DE60211555T2

DE60211555T2 - Sensor und methode zur messung der flächendichte von magnetischen nanopartikeln auf einem mikroarray

Info

Publication number: DE60211555T2
Application number: DE60211555T
Authority: DE
Inventors: Reinder Coehoorn; W. Menno PRINS
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-17
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2022-12-18
Also published as: WO2003054523A2; US7048890B2; DE60211555D1; CN100343670C; EP1456658A2; US20050087000A1; KR20040068968A; AU2002366904A1; AU2002366904A8; EP1456658B1; JP2005513475A; TWI295323B; CN1608206A; WO2003054523A3; TW200411063A; US20060128035A1; ATE326697T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Gerät zur Erfassung von magnetischen Nanopartikeln. Die Erfindung betrifft insbesondere ein magnetisches Nachweisgerät und ein Verfahren zur Bindung biologischer Moleküle auf einem Mikroarray oder Mikrochip.
Die Einführung von Mikroarrays oder Biochips revolutioniert gegenwärtig die Analyse von DNA (Desoxyribonukleinsäure), RNA (Ribonukleinsäure) und Proteinen, z. B. die Untersuchung von menschlichem Erbgut (z. B. in Krankenhäusern oder in Arztpraxen durch Ärzte oder Krankenschwestern), bakteriologische Untersuchungen sowie die biologische und pharmakologische Forschung.
Biochips, die auch als Biosensorchips bezeichnet werden, biologische Mikrochips, Genchips oder DNA-Chips bestehen in ihrer einfachsten Form aus einem Substrat, auf dem in genau definierten Regionen des Chips eine große Anzahl unterschiedlicher Sondenmoleküle angeordnet ist, an die die zu analysierenden Moleküle oder Molekülfragmente binden können, wenn sie exakt zu den Testmolekülen passen. Zum Beispiel bindet ein Fragment eines DNA-Moleküls an ein eindeutiges komplementäres (c-DNA) DNA-Molekülfragment. Das Auftreten einer Bindungsreaktion lässt sich nachweisen, z. B. durch die Anwendung fluoreszierender Marker, die an die zu analysierenden Moleküle gekoppelt werden. Auf diese Weise kann man in kurzer Zeit kleine Mengen einer großen Anzahl unterschiedlicher Moleküle oder Molekülfragmente parallel analysieren. Ein Biochip kann Assays für mehr als 1000 unterschiedliche Molekülfragmente enthalten. Es wird erwartet, dass als Folge solcher Projekte wie dem Human-Genom-Projekt und den Nachfolgestudien über die Funktionen von Genen und Proteinen in den kommenden zehn Jahren die Brauchbarkeit von Information sehr rasch zunimmt, die durch die Anwendung von Biochips gewonnen werden können.
Ein Verfahren zum elektronischen Nachweis der Bindung von Probemolekülen an Sondenmoleküle wurde durch Clinical Micro Sensors (CMS), einem Tochterunternehmen von Motorola, dargestellt, das in „Bioelectric detection of DNA and the automation of molecular diagnostics" von D. H. Farkas in The Journal of the Association for Laborato ry Automation, Band 4, Nummer 5 (1999), Seiten 20–24, beschrieben ist. Das Unternehmen hat einen „bioelektrischen DNA-Nachweis-Chip" entwickelt. Das Prinzip erfordert die Verwendung von Ferrocen-Markermolekülen, welche die Quellen oder Senken von Elektronen bilden. An goldbeschichteten Elektroden auf dem Biochip sind Erfassungssonden angebracht. Die Erfassungssonden sind einzelne Stränge von DNA, die komplementär zu einer eindeutigen Region der Ziel-DNA- oder Ziel-RNA-Sequenz ist. Wenn eine Probe, welche die Ziel-DNA enthält, in die Kassette eingeführt wird, treffen spezielle Erfassungssonden einer Elektrodenoberfläche auf komplementäre DNA aus der Probe. Anschließend tritt die Bindung oder Hybridisierung ein. Das System enthält auch DNA-Sequenzen mit proprietären Markierungen, die als Signalisierungssonden bezeichnet werden. Diese Signalisierungssonden binden ebenfalls an die Ziel-DANN-Sequenzen. Durch die Bindung der Zielsequenz sowohl an die Erfassungssonde als auch an die Signalisierungssonde werden die elektronischen Markierungen mit der Oberfläche verbunden. Der Bindungsvorgang eines Molekülfragments wird durch das Auftreten eines Wechselstroms nachgewiesen, der durch eine Elektrode fließt, an die die Moleküle binden, wenn zwischen der Elektrode und der Lösung über dem Chip eine geringe Wechselspannung angelegt wird, da die Markierungen Elektronen freisetzen, die ein charakteristisches Signal erzeugen, das durch die Elektrode nachgewiesen werden kann. Dies zeigt das Vorhandensein der Ziel-DNA an. Bei diesem Konzept ist das Signal proportional zur absoluten Anzahl von Bindungsreaktionen, die stattgefunden haben. Die Anzahl an Elektronen, die pro Zyklus und pro gebundenem DNA/c-DNA-Paar fließen, ist sehr klein (nur wenige oder wenige zehn Elektronen). In dem oben erwähnten Artikel wird davon gesprochen, dass in der Praxis die Ströme im pA- bis μA-Bereich liegen, ohne leider die Elektrodenfläche oder die absolute Anzahl gebundener Paare (vermutlich sehr große Zahlen) anzugeben. Zur Identifizierung und Quantifizierung der Ziel-DNA-Sequenz wird eine proprietäre Signalverarbeitungstechnologie eingesetzt.
Ein zweites Prinzip ist ein Bead-Array-Counter-Biochip (BARC-Biochip), der in folgenden Veröffentlichungen beschrieben wird: „A biosensor based on magnetoresistance technology" von D. R. Baselt in Biosensors & Bioelectronics, 13, 1998, Seite 731–739; „The BARC biosensor applied to the detection of biological warfare agents" von R. L. Edelstein et al. in „Biosensors & Bioelectronics", 14, 2000, Seite 805; und „A DNA array sensor utilizing magnetic microbeads and magnetoelectronic detection" von M. M. Miller et al. in Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 225, 2001, Seite 138–144.
Mit Hilfe magnetoresistiver Werkstoffe wird ein robuster Einkomponenten-Mikrodetektor hergestellt, der gleichzeitig hunderte, tausende oder sogar Millionen von Versuchen überwachen kann. Wie in 1 dargestellt, hat Detektor 100 ein Array aus vielen magnetoresistiven Sensoren im Mikrometerbereich 101. Zur besseren Übersichtlichkeit sind nur zwei Sonden mit je einem GMR-Sensor dargestellt. Diese Sensoren 101 befinden sich in sehr geringer Tiefe (= Dicke der Passivierungsschicht aus Siliziumnitrid (Si₃N₄) 102, kombiniert mit der Dicke einer relativ dünnen Goldschicht 103) unter der Oberfläche des Substrats, mit dem die Sonden-DNA 104 verbunden ist. Biotinylierte Proben-DNA 105 binden an die Sonden-DNA 104, wenn die von den Paaren gebildeten Nucleotidsequenzen komplementär sind. Zu der Lösung werden frei bewegliche, magnetische, mit Streptavidin beschichtete Mikrokügelchen 106 hinzugefügt, nachdem die Hybridisierung von Sonden- und Proben-DNA stattgefunden hat. Die Kügelchen binden an die Proben-DNA, die durch die Bildung einer Streptavidin-Biotinyl-Bindung mit Sonden-DNA hybridisiert hat. Wenn also Proben-DNA 105 mit Sequenzen vorhanden ist, die zu beiden Sonden 104 komplementär sind, verbindet die Proben-DNA 105 die Kügelchen 106 mit den Sensoren 101. Die verwendeten Kügelchen 106 haben einen Durchmesser in der Größenordnung von 1 μm. In den Kügelchen 106 sind magnetische Nanopartikel vorhanden (in der Zeichnung nicht dargestellt), die aufgrund ihrer geringen Größe superparamagnetisch sind. Diese Nanopartikel bestehen in der Regel aus Eisenoxid und sind in einer Polymer- oder Silica-Matrix dispergiert, befinden sich als Schicht auf dieser Matrix oder sind mit dieser Matrix beschichtet und bilden Kügelchen von etwa 1 μm Durchmesser. Kügelchen, die keine Bindung eingehen, werden durch ein schwaches Magnetfeld mit einem kleinen Feldgradienten oder durch Spülen mit einer Pufferlösung entfernt. Das Vorhandensein der Kügelchen, die eine Bindung auf dem Biochip eingegangen sind, wird dann durch Magnetisierung der Partikel in einem relativ schwachen, bekannten, externen, rechtwinklig zur Ebene des Substrats ausgerichteten, Magnetfeld nachgewiesen.
Obwohl das oben gegebene Beispiel dem Nachweis von DNA dient, können mit Hilfe des BARC-Biochips nach dem Stand der Technik auch andere Moleküle, wie z. B. Proteine, nachgewiesen werden.
In den oben erwähnten Artikeln wird das Vorhandensein von Partikeln durch den Einsatz von als Wheatstone-Halbbrücken ausgeführten GMR-Sensoren im Substrat nachgewiesen, die eine Widerstand/angelegtes Feld-Kurve wie in 2 dargestellt haben. Die Wheatstone-Halbbrücke besteht aus einem empfindlichen Teil, über dem Kügelchen vorhanden sind, und einem Referenz-Teil, über dem keine Kügelchen vorhanden sind. Die Widerstand/Feld-Kurve des verwendeten GMR-Materials ist nahezu symmetrisch zur Null-Feldstärke, wie in 2 gezeigt, sodass das Vorzeichen der Feldrichtung nicht gemessen wird. Der Widerstand des GMR-Materials als Reaktion auf ein positives oder negatives angelegtes Feld nimmt um etwa denselben Betrag ab. In 2 ist zu erkennen, dass das GMR-Material eine gewisse Hysterese aufweist, die nahe der Feldstärke null besonders deutlich ist. Daher ist der exakte Nachweis schwacher Magnetfelder nahezu unmöglich.
Das Konzept des BARC-Biochips funktioniert, aber die in 9 von „A biosensor based on magnetoresistance technology" von D. R. Baselt in Biosensors & Bioelectronics, 13, 1998, Seite 731–739, dargestellten Ergebnisse zeigen ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR). Das Hauptproblem ist, dass die verwendeten großen (1-μm-Bereich) Kügelchen langsam durch die Lösung diffundieren, sodass sich selbst nach einer relativ langen Zeit für die Bindung zwischen den Kügelchen und der Proben-DNA nur eine relativ kleine Anzahl von Kügelchen an hybridisierte Probenmoleküle gebunden hat, was zu einem schwachen Signal führt. Zweitens haben die Kügelchen eine bestimmte Verteilung ihres magnetischen Moments (bei einem gegebenen Feld), wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis beeinträchtigt wird, wenn nur eines oder wenige Kügelchen pro Sensor vorhanden sind. Wie die Autoren zeigen, könnte das Signal-Rausch-Verhältnis für die Messung eines einzelnen Kügelchens verbessert werden, indem man kleinere Sensoroberflächen verwendet. Wenn jedoch viele Sensoren pro Sonde verwendet werden, wird die erforderliche elektronische Schaltung sehr komplex. Außerdem bedeutet die langsame Brownsche Bewegung großer magnetischer Partikel von etwa 1 μm Größe, dass es lange dauern kann, bis das magnetische Partikel die Bindungsstelle erreicht. Somit dauert die eigentliche Messung lange.
Tondra et al. beschreiben in „Model for detection of immobilized superparamagnetic nanosphere assay labels using giant magnetoresistive sensors" in J. Vac. Sci. Technol., A 18(4), Juli/August 2000, Seite 1125–1129, dass ein GMR-Sensor ein einzelnes paramagnetisches Kügelchen beliebiger Größe nachweisen kann, solange bestimmte Bedingungen erfüllt sind, von denen eine darin besteht, dass der Sensor etwa dieselbe Größe wie das Kügelchen haben muss. Diese Bedingung ist bei einem Radius des Kügelchens von 500 nm leicht einzuhalten. Die Verringerung des Radius auf 100 nm ist möglich durch die Überwindung technischer Schwierigkeiten bei der Herstellung von GMR-Sensoren. Die weitere Reduzierung des Radius der Kügelchen auf 10 nm setzt weitere Fortschritte in der Herstellungstechnologie für die Kügelchen sowie bei der Herstellung von GMR-Sensoren voraus. Ein Nachteil dieser Lösung ist die erforderliche exakte Positionierung der Sondenbereiche in Bezug auf den GMR-Sensor, die in einem Genauigkeitsbereich von deutlich unter 0,5 μm erfolgen muss.
US 5,981,297 beschreibt eine Sensoranordnung zum Nachweis von Zielmolekülen in einer flüssigen Phase. Die Sensoranordnung umfasst magnetoresistive Referenzelemente, die keine Bindemoleküle tragen, und magnetoresistive Signalelemente mit einer Beschichtung aus kovalent gebundenen Bindemolekülen.
In dem Artikel „Ultrasensitive magnetic biosensor for homogeneous immunoassay" von Chemla et al. in PNAS, 19. Dezember 2000, Bd. 97, Nr. 26, wird ein Sensor auf SQUID-Basis beschrieben, bei dem magnetische Nanopartikel verwendet werden. Ein Magnetfeld, das in Richtung der Sensorebene verläuft, wird angelegt, um die zufällige Verteilung der magnetischen Momente der Nanopartikel zu beseitigen, die an eine immobilisierte Zone auf einem Substrat gebunden sind. Die immobilisierte Zone liegt in einer Vertiefung und als Beispiel dafür wird eine Mylar^®-Schicht beschrieben. Dann wird das Feld abgeschaltet. Die Relaxation der magnetischen Dipole der nach dem Néel-Mechanismus gebundenen Nanopartikel erzeugt für einen Zeitraum von mehreren Sekunden eine messbare Zeitabhängigkeit des Magnetflusses durch den SQUID. Dieser Magnetfluss wird durch eine SQUID-Sonde nachgewiesen, die nahe am Rand der immobilisierten Zone angeordnet ist. Superparamagnetische Nanopartikel bewegen sich gemäß der Brownschen Bewegung frei in der Flüssigkeit und erzeugen bei Abwesenheit eines angelegten Feldes kein Magnetfeld. SQUID-Flussdetektoren haben den Nachteil, dass sie sehr teuer sind und nur unter Tieftemperaturbedingungen funktionieren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Gerät zum exakten Nachweis von magnetischen Partikeln in Biochips mit einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis zu schaffen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein schnelles Verfahren zum Nachweis von magnetischen Partikeln in Biochips und ein entsprechendes Gerät zu schaffen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist außerdem, ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren und ein ebensolches Gerät zum Nachweis von magnetischen Partikeln zu schaffen, wobei das Verfahren und das Gerät insbesondere keine exakte Positionierung einzelner magnetischer Kügelchen in Bezug auf die Sensoren erfordern.
Die oben genannten Aufgaben werden erfindungsgemäß durch einen magnetoresistiven Sensor gelöst, mit dessen Hilfe das Vorhandensein oder die Flächendichte magnetischer Nanopartikel bestimmt wird, die direkt oder indirekt an ein Ziel gekoppelt sind, wobei der magnetoresistive Sensor mindestens ein Sondenelement umfasst, das auf einem Substrat angeordnet ist und der Sensor Bindungsstellen aufweist, die selektiv ein Ziel binden können, sowie durch einen magnetoresistiven Sensor zum Nachweis des Magnetfeldes von magnetischen Nanopartikeln zumindest dann, wenn sie an das Ziel gekoppelt sind, wobei der magnetoresistive Sensor Paare von ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselementen oder erste und zweite Gruppen von magnetoresistiven Erfassungselementen umfasst, jedes Paar einem Sondenelement zugeordnet und parallel zu diesem angeordnet ist und die Ausgangssignale der ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselementen oder der ersten und zweiten Gruppen von magnetoresistiven Erfassungselementen zu einer Komparatorschaltung geleitet werden.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder zur Messung der Flächendichte von magnetischen Nanopartikeln auf einem Substrat ein und umfasst die folgenden Schritte:

– Binden eines Ziels an selektive Bindungsstellen an mindestens einem Sondenelement, das sich auf dem Substrat befindet, wobei das Ziel direkt oder indirekt mit magnetischen Nanopartikeln markiert ist,
– Erfassen des Vorhandenseins der an eine Bindungsstelle gebundenen magnetischen Nanopartikel, um dadurch das Vorhandensein oder die Dichte des Ziels zu bestimmen, das mit magnetischen Nanopartikeln markiert ist,
– wobei der Schritt des Erfassens durch Extrahieren zweier Signale ausgeführt wird, die von dem Magnetfeld abgeleitet werden, das von den an die Bindungsstelle gebundenen Nanopartikeln erzeugt wird, zum Extrahieren Paare von ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselementen oder erste und zweite Gruppen von magnetoresistiven Erfassungselementen verwendet werden, jedes Paar mindestens einem Sondenelement zugeordnet und parallel zu diesem angeordnet ist und die Differenz zwischen den beiden Signalen bestimmt wird.

Breite und Länge der Sondenflächen, bei denen es sich um die Flächen auf dem Chip handelt, an welche die Sondenelemente, wie z. B. Antikörper, binden, und die Breite und Länge der magnetoresistiven Sensorelemente (MR-Sensorelemente) sind viel größer als der Durchmesser der magnetischen Nanopartikel, deren Vorhandensein und Konzentration zu messen sind. Die Nanopartikel können z. B. einen Durchmesser zwischen 1 und 250 nm haben, vorzugsweise zwischen 3 und 100 nm und am meisten bevorzugt zwischen 10 und 60 nm. Bei derartig kleinen Partikeln verläuft die Diffusion mit hoher Geschwindigkeit. Breite und Länge der Sensorelemente sind um mindestens den Faktor 10, vorzugsweise um den Faktor 100, größer als der Durchmesser der Nanopartikel, z. B. 1 μm × 1 μm. Andere Abmessungen der Sensorelemente sind ebenfalls möglich. Bei Verwendung anderer Abmessungen ergeben sich andere Signal-Rausch-Verhältnisse.
Der Begriff „Mikro-Array" oder „Biochip" bezieht sich auf generierte Arrays auf einer ebenen Oberfläche, die aus einer Vielzahl diskreter Reaktions- oder Inkubationsabschnitte bestehen und die anhand ihrer jeweiligen Lage oder X-Y-Koordinate auf dem Array erkennbar sind. Derartige Arrays sind für den Einsatz bei Assays zur Bewertung bestimmter Bindungseigenschaften zwischen Teilen bestimmter Bindungspaare geeignet. Die Erfindung ist sehr geeignet bei kompetitiven Assays oder Verdrängungsassays. Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen deutlich, in denen das Prinzip der Erfindung exemplarisch dargestellt ist. Die folgende Beschreibung dient lediglich als Beispiel, ohne den Anwendungsbereich der Erfindung einzuschränken. Die nachfolgend aufgeführten Bezeichnungen der Figuren beziehen sich auf die beiliegenden Zeichnungen.
1 ist eine schematische Darstellung eines BARC-Chips nach dem Stand der Technik.
2 ist eine grafische Darstellung des Reaktionsverhaltens (Widerstand) einer Multilayer-GMR-Sensoranordnung nach dem Stand der Technik auf ein angelegtes Feld.
3 ist die perspektivische Ansicht eines Biochips.
Die 4A, 4B und 4C zeigen Details eines Sondenelements mit Bindungsstellen, die selektiv eine Zielprobe binden können, und magnetische Nanopartikel, die auf verschiedene Weise direkt oder indirekt an die Zielprobe gebunden sind.
4D zeigt ein Schema einer kompetitiven Analyse.
5A ist ein Querschnitt einer Ausführungsform eines Sondenbereichs auf dem Biochip der 3 gemäß Schnitt A-A' in der Figur.
5B ist ein Querschnitt einer weiteren Ausführungsform eines Sondenbereichs auf dem Biochip der 3 gemäß Schnitt A-A' in der Figur.
5C ist eine grafische Darstellung des Reaktionsverhaltens eines erfindungsgemäßen Multilayer-GMR-Sensorelements auf ein angelegtes Feld. Die Punkte zeigen schematisch die R(H)-Werte in der Unterlage der einzelnen magnetoresistiven Sensorelemente an.
6 zeigt eine Anordnung, in der zwei Spulen mit einem Eisenmagnetkern zur Magnetisierung der magnetischen Nanopartikel verwendet werden.
7 ist eine schematische Darstellung einer Wheatstone-Brücke.
8 ist eine Darstellung einer erfindungsgemäßen Wheatstone-Brückenkonfiguration, in der alle Teile magnetisch identisch sind.
Die 9A und 9B zeigen ein erstes und ein zweites Beispiel geeigneter GMR-Strukturen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung.
10 ist eine grafische Darstellung der Ober- und Untergrenzen der nachweisbaren Flächendichte als Funktion des Durchmessers der magnetischen Partikel.
11 ist eine Kurve der X-Komponenten des Magnetfeldes der Nanopartikel in der Ebene der GMR-Sensorelemente.
12 zeigt schematisch eine mehrstufige Struktur über der Vielzahl von magnetischen Sensorelementen.
In den verschiedenen Zeichnungen beziehen sich dieselben Positionsnummern auf dieselben oder analoge Elemente.
Die vorliegende Erfindung wird in Bezug auf einzelne Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf bestimmte Zeichnungen beschrieben, ist jedoch nicht darauf beschränkt, sondern nur durch die Patentansprüche. Zum Beispiel wird die vorliegende Erfindung unter Bezug auf zwei magnetoresistive Sensorelemente für jedes Sondenelement beschrieben, ohne dass die vorliegende Erfindung darauf beschränkt ist. Beispielsweise können 4, 6 oder mehr geradzahlige Anzahlen von Sensorelementen in jedem Sondenelement verwendet und in zwei Gruppen aufgeteilt werden. Ein Ausgangssignal aus jeder Gruppe wird dann zu einem Differenz-Komparator oder zu einer Summierschaltung übertragen. Die Zeichnungen sind lediglich schematische Darstellungen und stellen keine Einschränkung dar. Die Zeichnungen sind nicht maßstabsgerecht.
In der detaillierten Beschreibung wird mit der folgenden Spezifikation ein Beispiel angegeben, das keine Einschränkung darstellt:

a) Die Fläche des Biochips beträgt 1 × 1 mm².
b) Es befinden sich 100 verschiedene Sonden auf dem Biochip, wobei jede Sonde eine Fläche (Breite W₁ × Länge l) von 10^–2 mm² (z. B. 100 μm × 100 μm) hat.
c) In einer Gesamtzeit von 3 Minuten werden an jedem Sondenelement 100 Messungen auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Nanopartikeln und/oder der Nanopartikeldichte durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein System mit den angegebenen Abmessungen und Werten, sondern nur durch die Patentansprüche beschränkt.
Ein Biochip 1 umfasst ein Substrat 3 mit mindestens einem Sondenbereich und vorzugsweise einer Vielzahl von Sondenbereichen 5, wie in 3 dargestellt. Jeder Sondenbereich 5 umfasst ein vorzugsweise streifenförmiges Sondenelement 7 über seiner Oberfläche wie in den beiden Ausführungsformen von 5A und 5B gezeigt, die nachfolgend beschrieben sind.
Wie in den 4A, 4B und 4C, 4D dargestellt, ist ein Sondenelement 7 mit Bindungsstellen 9, wie z. B. Bindemolekülen oder Antikörpern ausgestattet, die selektiv eine Zielprobe 11, wie z. B. eine Zielmolekülspezies oder ein Antigen, binden können. Alle biologischen Moleküle, die an eine Matrix gekoppelt werden können, sind potenziell in dieser Anwendung verwendbar.
Beispiele sind:

– Nucleinsäuren: DNA, RNA mit einem oder zwei Strängen oder DNA-RNA-Hybride mit oder ohne Modifikationen. Nucleinsäure-Arrays sind bekannte Beispiele.
– Proteine oder Peptide mit oder ohne Modifikationen, z. B. Antikörper, DNA oder RNA-Bindeproteine. Das vollständige Hefe-Proteom wurde kürzlich veröffentlicht.
– Oligo- oder Polysaccharide oder Zuckerarten
– kleine Moleküle wie Inhibitoren, Liganden, die direkt oder über ein Trennmolekül zu einer Matrix vernetzt sind.

Die im Netz gefundenen Elemente sind höchstwahrscheinlich Bibliotheken von Verbindungen wie Peptid/Protein-Bibliotheken, Oligonucleotid-Bibliotheken und Inhibitor-Bibliotheken.
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um magnetische Nanopartikel 15 mit dem Ziel 11 zu verbinden. Beispiele hierfür werden in den 4A, 4B, 4C und 4D Beispiele gezeigt.
In 4A können mit magnetischen Partikeln 15 markierte Sensormoleküle 13 ein Ziel 11 selektiv binden. Werden unspezifische Suchvorgänge durchgeführt, z. B. eine Suche nach den DNA-Bindeproteinen eines bestimmten Gewebeextrakts, die an ein Netz mit einer Bibliothek von Nucleotiden binden, muss das Sensormolekül eine sehr breite Spezifität haben. Im vorliegenden Beispiel wäre ein Sensormolekül mit einem Trenner, der mit Aminogruppen oder Kohlenstoffgruppen reagiert, nützlich. Andere Sensormoleküle mit einer Reaktionsgruppe für Zuckerverbindungen oder DNA sind ebenfalls geeignet. Bei einer direkten Suche können auf die Suche zugeschnittene Moleküle verwendet werden, wenn z. B. die Suche mit einem Protein nach einer Proteinbibliothek bei einer vermuteten Protein-Protein-Wechselwirkung durchgeführt wird, ist ein Antikörper die naheliegende Wahl. Es können sowohl mono- als auch polyklonale Antikörper verwendet werden. Wie in 4A gezeigt, sind magnetische Partikel 15 indirekt an die Zielprobe 11 gebunden.
In 4B sind die Moleküle der Zielprobe 11 durch magnetische Nanopartikel 15 direkt markiert.
In 4C ist Zielprobe 11 durch die Marker 12 markiert. Die derartig markierte Zielprobe 11 (z. B. biotynilierte Proben-DNA) ist selektiv an die Bindungsstellen 9 gebunden. Sensormoleküle 13 (z. B. Streptavidin), die mit magnetischen Nanopartikeln 15 markiert sind, können selektiv die Marker 12 an der Zielprobe 11 binden. Auch hier sind die magnetischen Nanopartikel 15 indirekt an die Zielprobe 11 gebunden.
In 4D sind in der Flüssigkeit oder dem Gas ein Ziel 11 und ein weiteres Ziel vorhanden, das mit den magnetischen Nanopartikeln 15 markiert ist. In einem kompetitiven Assay kann das Ziel mit magnetischen Nanopartikeln selektiv binden, wenn es die Bindungsstelle 9 eher als das Ziel erreicht. Je mehr Ziele, die mit magnetischen Nanopartikeln 15 markiert sind, gebunden wurden, desto weniger Ziele waren in der Flüssigkeit oder in dem Gas vorhanden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die magnetischen Partikel 15 vorzugsweise superparamagnetische Nanopartikel mit einem Durchmesser unter 1 μm und einem durchschnittlichen magnetischen Moment m. Mit dem Begriff „Nanopartikel" sind Partikel gemeint, die mindestens eine Abmessung im Bereich zwischen 1 nm und 250 nm haben, vorzugsweise zwischen 3 nm und 100 nm, mehr bevorzugt zwischen 10 nm und 60 nm. Sie sind an Sondenelement 7 auf dem Substrat 3 des Biochips 1 angeordnet, entweder direkt oder indirekt, vorzugsweise durch eines der in 4A, 4B oder 4C gezeigten oder durch ähnliche Verfahren. Die Nanopartikel 15 sind normalerweise in einem klar definierten Bereich auf dem Chip 1 zufällig angeordnet, wobei der klar definierte Bereich einen Sondenbereich 5 darstellt. Der Sondenbereich 5 hat eine Breite W₁ und eine Länge l. Die Flächendichte der Nanopartikel 15 ist n (Nanopartikel pro m²). Im Allgemeinen ist die Flächendichte eine Funktion der Zeit.
Der Sondenbereich 5 kann ein einzelner langer Streifen sein. Anstelle eines einzelnen langen Streifens kann auch eine bestimmte Anzahl kürzerer Streifen verwendet werden, die nahe nebeneinander angeordnet sind, sodass die Gesamtfläche, die von einer einzelnen Sonde 5 eingenommen wird, quadratischer wird, eher wie in 3 dargestellt. Da dies die elektronische Empfindlichkeit der Ergebnisse nicht beeinflusst, wird im Folgenden nur der Fall eines einzelnen langen streifenförmigen Sondenbereichs 5 näher ausgeführt.
Der Biochip funktioniert wie folgt: Jedes Probenelement 7 ist mit Bindungsstellen 9 eines bestimmten Typs ausgestattet. Zielprobe 11 wird dem Sondenelement 7 zugeführt oder daran vorbeigeführt, und wenn die Bindungsstellen 9 und die Zielprobe 11 zueinander passen, binden sie aneinander. Infolgedessen werden magnetische Nanopartikel 15 direkt oder indirekt an die Zielprobe 11 gekoppelt, wie in den 4A, 4B und 4C dargestellt. Die magnetischen Nanopartikel 15 ermöglichen es, die vom Biochip 1 gesammelten Informationen auszulesen. Die Nanopartikel sind vorzugsweise erfindungsgemäße superparamagnetische Nanopartikel 15. Superparamagnetische Partikel sind ferromagnetische Partikel, die aufgrund der thermisch induzierten Umkehr des magnetischen Moments, die während der Zeit der Magnetisierungsmessung häufig auftritt, bei einem angelegten Magnetfeld der Stärke null einen zeitlichen Magnetisierungs-Mittelwert von null haben. Die mittlere Frequenz der Umkehrversuche ergibt sich aus
wobei KV (mit K als Energiedichte der magnetischen Anisotropie und V als Partikelvolumen) die zu überwindende Energiebarriere und ν₀ die Umkehrfrequenz ist (typischer Wert: 10⁹ s^–1).
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die superparamagnetischen Partikel 15 vorzugsweise rechtwinklig zur Chipebene magnetisiert, um die durch den Biochip 1 gesammelten Informationen auszulesen. In anderen Ausführungsformen der Erfindung werden die Nanopartikel parallel zur Chipebene magnetisiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung dient ein magnetoresistiver Sensor (MR-Sensor), z. B. ein GMR-Sensor, ein magnetoresistiver Tunnelsensor (TMR-Sensor) oder ein anisotroper magnetoresistiver Sensor (AMR-Sensor) dazu, die durch den Biochip 1 gesammelten Informationen und somit die Informationen über das Vorhandensein oder die Abwesenheit der Partikel auszulesen und/oder eine Flächendichte der magnetischen Nanopartikel 15 auf den Sondenfläche 5 zu bestimmen oder abzuschätzen.
In einem AMR-, GMR- oder TMR-Material ändert sich der elektrische Widerstand, wenn sich die Magnetisierungsrichtung einer oder mehrerer Schichten als Folge eines angelegten Magnetfeldes ändert. GMR ist der Magnetwiderstand für Schichtstrukturen mit leitenden Zwischenschichten zwischen den schaltenden Magnetschichten und TMR ist der Magnetwiderstand für Schichtstrukturen, die Schichten mit magnetischen Metallelektroden und eine dielektrische Zwischenschicht umfassen.
In der GMR-Technologie wurden Strukturen entwickelt, bei denen zwei sehr dünne magnetische Folien sehr dicht zusammengefügt sind. Die erste magnetische Folie ist fixiert, d. h., ihre magnetische Ausrichtung ist festgelegt, normalerweise dadurch, dass sich die Folie dicht an einer Austausch-Vormagnetisierungsschicht befindet, einer Schicht aus antiferromagnetischem Material, durch welche die magnetische Ausrichtung der ersten magnetischen Folie fixiert wird. Die zweite magnetische Schicht oder freie Schicht hat eine freie, variable magnetische Ausrichtung. Änderungen in dem Magnetfeld, die im vorliegenden Fall aus Änderungen in der Magnetisierung der superparamagnetischen Partikel 15 resultieren, bewirken eine Drehung der magnetischen Ausrichtung der freien Magnetschicht, die wiederum den Widerstand der gesamten Sensorstruktur erhöht oder verringert. Niedriger Widerstand tritt allgemein dann auf, wenn der Sensor und die fixierten Schichten dieselbe magnetische Ausrichtung haben. Ein höherer Widerstand tritt dann auf, wenn die magnetische Ausrichtung des Sensors und der fixierten Schichten einander entgegengesetzt sind.
TMR ist in Systemen zu finden, die aus zwei ferromagnetischen Elektrodenschichten bestehen, die durch eine isolierende Barriere (Tunnelbarriere) getrennt sind. Diese Barriere muss sehr dünn sein, d. h. in der Größenordnung von 1 nm. Nur dann können Elektronen durch diese Barriere tunneln. Dies ist ein vollständig quantenmechanischer Transportprozess. Auch hier kann die magnetische Ausrichtung einer Schicht ohne Auswirkungen auf die andere Schicht durch Verwendung einer Austausch-Vormagnetisierungsschicht geändert werden. Änderungen im Magnetfeld, die im vorliegenden Fall ebenfalls aus Änderungen in der Magnetisierung der superparamagnetischen Partikel 15 resultieren, bewirken eine Drehung der magnetischen Ausrichtung der Sensorfolie, die wiederum den Widerstand der gesamten Sensorstruktur erhöht oder verringert.
Der anoisotrope Magnetwiderstand (AMR) ferromagnetischer Materialien besteht in der Abhängigkeit des Widerstands vom Winkel, den der Strom mit der Magnetrichtung bildet. Dieses Phänomen beruht auf einer Asymmetrie beim Streuquerschnitt von Elektronen in ferromagnetischen Materialien.
Im Folgenden werden Ausführungsformen mit GMR-Sensoren erläutert, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt.
In einer ersten Ausführungsform, die in 5A dargestellt ist, umfasst der magnetoresistive Sensor, z. B. ein GMR-Sensor, ein erstes Sensorelement, z. B. ein GMR-Element 17, und ein zweites Sensorelement, z. B. ein GMR-Element 19, das in das Substrat 3 des Biochips in einem Abstand d unter der Oberfläche des Substrats 3 integriert ist. Jedes der GMR-Elemente 17, 19 umfasst eine fixierte Folie mit derselben Magnetisierungsrichtung, parallel oder im Wesentlichen parallel zur X-Richtung, und eine freie Folie oder Sensorfolie, deren Magnetisierungsrichtung durch ein externes Magnetfeld geändert werden kann. Um den Biochip 1 auszulesen, werden die an ihn gebundenen superparamagnetischen Nanopartikel 15 durch ein externes, gleichförmiges Magnetfeld magnetisiert, das rechtwinklig zur Ebene des Biochips 1 angeordnet ist. Die Verwendung eines rechtwinklig angeordneten Magnetfeldes erzeugt an den beiden Seiten des streifenförmigen Bereiches, der von Nanopartikeln bedeckt ist, nahe den Sensorelementen 17, 19 ein mittleres Netto-Magnetfeld. Die Sondenbereiche überlappen sich nur mit der Hälfte der GMR-Sensorstreifen, sodass das mittlere Netto-Magnetfeld in den Sensorstreifen, das durch die Nanopartikel erzeugt wird, entlang oder nahe der Mittelachse der Streifen am größten ist. Die magnetisierten Nanopartikel 15 erzeugen in der Ebene der darunter liegenden GMR-Folien Regionen von entgegengesetzten magnetischen Induktionsvektoren, wie in 11 gezeigt, und das resultierende Magnetfeld wird durch die GMR-Sensorelemente 17, 19 nachgewiesen. In den 3, 5A und 5B wurde ein Koordinatensystem eingeführt; anhand dieses Koordinatensystems erstrecken sich das Sondenelement 7 und die GMR- Elemente 17, 19 in der Y-Richtung über die Länge l. Wenn die magnetoresistiven Sensorelemente 17, 19 in der XY-Ebene liegen, nacheisen die GMR-Sensorelemente 17, 19 nur die X-Komponente des Magnetfeldes. Das resultierende Magnetfeld von den magnetisierten superparamagnetischen Partikeln 15 wird durch das erste GMR-Element 17 und das zweite GMR-Element 19 nachgewiesen. Über die Breite W von Sondenelement 7 trägt die begrenzte (nicht infinite) räumliche Ausdehnung der magnetischen Partikel zu einem Nettosignal bei, das durch das Magnetfeld in der Ebene der GMR-Elemente 17, 19 erzeugt wird. An einer Seite der magnetischen Partikel an den Rändern des Sondenelements befinden sich keine Partikel und daher hat das Magnetfeld dieser Partikeln in den Sensorelementen 17, 19 eine in derselben Ebene liegende Netto-Feldkomponente in einer Richtung. Bei Partikeln, die näher am Zentrum eines Sensors 17, 19 liegen, ist das in ihrer Ebene liegende Magnetfeld durch benachbarte Partikel auf beiden Seiten bis zu einem gewissen Ausmaß neutralisiert. Somit tragen alle Partikel zu den Signalen bei, die in den Sensorelementen 17, 19 erzeugt werden. Obwohl alle Nanopartikel etwas zum Netto-Feld beitragen, tragen die Partikel nahe den Rändern der Sensorelemente 17, 19 mehr zum Gesamt-Magnetfeld bei. Da die magnetischen Sensorelemente 17, 19 im Zentrum am empfindlichsten sind, befinden sich die magnetischen Nanopartikel 15 an den Rändern von Sondenelement 7, in rechtwinkliger Projektion betrachtet, vorzugsweise im Zentrum der Sensorelemente 17, 19. Die Funktion des Sensors hängt nicht entscheidend vom Abstand W zwischen den GMR-Streifen ab, der viel größer als der Durchmesser der Nanopartikel sein kann. Beispielsweise können die fixierten Folien im ersten GMR-Element 17 und im zweiten GMR-Element 19 beide in positiver X-Richtung ausgerichtet sein. In dem in 5A gegebenen Beispiel liegt die Magnetisierungsrichtung der freien Folie bzw. Sensorfolie des ersten GMR-Elements 17 ebenfalls in positiver X-Richtung und die Magnetisierungsrichtung der freien Folien im zweiten GMR-Element 19 in negativer X-Richtung. Da die Magnetisierungsrichtungen der fixierten Folie und der festen Folie des ersten GMR-Elements 17 identisch sind, zeigt das erste GMR-Element 17 einen niedrigen Widerstand. Da die Magnetisierungsrichtungen der fixierten Folie und der freien Folie des zweiten GMR-Elements 19 entgegengesetzt sind, zeigt das zweite GMR-Element 19 einen hohen Widerstand. Die Reaktion des ersten GMR-Elements 17 und des zweiten GMR-Elements 19 auf das Magnetfeld, das aufgrund der Magnetisierung der Nanopartikel vorhanden ist, ist in 5C (a) bzw. (b) dargestellt. Wie in diesen grafischen Darstellungen gezeigt wird, liegt das Magnetfeld je nach Platzierung des Nanopartikels entweder in paralleler oder antiparalleler Richtung im Vergleich zur Vormagnetisierung des GMR-Elements.
Die externe Magnetisierung der Nanopartikel 15 kann auf jede Weise erreicht werden, die dem Fachmann bekannt ist. Insbesondere kann sie mit Hilfe zweier Spulen 30 mit einem ferromagnetischen Kern 32 erreicht werden, wie in 6 dargestellt. Durch Anlegen eines Stroms von etwa 10 mA wird beispielsweise ein rechtwinklig zum Substrat ausgerichtetes Magnetfeld erzeugt, um eine Magnetisierung zu bewirken und die magnetischen Momente der Nanopartikel 15 auszurichten. Wird das Zentrum beider Spulen 30 entlang einer rechtwinklig zum Substrat 3 verlaufenden Linie angeordnet und der Spulendurchmesser ist ungefähr gleich dem oder größer als der Abstand zwischen den Spulen und sind die Ströme durch die beiden Spulen gleich groß, entspricht das angelegte Magnetfeld einer guten Annäherung, die sich über eine Fläche, die der Spulenfläche entspricht, rechtwinklig zum Substrat 3 erstreckt. Es kann nützlich sein, durch geringfügige Verschiebung in X-, Y- und Z-Richtung einer oder beider Spulen die Spulenpositionen so verändern zu können, dass im Sondenbereich ein linearer Gradient des Magnetfeldes entsteht.
Alternativ dazu könnte ein Gradient erzeugt werden, indem ein Stromunterschied ausgenutzt wird. Auch die Möglichkeit, die Ausrichtung der Spulen in Bezug auf den Probenbereich geringfügig verändern zu können, was zu einer kleinen, gut kontrollierten, in der Ebene liegenden Feldkomponente führt, kann nützlich sein. Durch Ausnutzung der Kombination aus Magnetfeld und Feldgradient kann die Stärke der Bindung des magnetischen Partikels in verschiedene Richtungen bestimmt werden. Schwache Bindungen können nachgewiesen werden, da die magnetischen Nanopartikel bei einem bestimmten Magnetfeld ihre Bindung verlieren und nicht mehr durch die MR-Sensorelemente nachgewiesen werden, da sie in die Masse der Partikel wandern und somit zu weit von den Sensoren entfernt sind, um nachgewiesen werden zu können. Dies ist von besonderer Bedeutung für große Proteine, während die Bindung von DNA mehr oder weniger entweder ein- oder ausgeschaltet ist. Durch Ausnutzung einer kleinen und gut kontrollierten in der Ebene liegenden Feldkomponente in X-Richtung lässt sich eine mögliche unerwünschte Verschiebung der Mitte der R(H)-Kurven der Null-Feld-Position korrigieren, die bei durch Austausch vormagnetisierten GMR- oder TMR-Sensoren aus einer magnetischen Restkopplung zwischen der freien und der festen Schicht entstehen würde.
In einer zweiten Ausführungsform, die in 5B dargestellt ist, hat die Oberfläche des Sondenbereiches 5 eine Puffer- oder Isolierzone, durch welche die Beein trächtigung der Messung verhindert oder reduziert wird, die durch zufällig in dieser Zone befindliche Nanopartikel verursacht wird. Beispielsweise kann die Oberfläche des Halbleiter-Sensorelements strukturiert werden. Der Zweck der Strukturierung kann darin bestehen, die Partikel so weit von den Sensoren zu entfernen, dass sie die Messung nicht mehr beeinflussen. Eine derartige Strukturierung kann physikalisch vorgenommen werden, z. B. mit Hilfe eines Stufenprofils oder, wie in 5B gezeigt, mit einem Gradientenprofil, z. B. durch Ätzen des Halbleitermaterials des Sensorelements mittels anisotroper oder isotroper Ätzlösungen, um z. B. eine entsprechende Vertiefung zu bilden. Alternativ dazu kann der Sondenbereich auch durch einen Graben umgeben sein, der tief genug ist, um eventuelle Nanopartikel von den Sensoren zu trennen. Außer oder zusätzlich zu einer derartigen physikalischen Strukturierung kann die Oberfläche des Sondenbereichs 5 auch chemisch oder biochemisch strukturiert werden, z. B. indem auf dem Sondenelement 7 des Sondenbereichs 5 Bindungsstellen geschaffen werden, nicht jedoch auf den Regionen 8 des Sondenbereichs, die sich neben dem Sondenelement 7 befinden. Für diese Pufferzonen können Materialien mit Abstoßungswirkung verwendet werden.
Der Sensor umfasst dünne Folienmaterialien, im Beispiel, auf das hier Bezug genommen wird, GMR-Materialien, aber auch andere dünne Folienmaterialien wie AMR-, TMR- oder andere MR-Materialien mit im Wesentlichen linearen R(H)-Kurven im Bereich H = 0 sind mögliche Materialien. Der Sensor ist von den magnetischen Nanopartikeln 15 durch eine Trennschicht 40, z. B. Siliziumdioxid, Siliziumnitrid oder organisches Material, wie z. B. Kunstharz oder Epoxidharz, getrennt.
Die Magnetisierung der Nanopartikel 15 wird durch ein externes Feld gesteuert, das rechtwinklig zur Oberfläche des Biochips 1 (d. h. entlang der Z-Achse) angelegt wird. Der Sensor wird nun dem Magnetfeld aus den Nanopartikeln 15 ausgesetzt, dessen (über die Streifen gemittelte) in der Ebene liegende Komponente unter den Seiten der Sondenregion, die mit den magnetischen Nanopartikeln bedeckt sind, besonders hoch ist. Die Widerstandsdifferenz der Sensoren 17, 19, die sich ändert, wenn ein Magnetfeld im rechten Winkel angelegt wird, dient zur Messung der Flächendichte von Nanopartikeln auf dem Sondenelement. Die Flächendichte der magnetischen Nanopartikel 15 auf der unteren Oberfläche des Sondenelements 7a, ist durch die Dichte σ₁ und auf der oberen Oberfläche durch die Dichte σ₂ gegeben. Die Verwendung einer vertieften Sondenregion (d₂ ≠ 0 in 5B) reduziert die Empfindlichkeit gegenüber Kügelchen, die sich auf der Oberfläche außerhalb des Sondenbereichs befinden, d. h., die nicht speziell an Sondenmolekülen ge bunden sind. Um die Möglichkeit zu reduzieren, dass diese Kügelchen einen Beitrag zum Signal für die Flächendichte von Nanopartikeln in der Flüssigkeit der vertieften Region liefern, kann ein zusätzlicher Waschschritt ausgeführt werden oder die Partikel können durch ein Magnetfeld und einen Magnetfeldgradienten von der Sensoroberfläche entfernt werden.
Die Flächendichte von Partikeln liegt in der Regel im Bereich zwischen null und 10³ bis 10⁴ Partikeln pro μm².
In der Praxis ist die Herstellung physikalischer Strukturen im Mikrometer- oder Submikrometerbereich auf Oberflächen relativ einfach, während die Herstellung biochemischer Oberflächen mit Mikrometer- oder Submikrometerstrukturen weitaus schwieriger ist.
In der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht der Sensor aus einem Paar von Sensorelementen 17 und 19 in einer Konfiguration bezüglich eines Sondenbereichs, wie in 5B dargestellt. Die Flächendichte magnetischer Nanokügelchen wird aus der Differenz der Widerstandsänderungen der beiden Sensorelemente 17 und 19 abgeleitet, die bei einem im rechten Winkel angelegten Magnetfeld entstehen. Da die Sensorelemente 17 und 19 gleichermaßen empfindlich gegenüber den Effekten einer in der Ebene liegenden Komponente des externen Feldes oder gegenüber den durch Wärmedrift verursachten Effekten sind, kompensieren sich diese Effekte. Ein praktisches Verfahren zur Gewinnung des Signals ist die Verwendung von Sensor 17 und 19 als Elemente a und b in einer Wheatstone-Brücke, wie schematisch in 7 dargestellt, bei der angenommen wird, dass die Elemente c und d entweder (annähernd) identische nicht magnetische Widerstände oder magnetische Widerstände desselben Typs wie die Sensoren a und b sind, bei denen sich der Widerstand unter einem angelegten Feld nicht ändert. Dies kann erreicht werden, indem man z. B. keine Sondenmoleküle in die Nähe der Sensoren c und d bringt oder indem man Sondenmoleküle über den Sensoren c und d in eine Region bringt, die viel breiter als die Gesamtbreite des Bereichs der Sensoren c und d ist (sodass der Nettoeffekt aller Dipolfelder gleich null ist), oder indem man lokal eine dicke Deckschicht oben auf die Sensoren c und d aufbringt, sodass die Empfindlichkeit gegenüber vorhandenen magnetischen Partikeln stark verringert ist. Es ist nicht notwendig, dass die Sensoren c und d dieselben physikalischen Abmessung haben wie die Sensoren a und b.
Ungeachtet des im Einzelnen verwendeten praktischen Verfahrens zur Gewinnung des Signals wird dieses System im Folgenden als Wheatstone-Halbbrücke be zeichnet. Vorteilhaft ist, wenn die Sensorelemente 17 und 19 und nominell identische Sensorelemente 17' und 19' eine Wheatstone-Vollbrücke bilden, wie in 8 dargestellt. In diesem Fall entsprechen die Elemente 17, 19, 17' und 19' den Elementen a, b, d und c der in 7 dargestellten schematischen Struktur. Bei einem festen Erfassungsstrom I_sens wird das Signal, aus dem man die Flächendichte erhält, wie in 8 dargestellt mit einem Voltmeter gemessen. Eine praktische Implementierung einer derartigen Kombination ist schematisch in 12 dargestellt, in der eine Folge vertiefter Regionen 50 zu sehen ist. Die Vorteile der Messung von Differenzen zwischen zwei Sensorelementen 17 und 19 bei einem Sondenelement oder zwischen Gruppen von Sensoren 17, 19 bestehen darin, dass keine Referenz-Sensorelemente benötigt werden und man eine hohe Nachweisempfindlichkeit bei gleichzeitiger Unabhängigkeit gegenüber äußeren Einflüssen, wie z. B. der Temperatur, erhält. Die Empfindlichkeit einer Wheatstone-Vollbrücke ist doppelt so hoch wie die einer ansonsten identischen Wheatstone-Halbbrücke.
Das Ausgangssignal des Komparators liefert zum Beispiel eine Anzeige dafür, ob Nanopartikel vorhanden sind (wenn ein minimaler Schwellenwert überschritten ist), oder das Signal kann verwendet werden, um die Flächendichte der Partikel zu bestimmen oder abzuschätzen.
Bei streifenförmigen GMR- und TMR-Sensormaterialien, die fixierte und freie magnetische Schichten umfassen, kann man eine im Wesentlichen lineare und hysteresefreie Widerstand/Feld-Kurve erhalten, indem man eine Konfiguration verwendet, bei der die Richtung der Austausch-Vormagnetisierung rechtwinklig zur Längsrichtung (Stromrichtung) liegt und bei der die freie Schicht leicht parallel zur Längsrichtung magnetisiert werden kann. Das externe Feld, gegenüber dem der Sensor empfindlich ist, ist rechtwinklig zur Längsrichtung der Streifen gerichtet. Der Feldbereich („Schaltfeld"), in dem sich die Magnetisierung der freien Schicht von einer bezüglich der Richtung der „festen" austauschvormagnetisierten Schicht parallelen in eine antiparallele Richtung dreht, wird durch die Kombination verschiedener Beiträge zur magnetischen Anisotropie bestimmt, einschließlich eines Eigenbeitrags, z. B. aufgrund der Züchtung in einem Magnetfeld, und einschließlich der Form-Anisotropie. Hierbei handelt es sich um eine so genannte gekreuzte Anisotropie. Um eine im Wesentlichen lineare R(H)-Kurve in der Nähe des angelegten Null-Feldes zu erhalten, sollte das effektive magnetische Koppelfeld, das aufgrund des Vorhandenseins der fixierten Schicht auf die freie Schicht wirkt, auf einen Wert reduziert werden, der deutlich unter dem Schaltfeld liegt. Zu dieser Kopplung tragen verschiedene Details bei. Die Kopplung aufgrund der Fixierlöcher in der Zwischenschicht, die Austauschkopplung der Zwischenschicht und die magnetostatische Kopplung aufgrund von nicht flachen Schnittstellen zwischen magnetischem Metall und Zwischenschicht kann reduziert werden, indem man ausreichend dicke Zwischenschichten verwendet. Die im Zusammenhang mit der endlichen Streifenbreite stehende magnetostatische Kopplung kann z. B. reduziert werden, indem man die Dicke der fixierten und der freien Schicht aneinander anpasst oder indem man andere Möglichkeiten verwendet, durch die das Produkt aus Magnetisierungszeiten und Schichtdicke effektiv reduziert wird. Es ist auch möglich, nicht diese einzelnen Beiträge zum Kopplungsfeld zu reduzieren, sondern die Summe aller Beiträge zur Kopplung, indem man ein System entwickelt, in dem die unterschiedlichen Beiträge entgegengesetzte Vorzeichen tragen.
Allgemein bekannte Verfahren, die bei AMR-Materialien zu linearen R(H)-Kurven um das Null-Feld herum, sind das so genannte Soft-Adjacent-Layer-Verfahren und das Barber-Pole-Verfahren. Beide Verfahren führen effektiv zu einer Konfiguration, in welcher der Winkel zwischen Strom und Magnetisierung bei H = 0 nahe 45° liegt.
Ein erstes Beispiel für eine geeignete GMR-Struktur 60 für eine erfindungsgemäße Sensoranordnung ist in 9A dargestellt. Die GMR-Struktur 60 umfasst ein thermisch oxidiertes Siliziumsubstrat 61 mit einer Hauptoberfläche 62. Auf der Hauptoberfläche 62 des Substrats 61 sind mehrere Schichten übereinander angeordnet: eine erste (Vielzahl von) Pufferschicht(en) 63, ein Antiferromagnet (AF) 64, ein fixierter Ferromagnet (F_fixiert) 65, ein nicht magnetisches Material (NM) 66, ein freier Ferromagnet (F_frei) 67 und eine Deckschicht 68. Die Schichten 65, 66 und 67 sind Metalle. Speziell in diesem ersten Beispiel können die erwähnten Schichten aus den folgenden Materialien bestehen und folgende Dicken aufweisen:

– Pufferschicht 63: eine 3 nm dicke Ta-Schicht 63a mit einer 3 nm dicken Ni₈₀Fe₂₀-Schicht 63b darüber
– Schicht AF, 64: eine 10 nm dicke Ir₂₀Mn₈₀-Schicht
– Schicht F_fixiert, 65: eine 6 nm dicke Co-Schicht
– Schicht NM, 66: eine 3 nm dicke Cu-Schicht
– Schicht F_frei, 67: eine 6 nm dicke Ni₈₀Fe₂₀-Schicht und
– Deckschicht, 68: eine 3 nm dicke Ta-Schicht.

Die Ir₂₀Mn₈₀-Schicht 64 ist ein Antiferromagnet (AF), der bewirkt, dass die Magnetisierung der Co-Schicht 65 rechtwinklig zur Länge der GMR-Streifen 17, 19 fixiert wird. Dies ge schieht durch Züchtung der Co-Schicht 65 in einem Magnetfeld oder nach der Züchtung in einem Magnetfeld durch Abkühlung des Systems von einer Temperatur oberhalb der so genannten „Blockiertemperatur" (die bei den betrachteten Materialien etwa 300 °C beträgt). Die Cu-Schicht 66 trennt die fixierte Co-Schicht 65 von der freien Ni₈₀Fe₂₀-Schicht 67. Die obere Ta-Schicht 68 schützt die GMR-Struktur 60 vor Oxidation, wenn der Wafer nach dem Aufbringen der Schichten der Luft ausgesetzt wird. Die untere Ta-Schicht 63a und die sich anschließende Ni₈₀Fe₂₀-Schicht 63b tragen zum Aufbau oder zur Züchtung einer geeigneten Mikrostruktur und Kristallausrichtung bei.
Ein zweites Beispiel einer geeigneten GMR-Struktur 69 ist in 9B dargestellt. Die GMR-Struktur 69 umfasst ein thermisch oxidiertes Siliziumsubstrat 61 mit einer Hauptoberfläche 62. Auf der Hauptoberfläche 62 des Substrats 61 sind mehrere Schichten übereinander angeordnet: eine erste (Vielzahl von) Pufferschicht(en) 63, dann ein künstlicher Antiferromagnet (AF) 70, ein nicht magnetisches Material (NM) 66, ein freier Ferromagnet (F_frei) 67 und eine Deckschicht 68. Speziell in diesem zweiten Beispiel können die erwähnten Schichten aus den folgenden Materialien bestehen und folgende Dicken aufweisen:

– Pufferschicht 63: eine 3 nm dicke Ta-Schicht 63a mit einer 3 nm dicken Ni₈₀Fe₂₀-Schicht 63b darüber
– Schicht AF, 70: eine AF-Schicht, z. B. eine 10 nm dicke Ir₂₀Mn₈₀-Schicht 70a, eine 6 nm dicke Co-Schicht 70b, eine 0,8 nm dicke Ru-Schicht und eine 6 nm dicke Co-Schicht 70d
– Schicht NM, 66: eine 3 nm dicke Cu-Schicht
– Schicht F_frei, 67: eine 6 nm dicke Ni₈₀Fe₂₀-Schicht und
– Deckschicht, 68: eine 3 nm dicke Ta-Schicht.

Die AF-Schicht 70 hat die Form AF/Co/Ru/Co. Die Dicke der Ru-Schicht 70c ist so gewählt, dass die Magnetisierungsrichtungen der beiden Co-Schichten 70b und 70d aufgrund der Austauschkopplung über die Ru-Schicht 70c antiparallel verlaufen. Die AF-Schicht 70a bewirkt, dass die beiden Co-Schichten 70b, 70d rechtwinklig zur Längsachse der GMR-Streifen 17, 19 magnetisiert werden.
Diese zweite GMR-Struktur 69 hat gegenüber der ersten GMR-Struktur 60 den Vorteil, dass die magnetische Struktur stabiler gegenüber externen Magnetfeldern ist. Außerdem kann aufgrund des Dickenverhältnisses zwischen den beiden Co-Schichten 70b, 70d, die durch die Ru-Schicht 70c getrennt sind, die Kopplung zwischen der fixierten Schicht 70d und der freien Schicht 67 angepasst werden. Dadurch kann die schwache Kopplung zwischen der fixierten Schicht 70d und der freien Schicht 67 über die Cu-Schicht 66 hinweg kompensiert werden. Die Summe aller Kopplungen wird im Wesentlichen auf null eingestellt, sodass die Magnetisierung der freien Schicht 67 bei einem angelegten Null-Feld (keine Partikel) exakt rechtwinklig zur Magnetisierung der fixierten Schicht 70d verläuft (und somit parallel zur Achse der Streifen 17, 19). Je dünner die Cu-Schicht 66 ist, desto höher ist der Magnetwiderstand, desto höher ist aber auch die parallele Kopplung zwischen der freien Schicht 65 und der fixierten Schicht 67 (bzw. zwischen 70d und 67 bei Dicken ab 3 nm). Mit dem magnetostatischen Feld von der Schicht AF 70, dessen Vorzeichen und Größe durch Variieren des Dickenunterschieds zwischen den Schichten 70b und 70d verändert werden kann, kann dies kompensiert werden, was zu einer höheren Empfindlichkeit der MR-Sensoranordnung führt.
Der Durchmesser der Nanopartikel 15, (in 3 nicht dargestellt) ist weitaus kleiner als W. Mit „weitaus kleiner" ist gemeint um einen Faktor von mindestens 10, vorzugsweise von 100 oder mehr.
Es gibt drei Betriebsarten, von denen jede eine separate Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt:

– Messung der Widerstandsänderung bei Anlegen eines Magnetfeldes, das rechtwinklig zur Ebene der Sensorelemente ausgerichtet ist. Drei Ausführungsformen sind bereits oben vorgestellt worden: Messung durch ein einzelnes Element, durch Differenzvergleich zwischen den Ausgangssignalen der Sensorelemente 17, 19 (Wheatstone-Halbbrücke) oder durch eine Wheatstone-Vollbrücke (siehe oben).
– Messung der Magnetisierung, nachdem das Magnetfeld abgeschaltet wurde. In diesem Fall entsteht das Feld, das durch die Sensorelemente 17, 19 gemessen wird, durch die langsame Abnahme (thermische Relaxation) der Magnetisierung bei den an die Sonde gebundenen Partikeln. Die Abnahme der Magnetisierung von nicht gebundenen Partikeln verläuft aufgrund ihrer hohen zufälligen Rotationsbewegung wesentlich schneller. Kurz nach Abschaltung des angelegten Feldes ist deren Netto-Magnetisierung daher vernachlässigbar. Der Nachweis mittels Differenzvergleich (Wheatstone-Halb- und -Vollbrücke) kann in dieser Betriebsart ebenfalls eingesetzt werden.
– Messung der Magnetisierung, nachdem ein in der Ebene liegendes Magnetfeld abgeschaltet wurde. Diese ist eine weniger bevorzugte Ausführungsform. Die Magnetisierung in der Ebene erzeugt in den Sensorelementen 17, 19 ein in der Ebene liegendes Magnetfeld. Dieses in der Ebene liegende Magnetfeld ist jedoch nicht so stark wie das Magnetfeld in der Nähe der Enden der magnetischen Dipole und daher ist die Empfindlichkeit bei dieser Technik geringer. Das gemessene Magnetfeld von den Nanopartikeln entsteht ebenfalls durch die langsame Abnahme (thermische Relaxation) der Magnetisierung bei den an die Sonde gebundenen Partikeln. Die Abnahme der Magnetisierung von nicht gebundenen Partikeln verläuft aufgrund ihrer hohen zufälligen Rotationsbewegung viel schneller. Kurz nach Abschaltung des angelegten Feldes ist deren Netto-Magnetisierung daher vernachlässigbar. In dieser Betriebsart sind jedoch die Ausgangssignale der beiden Sensoren 17, 19 nahezu identisch, sodass anstelle zweier Sensoren ein einzelnes, mittig angeordnetes Sensorelement verwendet werden kann. In einer Wheatstone-Halbbrücke kann die Widerstandsänderung dieses Sensors mit der eines nominell identischen Sensors (Referenz) verglichen werden, der sich unter einem Bereich auf dem Chip befindet, in dem keine Sondenmoleküle und somit keine Kügelchen vorhanden sind. In ähnlicher Weise lässt sich eine Wheatstone-Vollbrücke aufbauen, indem man dazu die Sensoren a und d verwendet, die sich unter einer Sondenregion befinden, und die Sensoren b und c, die sich unter einem Bereich auf dem Chip befinden, in dem keine Sondenmoleküle vorhanden sind.

In der vorliegenden Erfindung werden alle diese Betriebsarten berücksich tigt. Um alle drei Betriebsarten mit einer Anordnung zu realisieren, kann die Sensoranordnung mit Mitteln ausgestattet sein, die entweder ein rechtwinklig zur Ebene des Sondenelements ausgerichtetes Magnetfeld (Betriebsarten 1 und 2) oder ein parallel zur Ebene des Sondenelements ausgerichtetes Magnetfeld in der Ebene der Nanopartikel (Betriebsart 3) oder, falls das gewünscht wird, beide erzeugen. Es können auch Schalter vorgesehen werden, um den Widerstand der Sensorstreifen separat messen zu können oder um z. B. Summen oder Differenzen von Widerständen messen zu können.
Die erforderlichen magnetischen Eigenschaften der superparamagnetischen Partikel 15, insbesondere die Verteilung ihrer Relaxationszeit, sind bei den verschiedenen Betriebsarten unterschiedlich, wie im Folgenden erläutert wird.
Die Auswirkung auf das GMR-Signal, der durch die Zufälligkeit der Positionen der Nanopartikel 15 entsteht, wird ausgemittelt, wenn das Sondenelement 7 in der Y-Richtung lang genug und die Partikeldichte n groß genug sind. Eine typische Anordnung kann aus einem Sondenelement 7 mit der Länge l = 1 mm in Y-Richtung und der Breite W = 3 in X-Richtung enthalten. Die Breite w der GMR-Elemente 17, 19 kann w = 3 μm betragen, wovon sich ungefähr die Hälfte in X-Richtung unter dem Sondenelement 7 befin det. Wenn die Gesamtbreite W₁, die von einem Sondenbereich 5 belegt wird, durch die Breite W jedes Sondenelements 7 gegeben ist, die halbe Breite jedes GMR-Elements 17, 19 plus ein Zuschlag zur Beseitigung von Effekten, die zwischen den Feldern auftreten können, berücksichtigt wird und dieser Zuschlag 5 μm beträgt, dann bleibt auf einem Biochip 1 mit einer Größe von 1 × 1 mm² genügend Platz für 100 Sondenbereiche 5. Das über die Streifen gemittelte Feld bei einem Bereich mit großer Partikelmenge pro Einheit für Nanopartikel 15 mit einer Magnetisierung entlang der positiven X-Achse ist schematisch durch die Feldlinien in den 5A und 5B dargestellt. Es entspricht einem Magnetfeld, das durch zwei an den Rändern der Streifen parallel verlaufende Drähte erzeugt wird, durch die der Strom I = m × n (Gl. 1)fließt. Es wird deutlich, dass die Momente m pro supermagnetischem Partikel 15 bei einem gegebenen Volumen des Partikels 15 so groß wie möglich sein sollten, um ein möglichst großes Magnetfeld zu erhalten.
Die GMR-Elemente 17, 19 messen die X-Komponente des Magnetfeldes, die beim ersten GMR-Element 17 positiv und beim zweiten GMR-Element 19 negativ ist. Wird der Ursprung des Koordinatensystems in die Mitte des ersten GMR-Elements 17 gelegt, dann beträgt die durchschnittliche X-Komponente des Feldes in diesem Element 17
Daher kann H_x,aν vergrößert werden, indem die Breite w der GMR-Elemente 17, 19 gering gehalten und die Tiefe d der GMR-Elemente 17, 19 unter der Substratoberfläche kleiner als oder etwa so groß wie w gewählt wird. Die Wahl einer geringen Breite W des Sondenelements 7 ändert das an den GMR-Elementen 17, 19 erfasste Feld nicht, solange die Breite W des Sondenelements 7 etwa der Breite w der GMR-Elemente 17, 19 und der Tiefe d der GMR-Elemente 17, 19 unter der Substratoberfläche entspricht oder größer ist. Das Feld aufgrund der Nanopartikel 15 auf der Mitte des Sondenelements 7 wird dann nicht nachgewiesen. Andernfalls wird das Signal mit abnehmender Breite W des Sondenelements 7 kleiner. Somit ist es normalerweise nicht vorteilhaft, die Breite W des Sondenelements 7 viel größer zu wählen als die Breite w der GMR-Elemente 17, 19, außer vielleicht aus praktischen Gründen wie der (bereits vorhandenen) Strukturierungstechnologie.
Das Paar von GMR-Elementen 17, 19 mit einem entgegengesetzten Signal kann für eine Wheatstone-Brückenkonfiguration verwendet werden, bei der alle Teile magnetisch identisch sind, d. h., in der in allen Zweigen dieselben Austausch-Vormagnetisierungsrichtungen vorhanden sind. Ein Beispiel für eine derartige Wheatstone-Brücke wird in 8 gegeben. Aufgrund des Wegfalls eines nicht aktiven MR-Referenzelements verdoppelt sich das Signal und ein Gleichtaktsignal (z. B. durch in der Ebene liegende externe Felder oder durch Wärmedrift) wird aufgehoben.
Die Signalspannung ist gegeben durch:
wobei I_sense der Erfassungsstrom,
R_sheet der GMR-Schichtwiderstand,
das Magnetwiderstandsverhältnis bei Ausnutzung des vollen Dynamikbereiches und
(ΔH)_max der Feldbereich ist, in dem das Element vollständig schaltet. Wenn die Form-Anisotropie diesen Bereich bestimmt, dann
wobei t und M_sat die Dicke und die Sättigungsmagnetisierung der freien magnetischen Schicht sind.
Die Kombination der Gleichungen 1 bis 4 führt zu
Es wird angenommen, dass das elektronische Rauschen auf thermisches Rauschen zurückzuführen ist. Der Effektivwert der thermischen Rauschspannung beträgt:
wobei die effektive Messzeit t_meas der Zeit entspricht, während der das Signal gemessen wird, vorausgesetzt, dass unmittelbar vor der Messung die Magnetisierung als null angenommen werden kann (weil die Partikel superparamagnetisch sind). Dadurch wird der Referenzpegel definiert. Das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) beträgt: SNR = V_S/V_N.
Zur korrekten Funktion des Systems in der ersten Betriebsart (Messung der Magnetisierung bei angelegtem Feld) ist es bevorzugt, dass die superparamagnetische Relaxationszeit aller Partikel viel kleiner, mindestens um den Faktor 5, vorzugsweise um den Faktor 10 oder noch kleiner, als die Zeitdauer ist, während der das Feld angelegt ist und während der die Messung durchgeführt wird. Die Magnetisierung der Partikel wird dann nahezu unmittelbar, nachdem das Feld ein- und ausgeschaltet wurde, ebenfalls ein- und ausgeschaltet. In diesem Fall ist die Wechselwirkung der magnetischen Dipole zwischen den Partikeln nach einer Messung vernachlässigbar und die Bindungsreaktion kann weiter vonstatten gehen, ohne durch derartige Wechselwirkungen zwischen den Messungen gestört zu werden. Dazu ist erforderlich, dass die magnetischen Partikel in den Nanokügelchen ein ausreichend kleines Produkt aus dem Volumen V und der magnetischen Anisotropiekonstante K aufweisen. In der ersten Betriebsart dürfen sich die Partikel 15, die nicht an Chip 1 gebunden sind, während der Messung nicht an der Schnittstelle des Chips befinden. Dies lässt sich erreichen durch einen Waschschritt unmittelbar vor jeder Messung oder durch die vorübergehende Verlagerung der nicht gebundenen Partikel vom Chip 1 unmittelbar nach dem Anlegen eines Feldes plus einem Feldgradienten parallel zur normalen Richtung. Die resultierende Kraft sollte ausreichen, um die Partikel wenige Mikrometer über die Chipoberfläche zu verlagern (wo ihr Dipolfeld an der Oberfläche gering ist und wo ihre Positionen in Bezug auf die GMR-Elemente 17, 19 ausreichend zufälliger Natur sind, sodass auch aus diesem Grund das Nettosignal vernachlässigbar ist). Auf der anderen Seite muss die Kraft kleiner sein als die zum Aufbrechen einer Bindung erforderliche Kraft.
In der zweiten (und dritten) Betriebsart (Messung der Magnetisierung, nachdem das Feld abgeschaltet wurde), wird zunächst ein Feld während eines Zeitraums t_f angelegt, und nach dem Abschalten des Feldes werden p Messungen des abklingenden Signals in einem Zeitraum p × t_meas ≈ t_f durchgeführt. Im Idealfall sollten unmittelbar, nachdem das magnetisierende Feld abgeschaltet ist, alle superparamagnetischen Partikel 15 vollständig magnetisiert sein, aber nach einer Folge von p Messungen sollten alle Partikel 15 ihre Magnetisierung verloren haben. Andernfalls würden die Partikel 15 während der Reaktionsperioden zwischen den Messperioden in eine magnetische Wechselwirkung treten. Dies würde bedeuten, dass nur Partikel 15 verwendet werden können, deren Relaxationszeit kleiner ist als t_f Durch Verwendung angelegter Felder mit wechselnden Vorzeichen in aufeinander folgenden Messzyklen kann man verhindern, dass ein kleiner unerwünschter Bruchteil gebundener Partikel 15 mit einer größeren Relaxationszeit als t_f ein magnetisches Gesamt moment aufbaut, das monoton mit der Anzahl abgeschlossener Messzyklen zunimmt und das zwischen den Zeiträumen, in denen das Feld angelegt ist, nicht bis auf null abklingt. Andererseits muss die Relaxationszeit größer als t_meas sein, da sonst selbst die erste Messung nach dem Abschalten des Feldes kein Signal ergeben würde.
Die obige Darstellung bedeutet praktisch, dass die Relaxationszeit zwischen 1 ms und 1 s liegen sollte (siehe unten). Dies ist eine schwieriger zu erfüllende Anforderung als bei der ersten Betriebsart. Partikel, die aus diesem Bereich herausfallen, tragen nicht zum Signal bei und sollten im Idealfall nicht vorhanden sein. Der Partikeldurchmesser sollte daher in sehr guter Annäherung monodispers sein. Ein Verfahren zur Schaffung derartiger Partikel ist bekannt und in „Monodisperse FePt Nanoparticles and Ferromagnetic Nanocrystal Superlattices" von S. Sun et al. in Science, 287, 1989–1992 (2000), beschrieben.
Das Signal-Rausch-Verhältnis wird für ein System gemäß der folgenden Tabelle, in der die Parameter für das Beispiel angegeben sind, für handelsübliche magnetische Partikel mit 35 nm Durchmesser, wie z. B. Magnetitpartikel (Fe₃O₄), berechnet.
Das angegebene Moment m ist das Sättigungsmoment, das man bereits erhält, wenn die angelegte Feldstärke höher als 1,2 kA/m ist.. Die Spannung über jedem MR-Element beträgt 10 V. Die Leistung während einer Messung beträgt pro Sonde 20 mW. Die numerischen Ergebnisse sind folgende:
Wenn man annimmt, dass das minimale Signal-Rausch-Verhältnis, das zum Nachweis der Nanopartikel 15 erforderlich ist, 10 (20 dB) beträgt, errechnet sich die minimale nachweisbare Flächendichte von Nanopartikeln n_min wie folgt:
Die minimale Anzahl nachweisbarer Partikel auf einer Sondenfläche von 10^–8 m² (100 μm × 100 μm) beträgt:
Die obige Theorie versagt, wenn die absolute Anzahl von Partikeln pro Sondenfläche zu klein ist. Eine Untergrenze kann die Zahl 50 sein. Dies bedeutet, dass die Erhöhung der Messzeit t_meas zu einer Verringerung der minimalen Anzahl nachweisbarer Nanopartikel führt, bis t_meas die Größenordnung von 1 ms erreicht hat. Glücklicherweise liegt diese Messzeit weit unter der angestrebten Wiederholzeit der Messungen (100 Messungen in 3 Minuten). Eine längere Messzeit ist nicht von Nutzen. Daraus ist zu schließen, dass für die verwendeten Parameter und unter der Bedingung t_meas > 1 ms die minimale Anzahl von Partikeln, die exakt gemessen werden kann, 50 auf einer Sondenfläche, durch die Statistik und nicht durch die Empfindlichkeit des GMR-Sensors bestimmt ist.
Die maximal messbare Flächendichte von Partikeln entspricht dem niedrigeren der beiden folgenden Dichtewerte:
Die Dichte, oberhalb der die Wechselwirkung der magnetischen Dipole zwischen den Partikeln, die sterische Hinderung, zu stark wird. Bei 35-nm-Partikeln kann dies bei einer Dichte in der Größenordnung von 100 Partikeln pro μm² sein.
Die Dichte, oberhalb der das Feld von den Partikeln den GMR-Sensor sättigt. In der verwendeten Kontinuumapproximation geschieht dies, wenn H_x,aν > 1/2ΔH_sat, d. h. bei einer Dichte in der Größenordnung von etwa 960 Partikeln pro μm².
Keine der beiden Dichten ist von der Messzeit t_meas abhängig. Im gegebenen Beispiel bestimmt normalerweise die Wechselwirkung zwischen den Partikeln und nicht das GMR-Sättigungsfeld die maximal messbare Anzahl von Partikeln.
In der ersten Betriebsart beträgt der zeitliche Mittelwert der Leistungsabgabe 2 mW, wobei 100 Sonden und ein Tastverhältnis von 1:1000 für jede Sonde (eine Messung pro Sekunde mit einer Dauer von 1 ms) angenommen werden. Analog dazu beträgt bei der zweiten Betriebsart der Wert der Leistungsabgabe p × 2 mW, wobei p die Anzahl von 1-ms-Messintervallen pro Zyklus ist.
Bei der zweiten Betriebsart kann das 1/f-Rauschen wichtig werden, besonders dann, wenn der Zeitraum, während dessen das Abklingen des Signals gemessen wird, bis zu einer Sekunde lang ist.
Die obigen Resultate können wie folgt verallgemeinert werden: Die Flächendichte von Partikeln, die nachgewiesen werden können, sollte nicht unter der Dichte n.(stat) liegen, die dem statistisch ermittelten Wert von ≈ 50 Partikeln pro Sonde entspricht, unter der die obige Theorie versagt. Bei Sonden mit einer Fläche von 10⁴ μm² ist n_(stat) = 0,005/μm². Die messbare Flächendichte von Partikeln ist deutlich geringer als die Dichte n₊(int), bei der die Wechselwirkungen zwischen den Partikeln bzw. die sterische Hinderung zu groß wird. Es wird angenommen, dass n₊(int) ≈ 1,25 × 10⁵/d², wobei d der Partikeldurchmesser in nm ist. Somit beträgt, unabhängig von der Empfindlichkeit der verwendeten GMR-Elemente, der Messzeit und den magnetischen Momenten der Partikel, die höchstmögliche Breite des Dynamikbereichs:
max. dynamischer Bereich
Von diesem Standpunkt aus betrachtet ist die Verwendung kleiner Partikel vorteilhaft, da die Breite des Dynamikbereichs vergrößert wird. Die tatsächliche Untergren ze für die Dichte wird jedoch möglicherweise nicht durch n.(stat) gegeben, sondern durch einen Wert n_(sens) = n_min, der von der Empfindlichkeit des GMR-Sensors abhängt. Dies ist bei n_(sens) > n_(stat) der Fall. Der Wert von n_(sens) ist umgekehrt proportional zum Partikelvolumen und zur Quadratwurzel der Messzeit. Außerdem ist der obere Grenzwert der Dichte nicht durch n₊(int) gegeben, sondern durch die Dichte n₊(satur), bei der das GMR-Element gesättigt ist, wenn n₊(satur) < n₊(int). Unter den angenommenen Bedingungen ist n₊(satur) = 4,11 × 10⁷/d³
10 ist eine grafische Darstellung der Flächendichte (in Partikeln/μm²) als Funktion des Partikeldurchmessers (in nm). Aus dem Diagramm kann für das betrachtete System mit den in der obigen Tabelle angegebenen Parameterwerten und für eine Messzeit von 1 ms ein Dynamikbereich als Funktion des Durchmessers der magnetischen Partikel abgeleitet werden. Die Obergrenzen des Dynamikbereichs sind für größere Partikeldurchmesser aufgrund der Sättigung des magnetoresistiven Elements durch n₊(satur) und für kleinere Partikeldurchmesser aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den Partikeln bzw. die sterische Hinderung durch n₊(int) gegeben. Die Untergrenzen des Dynamikbereichs sind für größere Partikeldurchmesser aufgrund der statistischen (zufälligen) Position der Partikel auf der Sondenfläche durch n.(stat) und für kleinere Partikeldurchmesser aufgrund der Empfindlichkeit des magnetoresistiven Elements durch n.(sens) gegeben. Die Gesamtobergrenze der Empfindlichkeit ist durch Linie 30 und die Gesamtuntergrenze durch Linie 31 angegeben. Der Dynamikbereich für 35-nm-Partikel ist durch den Doppelpfeil 32 angegeben. Aus 10 ist zu erkennen, dass bei einer angenommenen Messzeit von 1 ms der Partikelradius von 35 nm optimal ist. Eine Abnahme des Sättigungsfeldes des MR-Elements oder eine Zunahme der Partikelmagnetisierung führen zu einer parallelen Abwärtsverschiebung der Linien für n_(sens) und n₊(satur). Einzeln oder zusammen könnten diese beiden Verbesserungen des Systems den optimalen Durchmesser auf bestenfalls etwa 10 nm ändern, was zu einem Dynamikbereich von 2 × 10⁵ führt.
Anzumerken ist, dass aus Gründen der Vereinfachung angenommen wurde, dass das Magnetisierungsfeld die Partikel vollständig magnetisieren kann. Bei einem maximalen Magnetisierungsfeld von l 15 kA/m versagt diese Annahme, wenn der Partikelradius unter etwa 10 nm liegt. Die tatsächlichen Werte von n_(sens) sind dann höher als in 10 angegeben.
Texte zu den Figuren
1

magnetisches Kügelchen
Streptavidin
biotinylierte Proben-DNA
Sonden-DNA
GMR-Sensor
PEG

2

angelegtes Feld (Oe)
Widerstand (kOhm)

10

Partikeldurchmesser (nm)
Flächendichte (Partikel/μm²)
[übrige Erläuterungen wie Original]

Claims

Magnetoresistive Sensoranordnung zum Bestimmen des Vorhandenseins oder einer Flächendichte von magnetischen Nanopartikeln (15), die direkt oder indirekt an ein Ziel (11) gekoppelt sind, wobei die magnetoresistive Sensoranordnung mindestens ein auf einem Substrat (3) befindliches Sondenelement (7) umfasst, das Bindungsstellen (9) hat, die ein Ziel (11) selektiv binden können, sowie einen magnetoresistiven Sensor zum Nachweis des Magnetfelds von magnetischen Nanopartikeln (15) zumindest dann, wenn sie an das Ziel gekoppelt sind, wobei der magnetoresistive Sensor Paare von ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) oder erste und zweite Gruppen von magnetoresistiven Erfassungselementen umfasst und jedes Paar einem Sondenelement (7) zugeordnet und parallel zu diesem angeordnet ist, und die Ausgangssignale der ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselemente (17, 19) oder der ersten und zweiten Gruppen von magnetoresistiven Erfassungselementen einer Komparatorschaltung zugeführt werden.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 1, die des Weiteren Mittel zum Erzeugen eines Magnetfeldes umfasst, das rechtwinklig zu den magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) ausgerichtet ist.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 1, bei der ein Sondenbereich (5) vorhanden ist, der mindestens ein Sondenelement (7) hat, und bei im Wesentlichen rechtwinkliger Projektion ein überlappender Bereich zwischen den magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) und dem Sondenbereich (5) vorhanden ist.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 1, die des Weiteren Mittel zum Erzeugen eines Magnetfeldes umfasst, das parallel zu den magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) ausgerichtet ist.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Länge und Breite der magnetoresistiven Erfassungselemente (17, 19) mindestens um den Faktor 10, vorzugsweise um den Faktor 100, größer sind als der durchschnittliche Durchmesser der Nanopartikel (15).
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Anordnung ein Mikroarray ist.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselemente (17, 19) Giantmagnetoresistive Elemente (GMR-Elemente) sind.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei der die ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselemente (17, 19) Tunnelmagnetoresistive Elemente (TMR-Elemente) sind.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei der die ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselemente (17, 19) anisotrope magnetoresistive Elemente (AMR-Elemente) sind.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 7 bis 9, bei der ein Paar magnetoresistiver Erfassungselemente (17, 19) eine Wheatstone-Brücke oder eine Wheatstone-Halbbrücke bilden.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der jedes magnetoresistive Erfassungselement (17, 19) eines Paares von ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) oder von Gruppen von ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselementen in derselben Richtung vormagnetisiert ist.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 1, 10, bei der jedes magnetoresistive Erfassungselement (17, 19) einen Streifen magnetoresistiven Materials umfasst und das magnetoresistive Material eine lineare und hysteresefreie Widerstand/Magnetfeld-Kurve hat.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 1, bei der die Komparatorschaltung in eine weitere elektronische Schaltung im Substrat (3) integriert ist.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 12, bei der die Breite der magnetoresistiven Erfassungselemente (17, 19) mindesten 50 %, vorzugsweise mindestens 60 %, am meisten bevorzugt mindestens 70 %, der Breite des Sondenelements (7) beträgt.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 12, bei der der Abstand der magnetoresistiven Erfassungselemente (17, 19) zum Sondenelement (7) kleiner als die Breite der magnetoresistiven Erfassungselemente (17, 19) ist.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die magnetischen Nanopartikel (15) superparamagnetisch sind.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Sensoranordnung eine strukturierte Oberfläche hat.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 17, bei der die strukturierte Oberfläche ein Stufenprofil hat.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 17, bei der die strukturierte Oberfläche ein Gradientenprofil hat.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, bei der die strukturierte Oberfläche eine chemisch strukturierte Oberfläche ist.
Magnetoresistive Sensoranordnung nach Anspruch 20, bei der man die chemisch strukturierte Oberfläche dadurch erhält, dass nur auf einem Teil der Oberfläche Bindungsstellen (9) vorhanden sind.
Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins oder zum Messen einer Flächendichte von magnetischen Nanopartikeln (15) auf einem Substrat (3), das die folgenden Schritte umfasst: – Binden eines Ziels (11) an selektiv wirkende Bindungsstellen (9) an mindestens einem Sondenelement (7), das auf einem Substrat (3) angeordnet ist, wobei das Ziel (11) direkt oder indirekt mit magnetischen Nanopartikeln (15) markiert ist, – Erfassen des Vorhandenseins der an eine Bindungsstelle (9) gebundenen magnetischen Nanopartikel (15), um dadurch das Vorhandensein oder die Dichte des Ziels (11) zu bestimmen, das mit magnetischen Nanopartikeln (15) markiert ist, – wobei der Erfassungsschritt durch Extrahieren zweier Signale ausgeführt wird, die von dem Magnetfeld abgeleitet werden, das durch die an die Bindungsstellen (9) gebundenen Nanopartikel (15) erzeugt wird, und zum Erfassen Paare von ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) oder erste und zweite Gruppen von magnetoresistiven Erfassungselementen verwendet werden und jedes Paar mindestens einem Sondenelement (7) zugeordnet und parallel zu diesem angeordnet ist, und – Bestimmen der Differenz zwischen den beiden Signalen.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem ein Magnetfeld rechtwinklig zu den magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) angelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem ein Magnetfeld parallel zu den magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) angelegt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, bei dem der Erfassungsschritt mit Hilfe eines magnetoresistiven Sensors ausgeführt wird, der eine Vielzahl von Giant-Magnetoresistive-Erfassungselementen (GMR-Erfassungselemente) (17, 19) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, bei dem der Erfassungsschritt mit Hilfe eines magnetoresistiven Sensors ausgeführt wird, der eine Vielzahl von Tunnel-Magnetoresistive-Erfassungselementen (TMR-Erfassungselemente) (17, 19) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, bei dem der Erfassungsschritt mit Hilfe eines magnetoresistiven Sensors ausgeführt wird, der eine Vielzahl von anisotropen magnetoresistiven Erfassungselementen (AMR-Erfassungselemente) (17, 19) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22, 25 bis 27, bei dem der Erfassungsschritt mit Hilfe einer Wheatstone-Brücke oder einer Wheatstone-Halbbrücke ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 28, bei dem der Bindungsschritt und der Erfassungsschritt an einer Vielzahl von Sondenelementen (7) auf einem Mikroarray (1) ausgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 29, bei dem die Nanopartikel (15) superparamagnetisch sind.
Verfahren zum Nachweisen eines Ziels (11) in einer Flüssigkeit, das folgende Schritte umfasst: – Binden eines Ziels (11) an selektiv wirkende Bindungsstellen (9) an mindestens einem Sondenelement (7), das sich auf dem Substrat (3) befindet, wobei das Ziel (11) direkt oder indirekt mit magnetischen Nanopartikeln (15) markiert ist, – Erfassen des Vorhandenseins der an die Bindungsstellen (9) gebundenen magnetischen Nanopartikel (15), um dadurch das Vorhandensein oder die Dichte des Ziels (11) zu bestimmen, das mit magnetischen Nanopartikeln (15 ) markiert ist, – wobei der Erfassungsschritt durch Extrahieren zweier Signale ausgeführt wird, die von dem Magnetfeld abgeleitet werden, das durch die an die Bindungsstellen (9) gebundenen Nanopartikel (15) erzeugt wird, und zum Erfassen Paare von ersten und zweiten magnetoresistiven Erfassungselementen (17, 19) oder erste und zweite Gruppen von magnetoresistiven Erfassungselementen verwendet werden und jedes Paar mindestens einem Sondenelement (7) zugeordnet und parallel zu diesem angeordnet ist, und – Bestimmen der Differenz zwischen den beiden Signalen.
Verfahren nach Anspruch 31, bei dem die Flüssigkeit Blut ist.
Verfahren nach Anspruch 31, bei dem die Flüssigkeit Urin ist.
Verfahren zum Nachweisen einer ausgewählten Art von Molekülen in einer Flüssigkeit, bei dem ein Mittel, das magnetische Nanopartikel (15) enthält, einer Flüssigkeit zugesetzt wird und das Mittel mit der ausgewählten Art von Molekülen chemisch reagiert und dadurch ein Ziel (11) bildet und bei dem das Ziel (11) durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33 nachgewiesen wird.