WO2002029430A1 - Verfahren und vorrichtung zur untersuchung biologischer und/oder chemischer proben mittels giant-magnetoimpedanz (gmi) - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur untersuchung biologischer und/oder chemischer proben mittels giant-magnetoimpedanz (gmi) Download PDF

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WO2002029430A1
WO2002029430A1 PCT/EP2001/011461 EP0111461W WO0229430A1 WO 2002029430 A1 WO2002029430 A1 WO 2002029430A1 EP 0111461 W EP0111461 W EP 0111461W WO 0229430 A1 WO0229430 A1 WO 0229430A1
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binding partner
magnetic
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sensor
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PCT/EP2001/011461
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Inventor
Erhard Kisker
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Evotec Technologies Gmbh
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y25/00—Nanomagnetism, e.g. magnetoimpedance, anisotropic magnetoresistance, giant magnetoresistance or tunneling magnetoresistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/02—Measuring direction or magnitude of magnetic fields or magnetic flux
    • G01R33/06—Measuring direction or magnitude of magnetic fields or magnetic flux using galvano-magnetic devices
    • G01R33/09—Magnetoresistive devices
    • G01R33/093—Magnetoresistive devices using multilayer structures, e.g. giant magnetoresistance sensors

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for examining biological and / or chemical samples by means of giant magnetoimpedance (GMI).
  • GMI giant magnetoimpedance
  • the methods and devices according to the invention are very well suited for diagnostics and the search for biologically active and / or pharmaceutically active compounds.
  • macromolecules e.g. proteins, nucleic acids, hormones
  • complementary partners e.g. antigen-antibody hybridizations
  • Magnetic particles are particularly suitable as magnetic probes.
  • the magnetic particles can advantageously be detected very sensitively with the aid of magnetic sensors. Two approaches for the detection of magnetic probes are described in the literature and the patent literature.
  • No. 5,981,297 describes the detection of magnetically marked molecules in sample solutions by means of magnetoresistive sensors, so-called GMR sensors.
  • the molecules to be determined are selectively attached to the sensor surface.
  • a change in the measured values on the magnetoresistive sensors is an indication of the concentration of the molecules to be determined in the samples.
  • No. 6,110,660 describes a permeability sensor for carrying out induction measurements using a coil. Sedimenting magnetically labeled molecules are investigated using an AC bridge circuit to increase the sensitivity of detection. The change in inductance of a relatively large coil is measured when the sediment is introduced.
  • GMI sensors The limited use of GMI sensors is also due to the fact that the impedance causes various effects that are initially relatively unclear. For example, the impedance determines the power that is implemented in such an examination system. A distinction must be made between apparent power, reactive power and active power, which depend in a complicated way on the value of the impedance.
  • the use of the GMI effect in the investigation of biological and / or chemical samples thus does not appear to make sense, since other methods based on magnetic probes are already available which are already fully understood and can be used as routine methods.
  • binding assays such as immunoassays
  • biotechnology and medical diagnostics take advantage of the ability of certain bindable molecules, in particular macromolecules, to bind specifically to specific binding sites. This enables the methods according to the invention to be used in medical diagnostics and to search for biologically active and / or pharmaceutically active substances.
  • Different types of binding assays can be carried out with the methods according to the invention. For example, these are sedimentation processes or sensor surface attachment processes.
  • a) providing a detector for measuring magnetic parameters b) providing at least one binding first binding partner in a sample vessel, c) bringing the first binding partner into contact with at least one second binding partner capable of selective binding to the first binding partner, the first and / or the second binding partner comprises at least one magnetic and / or magnetizable probe and d) determining at least one signal of the probe,
  • the giant magnetoimpedance signal of the probe is determined by at least one magnetism-sensitive sensor of the detector.
  • the at least one sensor is a giant magneto-impedance sensor which senses the at least one probe with the greatest possible sensitivity.
  • the probe changes the sensor's giant magnetoimpedance signal, which can be measured and from which the detection of the probe can be concluded.
  • An external magnetic field is preferably applied before the signal of the probe is determined.
  • the magnetic and / or magnetizable probes are preferably magnetic and / or magnetizable particles.
  • Magnetic particles are particularly preferably used.
  • Superparamagnetic particles are very particularly preferably used.
  • a change in the giant magnetoimpedance signal is preferably determined with the aid of the detector, in particular with respect to at least one reference sensor.
  • the magnetic or magnetizable probes in particular particles, if, for example, a magnetic polarizing field is applied, influence the latter and this influence can be demonstrated by a comparison measurement with a reference sensor that is located in an environment without probes.
  • a possible embodiment of a sedimentation process can be described as follows.
  • the first binding partner is provided with specific binding sites for the binding sites of the second binding partner.
  • the first binding partner is brought into contact with the second binding partner.
  • the result of this are selective binding events between the respective first and second binding partners.
  • the selective binding sites of the first and second binding partners can be located inside or on the surface of the binding partners. They are preferably located on the surface of the binding partner. It is further preferred that both the first and the second binding partner are in dissolved or suspended form.
  • the first and / or the second binding partner can contain the magnetic and / or magnetizable probe. Sediment the complexes formed in this way from the first and second binding partners, preferably by centrifuging, onto the Sensor surface and are enriched there.
  • For the specific determination of the concentration of the first binding partner only a single second binding partner is used, which is capable of selective binding to a specific first binding partner.
  • an example of this type of assay is the chemical hybridization between an antigen (first binding partner) and an antibody (second binding partner).
  • the antigen may have the probe to be detected.
  • reactions between other macro molecules and a bond-specific magnetic probe can also be considered.
  • An example of this is the reaction between hormones and the corresponding receptors.
  • the sedimentation method according to the invention uses a short piece of wire or a short linear thin layer system. It is particularly advantageous that the sensors for measuring the giant magneto-impedance effect are already in place before the sedimentation process, i.e. can also be in the sedimentation vessel during centrifugation. This enables comparative measurements to be carried out at the same time and thus considerably simplifies the test procedure.
  • a second sensor is used, for example, which is surrounded on the surface with a protective cover, which keeps the sedimenting complexes further away than the sensor without this protective cover.
  • sensors by electrical taps in several sensor elements can be divided into question.
  • This method enables, for example, the selective qualitative and / or quantitative determination of a diagnostic analyte, such as proteins, peptides, hormones, carbohydrates or nucleic acids.
  • a diagnostic analyte such as proteins, peptides, hormones, carbohydrates or nucleic acids.
  • different amounts of sedimenting complexes are formed, for example, and this results in a different giant magnetoimpedance signal.
  • the method according to the invention can be used to carry out a large number of assays which contain a selective binding to the sensor surface. As mentioned above, these assays are referred to as sensor surface attachment methods.
  • An example of the selective binding to the sensor surface is the simple binding assay described below.
  • this assay there is a bond between a dissolved or suspended first binding partner, which comprises a magnetic probe, and a second binding partner, which is stationary connected to the sensor surface.
  • a first binding partner which comprises a magnetic probe
  • a second binding partner which is stationary connected to the sensor surface.
  • This is, for example, the antigen-antibody hybridization between an antibody that is located, for example, on the surface of a magnetic particle and an antigen that is covalently connected to the sensor surface.
  • the reverse arrangement of antibodies and antigens is also possible.
  • the magnetic probes in particular particles, can be deposited as described above, for example by chemical hybridization on the surface of the sensors or sensor elements.
  • the first and second binding partners can also be selected in a manner other than by chemical hybridization.
  • Selection mechanisms are electrophoresis and / or the structuring of the sensor surface and / or the application of electrical, magnetic or electromagnetic fields. Combinations of the individual selection processes are also desirable and can increase the selectivity of the process.
  • the selective attachment of the probes to the sensor is preferably supported by electrical fields and / or inhomogeneous magnetic fields.
  • the structuring of the sensor surface can take place, for example, by pore formation, in which a selection of the binding partners can take place by the choice of the diameter of the pores or indentations.
  • the structuring of the surface by pore formation can also be used to enlarge the surface available for binding events.
  • binding sites can also be located in the pores.
  • the antibody / antigen hybridization can also take place in the magnetic probes and / or on molecules adsorbed on or in the sensor surface or on another carrier material. Combinations of the options described above are also possible.
  • the method according to the invention for examining biological and / or chemical samples, in particular for determining the binding between binding partners comprises the following steps: a) providing a detector for measuring magnetic parameters, b) providing at least one binding binding partner , at least one binding second binding partner and at least at least one binding third binding partner, the first and / or the third binding partner comprising at least one magnetic and / or magnetizable probe and the first binding partner and the third binding partner competing for binding to the second binding partner, c) determining at least one signal of the Probe,
  • the giant magnetoimpedance signal of the probe is determined by at least one magnetism-sensitive sensor of the detector.
  • An external magnetic field is preferably applied before the signal of the probe is determined.
  • first and third binding partners may be desirable to insert an incubation step of the first or third binding partner with the second binding partner. This is particularly desirable if the first and third binding partners have clearly different affinities with respect to the second binding partner.
  • a binding first binding partner and a second binding partner capable of selective binding to the first binding partner are provided. Selective formation of complexes occurs, comprising the first and second binding partners.
  • the first and the third binding partner can be dissolved or suspended. It is preferred that the second binding partner is applied stationary on a surface, preferably the sensor surface.
  • the sensors or sensor elements are preferably introduced into the assay vessel at the beginning of the assay, ie before the first and second binding partners are provided.
  • the complexes formed from the first and second binding partners are then brought into contact with the third binding partner, which is also capable of binding with respect to the second binding partner.
  • the third binding partner preferably comprises a magnetic probe.
  • the first binding partner is displaced to different extents from the sensor surface and thus a change in the giant magnetoimpedance signal.
  • the amount of magnetic probes bound to the sensor surface after displacement is dependent on the binding ability of the third in comparison to the first binding partner.
  • the third binding partner is, for example, synthetic and / or natural substances with potential biological activity and / or pharmaceutical activity, which are bound to the surface of magnetic particles and which are capable of selective binding to the binding sites on the sensor surface.
  • the first binding partner preferably comprises a magnetic probe, while the third binding partner does not have a probe.
  • the first binding partner and the third binding partner are preferably in dissolved or suspended form and the second binding partner is stationary.
  • the second binding partner is preferably attached to the sensor surface.
  • the second binding partner is brought into contact with a probe-labeled first binding partner with specific binding sites for the second binding partner at the start of the assay.
  • the result of this are selective binding events of the first binding partner to the second binding partner.
  • the system is then brought into contact with the third binding partner.
  • it depends from the third binding partner to a differently pronounced displacement of the first binding partner from the second binding partner, for example from the binding sites on the sensor surface and thus to a change in the giant magnetoimpedance signal.
  • the amount of the first binding partner still bound to the sensor surface after displacement is dependent on the concentration and the binding ability of the third binding partner.
  • Examples of competitive assay methods include those for the determination of estradiol or progesterone.
  • sandwich assays in particular immunological sand assays. more assays.
  • These sandwich assays preferably include the following steps:
  • a) providing a detector for measuring magnetic parameters b) providing at least one binding first binding partner, this binding partner being capable of selectively binding to the second binding partner, c) providing at least one binding second binding partner, this binding partner being able to selectively bind to the first and third binding partner is capable, d) providing at least one binding binding third binding partner, this binding partner being capable of selective binding to the second binding partner and wherein the first and / or second binding partner comprising at least one magnetic and / or magnetizable probe, e) Bringing the binding partners into contact to form complexes in which the second binding partner is bound to both the first and the third binding partner, f) determining at least one signal from the probe,
  • the giant magnetoimpedance signal of the probe is determined by at least one magnetism-sensitive sensor of the detector.
  • An external magnetic field is preferably applied before the signal of the probe is determined.
  • the first binding partner and the second binding partner are preferably present in dissolved or suspended form and the third binding partner is stationary on the sensor surface. In this case it is a. Sensor surface attachment assay. In a further preferred embodiment, all binding partners are present in dissolved or suspended form and sedimentation takes place on the sensor surface for measuring the giant magnetoimpedance signal. This would correspond to a sedimentation assay.
  • the first binding partner preferably comprises the magnetic or magnetizable probe.
  • the first binding partner particularly preferably comprises a magnetic probe, in particular a magnetic particle.
  • the species to be analyzed for example an antigen (second binding partner) is bound by two different antibodies (first and third binding partners).
  • first and third binding partners are bound by two different antibodies (first and third binding partners).
  • the sandwich assay is referred to as an immunological sandwich assay.
  • the second binding partner has a higher affinity for the first or third binding partner and thus first binds to it with the formation of a complex before this complex comes into contact with the remaining binding partner.
  • the first antibody preferably comprises a magnetic probe, in particular a magnetic particle, on the surface of which the antibody is attached.
  • the first antibody and the antigen are preferably in dissolved or suspended form.
  • the second antibody is preferably bound stationary on the sensor surface.
  • the second antibody is particularly preferably bound covalently to the sensor surface.
  • the species to be analyzed in this case antigens, bind to the second antibody on the sensor surface and are thus immobilized to form a complex.
  • This complex then binds to the first antibody, which comprises the magnetic probes, with Bil-. fertilizing a sandwich arrangement.
  • the binding of the first antibody to the immobilized antigen leads to a change in the giant magnetoimpedance signal.
  • Concentration in a sample is to be detected.
  • concentration in a sample for example serum
  • the antigen to be analyzed first binds to the first antibody and only this complex to the second antibody.
  • Other non-immunological sandwich assays are also possible. These sandwich processes are suitable for larger species, especially macromolecules. Sandwich assays for hCG (human chorionic gonadotropin) or TSH (thyroid hormone) are particularly interesting.
  • the giant magnetoimpedance signal of the probe is determined by at least one magnetism-sensitive sensor of the detector.
  • an external one is preferably used.
  • Magnetic probes in particular magnetic particles, are preferably used in this method.
  • the binding partners are preferably on the surface of the magnetic particles. Further preferred embodiments have been described above.
  • the individual GMI sensor preferably consists of a homogeneous ferromagnetic wire, of a wire consisting of different layers, of a thin magnetic layer or a thin layer system which contains one or more ferromagnetic layers and / or one or more highly conductive layers.
  • the sensor can be based on the giant magnetoimpedance in the form of a piece of wire with a diameter in the ⁇ m range or a similarly constructed thin layer.
  • the wire preferably has a diameter of approximately 10-100 ⁇ m and a length of approximately 0.1-10 mm, preferably 0.5-10 mm.
  • the thin layer system has a length of approximately 0.1-10 mm, preferably 0.5-10 mm. It preferably comprises layers of Cu conductors and magnetic layers.
  • a protective layer made of Au is preferably applied to the wire or the thin-layer system.
  • a sensor can be divided into different sensor elements by electrical taps, which enable the individual sensor elements to be read out separately.
  • This structure can be realized using a wire as well as a thin-film system.
  • Individual sensor elements created in this way can be coated with different second binding partners, for example antibodies, which react to different first binding partners, for example antigens. In this way, simultaneous or sequential analysis of different binding partners is possible.
  • individual sensor elements can also be uncoated or have a coating that prevents the probes from attaching. This simultaneous execution of comparison measurements enables a large number of measurements to be carried out quickly.
  • the invention described here also relates to devices for the analysis of small amounts of substance.
  • a magnetism-sensitive sensor is used which is many times more sensitive to magnetic fields than that in US Pat. No. 5,981,297 or US Pat. No. 6,110,660 used.
  • the devices according to the invention comprise the sensor on the basis of the giant magnetoimpedance as described above in the form of a piece of wire with a diameter in the ⁇ m range or a similarly constructed thin layer.
  • This sensor also has other positive properties that benefit the analysis method according to the invention. It can either consist of only one component or of annular or planar layers.
  • the following table shows a comparison of important parameters of the GMR sensor type with the (G) MI-based sensor type according to the invention.
  • the sensitivity to external magnetic fields is up to approx. 100 times higher than with GMR sensors, the detection limit for external magnetic fields is up to 10 5 times lower than with GMR sensors (see table).
  • the signal emitted by the sensor also depends on the magnetic properties of the environment or near-surface components of the sensor, eg the shape of the hysteresis curve.
  • the magnetic particles have a molecular dimension close to the surface or are alternatively even built into it (structured surface) and therefore take part in the physical processes of the sensor. They therefore influence the hysteresis curve. This is the size of the Magnetoimpedance effect, so that the signal emitted by the sensor is influenced in this way by the magnetic probes, in particular particles, on the surface or in its surface layer.
  • a reaction of a GMI sensor to the application of a ferrofluid liquid with magnetite particles
  • the harmonic spectrum also changes when magnetic particles are applied.
  • the GMI-based sensor type is significantly more robust against chemical influences (the analytes are corrosion-promoting solutions) than the GMR-based sensor type, since the thickness of the GMI sensors is in the ⁇ m range, while the active layers of the GMR sensors are only a few nm are thick. A change in the layer thickness of the GMR sensor due to corrosion would have fatal consequences on its characteristics. Therefore, it is a very reliable one. Protective layer on the GMR sensor necessary. In contrast, with the GMI sensor, a reduction in layer thickness due to chemical influences of the analyte has a significantly less effect on the sensor characteristics. With the GMI sensor, there are therefore only few demands placed on such a protective layer, or under certain circumstances this can be completely eliminated. It can therefore be expected that the manufacturing costs of a GMI sensor or detector are significantly lower than those of a GMR sensor or detector.
  • a three-phase current measuring circuit or other compensation methods can also be used in the devices according to the invention.
  • this offers the advantage that two of the sensors are available for the comparison measurement.
  • the analyte is advantageously applied to the middle of the three strips (sensors).
  • a device for highly sensitive analysis of marked macromolecules which is characterized by one or more magnetism-sensitive sensors, the shape of an individual Sensor is a short piece of wire or a corresponding thin layer which (based on the giant magnetoimpedance effect) emits a signal which depends on the concentration of the magnetic probes, comprising magnetic probes, in particular magnetic particles, which combine with the macromolecules to be analyzed , namely by means of selective coupling mechanisms for the magnetic probes to the magnetism-sensitive sensors, electrical connection elements, evaluation electronics, and - a coating with a layer that simultaneously improves the analytical properties (particle binding, GMI effect size) and protects against corrosion.
  • the device preferably also contains a device for generating an external magnetic field.
  • the signal is not proportional to the concentration of the probe.
  • Not proportional in the sense of the invention means not linearly proportional, i.e. the measured signal does not have to be linearly dependent on the concentration of the probe. Any other functional connection is also possible.
  • the concentration of the probe depends on the number of probes.
  • the invention provides a device for examining biological and / or chemical samples that is very well suited for carrying out the method according to the invention.
  • This device is characterized by at least one magnetism-sensitive sensor, the shape of a single sensor being a short piece of wire or a corresponding thin layer which, based on the giant magnetoimpedance effect, emits a signal which depends on the concentration of the magnetic and / or magnetisable probes depends comprehensively at least one magnetic and / or magnetizable probe, which can be bound to different binding partners by means of selective binding mechanisms, electrical connecting elements, and - evaluation electronics.
  • the device preferably also contains a device for generating an external magnetic field.
  • the sensor is preferably provided with a coating which at the same time improves the analytical properties, for example probe binding and GMI effect size, and protects against corrosion.
  • the magnetic and / or magnetizable probes are preferably magnetic particles, in particular superparamagnetic particles.
  • the sensors are divided into different sensor elements.
  • the sensors or sensor elements can additionally be provided with a protective cover which keeps the magnetic probes further away than those without a protective cover.
  • different binding partners can be applied to different sensors or sensor elements in a sample or these can be uncoated.
  • devices can also be provided which enable electrophoresis or the application of electrical, magnetic or electromagnetic fields. Because of the small diameter of the wire or the small width of the layer sensor, a very strong inhomogeneous field arises in the vicinity of the wire, which can be used for analytical purposes.
  • the electronic evaluation circuits used in the devices according to the invention include, for example:
  • Fig. 9 compensation circuit for comparing the GMI values of a. a superparamagnetic probe and an unoccupied sensor.
  • the devices according to the invention include the sensor on the basis of the giant magnetoimpedance, which can be in the form of a piece of wire with a diameter in the ⁇ m range or a similarly constructed thin layer.
  • the wire preferably has a diameter of approximately 10-100 ⁇ m and a length of approximately 0.1-10 mm, preferably 0.5-10 mm.
  • the thin layer system has a length of approximately 0.1-10 mm, preferably 0.5-10 mm. It preferably comprises layers of Cu conductors and magnetic layers.
  • a protective layer made of Au is preferably applied to the wire or the thin-layer system.
  • FIG. 2 shows that the magnetic or magnetizable probes, in particular particles, influence the latter if a magnetic polarizing field is applied. This influence can be demonstrated by a comparison measurement with a reference sensor that is located in an environment without probes. In this case, the probes selectively bind to binding sites on the sensor surface (FIG. 2B)).
  • FIG. 2B shows the reaction of a GMI sensor to the application of a ferrofluid (liquid with magnetite particles).
  • FIG. 5 shows an analysis by sedimentation of the magnetic probes on the sensor surface.
  • a sensor can, for example, be divided into different sensor elements by electrical taps, which enable the individual sensor elements to be read out separately.
  • This structure can be realized using a wire as well as a thin-film system.
  • the magnetically marked molecules can be bound directly to the sensor element.
  • a further possibility is the formation of a complex of both binding partners in the liquid phase, the complex then being sedimented onto the sensor surface.
  • FIG. 6 shows that individual sensor elements created in this way are coated with different binding partners (adhesive molecules), for example antibodies, which react selectively with other binding partners, for example antigens.
  • binding partners for example antibodies
  • individual sensor elements can also be uncoated.
  • Figure 8 shows an inhomogeneous field when the wire itself is one of the poles (both electrical and magnetic).
  • 9 shows a compensation circuit for comparing the GMI values of a sensor occupied by a superparamagnetic probe and an unassigned sensor.

Abstract

Eine mögliche Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen ersten Bindungspartners in einem Probengefäß, c) Inkontaktbringen des ersten Bindungspartners mit mindestens einem zur selektiven Bindung an den ersten Bindungspartner fähigen zweiten Bindungspartner, wobei der erste und/oder der zweite Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare Sonde umfasst, und d) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde, wobei e) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung biologischer und /oder chemischer Proben mittels Giant-Magnetoimpedanz (GMI)
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung biologischer und/oder chemischer Proben mittels Giant-Magnetoimpedanz (GMI). Insbesondere betrifft sie Giant-Magnetoimpedanz (GMI)-Immuno- assays. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen eignen sich sehr gut für die Diagnostik und die Suche nach biologisch aktiven und/oder pharmazeutisch wirksamen Verbindungen.
Die Analytik biologisch, medizinisch oder chemisch interessanter Moleküle, insbesondere Makromoleküle, ist eine Grundlage der modernen Biotechnologie, der Medizin, der Lebensmittelchemie und der Urinweltforschung. Diese Moleküle sind in den zu untersuchenden Proben häufig in sehr geringen Konzentrationen vorhanden und verlangen die Verwendung von höchstempfindlichen Analyseverfahren. Beispielsweise kann mit Hilfe der Bindung von Makromolekülen (z.B. Proteine, Nukleinsäuren, Hormone) an komplementäre Partner (z.B. Antigen-Antikörper Hybridisierungen), die sich an geeigneten Sonden befinden, über die Analytik der Sonden eine Analytik der Makromoleküle durchgeführt werden.
Die medizinische Diagnostik der Körperflüssigkeiten, insbesondere des Serums, ist von großer wirtschaftlicher und medizinischer Bedeutung. Der Kostendruck für die Entwicklung von geeigneten diagnostischen Testsystemen hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Erforderlich ist somit die Entwicklung von kostengünstigen, zuverlässigen, hochempfindlichen und schnellen Systemen. Des Weiteren ist es von großem wirtschaftlichen Interesse, Substanzen zur Behandlung von Krankheiten zu finden, die direkt in die Signaltransduktions- prozesse der Zelle eingreifen. Beispielsweise eignen sich biologisch aktive und/oder pharmazeutisch wirksame Substanzen, die durch Bindung an einen Rezeptor, das von diesem ausgehende Signal verstärken (Agonisten) und/oder Substanzen, die durch Bindung an den Rezeptor die Signaltransduktion verringern oder blockieren (Antagonisten). In der Vergangenheit wurden solche biologisch aktiven und/oder pharmazeutisch wirksamen Substanzen in Bezug auf verschiedene Krankheiten entweder über die Veränderung natürlicher physio- logischer Prozesse durch aufwendiges Testen von Naturstoff extra kten und synthetischen Substanzen oder aber rein zufällig entdeckt. In den letzten Jahren ist das Interesse der pharmazeutischen Industrie stets gewachsen, Technologien für die hocheffektive Suche nach biologisch aktiven und/oder pharmazeutisch wirksamen Substanzen zu entwickeln. Dabei steht es im Vor- dergrund, Systeme für die effiziente Durchmusterung großer Mengen natürlicher oder synthetischer Substanzen in kurzer Zeit und mit hoher Verlässlich- keit zu entwickeln. Erhältlich sind die großen Mengen an synthetischen Substanzen u.a. durch die mittels kombinatorischer Chemie hergestellten Substanzdatenbanken. Man bezeichnet solche Technologien zur hocheffektiven Suche nach biologisch aktiven und/oder pharmazeutisch wirksamen Verbindungen auch als Hochdurchsatzscreening-Technologien.
Sowohl in der medizinischen Diagnostik als auch in den Hochdurchsatz- screening-Technologien werden unterschiedliche Verfahren eingesetzt, die bei- spielsweise auf der Verwendung von radioaktiven, fluoreszenten, chemolumi- neszenten, enzymatischen oder magnetischen Sonden basieren. Insbesondere die Verwendung von magnetischen Sonden hat in den letzten Jahren stark an Bedeutung zugenommen. Als magnetische Sonden eignen sich insbesondere magnetische Partikel. Die magnetischen Partikel können vorteilhaft mit Hilfe magnetischer Sensoren sehr empfindlich nachgewiesen werden. In der Literatur bzw. der Patentliteratur werden zwei Ansätze für die Detektion magnetischer Sonden beschrieben.
US 5,981,297 beschreibt die Detektion magnetisch markierter Moleküle in Probenlösungen mittels Magnetowiderstandssensoren, sogenannten GMR Sensoren. Dabei werden die zu bestimmenden Moleküle selektiv an die Sensoroberfläche angelagert. Eine Veränderung der Messwerte an den Magnetowiderstandssensoren ist ein Hinweis auf die Konzentration der zu bestimmenden Moleküle in den Proben.
US 6,110,660 beschreibt einen Permeabilitätssensor zur Durchführung von Induktionsmessungen mittels einer Spule. Untersucht werden sedimentierende magnetisch markierte Moleküle unter Verwendung einer Wechselstrombrückenschaltung zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit. Gemessen wird die Induktivitätsänderung einer relativ großen Spule beim Einbringen des Sedimentes.
Allerdings sind diese Verfahren für Probenlösungen mit Analyten in sehr niedrigen Konzentrationen aufgrund schlechter Nachweisgrenzen nur bedingt oder gar nicht geeignet. Des Weiteren sind die verwendeten Sensoren wenig robust und insbesondere sehr empfindlich in Bezug auf chemische Einflüsse durch die Probenlösungen.
In der Literatur, beispielsweise bei K. Mohri et al., Sensors and Actuators A 59, 1, 1997, wird die Anwendung eines Giant-Magnetoimpedanz (GMI) Sensors zum Nachweis eines einige mm vom Sensor entfernten unspezifizierten : ' Magnetitpartikel-Clusters beschrieben.
Obwohl der Giant-Magnetoimpedanzeffekt an sich bekannt und in physikalisch- materialwissenschaftlich orientierten Anwendungen von Bedeutung ist, erfolgte bisher keine Nutzung in anderen Anwendungsgebieten, beispielsweise der
Untersuchung von biologischen und/oder chemischen Proben. Es gibt mehrere Veröffentlichungen, beispielsweise Baselt et al., Biosensors & Bioelectronics 13, 731, 1998; Panina und Mohri, Appl. Phys. Lett., 65, 1189, 1994; Mohri et al., Sensors and Actuators A 59, 1, 1997; Larson et al., Analusis 27, 617, 1999; oder Edelstein et al., Biosensors & Bioelectronics 14, 805, 2000, die die Methoden der Patente US 5,981,297 und US 6,110,660 und alternative Senso- rikmethoden auflisten. Die eingeschränkte Verwendung von GMI Sensoren ist auch darauf zurückzuführen, dass die Impedanz verschiedene Effekte bewirkt, die zunächst relativ unklar sind. Beispielsweise bestimmt die Impedanz die Leistung, die in einem solchen Untersuchungssystem umgesetzt wird. Dabei sind Scheinleistung, Blindleistung und Wirkleistung zu unterscheiden, die in komplizierter Weise von dem Wert der Impedanz abhängen. Eine Verwendung des GMI-Effektes bei der Untersuchung biologischer und/oder chemischer Proben erscheint somit nicht sinnvoll, da bereits andere Verfahren auf der Basis, von magnetischen Sonden zur Verfügung stehen, die bereits vollständig ver- standen und als Routine-Methoden anwendbar sind.
Unter Berücksichtigung der vorstehend beschriebenen Nachteile des Standes der Technik, ist es Aufgabe der Erfindung, verbesserte Verfahren und Vorrichtungen zur Untersuchung von biologischen und/oder chemischen Proben zur Verfügung zu stellen, wobei eine hochempfindliche, spezifische, effektive, kostengünstige und zuverlässige Bestimmung von Analyten möglich sein muss.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Untersuchung von biologischen und/oder chemischen Proben werden vorzugsweise für Bindungsassays ver- wendet. Bindungsassays, wie beispielsweise Immunoassays, sind in der Biotechnologie und der medizinischen Diagnostik weit verbreitet. Sie nutzen die Fähigkeit von bestimmten bindungsfähigen Molekülen, insbesondere Makromolekülen, aus, spezifisch an bestimmte Bindungsstellen zu binden. Dies ermöglicht die Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren in der medizini- sehen Diagnostik und zur Suche nach biologisch aktiven und/oder pharmazeutisch wirksamen Substanzen. Unterschiedliche Typen von Bindungsassays können mit den erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise handelt es sich dabei um Sedimentierungsverfahren oder Sensoroberflächenanlagerungs-Verfahren.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch die Verfahren gemäß den Ansprüchen 1, 17, 18 und 33 bzw. einem Gerät gemäß Anspruch 30. Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Eine mögliche Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen ersten Bindungspartners in einem Probengefäß, c) Inkontaktbringen des ersten Bindungspartners mit mindestens einem zur selektiven Bindung an den ersten Bindungspartner fähigen zweiten Bindungspartner, wobei der erste und/oder der zweite Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare Sonde umfasst und d) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, dass
e) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.
Bei dem mindestens einen Sensor handelt es sich um einen Giant-Magnetoim- pedanz-Sensor, der die mindestens eine Sonde mit größtmöglicher Empfindlichkeit sensiert. Die Sonde verändert das Giant-Magnetoimpedanzsignal des Sensors, was messtechnisch erfassbar ist und woraus auf die Detektion der Sonde geschlossen werden kann. Vor der Bestimmung des Signals der Sonde wird vorzugsweise ein externes Magnetfeld angelegt.
Vorzugsweise handelt es sich bei den magnetischen und/oder magnetisierba- ren Sonden um magnetische und/oder magnetisierbare Partikel. Besonders bevorzugt werden magnetische Partikel verwendet. Ganz besonders bevorzugt werden superparamagnetische Partikel eingesetzt.
Vorzugsweise wird mit Hilfe des Detektors eine Veränderung des Giant- Magnetoimpedanzsignals bestimmt, insbesondere in Bezug auf mindestens einen Referenzsensor.
Die magnetischen bzw. magnetisierbaren Sonden, insbesondere Partikel, sofern beispielsweise ein magnetisches Polarisierungsfeld angelegt wird, beein- flussen letzteres und dieser Einfluss kann durch eine Vergleichsmessung mit einem Referenzsensor, der sich in einer Umgebung ohne Sonden befindet, nachgewiesen werden.
Eine mögliche Ausführungsform eines Sedimentierungsverfahrens lässt sich wie folgt beschreiben. Bei diesem Assay wird der erste Bindungspartner mit spezifischen Bindungsstellen für die Bindungsstellen des zweiten Bindungspartners bereitgestellt. Der erste Bindungspartner wird mit dem zweiten Bindungspartner in Kontakt gebracht. Die Folge davon sind selektive Bindungsereignisse zwischen dem jeweiligen ersten und zweiten Bindungspartner. Die selektiven Bindungsstellen des ersten und zweiten Bindungspartners können sich im Inneren oder auf der Oberfläche der Bindungspartner befinden. Vorzugsweise befinden sie sich auf der Oberfläche der Bindungspartner. Es ist weiterhin bevorzugt, dass sowohl der erste als auch der zweite Bindungspartner in gelöster oder suspendierter Form vorliegen. Dabei kann der erste und/oder der zweite Bindungspartner die magnetische und/oder magnetisierbare Sonde enthalten. Die so gebildeten Komplexe aus den ersten und zweiten Bindungspartnern sedimentieren, vorzugsweise durch zentrifugieren, auf die Sensoroberfläche und werden dort angereichert. Zur gezielten Bestimmung der Konzentration des ersten Bindungspartners wird nur ein einziger zweiter Bindungspartner eingesetzt, der zur selektiven Bindung an einen bestimmten ersten Bindungspartner fähig ist.
Ein Beispiel für diesen Assay-Typ ist die chemische Hybridisierung zwischen einem Antigen (erster Bindungspartner) und einem Antikörper (zweiter Bindungspartner). Dabei kann beispielsweise das Antigen die zu detektierende Sonde aufweisen. Es können aber auch Reaktionen zwischen anderen Makro- molekülen und einer bindungsspezifischen magnetischen Sonde betrachtet werden. Ein Beispiel dafür ist die Reaktion zwischen Hormonen und den entsprechenden Rezeptoren.
Das erfindungsgemäße Sedimentierungsverfahren verwendet im Gegensatz zu den bereits im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, die beispielsweise auf Induktionsmessungen an einer konventionellen Drahtspule beruhen, ein kurzes Drahtstück oder ein kurzes lineares dünnes Schichtsystem. Besonders vorteilhaft ist, dass sich die Sensoren zur Messung des Giant-Magnetoimpe- danzeffektes bereits vor dem Sedimentierungsvorgang, d.h. auch während der Zentrifugierung im Sedimentierungsgefäß befinden können. Dies ermöglicht die gleichzeitige Durchführung von Vergleichsmessungen und vereinfacht so die Versuchsdurchführung erheblich. Für die Vergleichsmessung wird neben einem ersten Sensor beispielsweise ein zweiter Sensor benutzt, der auf der Oberfläche mit einer Schutzhülle umgeben ist, die die sedimentierenden Kom- plexe weiter entfernt hält als der Sensor ohne diese Schutzhülle. In diesem Fall detektiert nur der Sensor ohne Schutzhülle die sedimentierten Komplexe. Auf diesem Weg ist eine instantane Vergleichsmessung eines Sensors mit benachbarten magnetischen Sonden und eines Sensors ohne diese Sonden möglich, so dass es im Vergleich zum Stand der Technik zu einer deutlichen Zeiterspar- nis kommt. Im erfindungsgemäßen Sinne kommen separate Sensoren oder
Mehrfachsensoren, die durch elektrische Abgriffe in mehrere Sensorelemente unterteilt werden können, in Frage. Vorzugsweise werden zwei Sensoren oder ein Sensor mit zwei separierten Sensorelementen verwendet.
Dieses Verfahren ermöglicht beispielsweise die selektive qualitative und/oder quantitative Bestimmung eines diagnostischen Analyten, wie beispielsweise Proteinen, Peptiden, Hormonen, Kohlenhydraten oder Nukleinsäuren. In Abhängigkeit von der Konzentration der Analyten in der Lösung bilden sich beispielsweise unterschiedliche Mengen an sedimentierenden Komplexen und es kommt somit zu einem unterschiedlichen Giant-Magnetoimpedanzsignal.
Des Weiteren lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Vielzahl von Assays durchführen, die eine selektive Bindung an die Sensoroberfläche beinhalten. Man bezeichnet diese Assays wie vorstehend erwähnt als Sensor- oberflächenanlagerungs-Verfahren.
Ein Beispiel für die selektive Bindung an die Sensoroberfläche ist der im Folgenden beschriebene einfache Bindungsassay. Bei diesem Assay kommt es zu einer Bindung zwischen einem gelösten oder suspendierten ersten Bindungspartner, der eine magnetische Sonde umfasst, und einem zweiten Bindungs- partner, der stationär mit der Sensoroberfläche verbunden ist. Dabei handelt es sich beispielsweise um die Antigen-Antikörper-Hybridisierung zwischen einem Antikörper, der sich beispielsweise auf der Oberfläche eines magnetischen Partikels befindet und einem Antigen, das kovalent mit der Sensoroberfläche verbunden ist. Auch die umgekehrte Anordnung von Antikörper und An- tigen ist möglich.
Die Anlagerung der magnetischen Sonden, insbesondere Partikel, kann wie vorstehend beschrieben, beispielsweise durch chemische Hybridisierung an der Oberfläche der Sensoren bzw. Sensorelemente erfolgen.
Die Selektion der ersten und zweiten Bindungspartner kann auch auf andere Art und Weise als durch chemische Hybridisierung erfolgen. Beispiele der Selektionsmechanismen sind die Elektrophorese und/oder die Strukturierung der Sensoroberfläche und/oder das Anlegen elektrischer, magnetischer oder elektromagnetischer Felder. Kombinationen der einzelnen Selektionsverfahren sind ebenfalls erwünscht und können die Selektivität des Verfahrens erhöhen. Vorzugsweise erfolgt eine Unterstützung der selektiven Anlagerung der Sonden an den Sensor durch elektrische Felder und/oder inhomogene magnetische Felder.
Die Strukturierung der Sensoroberfläche kann beispielsweise durch Porenbil- düng erfolgen, bei der durch die Wahl des Durchmessers der Poren bzw. Einbuchtungen eine Selektion der Bindungspartner erfolgen kann. Die Strukturierung der Oberfläche durch Porenbildung kann auch zur Vergrößerung der für Bindungsereignisse zur Verfügung stehenden Oberfläche verwendet werden.. Des Weiteren können sich auch in den Poren Bindungsstellen befinden.
Die Antikörper/Antigen Hybridisierung kann auch in den magnetischen Sonden und/oder auf oder in der Sensoroberfläche oder auf einem anderen Trägermaterial adsorbierten Molekülen erfolgen. Kombinationen der vorstehend beschriebenen Möglichkeiten sind ebenfalls möglich.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren können auch kompetitive Assays durchgeführt werden. Ein Beispiel für einen kompetitiven Assay wird im Folgenden beschrieben. Bei den kompetitiven Assayverfahren werden beispielsweise kompetitive Bindungs- oder Dissoziationsassays unterschieden.
Im Falle der kompetitiven Assays umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung von biologischen und/oder chemischen Proben, insbesondere zur Bestimmung der Bindung zwischen Bindungspartnern, die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen ersten Bindungspartners, mindestens eines bindungsfähigen zweiten Bindungspartners und minde- stens eines bindungsfähigen dritten Bindungspartners, wobei der erste und/oder der dritte Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare Sonde umfasst und der erste Bindungspartner und der dritte Bindungspartner um die Bindung an den zweiten Bindungs- partner konkurrieren, c) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, dass
d) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.
Vor der Bestimmung des Signals der Sonde wird vorzugsweise ein externes Magnetfeld angelegt.
Generell kann es wünschenswert sein, einen Inkubationsschritt des ersten oder dritten Bindungspartners mit dem zweiten Bindungspartner einzufügen. Dies ist insbesondere wünschenswert, wenn die ersten und dritten Bindungspartner deutlich unterschiedliche Affinitäten in Bezug auf den zweiten Bin- dungspartner aufweisen.
Eine Ausführungsform von kompetitiven Sensoroberflächenanlagerungs-Assays kann wie folgt beschrieben werden. Zu Beginn des Assays wird ein bindungsfähiger erster Bindungspartner und ein zur selektiven Bindung an den ersten Bindungspartner fähiger zweiter Bindungspartner bereitgestellt. Es kommt zur selektiven Bildung von Komplexen, umfassend den ersten und zweiten Bindungspartner. Der erste und der dritte Bindungspartner können dabei gelöst oder suspendiert vorkommen. Dabei ist es bevorzugt, dass der zweite Bindungspartner stationär auf einer Oberfläche, vorzugsweise der Sensorober- fläche, aufgebracht ist. Bei diesen Assays werden die Sensoren oder Sensorelemente vorzugsweise bereits zu Beginn des Assays, d.h. vor dem Bereitstellen des ersten und zweiten Bindungspartners, in das Assaygefäß eingebracht. Anschließend werden die aus dem ersten und zweiten Bindungspartner gebildeten Komplexe mit dem dritten Bindungspartner in Kontakt gebracht, der ebenfalls bindungsfähig in Bezug auf den zweiten Bindungspartner ist. In dieser Ausführungsform umfasst der dritte Bindungspartner vorzugsweise eine magnetische Sonde. Im Folgenden kommt es in Abhängigkeit von dem in der Probenlösung enthaltenen dritten Bindungspartner zu einer unterschiedlich stark ausgeprägten Verdrängung des ersten Bindungspartners von der Sensoroberfläche und somit zu einer Veränderung des Giant-Magnetoimpedanz- signals. Beispielsweise ist die Menge der nach der Verdrängung an der Sen- soroberfläche gebundenen magnetischen Sonden abhängig von der Bindungsfähigkeit des dritten im Vergleich zum ersten Bindungspartner. Bei dem dritten Bindungspartner handelt es sich beispielsweise um synthetische und/oder natürliche Substanzen mit potentieller biologischer Aktivität und/oder pharmazeutischer Wirksamkeit, die an die Oberfläche von magnetischen Partikeln ge- bunden sind und die zur selektiven Bindung an die Bindungsstellen auf der Sensoroberfläche befähigt sind.
Eine weitere mögliche Assay-Form für kompetitive Sensoroberflächenanlage- rungs-Assays sind solche vom Dissoziationstyp. In dieser Ausführungsform umfasst der erste Bindungspartner vorzugsweise eine magnetische Sonde, während der dritte Bindungspartner keine Sonde aufweist. Vorzugsweise liegen in dieser Ausführungsform der erste Bindungspartner und der dritte Bindungspartner gelöst oder suspendiert vor und der zweite Bindungspartner ist stationär. Vorzugsweise ist der zweite Bindungspartner auf der Sensorober- fläche angebracht.
Bei diesen Assays wird der zweite Bindungspartner zu Beginn des Assays mit einem mit Sonden markierten ersten Bindungspartner mit spezifischen Bindungsstellen für den zweiten Bindungspartner in Kontakt gebracht. Die Folge davon sind selektive Bindungsereignisse des ersten Bindungspartners an den zweiten Bindungspartner. Anschließend wird das System mit dem dritten Bindungspartner in Kontakt gebracht. Im Folgenden kommt es in Abhängigkeit von dem dritten Bindungspartner zu einer unterschiedlich stark ausgeprägten Verdrängung des ersten Bindungspartners vom zweiten Bindungspartner, beispielsweise von den Bindungsstellen auf der Sensoroberfläche und somit zu einer Veränderung des Giant-Magnetoimpedanzsignals. Beispielsweise ist die Menge der nach der Verdrängung noch an der Sensoroberfläche gebundenen ersten Bindungspartner abhängig von der Konzentration und der Bindungsfähigkeit des dritten Bindungspartners.
Beispiele für kompetitive Assayverfahren umfassen solche zur Bestimmung von Estradiol oder Progesteron.
Weitere mögliche Anwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sogenannte Sandwich-Assays, insbesondere immunologische Sand-. wich-Assays.
Diese Sandwich-Assays umfassen vorzugsweise die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen ersten Bindungspartners, wobei dieser Bindungspartner zur selektiven Bindung an den zweiten Bindungspartner fähig ist, c) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen zweiten Bindungspartners, wobei dieser Bindungspartner zur selektiven Bindung an den ersten und dritten Bindungspartner fähig ist, d) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen dritten Bindungspartners, wobei dieser Bindungspartner zur selektiven Bindung an den zweiten Bindungspartner fähig ist und wobei der erste und/oder der zweite Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare Sonde umfasst, e) Inkontaktbringen der Bindungspartner unter Ausbildung von Komplexen bei denen der zweite Bindungspartner sowohl an den ersten als auch an den dritten Bindungspartner gebunden ist, f) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, dass
g) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.
Vor der Bestimmung des Signals der Sonde wird vorzugsweise ein externes Magnetfeld angelegt.
Vorzugsweise liegen der erste Bindungspartner und zweite Bindungspartner gelöst oder suspendiert vor und der dritte Bindungspartner ist stationär auf der Sensoroberfläche angebracht. In diesem Fall handelt es sich um einen. Sensoroberflächenanlagerungs-Assay. In einer weiteren bevorzugten Ausfüh- rungsform liegen alle Bindungspartner gelöst oder suspendiert vor und es erfolgt eine Sedimentation auf die Sensoroberfläche zur Messung des Giant- Magnetoimpedanzsignals. Diese Vorgehensweise würde einem Sedimenta- tionsassay entsprechen.
Vorzugsweise umfasst der erste Bindungspartner die magnetische oder magnetisierbare Sonde. Besonders bevorzugt umfasst der erste Bindungspartner eine magnetische Sonde, insbesondere einen magnetischen Partikel.
Beispielsweise wird in Sandwich-Assays die zu analysierende Spezies, bei- spielsweise ein Antigen (zweiter Bindungspartner), von zwei unterschiedlichen Antikörpern (erster und dritter Bindungspartner gebunden. In diesem Fall bezeichnet man den Sandwich-Assay als immunologischen Sandwich-Assay.
Der Fall ist möglich, dass der zweite Bindungspartner eine höhere Affinität zu dem ersten oder dritten Bindungspartner aufweist und somit zuerst unter Ausbildung eines Komplexes an diesen bindet, bevor dieser Komplex mit dem verbliebenen Bindungspartner in Kontakt kommt. Bei einer Ausführungsform der immunologischen Sandwich-Assays umfasst vorzugsweise der erste Antikörper (der erste Bindungspartner) eine magnetische Sonde, insbesondere einen magnetischen Partikel auf dessen Oberfläche der Antikörper angebracht ist. Der erste Antikörper und das Antigen (der zweite Bindungspartner) liegen vorzugsweise gelöst oder suspendiert vor. In diesem Fall ist der zweite Antikörper (der dritte Bindungspartner) vorzugsweise stationär auf der Sensoroberfläche gebunden. Besonders bevorzugt erfolgt die Bindung des zweiten Antikörpers an der Sensoroberfläche kovalent. Beispielsweise binden die zu analysierenden Spezies, in diesem Fall Antigene, an die zweiten Antikörper auf die Sensoroberfläche und werden somit unter Ausbildung eines Komplexes immobilisiert. Anschließend bindet dieser Komplex an den ersten Antikörper, der die magnetischen Sonden umfasst, unter Bil-. düng einer Sandwich-Anordnung. Durch die Bindung des ersten Antikörpers an das immobilisierte Antigen kommt es zu einer Veränderung des Giant-Magnetoimpedanzsignals.
Als Ergebnis dieses Immunoassays bilden sich wie beschrieben Antigen-Anti- körperbindungen. Es ist nun beispielsweise die Aufgabe des erfindungsge- mäßen Verfahrens, die Zahl der gebundenen Antigene, die proportional ihrer
Konzentration in einer Probe ist, zu detektieren. Solche Verfahren sind insbesondere für diagnostische Anwendungen relevant, bei denen die Konzentration einer zu analysierenden Spezies in einer Probe, beispielsweise Serum, bestimmt werden soll.
Es ist weiterhin möglich, das das zu analysierende Antigen zunächst an den ersten Antikörper bindet und erst dieser Komplex an den zweiten Antikörper. Andere Sandwich-Assays auf nicht-immunologischer Basis sind ebenfalls möglich. Diese Sandwich-Verfahren eignen sich für größere Spezies, insbesondere Makromoleküle. Insbesondere interessant sind Sandwich-Assays für hCG (human chorionic go- nadotropin) oder TSH (Schilddrüsenhormon).
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Be- Stimmung der Bindung von Bindungspartnern umfasst die Schritte:
a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen von mindestens zwei bindungsfähigen Bindungspartnern, wobei mindestens ein Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare Sonde umfasst, c) Inkontaktbringen der Bindungspartner unter selektiver Bildung von Komplexen, d) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, dass
e) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.
Vor der Bestimmung des Signals der Sonde wird vorzugsweise ein externes
Magnetfeld angelegt.
Vorzugsweise werden in diesem Verfahren magnetische Sonden, insbesondere magnetische Partikel verwendet. Die Bindungspartner befinden sich vorzugs- weise auf der Oberfläche der magnetischen Partikel. Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind vorstehend beschrieben worden.
Der einzelne GMI Sensor besteht vorzugsweise aus einem homogenen ferro- magnetischen Draht, aus einem aus verschiedenen Schichten bestehendem Draht, aus einer dünnen magnetischen Schicht oder einem dünnen Schichtensystem, das eine oder mehrere ferromagnetische Schichten und/oder eine oder mehrere hochleitfähige Schichten enthält. Wie auch in Fig. 1 gezeigt, kann der Sensor auf der Basis der Giant-Magnetoimpedanz in der Form eines Drahtstückes mit Durchmesser im μm Bereich oder einer ähnlich aufgebauten dünnen Schicht vorliegen. Der Draht hat vorzugsweise einen Durchmesser von ca. 10-100 μm und eine Länge von ca. 0.1-10 mm, vorzugsweise 0.5-10 mm. Das Dünnschichtsystem hat eine Länge von ca. 0.1-10 mm, vorzugsweise 0.5- 10 mm. Es umfasst vorzugsweise Schichten aus Cu-Leitern und magnetischen Schichten. Vorzugsweise ist auf den Draht oder das Dünnschichtsystem eine Schutzschicht aus Au aufgebracht.
Ein Sensor kann wie vorstehend beschrieben durch elektrische Abgriffe in verschiedene Sensorelemente unterteilt werden, die ein separates Auslesen der einzelnen Sensorelemente ermöglichen. Diese Struktur kann sowohl bei der Verwendung eines Drahtes als auch eines Dünnschichtsystems realisiert werden. Einzelne so entstandene Sensorelemente können mit unterschiedlichen zweiten Bindungspartnern, beispielsweise Antikörpern, beschichtet werden, die auf unterschiedliche erste Bindungspartner, beispielsweise Antigene, reagieren. Auf diesem Weg ist die gleichzeitige oder sequentielle Analytik unterschiedlicher Bindungspartner möglich. Zur zeitgleichen Bestimmung von Referenzen können einzelne Sensorelemente auch unbeschichtet sein bzw. eine Beschichtung tragen, die die Anlagerung der Sonden verhindert. Diese zeitgleiche Durchführung von Vergleichsmessungen ermöglicht die schnelle Durchführung einer Vielzahl von Messungen.
Es entstehen Stabilitätsvorteile durch Benutzung eines einzelnen Sensors bzw. eines einzelnen Sensorelementes. Des Weiteren tritt eine Kostenersparnis auf, da beispielsweise nur ein HF-Stromgenerator erforderlich ist.
Die hier beschriebene Erfindung betrifft auch Vorrichtungen zur Analytik geringer Substanzmengen. Im Gegensatz zu den Vorrichtungen aus dem Stand der Technik (beispielsweise den Patenten US 5,981,297 und US 6,110,660), wird ein magnetismusempfindlicher Sensor benutzt, der um ein Vielfaches empfindlicher auf Magnetfelder reagiert als die in US 5,981,297 oder US 6,110,660 benutzten. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfassen den Sensor auf der Basis der Giant-Magnetoimpedanz wie vorstehend beschrieben in Form eines Drahtstückes mit Durchmesser im μm Bereich oder einer ähnlich aufgebauten dünnen Schicht. Dieser Sensor besitzt zusätzlich andere positive Eigenschaften, die der erfindungsgemäßen Analysemethode zugute kommen. Er kann entweder aus nur einer Komponente oder aus ringförmigen oder plana- ren Schichten bestehen. Die nachfolgende Tabelle zeigt einen Vergleich wichtiger Parameter des GMR Sensortyps mit dem erfindungsgemäßen (G)MI- basierten Sensortyp.
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Die Empfindlichkeit auf externe Magnetfelder ist bis zu ca. 100 mal höher als bei GMR Sensoren, die Nachweisgrenze für externe magnetische Felder bis zu 105 mal geringer als bei GMR Sensoren (siehe Tabelle).
Das vom Sensor abgegebene Signal hängt bei den GMI Sensoren auch von den magnetischen Eigenschaften der Umgebung oder oberflächennaher Bestandteile des Sensors ab, z.B. der Gestalt der Hysteresekurve. Die magnetischen Partikel sind auf molekularer Dimension nahe an der Oberfläche bzw. werden alternativ sogar in diese eingebaut (strukturierte Oberfläche) und nehmen daher Teil an den physikalischen Prozessen des Sensors. Sie beein- flussen daher die Hysteresekurve. Dieses ist die zu bestimmende Größe des Magnetoimpedanzeffektes, so dass das vom Sensor abgegebene Signal auf diese Weise von den magnetischen Sonden, insbesondere Partikeln, an der Oberfläche bzw. in seiner Oberflächenschicht beeinflusst wird. Es ist eine Reaktion eines GMI Sensors auf das Aufbringen eines Ferrofluids (Flüssigkeit mit Magnetitpartikeln) festzustellen. Auch das Oberwellenspektrum ändert sich beim Aufbringen magnetischer Partikel.
Zudem weist der GMI-basierte Sensortyp eine wesentlich größere Robustheit gegen chemische Einflüsse (die Analyten sind korrosionsfördemde Lösungen) auf als der GMR-basierte Sensortyp, da die Dicke der GMI Sensoren im μm- Bereich liegt, während die aktiven Schichten der GMR Sensoren nur wenige nm dick sind. Eine Schichtdickenveränderung des GMR Sensors durch Korrosion hätte fatale Folgen auf dessen Charakteristik. Daher ist eine sehr zuverlässige. Schutzschicht auf dem GMR Sensor notwendig. Beim GMI Sensor wirkt sich demgegenüber eine Schichtdickenverminderung durch chemische Einflüsse des Analyten ganz wesentlich weniger auf die Sensorcharakteristik aus. Beim GMI Sensor werden daher nur geringe Ansprüche an eine solche Schutzschicht gestellt bzw. diese kann unter Umständen ganz entfallen. Es ist daher zu erwarten, dass die Herstellungskosten eines GMI Sensors bzw. Detektors deutlich geringer sind als die eines GMR Sensors bzw. Detektors.
Anstelle der in den US Patenten US 5,981,297 und US 6,110,660 benutzten , Brückenschaltungen kann bei den erfindungsgemäßen Vorrichtungen auch eine Drehstrommessschaltung oder andere Kompensationsverfahren verwendet werden. Im Falle dreier Sensoren (Drehstromanordnung) bietet dies den Vorteil, dass zwei der Sensoren für die Vergleichsmessung zur Verfügung stehen. Dem mittleren der drei Streifen (Sensoren) wird vorteilhaft das Analyt appli- ziert.
Mit der Erfindung wird beispielsweise ein Gerät zur höchstempfindlichen Analytik markierter Makromoleküle geschaffen, das gekennzeichnet ist durch einen oder mehrere magnetismussensitive Sensoren, wobei die Form eines einzelnen Sensors ein kurzes Drahtstück oder eine entsprechende dünne Schicht ist, das (die) auf der Basis des Giant-Magnetoimpedanzeffektes ein Signal abgibt, das von der Konzentration der magnetischen Sonden abhängt, umfassend magnetische Sonden, insbesondere magnetischen Partikeln, die mit den zu analysierenden Makromolekülen kombinieren, und zwar mittels selektiver Ankoppelmechanismen für die magnetischen Sonden an die magnetismussensitiven Sensoren, elektrische Verbindungselementen, eine Auswerteelektronik, und - eine Beschichtung mit einer Schicht, die gleichzeitig die analytischen Eigenschaften (Partikelbindung, GMI Effekt-Größe) verbessert und vor Korrosion schützt.
Vorzugsweise enthält das Gerät auch eine Vorrichtung zur Erzeugung eines externen Magnetfeldes.
In der Regel ist das Signal nicht proportional zu der Konzentration der Sonde. Nicht proportional im erfindungsgemäßen Sinne bedeutet nicht linear proportional, d.h. das gemessene Signal muss nicht linear von der Konzentration der Sonde abhängig sein. Jeder andere funktionelle Zusammenhang ist ebenfalls möglich. Die Konzentration der Sonde ist abhängig von der Anzahl der Sonden.
Außerdem wird mit der Erfindung ein Gerät zur Untersuchung biologischer und/oder chemischer Proben geschaffen, dass sehr gut zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Dieses Gerät ist gekennzeichnet durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor, wobei die Form eines einzelnen Sensors ein kurzes Drahtstück oder eine entsprechende dünne Schicht ist, das (die) auf der Basis des Giant-Magnetoimpedanzeffektes ein Signal abgibt, das von der Konzentration der magnetischen und/oder magneti- sierbaren Sonden abhängt, umfassend mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbaren Sonde, die mittels selektiver Bindungsmechanismen an verschiedene Bindungspartner gebunden werden kann, elektrische Verbindungselemente, und - eine Auswerteelektronik.
Vorzugsweise enthält das Gerät auch eine Vorrichtung zur Erzeugung eines externen Magnetfeldes.
Der Sensor ist vorzugsweise mit einer Beschichtung versehen, die gleichzeitig die analytischen Eigenschaften, beispielsweise Sondenbindung und GMI Effekt- Größe, verbessert und vor Korrosion schützt.
Bei den magnetischen und/oder magnetisierbaren Sonden handelt es sich vor- zugsweise um magnetische Partikel, insbesondere superparamagnetische Partikel.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind die Sensoren in verschiedene Sensorelemente unterteilt. Des Weiteren können die Sensoren oder Sensorelemente zusätzlich mit einer Schutzhülle versehen werden, die die magnetischen Sonden weiter entfernt gehalten werden als bei denen ohne Schutzhülle.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen können auf verschiedenen Sen- soren oder Sensorelementen in einer Probe unterschiedliche Bindungspartner aufgebracht oder diese können unbeschichtet sein.
Zur Beeinflussung der Selektivität können auch Einrichtungen vorgesehen sein, die eine Elektrophorese oder das Anlegen von elektrischen, magnetischen oder elektromagnetischen Feldern ermöglichen. Wegen des geringen Durchmessers des Drahtes oder der geringen Breite des Schichtensensors entsteht ein sehr starkes inhomogenes Feld in der Umgebung des Drahtes, das zu analytischen Zwecken genutzt werden kann.
Die in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen verwendeten elektronische Auswerteschaltungen umfassen beispielsweise:
a) Mehrphasenschaltung Detektion der Sternpunktsspannungen zwischen Generatorsternpunkt und Sensorsternpunkt, b) Differenzmessung der GMI Signale (Fig. 9), c) Auswertung der Änderung des Frequenzspektrums (Fig. 4).
Nachfolgend wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 GMI Sensoren in Drahtform oder als Schichtsystem,
Fig. 2 Prinzip einer hier vorgeschlagenen Analytikmethode mittels eines
GMI-Sensors,
Fig. 3 Magnetfeldabhängigkeit der GMI Spannung an einem einkomponenti- gen GMI Draht, mit und ohne aufgebrachten Tropfen (drop) eines Ferrofluids,
Fig. 4 Frequenzspektrum der Spannung an einem GMI Draht, mit und ohne einem aufgebrachten Tropfen eines Ferrofluids,
Fig. 5 GMI basierte Analytik mittels Sedimentierung des magnetisch markierten Analyten, Fig. 6 Analytik mehrerer unterschiedlicher Substanzen durch Einteilung des Sensors in mehrere mit unterschiedlichen Haftmolekülen belegte Sensorelemente; zwecks Referenzmessung können auch einzelne Sensorelemente unbeschichtet sein,
Fig. 7 inhomogenes Feld in der Umgebung eines ferromagnetischen Drahtes nach Anlegen eines homogenen Feldes (http://physics. sfsu.edu/~tfox/jackson/np502/np502.html),
Fig. 8 inhomogenes Feld, wenn der Draht selbst einer der Pole ist (sowohl elektrisch als auch magnetisch),
Fig. 9 Kompensationsschaltung zum Vergleich der GMI Werte eines mit. einer superparamagnetischer Sonde belegten Sensors und eines un- belegten Sensors.
Wie in Fig. 1 gezeigt, umfassen die erfindungsgemäßen Vorrichtungen den Sensor auf der Basis der Giant-Magnetoimpedanz, der in Form eines Drahtstückes mit Durchmesser im μm Bereich oder einer ähnlich aufgebauten dün- nen Schicht vorliegen kann. Der Draht hat vorzugsweise einen Durchmesser von ca. 10-100 μm und eine Länge von ca. 0.1-10 mm, vorzugsweise 0.5-10 mm. Das Dünnschichtsystem hat eine Länge von ca. 0.1-10 mm, vorzugsweise 0.5-10 mm. Es umfasst vorzugsweise Schichten aus Cu-Leitern und magnetischen Schichten. Vorzugsweise ist auf den Draht oder das Dünnschichtsystem eine Schutzschicht aus Au aufgebracht.
Fig. 2 zeigt, dass die magnetischen bzw. magnetisierbaren Sonden, insbesondere Partikel, sofern ein magnetisches Polarisierungsfeld angelegt wird, letzteres beeinflussen. Dieser Einfluss kann durch eine Vergleichsmessung mit einem Referenzsensor, der sich in einer Umgebung ohne Sonden befindet, nachgewiesen werden. Die Sonden binden in diesem Fall selektiv an Bindungsstellen auf der Sensoroberfläche (Fig. 2 B)). Fig. 3 zeigt die Reaktion eines GMI Sensors auf das Aufbringen eines Ferrofluids (Flüssigkeit mit Magnetitpartikeln).
Fig. 4 zeigt die Veränderung des Oberwellenspektrums beim Aufbringen der Magnetitpartikel.
Fig. 5 zeigt die Durchführung einer Analytik durch Sedimentation der magnetischen Sonden auf die Sensoroberfläche. Ein Sensor kann beispielsweise durch elektrische Abgriffe in verschiedene Sensorelemente unterteilt werden, die ein separates Auslesen der einzelnen Sensorelemente ermöglichen. Diese Struktur kann sowohl durch die Verwendung eines Drahtes als auch eines Dünnschichtsystems realisiert werden. Dabei kann eine direkte Bindung der magnetisch markierten Moleküle direkt an das Sensorelement erfolgen. Eine weitere Mög- lichkeit ist die Bildung eines Komplexes beider Bindungspartner in der flüssigen Phase, wobei der Komplex anschließend auf die Sensoroberfläche sedimentiert wird.
Fig. 6 zeigt, dass einzelne so entstandene Sensorelemente mit unterschied- liehen Bindungspartnern (Haftmolekülen), beispielsweise Antikörpern, beschichtet werden, die selektiv mit anderen Bindungspartnern, beispielsweise Antigene, reagieren. Zur zeitgleichen Bestimmung von Referenzen können einzelne Sensorelemente auch unbeschichtet sein.
Fig. 7 zeigt ein inhomogenes Feld in der Umgebung eines ferromagnetischen Drahtes nach Anlegen eines homogenen Feldes (http://physics. sfsu.edu/~tfox/jackson/np502/np502.html).
Fig. 8 zeigt ein inhomogenes Feld, wenn der Draht selbst einer der Pole ist (sowohl elektrisch als auch magnetisch). Fig. 9 zeigt eine Kompensationsschaltung zum Vergleich der GMI Werte eines mit einer superparamagnetischen Sonde belegten Sensors und eines unbelegten Sensors.

Claims

ANSPRUCHE
1. Verfahren zur Untersuchung von biologischen und/oder chemischen Proben, insbesondere zur Bestimmung der Bindung zwischen Bindungspartnern, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen ersten Bindungspartners, c) Inkontaktbringen des ersten Bindungspartners mit mindestens einem zur selektiven Bindung an den ersten Bindungspartner fähigen zweiten Bindungspartner, wobei der erste und/oder der zweite Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare. Sonde umfasst, und d) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, dass
e) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Bestimmung des Signals der Sonde ein externes Magnetfeld angelegt wird.
3. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Bindungspartner eine magnetische Sonde umfasst.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde ein magnetischer Partikel ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der magnetische Partikel ein superparamagnetischer Partikel ist.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Veränderung des Giant-Magnetoimpedanzsignals bestimmt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung des Giant-Magnetoimpedanzsignals in Bezug auf mindestens einen Referenzsensor bestimmt wird.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und der zweite Bindungspartner gelöst oder suspendiert vorliegen und selektiv unter Bildung eines sedimentierbaren Komplexes reagieren.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Sensoren oder ein mittels unterschiedlicher elektrischer Abgriffe in mindestens zwei Sensorelemente unterteilter Sensor verwendet werden (wird).
10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungspartner dem (den) Sensor(en) zugegeben werden.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene Sensoren oder Sensorelemente mit einer Schutzhülle versehen sind, die die sedimentierenden Komplexe weiter entfernt hält als bei den Sensoren oder Sensorelementen ohne diese Schutzhülle.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Bindungspartner an einen stationären zweiten Bindungspartner bindet, der sich auf der Oberfläche des Sensors befindet.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor in verschiedene Sensorelemente unterteilt ist, an deren Oberfläche sich jeweils unterschiedliche zweite Bindungspartner befinden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene Sensorelemente unbeschichtet sind.
15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Bindungspartner ein Antikörper und der zweite Bindungspartner ein Antigen ist, oder umgekehrt und die selektive Bindung durch chemische Hybridisierung bewirkt wird.
16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die selektive Bindung zwischen dem ersten und zweiten Bindungspartner durch Selektionsmechanismen wie beispielsweise Elektrophorese, Strukturierung der Oberfläche des Sensors, oder durch Anlegen elektrischer, magnetischer oder elektromagnetischer Felder, oder Kombinationen davon, bewirkt oder unterstützt wird.
17. Verfahren zur Untersuchung von biologischen und/oder chemischen Proben, insbesondere zur Bestimmung der Bindung zwischen Bindungspartnern, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen ersten Bindungspartners, mindestens eines bindungsfähigen zweiten Bindungspartners und mindestens eines bindungsfähigen dritten Bindungspartners, wo- bei der erste und/oder der dritte Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare Sonde umfasst und der erste Bindungspartner und der dritte Bindungspartner um die Bindung an den zweiten Bindungspartner konkurrieren, c) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, dass
d) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.
18. Verfahren zur Untersuchung von biologischen und/oder chemischen Proben, insbesondere zur Bestimmung der Bindung zwischen Bindungspart- nern, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen ersten Bindungspartners, wobei dieser Bindungspartner zur selektiven Bindung an den zweiten Bindungspartner fähig ist, c) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen zweiten Bindungspartners, wobei dieser Bindungspartner zur selektiven Bindung an den ersten und dritten Bindungspartner fähig ist, d) Bereitstellen mindestens eines bindungsfähigen dritten Bindungspartners, wobei dieser Bindungspartner zur selektiven Bindung an den zweiten Bindungspartner fähig ist und wobei der erste und/oder der zweite Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare Sonde umfasst, e) Inkontaktbringen der Bindungspartner unter Ausbildung von Komplexen bei denen der zweite Bindungspartner sowohl an den ersten als auch an den dritten Bindungspartner gebunden ist, f) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde, dadurch gekennzeichnet, dass
g) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.
19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Bestimmung des Signals der Sonde ein externes Magnetfeld angelegt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass nur der erste Bindungspartner eine magnetische Sonde umfasst.
21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass nur der dritte. Bindungspartner eine magnetische Sonde umfasst.
22. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass nur der erste Bindungspartner eine magnetische Sonde umfasst.
23. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein Inkubationsschritt des ersten oder dritten Bindungspartners mit dem zweiten Bindungspartner eingefügt wird.
24. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde ein magnetischer Partikel ist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der magnetische Partikel ein superparamagnetischer Partikel ist.
26. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine Veränderung des Giant-Magnetoimpedanzsignals bestimmt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung des Giant-Magnetoimpedanzsignals in Bezug auf mindestens einen Referenzsensor bestimmt wird.
28. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner gelöst oder suspendiert und der zweite Bindungspartner stationär auf der Sensoroberfläche angebracht ist.
29. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der erste und dritte Bindungspartner jeweils Antikörper und der zweite Bindungspartner ein Antigen ist.
30. Vorrichtung zur Untersuchung biologischer und/oder chemischer Proben, gekennzeichnet durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor, mindestens einen magnetismussensitiven Sensor, wobei die Form eines einzelnen Sensors ein kurzes Drahtstück oder eine entsprechende dünne Schicht ist, das (die) auf der Basis des Giant-Magnetoimpedanzeffektes ein Signal abgibt, das von der Konzentration der magnetischen und/oder magnetisierbaren Sonden abhängt, umfassend mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbaren Sonde, die mittels selektiver Bindungsmechanismen an verschiedene Bindungspartner gebunden werden kann, elektrische Verbindungselemente, und eine Auswerteelektronik.
31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung auch eine Vorrichtung zur Erzeugung eines externen Magnetfeldes umfasst.
32. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor mit einer Beschichtung versehen ist, die gleichzeitig die analytischen Eigenschaften, beispielsweise Partikelbindung und GMI Effekt-Größe, verbessert und vor Korrosion schützt.
33. Verfahren zur Bestimmung der Bindung von Bindungspartnern, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Detektors zur Messung von magnetischen Parametern, b) Bereitstellen von mindestens zwei bindungsfähigen Bindungspartnern, wobei mindestens ein Bindungspartner mindestens eine magnetische und/oder magnetisierbare Sonde umfasst, c) Inkontaktbringen der Bindungspartner unter selektiver Bildung von Komplexen, d) Bestimmung mindestens eines Signals der Sonde,
dadurch gekennzeichnet, dass
e) das Giant-Magnetoimpedanzsignal der Sonde durch mindestens einen magnetismussensitiven Sensor des Detektors bestimmt wird.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Bestimmung des Signals der Sonde ein externes Magnetfeld angelegt wird.
35. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass magnetische Sonden verwendet werden.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Sonden magnetische Partikel sind.
37. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 33 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Bindungspartner auf der Oberfläche der magnetischen Partikel befinden.
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