DE102007015543A1

DE102007015543A1 - Verfahren und Anordnung zur Detektion biologischer Reaktionsprodukte

Info

Publication number: DE102007015543A1
Application number: DE102007015543A
Authority: DE
Inventors: Joachim Dr. Bangert
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2007-03-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2008-10-09

Abstract

Insbesondere bei einem Verfahren zur Durchführung einer PCR wird beim Labeln des Primers eine Bionitilisierung durchgeführt, an die Bionitilisierung die DNA aufgeschmolzen und erfolgt eine Reaktion Streparidin-beschichteter Magnet-Beads. Erfindungsgemäß wird ein inhomogenes Magnetfeld in der Weise angelegt, dass der Feldgradient auf die Magnet-Beads einwirkt und die Magnet-Beads zur Oberfläche gelangen. Damit wird eine Beschleunigung des Assays erreicht. Bei der zugehörigen Einrichtung mit einem Assay und mit einem Label versehenen PCR-Produkt besteht das Label aus Magnet-Beads und wird das Assay magnetisch beschleunigt, wozu Mittel zur Erzeugung von zumindest einem inhomogenen Magnetfeld mit Feldgradient vorhanden sind.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion biologischer Reaktionsprodukte. Daneben bezieht sich die Erfindung auch auf eine Anordnung zur Durchführung des Verfahrens.
Die Detektion biologischer Reaktionen wird meist durch die Messung einer physikalischen Größe ersetzt. Die praktische Umsetzung der Messung findet im Allgemeinen durch das Anbringen eines Labels statt, teilweise direkt oder indirekt über eine vorhandene Biotin/Avidin-Gruppe. Beispielsweise hierfür sind Fluoreszenz-Label für eine optische Detektion, oft als direkt eingebaute Fluoreszenzgruppe (z. B. Tetramethylrhodamin-5-2'-deoxy-uridin-5'-triphosphat) oder bestimmte Enzyme zur indirekten elektrische Detektion.
Die biologischen Fragestellungen betreffen insbesondere eine DNA-Diagnostik, aber ggf. auch eine Protein-, Enzym- und/oder Hapten-Analyse. Ergänzen lassen sich diese Fragestellungen um Analysen anderer physikalischer oder chemischer Parameter, wie beispielsweise pH-Wert oder Anwesenheit bestimmter Molekülgruppen (z. B. COOH).
Kleine Mengen von biologischen Reaktionen können mit optischen Methoden nicht gefunden werden. Daher sind jeweils geeignete Verstärkungsmechanismen (sog. Amplifikationen) erforderlich. Kleinste Mengen der biologischen Reaktion können auch mit enzymatischen Methoden nicht sicher detektiert werden, so dass auch hier eine Amplifikation erfolgt.
Für die DNA-Analyse ist das wichtigste Amplifikations-Verfahren die PCR (Polymerase Chain Reaktion = Polymerase-Kettenreaktion). Dabei können Label verwendet werden, die so wohl eingebaut werden (Triphosphat) als auch im Start- oder bei ggf. vorhandenem Stop-Primer vorhanden sein können.
Der Ablauf des PCR-Zyklus erfolgt sehr stark vereinfacht mit folgenden Schritten:

– Trennen der DNA in Halbstränge ('aufschmelzen');
– Andocken des Primers neben der gesuchten Stelle ('hybridisieren');
– Elongation der DNA, beginnend am Primer für eine gewisse Zeit bzw. DNA-Länge;
– Wiederholung des Zyklus.

Die theoretisch vorgesehene Verdopplung der DNA in jedem Schritt wird in der Praxis nicht erreicht. Fehler können durch verschiedene Ursachen entstehen, z. B. durch Mutationen der Replizierung. Daher ist eine geringe Anzahl der Zyklen von Vorteil. Dies macht aber nur dann Sinn, wenn der physikalische Effekt trotzdem genau und empfindlich detektiert werden kann.
Ein derzeit in der Entwicklung befindliches indirektes Label ist das magnetische Bead, kurz Magnet-Bead oder auch Bead genannt. Das Bead wird mit Streptavidin beschichtet. Biotin wird bei der biologischen Reaktion mit eingebaut und bindet fest am Streptavidin, wenn sich die Reaktionspartner begegnen. Die detektierbare physikalische Größe ist die induzierte Magnetisierung des Beads. Das Bead wird durch Magnetfeldsensoren detektiert. Die detektierten Beads dienen als Maß für die erfolgte biologische Reaktion. Im Prinzip kann ein einzelnes Bead detektiert werden.
Die Magnetfeldsensoren zur Magnetfeldmessung befinden sich auf der Oberfläche eines Wafers. Daher müssen die Rektionspartner und das Bead an die Oberfläche gebracht werden und i. A. dort auch immobilisiert werden. Immobilisierung findet durch eine Reaktion eines Fängerhalbstranges mit dem PCR-Produkt statt, was sich – im Prinzip selbsterklärend – aus den 1 bis 3 der Zeichnung ergibt.
Die Reaktions-Kinetik an Oberflächen unterscheidet sich allerdings signifikant von der Volumenkinetik. Die Ausbeute des Andockprozesses (Fänger-Produkt-Hybridisierung) ist z. B. wegen der geringeren Beweglichkeit an einer Oberfläche geringer. Die PCR-Produkte 'wissen' nicht, dass irgendwo Fänger warten. Ebenso ist der zweite Schritt (Bead/Streptavidin/Biotin) an der Oberfläche kritisch, da auch die Beads nichts vom Biotin 'wissen'. Im Gegensatz zur Volumenkinetik bewegen sich die immobilisierten Stränge auch nicht dem Reaktionspartner entgegen.
Aus der WO 99/36577 A ist ein Assay für biochemische Messungen mit magnetischen Beads und Kraftdiskriminierung vorbekannt, bei dem die Kräfte durch Magnetfeldgradienten erzeugt werden. Diese Kräfte sollen derart zum Einsatz kommen, dass unspezifisch gebundene magnetische Label, d. h. Beads, von der Reaktionsfläche weg bewegt werden. Sollten Label spezifisch gebunden sein, verbleiben sie an der Reaktionsfläche und zeigen damit die Anwesenheit der Zielmoleküle. Gemäß der US 2004/253744 A können bei gegebener Größe und definierter Labelstruktur definierte Kräfte zum Entfernen der Label erzeugt werden.
Bei den vorstehend beschriebenen Verfahrensabläufen lässt sich zwar Label, insbesondere ein einzelnes Bead, verbessert detektieren. Die Wahrscheinlichkeit für ein erfolgreiches Andocken und Detektieren eines einzelnen Reaktionsprodukts ist jedoch an einer Oberfläche gering. Die bisher beim Stand der Technik dokumentierten Ausbeuten an immobilisierten Beads wird dort regelmäßig nur durch eine verlängerte Wartezeit erreicht.
Eine prinzipiell ähnliche Problematik liegt bei der Protein- bzw. Enzymanalyse vor, bei denen zwar keine PCR durchgeführt wird, aber ebenfalls zur Detektion der Reaktionsprodukte Magnet-Beads einsetzbar sind. Gleiches gilt für die Untersuchung von Haptenen.
Davon ausgehend ist es Aufgabe der Erfindung, die angegebenen biologischen Detektionsverfahren zu verbessern und zugehörige Anordnungen zur praxisgerechten Realisierung der Verfahren schaffen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Maßnahmen gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst. Eine zugehörige Anordnung ist Gegenstand des Patentanspruches 11. Weiterbildungen des Verfahrens, insbesondere für spezifische Anwendungen, und der zugehörigen Anordnung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Kern der Erfindung ist die Verwendung von inhomogenen Magnetfeldern mit gezielter Vorgabe der Magnetfeldgradienten zwecks richtungsgesteuerter Bewegung von Magnet-Beads als Marker bei der Detektion und Analyse bei biologischen Reaktionsprodukten. Damit wird eine Beschleunigung des Assays erreicht.
Die Erfindung wird vorzugsweise für eine PCR im Rahmen der DNA-Diagnostik verwendet. Neben der spezifischen DNA-Diagnostik kann die Erfindung aber auch im Rahmen von allgemeineren biologischen Fragestellungen mit der Reaktion von biologisch aktiven Molekülen, beispielsweise bei der Detektion von Proteinen, Enzymen und/oder Haptenen, eingesetzt werden.
Speziell bei der Realisierung der Erfindung für die Durchführung einer PCR im Rahmen der DNA-Diagnostik wird vorgeschlagen, die Ausbeute dadurch zu erhöhen, dass die PCR-Produkte 'abgeholt' und gezielt zur Sensoroberfläche geführt werden. Dazu sind folgende Schritte im Assay vorzunehmen:

– Biotinilisierung ('Labeln') des Primers oder Verwendung eines biotinilisierten Triphosphats bei der PCR;
– Aufschmelzen der DNA;
– Reaktion des PCR-Produkts mit Strepavidin-beschichteten Beads (sog 'scharfe Beads');
– Anlegen eines inhomogenen Magnetfeldes (sog. Transport-Feld) in der Art, dass die Beads zur Sensor-Oberfläche gelangen.

Bei letzterer Vorgehensweise kann mit der Erfindung erreicht werden, dass innerhalb von Sekunden sämtliche Beads zur Oberfläche des Sensors gezogen werden, wobei sowohl gelabelte, d. h. 'scharfe' Beads, als auch 'unscharfe' Beads betroffen sind. Dabei ist es auch vorteilhafterweise möglich, die Magnetfeldsensoren so auszulegen, dass die Annäherung der Beads mitverfolgt werden kann.
Der zweite Schritt erhöht die Ausbeute der Hybridisierung durch Anlegen eines inhomogenen Magnetfeldes (Hybridisierungs-Feld) in der Art, dass die Beads parallel zur Oberfläche bewegt werden, aber keine scharfen Bindungen abgerissen werden.
Das Angebot an Halbsträngen wird durch die Lateralbewegung erhöht. Es ist denkbar, die Magnetfeldsensoren so auszulegen, dass die Bewegung der Beads mitverfolgt werden kann. Sichtbar ist das Andocken der scharfen Beads als Ausbleiben der durch das Magnetfeld versuchten Bewegung. Eine entsprechende Software kann Hinweise auf erfolgreiches Andocken entnehmen.
Der dritte Schritt entfernt ungebundene Beads (analog zu biologischen Schritten 'Waschung' genannt) durch Anlegen eines inhomogenen Magnetfeldes ('Wasch-Feld') in der Art, dass die Beads von der Oberfläche weggezogen werden, aber keine Bindungen abgerissen werden.
Beads haften durch Adhäsion an der Oberfläche oder an anderen Beads, die Bindungskräfte sind jedoch sehr viel kleiner als die Kräfte der Biotin-Bindung.
Obige Verfahrensschritte können ggf. wiederholt werden. Damit wird ein magnetisch beschleunigtes Assay mit gelabeltem PCR-Produkt gebildet.
Mit der Erfindung ist also ein verbessertes Assay geschaffen, das die Vorteile der Magnetisierbarkeit magnetischer Beads zusätzlich zur eigentlichen Detektion der biologischen Reaktion auch zur Reaktionswahrscheinlichkeitserhöhung, zur stringenten Waschung und auch zur Online-Kontrolle der Beadkinetik nutzt.
Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen.
Es zeigen
1 bis 3 bekannte methodische Teilschritte bei der DNA-Analyse mittels magnetischer Verfahren unter Einsatz von Magnet-Beads gemäß dem Stand der Technik,
4 und 5 Einrichtungen zur Erzeugung inhomogener Magnetfelder,
6 methodisch das Andocken von Beads am Biotin ohne externes Magnetfeld,
7 einen Transfer von Beads unter dem Einfluss eines externen, inhomogenen Magnetfeldes,
8 die geometrische Verdeutlichung des Feldgradienten beim inhomogenen Magnetfeld gemäß 7,
9 methodisch den Transfer der Beads in Richtung auf die Sensoroberfläche mittels eines externen Magnetfeldes,
10 eine alternative Anwendung der beschrieben Vorgehensweise bei Proteinen und
11 ein zusammenfassendes Ablauf-Diagramm bei der für unterschiedliche Anwendungen beschriebenen Vorgehensweise.
Auf die 1 bis 3 wurde einleitend bereits bei der Diskussion des relevanten Standes der Technik eingegangen, worauf erneut verwiesen wird. Es wird dabei von aufgeschmolzenen DNA-Halbspiralen ausgegangen.
In den 1 bis 3 bedeuten 1 eine Bindungsfläche, 10 ein an die Fläche 1 gebundener Fänger-Halbstrang einer DNA-Halbspirale 11, 20 den freien Teil des Fängers der anderen DNA-Halbspirale 21 mit Biotin-Label 22 und 30 ein beschichtetes Bead aus einem magnetisierbaren Partikel 31 mit einer Streptavidin-Beschichtung 32. H_ST bedeutet schließlich ein vom Bead 30 erzeugtes magnetisches Streufeld.
In 1 ist an der Oberfläche 1 der gebundene Fänger-Halbstrang 10 und der freie Teil 20 der DNA-Spirale mit Biotin 22 vorhanden. In 2 erfolgt ein Andocken komplementärer Halbstränge 10 und 20, wobei das Biotin 22 noch ungebunden ist. In 3 ist ein spezifisches mit Streptavidin beschichtetes Bead 30 an das Biotin 22 gebunden, andere Beads 30_i sind dagegen frei. Die Beads 30_i sind magnetisch bzw. magnetisierbar, wobei ein gebundenes Bead 30 das Streufeld H_ST an der Bindungsstelle des Stranges 10, 20 zur Detektionsfläche generiert, das mit geeigneten Mitteln gemessen werden kann.
Letztere Vorgehensweise ist vom Stand der Technik im Rahmen von DNA-Analysen bekannt. Diese Vorgehensweise wir nunmehr durch den gezielten Einsatz von Magnetkräften verbessert.
In Ergänzung zu den 1 bis 3 wird zunächst das beim Stand der Technik verwendete Label beschrieben und zwar:

a) Im Primer: Beispielsweise 5'-biotin-labelled oligo(dT)-XbaI-NotI primer;
b) im DNA-Strang: Beispielsweise Biotin-16-2',3'-didesoxy-uridin-5'-triphosphat und/oder Biotin-ε-aminocaproyl-γ-aminobutyryl-[5-(3-aminoallyl)-2',3'-didesoxy-uridin-5'-triphosphat (≙ C₃₂H₄₈O₁₇N₇P₃S).

Im Einzelnen werden nunmehr solche biotinylierte Desoxynucleotidtriphosphate (dNTP), d. h. das Biotin-16-2',3'-didesoxy-uridin-5'-triphosphat und/oder das Biotin-ε-aminocaproyl-γ-aminobutyryl-[5-(3-aminoallyl)-2',3'-didesoxy- uridin-5'-triphosphat (≙ C₃₂H₄₈O₁₇N₇P₃S), verwendet, die durch nachfolgende Strukturformel charakterisiert sind:
Zur Durchführung des neuen Verfahrens werden die Magnet-Beads 30_i durch vorgebbare Magnetfeldgradienten nacheinander in mehreren Richtungen bewegt. Dazu sind inhomogene Magnetfelder in diesen Richtungen notwendig. Die Inhomogenität von Magnetfeldern kann bekannterweise durch entsprechende Spulen- und/oder Jochgeometrien eingestellt werden, wobei geeignete Feldverläufe vorgebbar sind. Im vorliegenden Zusammenhang bieten sich kegelförmige, d. h. achsensymmetrische oder keilförmige, d. h. flächensymmetrische, Feldverläufe an.
Eine Anordnung zur Realisierung solcher Feldverläufe unter Einsatz von inhomogenen Magnetfeldern ist in der älteren deutschen Patentanmeldung AZ 10 2006 037739.7 der Anmelderin mit der Bezeichnung „Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens, insbesondere zur Erkennung biochemischer Moleküle und mit dieser Vorrichtung ausführbare Analyseverfahren" bekannt
In den 4 und 5 sind vom Stand der Technik bekannte Anordnungen dargestellt, mit denen wahlweise homogene oder inhomogene Magnetfelder vorgegeben werden können, wobei bei letzterem geeignete Feldgradienten vorgebbar sind:
In 4 ist zur praktischen Realisierung gezeigt, dass bei einer Anordnung aus im Abstand angeordneten Spulen jeweils zwei in einer Ebene konzentrische Spulen 309, 310 bzw. 312, 313 ein Spulensystem und zwei in unterschiedlichen Ebenen liegenden ungleichen Spulen 309, 312, bzw. 310, 312 ein Spulenpaar bilden. Mit einer solchen Anordnung können bei Ansteuerung eines Spulenpaares in homogene Magnetfelder mit unterschiedlichen Gradienten generiert werden. Es ist auch möglich, durch Ansteuerung gleich großer Spulen homogene Magnetfelder zu erzeugen.
Das Prinzip von Spulenpaar/Spulensystem ermöglicht, in einfacher Weise geeignete Magnetfelder im Analysebereich der Durchflusszelle zu erzeugen und wird weiterhin als sog. Magnetfeldmittel bezeichnet. Mit dieser einfachen Anordnung können wahlfrei homogene und inhomogene Felder mit Feldänderungen im Mikrosekundenbereich erzeugt werden, indem wahlweise jeweils die geeigneten Spulen angesteuert bzw. bestromt werden, was einzeln oder gleichzeitig erfolgen kann.
Wie bereits erwähnt umfassen die technischen Mittel ein erstes, aus zwei axial beabstandeten, mit ihren Windungsebenen etwa parallel zur Planebene des Analysebereichs angeordneten, das Substrat zwischen sich einschließenden Spulen gebildetes Spulenpaar, wobei die auf der Analyseseite des Substrats angeordnete Spule einen kleineren Durchmesser aufweist als die andere Spule. Ein damit erzeugtes Magnetfeld ist hinsichtlich seiner Feldstärke anisotrop. Diese nimmt in Richtung der Normalen des – im Wesentlichen in einer Planebene verlaufenden – Analysebereichs zu. Vorzugsweise ist zur Erzeugung eines umgekehrt ausgerichteten Magnetfeldes ein zweites Spulenpaar vorhanden, das wie das erste Spulenpaar ausgestaltet und angeordnet ist, wobei jedoch die Spule mit dem größeren Durchmesser auf der Analyseseite des Substrats angeordnet ist. Es ergeben sich also zwei Spulenpaare, die gespiegelt angeordnet sind. Die jeweils oberen und unteren Spulen können zu zwei Spulensystemen zusammengefasst werden.
Eine alternative Ausgestaltung des Magnetmittels zur Erzeugung homogener und inhomogener Magnetfeldverteilungen besteht gemäß 5 aus länglichen Spulen 409, 410, 412, 413, vorzugsweise ähnlich einem Rechteck, was anhand 4 verdeutlicht wird. Die Spulen 409, 410, 412, 413 sind vergleichbar mit den konzentrischen Spulen 309, 310, 312, 313 aus 3 zu Paaren angeordnet: Jeweils liegt eine kleinere Spule einer Größeren gegenüber und bildet mit dieser ein Spulenpaar. Das erzeugte Magnetfeld einer Spule ist näherungsweise homogen in der Spulenebene, ist also homogen in einer Fläche ähnlich einen Rechteck. Gegenüber liegt eine Spule, deren Magnetfeld ebenfalls ein homogenes Rechteck, aber mit erheblich kleinerer Schmalseite ist. Dadurch ergibt sich ein keilförmiger Magnetfeldverlauf. Durch Spiegelung und Zusammenfassung der breiteren und der schmaleren Spule werden Spulensysteme beschrieben. Es können inhomogene Keilfelder in verschiedenen Richtungen, aber auch homogene Felder durch gemeinsame Beschaltung der breiten und schmalen Spulen erzeugt werden.
Eine Anordnung gemäß 4 oder 5 wird zur Ausführung nachfolgendes, mit im Wesentlichen drei Teilschritten umfassendes Verfahrens verwendet, wobei nacheinander ein Transportfeld, ein Hybridisierungsfeld und ein Waschfeld generiert werden. Für die Teilschritte gilt:

– Schritt I: Als Transportfeld wird ein statisches inhomogenes Magnetfeld verwendet.
– Schritt II: Als Hybridisierungsfeld: In der Ebene liegendes gepulstes Keilfeld verwendet, wobei die Feldrichtung wechselnd ist. Die Bewegung ungebundener Beads erfolgt pseudostochastisch oder in eckigen Spiralen. Durch Überlagerung eines schwachen 'Anpressfeldes' in Richtung der Waferoberfläche wird ein Wegschwimmen der Beads vermieden.
– Schritt III: Als Waschfeld wird ein gepulstes Magnetfeld verwendet.

Mit obiger Vorgehensweise kann insbesondere die Kinetik bei der DNA-Analyse verbessert werden: Dabei wird die Begegnung des PCR-Produkts und der beschichteten Beads vorteilhafterweise dadurch optimiert, dass ein Überschuss an Beads angeboten wird. Dies kann mit verschiedenen Mitteln gefördert werden. Beispiele für solche Mittel sind:

– Ein Netz mit Beads: Die Beads werden auf einem Trägersubstrat aufgebracht und das PCR-Produkt durchgepumpt. Nach und nach lösen sich Beads und werden mit dem Medium transportiert. Eine Befestigung der Beads kann durch Adhäsion oder insbesondere wasserlösliche Stoffe erfolgen, z. B. Salz, Zucker.
– Eine separate Reaktionskammer: Das gesamte PCR-Produkt wird in einen Bead-gefüllten Raum gepumpt. Nach einer Einwirkzeit wird der gesamte Inhalt samt Beads zum Sensor weitergeleitet.

Im Falle reversibler magnetischer Eigenschaften ist es möglich, durch Aufschmelzen der Fänger/DNA-Halbstrang-Verbindung den Sensor wieder zu reinigen. Der Erfolg dieser Maßnahme ist durch die magnetischen Sensoren kontrollierbar.
In 6 ist gezeigt, wie biologische Reaktionsprodukte mit einem Biotinlabel versehen werden. Dabei docken am Biotin die Streptavidin-beschichteten Beads an, wobei bei Bead-Überschuss freie Beads übrig bleiben. Es ergibt sich insgesamt eine vorteilhaft hohe Wahrscheinlichkeit für eine Bindung.
In 7 ist verdeutlicht, dass durch Anlegen eines inhomogenen magnetischen Feldes ein Transfer der Beads in Richtung Feldgradient, der von der großen Spule zur kleinen Spul verläuft. Dabei erfolgt der Transfer mit oder ohne Reaktionsprodukt.
Entsprechend 8 ergibt sich ein x-, y-, z-Koordinatensystem bezüglich der Sensoroberfläche 201 mit einem Feldgradienten in z-Richtung. In diese Richtung erfolgt die Bewegung der Beads, was aus 9 im Einzelnen ersichtlich ist.
In den 1 bis 3, die weiter oben im Einzelnen beschrieben sind, war speziell auf die DNA-Analyse abgestellt. Neben der DNA-Analyse, auf die vorstehend insbesondere mit der dort erforderlichen PCR eingegangen wurde, ist das beschriebene Verfahren auch für eine Protein-/Enzym-Analyse oder auch zur Detektion von sog. Haptenen einsetzbar. Eine PCR ist dort nicht notwendig, wogegen die Vorgehensweise zur eigentlichen Analyse bzw. Signalmessung an der Sensoroberfläche wie bei der DNA-Analyse erfolgt.
Anhand 10 wird die Anwendung der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise speziell für Proteine verdeutlicht. Proteine sind Eiweiße, die durch Kettenmoleküle in mehreren Ebenen definiert sind. Sie bilden in der figürlichen Darstellung auf der Zeichenebene als Makromolekül ein 'Knäuel'. Ein solches Molekülknäuel ist in 10 mit 50 und ein davon separiertes biotinylisiertes Teilmolekül ist mit 51 bezeichnet. An das biotinylisierte Teilmolekül 51 kann ein streptavidin-beschichtetes Magnet-Bead 30 entsprechend den 1 bis 3 andocken.
Durch Einwirkung von Magnetfeldern lässt sich also auch hier eine Bewegung in gezielte Richtung bewirken und insgesamt Beschleunigungen im Verfahrensablauf herbeiführen. In der Darstellung gemäß 10 wirkt das Gradientenfeld in Richtung auf die Bindungsfläche 1 entsprechend 1.
Anhand 11 wird der automatisierte Verfahrensablauf abschließend zusammengefasst: Das Struktogramm 100 zeigt insbesondere die Positionen 101 bis 107 mit Einzelschritten 101 bis 107, die nacheinander ablaufen und ggf. wiederholt werden können:
Bei START beginnt das Assay 100 und es erfolgt in Position 101 die Vorbereitung der Probe. Die Probenvorbereitung wird in bekannter Weise durchgeführt und beinhaltet im Einzelnen:
Eine Sensoroberfläche wird mit Fängermolekülen beschichtet und mit einer Abdeckung nebst Zu- und Ableitungen zu einer Fluidikzelle zusammengesetzt. Diese Fluidikzelle wird im Magnetfeldsystem positioniert und die Zu- bzw. Ableitungen angeschlossen. Volumina für die Probenflüssigkeit, Beads und Analyte, Spülflüssigkeiten, Abwässer und dgl. und zugehörige Pumpen sind erforderlich. Ggf. ist eine Heizung des Fluidikvolumens vorgesehen.
Das Assay 100 zur Erzeugung des biologischen Reaktionsprodukts wird folgendermaßen durchgeführt:

– Zugeben von Streptavidin-beschichteten magnetischen Markern als Beads;
– Optimierung der Reaktionsbedingungen zwischen Biotin und Streptavidin

In Position 102 wird ein Transportfeld angelegt (Schritt I). Dies beinhaltet:

– Anlegen des inhomogenes Magnetfeldes in z-Richtung;
– Die Sensoren detektieren ggf. eine Annäherung und einen Stillstand der Beads.

In Position 103 wird das Hybridisierungsfeld angelegt (Schritt II). Dies beinhaltet:

– Anlegen des inhomogenes Magnetfeldes in +/–x-, y-Richtung;
– ein drehendes Feld bewirken;
– eine leichte –z-Komponente zulassen;
– die Sensoren detektieren ggf. die Bewegung der Beadbelegung bzw. einen Stillstand einzelner Beads.

In Position 104 wird das Waschfeld durch folgende Maßnahmen realisiert (Schritt III). Dies beinhaltet:

– Inhomogenes Magnetfeld in +z-Richtung anlegen;
– die Sensoren detektieren ggf. die Entfernung bzw. eine konstante Position der Beads.

In Position 105 erfolgt die Messung in an sich bekannter Weise, und zwar:

– Anlegen eines homogenes Magnetfeldes, so dass die Streufelder der Beads ein Sensorsignal bilden, das gemessen werden kann;
– dabei wird das Assay vorteilhafterweise so gestaltet, dass an bestimmten Stellen Tests der Bead-Bindung mitlaufen. Deren Messsignale dienen als Referenzwerte.

In Position 106 erfolgt eine Bewertung des Ergebnisses:

– Falls keine Beads zurückbleiben, war die Vorgehensweise fehlerhaft;
– in diesem Fall sind die Maßnahmen 102 bis 105 mit alternativen Parametern zu wiederholen.

Bei Position 107 ist die Analyse abgeschlossen: Das Ergebnis wird dargestellt und es erfolgt eine Ausgabe. Es wird END angezeigt.
In 11 ist eine durchgehende Prozesskette 102 bis 106 dargestellt, wobei in weiteren Ausführungsbeispielen Variationen möglich sind:
Beispielsweise kann zwischen Schritt II und III eine optionale Messung erfolgen. Dazu ist ein Abzweig 105a vorhanden, der zu einem Vorher-/Nachher-Vergleich verwendet werden kann.
In der Prozesskette können Rücksprunge zum Waschschritt vorgenommen werden. Über eine erweiterte Bewertungsstufe erfolgt dann eine Erhöhung der Waschkraft, sofern eine erste Waschkraft-Stärke definiert ist
Es ergibt sich dann folgende Vorgehensweise unter Einbindung eines INIT-Zählers: Rücksprung zur erneuten Waschung und sukzessive Erhöhung mit einer erweiterten Bewertungsstufe.
Die INIT-Definition der ersten Waschkraft-Stärke erfolgt nach Position 101:

– Position 102: Transport und INIT Zähler: = 0;
– Position 103: Hybridisierung;
– Position 103a: Zähler erhöhen, Messen und Abspeichern der Werte
– Position 104: Waschen mit definierter Kraft;
– Position 105: Zähler erhöhen, Messen und Abspeichern der Werte
– Position 106: Bewertung: (Zähler < 3) AND ('keine Beads mehr da')--> Reduktion der ersten Waschkraft-Stärke und dann Rücksprung auf Position 102;
– Position 106a: Bewertung über den Erfolg der 'Kraftanstrengung' durch Vergleich aktuellen Messung (Zählerwert) mit Messung (Zählerwert-1);
– Position 106b: Bewertung: (Zähler > 2) AND ('keine Beads mehr da')--> gehe zu Position 107; ansonsten erfolgt ein Durchführen einer Trendanalyse zur Berechnung der nächsten Kraft mit Rücksprung auf Position 104;
– Position 107: Ausgabe und END

In einem anderen Ausführungsbeispielen des Assays erfolgt bei Position 106b folgende spezifische Bewertung: Falls keine Beads bei Position 104 entfernt wurden, war die Krafterhöhung zu gering und muss daher um einen weiteren Schritt erhöht werden.
Die Vorgehensweise gemäß 11 gilt für alle oben angegebenen Anwendungsfälle der biochemischen Detektion, womit jeweils ein magnetisch beschleunigtes Assay realisiert ist.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 99/36577 A [0011]
- US 2004/253744 A [0011]
- DE 102006037739 [0043]

Claims

Verfahren zur Detektion biologischer Reaktionsprodukte an Sensorflächen, bei dem die biologischen Reaktionsprodukte biologisch aktives Biotin aufweisen und magnetische oder magnetisierbare Teilchen (Beads) Streptavidin-beschichtet sind, wobei die Beads in eine gewünschte Richtung, insbesondere zum Andocken an die zu detektierenden biologisch aktiven Substanzen, bewegt werden und das magnetische Streufeld der Beads detektiert wird, mit folgenden Verfahrensschritten: – Es wird ein inhomogenes Magnetfeld verwendet, – durch das inhomogene Magnetfeld erfolgt ein Transfer der Beads in eine vorgegebene Richtung, insbesondere in der gewünschten Richtung zur Sensorfläche.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als inhomogenes Magnetfeld ein Kegel- oder ein Keilfeld verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle und Anzahl der Beads vorgegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Überwachung des Transfers wenigstens ein magnetfeldempfindlicher Sensor verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass durch geeignete Verfahrensführung, insbesondere Umrühren und Temperaturbehandlung, eine Verfahrensbeschleunigung erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Wahrscheinlichkeitserhöhung der Hybridisierung durch das inhomogene Magnetfeld ein Annähern der Beads an die Oberfläche gezielt durchgeführt wird, wobei zusätzlich ein Lateraltransfer durch das inhomogene Magnetfeld und/oder die Strömung beschleunigt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als inhomogenes Magnetfeld ein Kegel- oder ein Keilfeld verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle und Anzahl der Beads vorgegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Überwachung des Transfers wenigstens ein magnetfeldempfindlicher Sensor verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass durch geeignete Verfahrensführung, insbesondere Umrühren und Temperaturbehandlung, eine Verfahrensbeschleunigung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das inhomogene Magnetfeld auch für eine Waschung der Beads eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als inhomogenes Magnetfeld ein Kegel- oder ein Keilfeld verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle und Anzahl der Beads vorgegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zur Überwachung des Transfers wenigstens ein magnetfeldempfindlicher Sensor verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass durch geeignete Verfahrensführung, insbesondere Umrühren und Temperaturbehandlung, eine Verfahrensbeschleunigung erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet in der DNA-Analyse.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass Biotin-gelabelte DNA-Halbstränge (Tri-Phosphat; Primer-Label) verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gekennzeichnet in der Verwendung für eine Protein/Hapten-Analyse.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein Einbauen/Anketten von Biotin-gelabelten Hilfsstoffen erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gekennzeichnet in der Verwendung für eine Enzym-Analyse.
Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Verwendung bei biomolekularen Analysen gemäß Anspruch 16, Anspruch 18 oder Anspruch 20, mit einer Sensorfläche (1) zur Immobilisierung von Biomolekülen, der eine Einrichtung (300, 400) zur Erzeugung eines inhomogenen Magnetfeldes zugeordnet ist.
Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensorfläche eine definierte Waferfläche (201) ist.
Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das inhomogene Magnetfeld ein Kegelfeld (A) ist.
Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das inhomogene Magnetfeld ein Keilfeld (B) ist.
Anordnung nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass Spulensysteme (300, 400) aus jeweils einem Spulenpaar (309, 313; 310, 312; 409, 413; 410, 413) unterschiedlichen Querschnittes verwendet werden, die separat aktivierbar sind.
Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Transport des Analyten vorhanden sind.
Anordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Spülen des Analyten vorhanden sind.