DE3006899C2

DE3006899C2 -

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Publication number: DE3006899C2
Application number: DE3006899A
Authority: DE
Inventors: Pierre L. Dr.Med. Bruessel/Bruxelles Be Masson; Cesar L. Kraainem Be Cambiaso; Adrian E. Amersham Buckinghamshire Gb Leek; Floris De Leidschendam Nl Steenwinkel
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1979-02-26
Filing date: 1980-02-23
Publication date: 1989-02-09
Also published as: FR2449892A1; JPS55156866A; GB2045431A; CA1132902A; US4279617A; FR2449892B1; JPS6362699B2; GB2045431B; DE3006899A1

Description

Die Erfindung betrifft die Analyse von Flüssigkeiten, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich von biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, hinsichtlich immunchemischer Substanzen, wie Antigenen oder Antikörpern. In der vorliegenden Beschreibung werden die Bezeichnungen "Ag", "Ab" und "Ab : Ag" für ein Antigen bzw. Antigene (worin Haptene und andere Substanzen eingeschlossen sein sollen, die durch Antikörper oder analoge bindende Proteine gebunden werden können,) einen Antikörper bzw. Antikörper (ein schließlich ähnlicher bindender Proteine und solcher Pro teine, wie des Rheumafaktors (RF), C1q, des aktiven Be standteils von Mäuseserum und der Aszites-Flüssigkeit der Maus) bzw. für Komplexe aus Ag und Ab verwendet.

Bekanntlich reagiert Ag mit einem geeigneten Ab zu Ab : Ag, und die meisten Immunoassay-Verfahren bedienen sich dieser Umsetzung. Es ist weiter bekannt, teilchenförmige Materialien, wie beispielsweise solche aus Polystyrol (im allgemeinen als Latex bezeichnet) mit einem Ab oder Ag zu überziehen und anschließend die überzogenen Teilchen der zu untersuchenden Probenlösung auszusetzen, um zu sehen, ob und in welchem Ausmaß die Teilchen agglutiniert werden. Die Agglutination zeigt die Anwesenheit eines Ab oder Ag in der Probe an, das mit zwei oder mehreren überzogenen Latexteilchen reagieren kann, um Agglutination zu verur sachen.

Agglutinationstechniken allgemein sowie solche, die zur Bestim mung des Rheumafaktors (RF) angewandt werden, sind aus der Literaturstelle G. Müller, Klin. Biochem. u. Laboratoriums diagnostik, Stuttgart und New York 1977, Seiten 53, 54 und 226 bekannt. Aus US-PS 40 92 114 ist ein indirekter Latex test zur Bestimmung von Immunglobulinen bekannt, der sich einer Doppelantikörper-Methode bedient, bei der der zweite Antikörper an eine feste Matrix gebunden ist. Schließlich ist aus DE-OS 27 54 645 ein Agglutinations-Hemmtest bekannt, bei dem zwei verschiedene teilchenförmige Reagenzien verwendet werden.

Während das oben erwähnte Verfahren zur Beobachtung der Agglutination von überzogenen Teilchen in vielfältiger Hin sicht zufriedenstellend ist, gibt es bei der Bestimmung kleiner Mengen (in besonders niedrigen Konzentrationen) von Ab oder Ag Schwierigkeiten. Die kleine Menge Ab oder Ag kann nicht ausreichend sein, um eine verläßlich beobachtbare Agglutination der mit Ab bzw. Ag überzogenen Latexteilchen zu gewährleisten. Somit erfolgt eine bestimmbare Aggluti nation zufolge der Größen- und daher Massendifferenzen zwischen Antigenen oder Antikörpern und normalerweise ver wendeten Latexteilchen lediglich dann, wenn zwischen zwei oder mehreren Latexteilchen mehrere Antigen/Antikörper- Brücken gebildet werden. Wenn jedoch die Anzahl der Antigen- oder Antikörpermoleküle sehr gering ist, ist die statistische Wahrscheinlichkeit, daß mehrere Antikörperbrücken für jede Agglutination gebildet werden können, sehr gering, weshalb auch die Agglutination sehr gering ist.

Es wurde nun ein Verfahren zur Überwindung dieser Schwierigkeit gefunden, bei dem zwei verschiedene beschichtete Teilchen verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse einer Flüssigkeit hinsichtlich eines darin enthaltenen Antikörpers oder Antigens, bei dem man

a) die Flüssigkeit mit einem ersten mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz, das mit dem zu untersuchenden Antikörper oder Antigen unter Ausbildung eines Komplexes eine Bindung eingeht, vermischt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man anschließend
b) das Gemisch aus Stufe a) mit einem zweiten, anderen mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz versetzt, das mit dem in Stufe a) gebildeten Komplex unter Ausbildung eines Agglutinats, jedoch nicht mit dem freien ersten teilchenförmigen Reagenz eine Bindung eingeht, und
c) die nicht agglutinierten Anteile des ersten oder zweiten teilchenförmigen Reagenzes selektiv bestimmt und dadurch den zu untersuchenden Antikörper oder des zu untersuchenden Antigens nachweist und bzw. oder bestimmt.

Erfindungsgemäß wird also das zu bestimmende Antigen oder der zu bestimmende Antikörper mit einem ersten teil chenförmigen Reagenz vermischt, das mit Ab oder Ag eine Bindung ausbildet. Die Bindungsreaktion

Ab + Teilchen [Ab · Teilchen] (1)

ist reversibel. Das geringe Ausmaß an Agglutination, das stattfindet, ist unzureichend, um eine genaue und zuver lässige Messung zu gestatten. Das Gemisch wird deshalb an schließend mit einem Überschuß eines zweiten teilchenförmigen Reagenzes versetzt. Dieses zweite Reagenz bindet sich an den Komplex (Ab · Teilchen) unter Ausbildung eines Agglu tinats, wodurch der Komplex aus dem Gleichgewicht wirksam entfernt wird, das dadurch gemäß Gleichung (1) nach rechts verschoben wird. So kann die Gesamtmenge an zu bestimmendem Ab oder Ag in Komplexe überführt und agglutiniert werden. Durch Messen der Menge an erstem oder zweitem Reagenz, die nicht agglutiniert in dem Gemisch zurückgeblieben ist, kann die Anwesenheit und bzw. oder Menge an Ab oder Ag bestimmt werden.

Gegenstand der Erfindung ist weiter eine Ausbildung des obigen Verfahrens zur Analyse einer Flüssigkeit hinsichtlich des in ihr enthaltenen Rheumafaktors (RF), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) die Flüssigkeit mit einem ersten mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz, das mit dem zu untersuchenden Rheumafaktor eine Bindung eingeht, vermischt,
b) das Gemisch aus Stufe a) mit einem zweiten, anderen mikroskopischen oder submikroskopischen, teilchenförmigen Reagenz versetzt, das mit denjenigen ersten Reagenzteilchen, die an den Rheumafaktor gebunden sind, unter Ausbildung eines Agglutinats, jedoch nicht mit denjenigen Teilchen des ersten Reagenzes, die nicht an den Rheumafaktor gebunden sind, eine Bindung ausbildet, und
c) die nicht agglutinierten Anteile des ersten oder zweiten teilchenförmigen Reagenzes selektiv bestimmt und dadurch den zu untersuchenden Rheumafaktor nachweist und bzw. oder bestimmt.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten teil chenförmigen Reagenzien besitzen mikroskopische oder submi kroskopische Größe, d. h. sie sind im allgemeinen kleiner als 15 µm und gewöhnlich nur einige Mikrometer oder unter einem Mikrometer groß. Latexteilchen derartiger Größe sind im Handel erhältlich. Es ist bekannt, Ab oder Ag an mikro skopisches teilchenförmiges Material, wie Latex, zu binden. Dies erfolgt normalerweise durch Herstellung einer reak tionsfähigen Beschichtung auf dem Teilchen und anschließende chemische Bindung oder Adsorption von Ab oder Ag daran. In bestimmten Fällen ist es auch möglich, Ab oder Ag unmittelbar an das Teilchen (ohne dazwischengeschobene Beschichtung) zu binden. Da die Art der Herstellung der teilchen förmigen Reagenzien nicht zur vorliegenden Erfindung ge hört und wohlbekannt ist, wird sie hier nicht näher be schrieben.

In Stufe c) des Verfahrens wird das nicht aggluti nierte erste oder zweite teilchenförmige Reagenz selektiv ermittelt und dadurch die Anwesenheit und bzw. oder Menge an zu ermittelndem Ab oder Ag festgestellt. Gemäß einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Ver fahrens wird die selektive Bestimmung durch Auszählen des freien ersten oder zweiten teilchenförmigen Reagenzes in Anwesenheit des Agglutinats, d. h. ohne weiteren Trennungs schritt, durchgeführt. Dies kann dadurch erzielt werden, daß man erste und zweite teilchenförmige Reagenzien mit unterschiedlicher Größe verwendet, so daß mindestens eines der beiden teilchenförmigen Reagenzien selektiv in dem Umsetzungsgemisch ausgezählt werden kann. Zähleinrichtungen, die für diesen Zweck eingesetzt werden können, sind bekannt. Sie können so programmiert werden, daß sämtliche Teilchen außerhalb eines gewissen Größenbereiches unbe rücksichtigt bleiben, so daß durch Auswahl geeigneter Größen für die beiden Reagenzien ein selektives Auszählen des einen in Anwesenheit des anderen sowie in Gegenwart von Agglutinat erreicht werden kann. Im allgemeinen beträgt die Mindestteilchengröße, die zuverlässig ausgezählt werden kann, etwa 0,6 µm, so daß mindestens eines der beiden teil chenförmigen Reagenzien mindestens diese Größe aufweist. Das andere Reagenz kann kleinere oder größere Teilchen größen aufweisen. Es wird bevorzugt, daß das andere Rea genz kleiner ist und vorzugsweise eine Größe von unter 0,6 µm aufweist, so daß keine signifikante Möglichkeit be steht, daß es bei der Auszählung des ersten Reagenzes stört. Wenn das zweite Reagenz kleiner als das erste ist, wird außerdem seine Umsetzung mit dem Komplex, der gemäß Gleichgewicht (1) gebildet wird, wirkungsvoller. Vorzugs weise besitzen die Teilchen des ersten Reagenzes minde stens die zweifache Größe der Teilchen des zweiten Rea genzes. Vorzugsweise ist die Teilchengröße jedes teilchen förmigen Reagenzes praktisch gleichförmig.

Zwar ist es ein bevorzugtes Merkmal des erfindungsge mäßen Verfahrens, eines der freien, teilchenförmigen Rea genzien durch selektives Auszählen ohne vorherige Abtren nungsstufe zu bestimmen, jedoch ist es auch möglich, eines der freien, teilchenförmigen Reagenzien (oder beide) von dem Agglutinat abzutrennen und anschließend die selektive Bestimmung gemäß Stufe c) durchzuführen. Die Abtrennungs stufe kann auf vielfältige Weise durchgeführt werden, bei spielsweise durch Abzentrifugieren. Vorzugsweise besteht ein Größenunterschied zwischen den beiden teilchenförmigen Reagenzien, so daß nach dem Zentrifugieren das Agglutinat und das größere der beiden teilchenförmigen Reagenzien sedimentiert sind, während das andere freie teilchenför mige Reagenz für die Bestimmung in Suspension bleibt. Die Bestimmung kann durch Auszählen oder in anderer beliebiger Form durchgeführt werden. Beispielsweise kann das verbleibende freie teilchenförmige Reagenz eine es iden tifizierende Markierung, wie beispielsweise ein radio aktives Atom, einen Fluorophor oder ein Enzym, tragen, und die Bestimmung kann mit Hilfe der Markierung auf be kannte Weise durchgeführt werden.

Eine andere Methode, bei der die Abtrennung sehr be quem und leicht erzielt werden kann, besteht darin, daß man in eines der teilchenförmigen Reagenzien magnetisch anziehbares Material einbringt, so daß dieses Reagenz (sowohl in freier Form als auch im Agglutinat) nach Anle gen eines magnetischen Feldes sedimentiert oder auf andere Weise an einen bestimmten Ort verbracht werden kann, während das andere (nichtmagnetische) freie Reagenz in Sus pension bleibt. Wiederum kann das freie Reagenz auf be liebige zweckmäßige Weise, wie beispielsweise durch Aus zählen oder Verwendung einer Markierung, wie oben beschrieben, bestimmt werden. Magnetisch anziehbare Teilchen sind bekannt.

Bei der Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung zum Nachweis eines bestimmten Ab oder Ag ist es lediglich erforderlich, festzustellen, ob eine Agglutina tion überhaupt stattgefunden hat. Das heißt, es ist lediglich erforderlich, festzustellen, ob überhaupt das erste oder das zweite teilchenförmige Reagenz unter Agglutinatbil dung aufgenommen worden ist. So kann beispielsweise durch Auszählen der Teilchen des ersten Reagenzes, die im Um setzungsgemisch frei zurückgeblieben sind, und Vergleichen des Ergebnisses mit der Zahl dieser Teilchen, die man in Stufe a) zugesetzt hat, bestimmt werden, ob überhaupt Teilchen des ersten Reagenzes an den Antikörper oder das Antigen, die nachgewiesen werden sollen, gebunden und auf diese Weise in das Agglutinat aufgenommen worden sind.

Für quantitative Bestimmungen bedient man sich norma lerweise Standardergebnissen, d. h. Ergebnissen, die unter Verwendung bestimmter Mengen von Reagenzien zur Bestimmung bekannter Mengen von bestimmten Ab oder Ag erhalten worden sind. Dann ist es möglich, eine unbekannte Menge von dem selben Ab oder Ag lediglich durch Vergleichen des Bestim mungsergebnisses von Stufe c) mit den Standardergebnissen festzustellen. Die Verwendung von Standardergebnissen, beispielsweise Standardkurven, in dieser allgemeinen Weise ist bekannt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis und zur Bestimmung der verschiedenartigsten Antikörper verwendet werden, die vom Körper gegen Virus- oder bakterielle Infektionen erzeugt werden, wie beispielsweise zum Nach weis und zur Bestimmung von Antikörpern gegen DNS, den Masernvirus, Nahrungsmittelantigene, Brucella sowie andere Substanzen, wie Ferritin. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Bestimmung geringer Mengen von Antikörpern im menschlichen Serum. Beispielsweise ist es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, geringe Mengen an IgE-Antikörpern gegenüber einem bestimmten Aller gen in Gegenwart von IgE und IgE-Antikörpern gegenüber anderen Antigenen quantitativ zu bestimmen.

Die Bestimmung und Titrierung von IgE-Antikörpern gegenüber bestimmten Allergenen wird gewöhnlich dazu ein gesetzt, um die Substanzen zu identifizieren, gegenüber denen Patienten allergisch sind. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Teilchen des ersten Reagenzes mit dem Allergen überzogen, beispielsweise Extrakten von Hausstaub, Katzenfell oder Graspollen, indem man beispielsweise eine Adsorption oder eine kovalente Bindung eintreten läßt. Dieser Latex wird anschließend im Serum eines Patienten inkubiert. Wenn dieses Serum IgE-Antikörper gegen das auf den Teilchen vorhandene Allergen enthält, werden diese Teilchen die Antikörper aufnehmen. Durch Verwendung der Teilchen des zweiten Reagenzes, die beispielsweise Kanin chen- oder Ziegenantikörper gegen menschliche IgE-Anti körper tragen, wird es ermöglicht, die mit dem Allergen beschichteten Teilchen zu agglutinieren, sofern IgE-Anti körper an sie gebunden sind. Das Ausmaß der Agglutination hängt von der Menge an gebundenen IgE-Antikörper ab. Unter Verwendung von Teilchen des zweiten Reagenzes, die mit Anti-IgG- oder Anti-IgA-Antikörpern überzogen sind, ist es möglich, die Antikörper anderer Klassen zu bestimmen. Um eine Störung durch Immunglobuline zu vermeiden, die sich mit dem auf den Teilchen vorhandenen Allergen nicht umgesetzt haben, kann der Latex zentrifugiert und gewaschen werden. Die beiden Stufen des Verfahrens können wie folgt schematisch dargestellt werden:

(1) Lx - Graspollen + IgE-Anti-Graspollen + IgE-Anti- (andere Allergene) → Lx - Graspollen - IgE-Anti- Graspollen + IgE-Anti-(andere Allergene)
(2) Lx - Graspollen -IgE-Anti-Graspollen + Lx-Anti- IgE-Antikörper → Agglutination.

Mit Antigen beschichteter Latex kann durch mit Anti gen beschichtete magnetisierte Teilchen ersetzt werden. In diesem Falle wird eine magnetische Trennung anstelle der Zentrifugentrennung angewandt, und eine weitere ma gnetische Trennung kann durchgeführt werden, nachdem die Teilchen des zweiten Reagenzes zugesetzt worden sind, so daß lediglich die freien Teilchen des zweiten Reagenzes in der Suspension zum Auszählen zurückbleiben.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch zur Bestimmung des Rheumafaktors (RF) und anderer ähnlicher bindender Proteine oder Agglutinatoren anwenden (bei spielsweise C1q, die aktive Fraktion von Mäuseserum - US-PS 41 62 895 - und die aktive Fraktion von Aszites flüssigkeit von Mäusen - europäische Patentanmeldung 79302342.5). RF ist ein Autoantikörper, der gegen IgG wirkt. Er kann selbst ein Immunglobulin der Klasse IgG, IgM oder IgA sein. Die Identifizierung der Klasse des Rheumafaktors kann für diese Diagnose und die Beurteilung der Schwere bestimmter Krankheiten von Bedeutung sein, und diese Identifizierung kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt werden. Bei dem Verfahren wird RF zu nächst aus dem Serum aufgenommen, beispielsweise durch Vermischen des Serums mit mit Kaninchen-IgG überzogenen magnetisierten Celluloseteilchen. Die Teilchen, die RF tragen, werden abgetrennt und gewaschen und anschließend mit Teilchen des zweiten Reagenzes vermischt, die bei spielsweise mit Ziegen-IgG-Anti-Human-IgG (oder -Anti- Human-IgA oder -Anti-Human-IgM, wie erforderlich) über zogen sind. Nach einer magnetischen Trennung werden die freien Teilchen des zweiten Reagenzes ausgezählt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Bestimmung von Ag. Bei diesem Verfahren wird das das Antigen enthaltende Serum zunächst mit Latexteilchen ver mischt, die dasselbe Antigen tragen, sowie einer beschränkten Menge Ab gegen das Ag. Das freie und das an Latex ge bundene Ag konkurrieren um den Ab, und die Menge an Ab, die an das Latex-Ag unter Bildung eines Immunkomplexes auf dem Latex gebunden wird, hängt von der Menge an freiem Ag in der Serumprobe ab. Nun wird das zweite teilchenförmige Reagenz zugesetzt, das als Reagenz Ab gegen den in der ersten Stufe verwendeten Ab enthält. Das zweite Reagenz verursacht somit eine Agglutination derjenigen Teilchen des ersten Reagenzes, die einen Immunkomplex tragen. Durch Mes sen der ersten oder zweiten nicht agglutinierten Reagenz teilchen kann das Ag im Serum nachgewiesen und bzw. oder bestimmt werden.

Diese Bestimmung kann beispielsweise für Progesteron verwendet werden, wobei als erstes teilchenförmiges Reagenz ein 0,8 µm Latex verwendet wird, das durch physikalische Adsorption mit einem Konjugat aus Ferritin und Progesteron überzogen ist, während man als zweites teil chenförmiges Reagenz 0,2 µm große Teilchen verwendet, die durch Adsorption mit Ziegen-IgG-Anti-Kaninchen-IgG über zogen sind. Das verwendete Antiserum ist Kaninchen-Anti progesteron-Antiserum.

Bei dem Verfahren zur Bestimmung von Ag, wie oben beschrieben, wird die Bestimmung tatsächlich bezüglich der Menge von Ab durchgeführt, die zur Verfügung steht, um sich an das erste teilchenförmige Reagenz zu binden, und diese Menge ist ihrerseits von der Menge Ag abhängig, die im Serum vorhanden ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das erste teilchenförmige Reagenz gegenüber der zu bestimmenden Sub stanz selektiv, und die Teilchen des ersten Reagenzes sind vorzugsweise größer als diejenigen des zweiten Reagenzes. Von den Teilchen des zweiten Reagenzes wird ein großer Überschuß verwendet, um für den Prozoneneffekt Vorsorge zu tragen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Bestimmung von IgE-Antikörpern in menschlichem Serum

IgE-Antikörper gegen ein Allergen (beispielsweise Kreuz krautpollen) werden wie folgt bestimmt:

Latexteilchen von verhältnismäßig großem Durchmeser (beispielsweise 0,79 µm) werden mit dem Allergen überzogen, beispielsweise durch einfache Adsorption oder durch kova lente Bindung mit Bromcyan- oder hydroxyliertem Latex. Eine Menge von beispielsweise 50 µl Serum wird mit einer Menge von beispielsweise 50 µl einer Suspension dieser Teilchen in einer Pufferlösung (beispielsweise 10⁷ Teilchen/ml) vermischt. Das Gemisch wird etwa 10 min bei 25°C be brütet. Anschließend wird eine Menge von beispielsweise 50 µl Latexteilchen mit einem verhältnismäßig geringen Durchmesser von beispielsweise 0,08 µm zugesetzt. Diese Teilchen sind mit Kaninchen-Anti-IgE-Antikörpern durch Adsorption überzogen worden. Die Teilchen werden dem Gemisch in Form einer Suspension von etwa 10⁷ Teilchen/ml in einem Puffer zugesetzt.

Das erhaltene Gemisch wird etwa 10 min bei 25°C bebrütet und anschließend mit etwa 60 ml GBS-Puffer (0,1 M Glycin, 0,17 M NaCl, pH 9) verdünnt und schießlich durch einen Teilchenzähler gesaugt, der so eingerichtet ist, daß er sowohl große Agglutinate als auch die Latex-Ab-Teilchen unberücksichtigt läßt. Die Anzahl an nicht agglutinierten großen Latexteilchen ist umgekehrt proportional der Menge an IgE, die an das Allergen auf den großen Teilchen ge bunden ist, und demzufolge zur Menge an IgE im Serum.

Beispiel 2 Bestimmung des Rheumafaktors

Reagenzien: Kaninchen-IgG wurde an magnetisierte Cellulose teilchen gekuppelt, deren Teilchengröße einer Gauss'schen Verteilung folgt, wobei 95% zwischen 0,5 und 3,0 µm liegen. Polystyrolteilchen von 0,8 µm Dicke wurden durch physikalische Adsorption entweder mit Ziegen-IgG-Anti-Human-IgG, Ziegen-IgG-Anti-Human-IgA oder Ziegen-IgG-Human-IgM überzogen. Zuvor waren die Ziegen-Antiseren durch Kanin chen-IgG absorbiert worden, um eine Kreuzreaktion mit dem Material zu verhindern, das die Celluloseteilchen überzieht. Das Reaktionsmedium bestand aus einer 0,1 M Glycin-Natron lauge-Pufferlösung vom pH-Wert 9,2 mit einem Gehalt von 0,17 M NaCl.

75 µl der Suspension der magnetischen Teilchen (5 mg/ml Glycinpuffer) wurden in 3-ml-Glasröhrchen mit 300 µl verschiedener Verdünnungen von Serum 45 min lang bei Raumtemperatur auf einem Wirbelmischer bebrütet. Die magnetischen Teilchen wurden anschließend dreimal mit 2 ml Glycinpuffer gewaschen, wobei ein Magnet verwendet wurde, um die Teilchen einzufangen. Nach der letzten Wa schung und einem Zusatz von 75 µl Glycinpuffer wurde die Suspension in drei Glasröhrchen verteilt, von denen je eines zur Bestimmung einer der Antikörperklassen verwen det wurde. Eine Probe von 100 µl der Suspension (0,625 g/l) aus Anti-IgG-Latex wurde in das Röhrchen Nr. 1, von Anti- IgA-Latex in das Röhrchen Nr. 2 und von Anti-IgM-Latex in das Röhrchen Nr. 3 eingebracht. Latex und Celluloseteilchen wurden 30 min bei Raumtemperatur auf einem Wirbelmischer be brütet. Nach Verdünnung mit 2 ml Glycinpuffer wurden die Röhrchen zweimal umgedreht und die magnetischen Teilchen mit Hilfe eines Magnetes an der Röhrchenwand zurückgehalten. 250 µl der überstehenden Flüssigkeit wurden in 2 ml Glycin puffer verdünnt und in eine automatische Analysiervorrich tung (Technicon AutoAnalyser) eingesaugt. Die Teilchen, die nicht magnetisch zurückgehalten worden waren, wurden dabei gezählt (AutoCounter). Die Anzahl der Teilchen wurde mit der Verdünnung des untersuchten Serums in Beziehung gesetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann absatzweise oder nach dem Prinzip des kontinuierlichen Durchflusses auto matisch durchgeführt werden. Als Beispiel für ein automa tisiertes System kann folgende Verfahrensweise dienen: 50 µl einer vorbereiteten Probe werden durch eine peri staltische Pumpe gleichzeitig mit 50 µl Latex-Allergen angesaugt. Der erhaltene Strom läuft 10 min lang durch eine mit einer Frequenz von 50 Hz schwingende Mischschlange. Nach dem Auftauchen aus der Schlange verbindet sich der Strom mit einem weiteren Strom, der mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/min fließt und Latex-Ab-Kon jugat enthält. Die vereinigten Ströme fließen 5 min lang durch eine zweite Vibrations-Mischschlange. Danach wird der Strom 400fach verdünnt und anschließend durch eine Zellenzählanlage geschickt, die mit einer doppelten Schwelle ausgestattet ist, um sowohl agglutinierte Teilchen als auch den kleinen Latex-Ab zu eliminieren.

Selbstverständlich werden das Serum oder die Flüssig keit, die zu untersuchen sind, in den Fällen, daß sie Sub stanzen enthalten, die das erfindungsgemäße Verfahren stören könnten, vorher behandelt, um derartige Substanzen zu entfernen oder zu inaktivieren.

Claims

1. Verfahren zur Analyse einer Flüssigkeit hinsichtlich eines darin enthaltenen Antikörpers oder Antigens, bei dem man

a) die Flüssigkeit mit einem ersten mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz, das mit dem zu untersuchenden Antikörper oder Antigen unter Aus bildung eines Komplexes eine Bindung eingeht, vermischt, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend
b) das Gemisch aus Stufe a) mit einem zweiten, anderen mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz versetzt, das mit dem in Stufe a) gebildeten Komplex unter Ausbildung eines Agglutinats, jedoch nicht mit dem freien ersten teilchenförmigen Reagenz eine Bindung eingeht, und
c) die nicht agglutinierten Anteile des ersten oder zweiten teilchenförmigen Reagenzes selektiv bestimmt und dadurch den zu untersuchenden Antikörper oder das zu untersuchende Antigen nachweist und bzw. oder bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Analyse einer Flüssigkeit hinsichtlich des in ihr enthaltenen Rheumafaktors (RF), dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Flüssigkeit mit einem ersten mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz vermischt, das mit dem zu untersuchenden RF eine Bindung eingeht,
b) das Gemisch aus Stufe a) mit einem zweiten, anderen mikroskopischen oder submikroskopischen teilchenförmigen Reagenz versetzt, das mit denjenigen ersten Reagenzteilchen, die an RF gebunden sind, unter Ausbildung eines Agglutinats, jedoch nicht mit denjenigen ersten Reagenzteilchen, die nicht an RF gebunden sind, eine Bindung eingeht, und
c) die nicht agglutinierten Anteile des ersten oder zweiten teilchenförmigen Reagenzes selektiv bestimmt und dadurch den zu untersuchenden RF nachweist und bzw. oder bestimmt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe b) als zweites Reagenz ein IgG, IgM oder IgA verwendet, wobei in Stufe c) die IgG-, IgM- bzw. IgA-Fraktion des RF bestimmt wird.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als erste und zweite teilchenförmige Reagenzien solche mit unterschiedlicher Größe verwendet, so daß in Stufe c) mindestens entweder die nicht agglutinierten er sten oder zweiten Reagenzteilchen im Gemisch mit ersten und zweiten Reagenzteilchen und Agglutinat ohne Abtren nung selektiv gezählt werden können und das nicht agglu tinierte erste oder zweite teilchenförmige Reagenz durch eine derartige selektive Auszählung nachgewiesen oder be stimmt wird.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man für eines der teilchenförmigen Reagenzien eine Teilchengröße unter 0,6 µm und für das andere eine Teilchengröße von über 0,6µm wählt.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das zweite teilchenförmige Reagenz kleiner als das erste wählt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe c) mindestens eines der freien ersten und zweiten teilchenförmigen Reagenzien von dem Agglutinat vor der selektiven Bestimmung abtrennt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung durch Zentrifugieren durchführt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als eines der ersten und zweiten teilchenförmigen Reagenzien ein solches wählt, das magnetisch anziehbares Material enthält, und man die Trennung dadurch durchführt, daß man ein magnetisches Feld zur Trennung von Agglutinat und freien magnetischen Teilchen des einen Reagenzes von den freien Teilchen des anderen Reagenzes anlegt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als eines der teilchenförmigen Reagenzien ein solches wählt, das eine Markierung trägt und die freien Teilchen nach der Abtrennung von dem Agglutinat aufgrund der Markierung bestimmt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das freie teilchenförmige Reagenz oder eines von ihnen, das von dem Agglutinat abgetrennt worden ist, durch Auszählen bestimmt.

12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man solche teilchenförmigen Reagenzien wählt, die aus Latexteilchen bestehen, die ein Reagenz tragen.

13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man für jedes teilchenförmige Reagenz jeweils eine gleichmäßige Teilchengröße wählt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung eines Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß man die Menge eines Antikörpers in einem Ag : Ab-Komplex auf dem ersten teilchenförmigen Reagenz bestimmt, wobei die Menge des Antikörpers in dem Komplex von der Menge des Antigens abhängt, das ebenfalls in der Flüssigkeit vorhanden ist, wodurch aufgrund des Ergebnisses der Bestimmung die Menge an Antigen bestimmt werden kann.

15. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Technik des kontinuierlichen Durchflusses anwendet.