine nachweisbare Weise an ein Konjugat von Analyt und
Marker zu binden, jedoch nicht in der Lage ist, an nicht-konjugierten
Analyten zu binden.
- (c) Durchfließenlassen
der Probe durch eine terminale Stelle stromabwärts von den aufeinanderfolgenden
Reagenzzonen und umfassend ein Indikatorreagenz zur Bestätigung der
Vervollständigung
des jeweiligen Tests;
- (d) Bestimmen der Anwesenheit jedes Analyten in der Probe durch
Nachweisen der Anwesenheit des jeweiligen Analyt-Konjugats in jeder
Ablesezone und Ermitteln der positiven und negativen Kontrollen
um die richtige Durchführung
des jeweiligen Tests zu bestimmen.