DE102006037739A1

DE102006037739A1 - Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens, insbesondere zur Erkennung biochemischer Moleküle, und mit dieser Vorrichtung ausführbare Analyseverfahren

Info

Publication number: DE102006037739A1
Application number: DE102006037739A
Authority: DE
Inventors: Joachim Dr. Bangert
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2026-08-12
Also published as: DE102006037739B4

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens, bei dem auf einem Substrat (1) innerhalb eines Analysebereichs (2) immobilisierte Sondenmoleküle (19), nämlich biochemisch wirksame Moleküle und Strukturen, mit einer Zielmoleküle (3) als Reaktionspartner enthaltenden Analytlösung in Kontakt gebracht und Reaktionsereignisse zwischen Ziel- und Sondenmolekülen mit Hilfe von an die Ziel- oder die Sondenmoleküle gekoppelten magnetisierbaren Markerpartikeln (18) detektiert werden. Vor und/oder nach einer Detektion wird der Analysebereich mit einem inhomogenen Magnetfeld (20, 20a) beaufschlagt. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Magnetfeldmittel (100; 9, 10, 12, 13) zumindest zur Erzeugung eines im Analysebereich (2) wirksamen inhomogenen Magnetfeldes (20, 20a) vorhanden, wobei diese Magnetfeldmittel (100; 9, 10, 12, 13) Teil einer Ablaufsteuerung zur Bestimmung der Bindungskräfte der Reaktionsereignisse sind.

Description

Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens, insbesondere zur Erkennung biochemischer Moleküle, und mit dieser Vorrichtung ausführbare Analyseverfahren
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens, insbesondere zur Erkennung biochemischer Moleküle oder Strukturen. Daneben bezieht sich die Erfindung auch auf mit dieser Vorrichtung ausführbare Analyseverfahren.

Das allgemeine Ziel speziell biochemischer Analyseverfahren ist es, biochemische Moleküle, beispielsweise DNA-Sequenzen, Proteine, Haptene oder Antigene zu erkennen. Beispielsweise werden dazu auf einem Substrat innerhalb eines Analysebereiches immobilisierte Sondenmoleküle mit einer die genannten biochemischen Moleküle oder Strukturen (nachfolgend kurz als Zielmoleküle bezeichnet) enthaltenden Analytlösung in Kontakt gebracht. Mit einem Sondenmolekül etwa nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip zusammenpassende Zielmoleküle werden unter Bildung von Bindungspaaren an Sondenmoleküle gebunden. Das Auftreten von derartigen Reaktionsereignissen wird mit Hilfe von an den Zielmolekülen vorhandenen Labels bzw. Markern beispielsweise auf optische oder elektrische Weise detektiert.

Neben derart detektierbaren Markern werden auch magnetisierbare Markerpartikel eingesetzt. In diesen Fällen wird ein auf den Analysebereich einwirkendes homogenes Magnetfeld erzeugt, und mit Hilfe elektromagnetischer Sensoren durch die magnetisierbaren Markerpartikel hervorgerufene Streufelder detektiert.

In der Literatur-Veröffentlichung „Biosensor based on force microscope technology" aus J. Vac. Sci. Technology B 14(2), March/April 1996, P. 789 pp. wird ein Biosensor beschrieben, bei dem mechanische Schwingbalken, d. h. kommerzielle piezoelektrische Rastersonden-Messspitzen, zur Detektion von mag netisch induzierten Kräften verwendet werden. Nach einer biologischen Reaktion, insbesondere zur DNA-Erkennung, werden magnetisierbare Marker auf dem Schwingbalken zurückgelassen und die Veränderung des Schwingungsverhaltens aufgrund einer einstellbaren magnetischen Kraft wird als Maß für die Anzahl der magnetisierbaren Marker und damit für die biologische Reaktion herangezogen. Das Magnetfeld wird durch Permanentmagnete und ein Helmholtzspulenpaar erzeugt. Empfindliche Messungen in einem flüssigen Medium sind mit Schwingbalken nicht möglich.

Die US 5,981,297 A beschreibt die Detektion von selektiv angelagerten Molekülen mit magnetischen Markern durch GMR-Sensoren. Mit den Sensoren können Hinweise auf die Konzentration der Zielmoleküle gewonnen werden. Hier wird darauf hingewiesen, mittels einer magnetischen Kraft ungebundene Marker zu entfernen, weitergehende Analysen oder Mittel zur Durchführung dieser fehlen. In der US 6,180,418 B1 werden Anordnungen beweglicher Dauermagneten beschrieben, mit denen magnetisierbare Marker (sog. Beads) im Ablauf eines Assays bewegt werden. Die Detektion der Beads wird optisch vorgenommen. Ungebundene Beads werden durch Anlegen eines vorher berechneten Kraftgradienten, d.h. mechanisches Verstellen der Magnete, entfernt. Eine Bestimmung der biologischen Bindungskräfte wird nicht durchgeführt. Weiterhin beschreibt die WO 00/61803 A1 ein Verfahren mit einem Reinigungsschritt mit magnetischen Kräften. Eine Bestimmung der biologischen Bindungskräfte jenseits der Reinigungskraft von 1pN ist aber hier nicht durchführbar. Eine Detektion und Manipulation von Biomolekülen mit Magnetpartikeln (Magnetic Beads) ist aus der US 2004/0219695 A1 bekannt. Dazu werden Magnete hin- und herbewegt.

Die US 5,445,970 A beschreibt eine von Hand geregelte Balance aus chemischen und magnetischen Kräften. Die Detektion der Beads wird optisch vorgenommen. Dem magnetischen Design wird wenig Beachtung geschenkt, Standardausführungen erscheinen ausreichend. In der WO 02/29430 A1 wird ein GMI-Sensor zur Detektion magnetischer Marker beschrieben. Das externe Magnetfeld muss dort eine konstante Größe aufweisen, um den GMI-Effekt nutzen zu können. Daher sind Bindungskräfte nicht bestimmbar. Die Detektion der Beads wird hier optisch vorgenommen. Mit magnetischen Beads arbeitende Manipulatoren sind ebenfalls aus der DE 100 50 029 A1 bekannt.

Schließlich ist aus der US 2005/0087000 A1 ein Verfahren bekannt, das in wesentlichen Teilen dem BARC-Sensor aus der US 5,981,297A gleicht. Der Unterschied besteht in der Verwendung erheblich kleinerer Beads, denen eine höhere Messempfindlichkeit zugetraut wird. Zur Messung der Flächendichte der Beads und zur Messung kleinster Magnetfeldänderungen werden insbesondere GMR-Sensoren verwendet. Die Magnetfelder werden durch ein Spulenpaar erzeugt.

Aufgabe der Erfindung ist es demgegnüber, eine Vorrichtung oben genannter Art so weiter zu entwickeln, dass es neben dem Auslesen von Reaktionsereignissen weitere Funktionen erfüllt. Diese weiteren Funktionen können einzeln oder kombiniert insbesondere sein:

– ein Reinigungsschritt durch ein Magnetfeld und Applikation eines Spülfluids für unspezifische Adhäsionen,
– ein Reinigungsschritt durch Magnetfeld und Applikation eines Spülfluids für unspezifische DNA-Bindungen.

Weiterhin sollen mit der Erfindung mit der neuen Vorrichtung ausführbare biochemische Analyseverfahren angegeben werden.

Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit der Gesamtheit der Merkmale des Patentanspruchs 1 gelöst. Ein spezifisches, mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung besonders einfach ausführbares Analyseverfahren ergibt sich aus dem Anspruch 21. Weiterbildungen der Vorrichtung bzw. des Analyseverfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.

Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung, die in Kombination mit einer Durchflusszelle für eine Analytlösung und einem Substrat mit einem Analysenbereich geeignete Mittel zur Fluidsteuerung bzw. -regelung, zur Erzeugung und Steuerung geeigneter Magnetfelder und zur Erfassung und Auswertung von Messwerten der Magnetsensoren aufweist. Als Auswertegrößen können dabei insbesondere Werte für Bindungskräfte bei Reaktionsereignissen ausgegeben werden. Dies ist insbesondere in biochemischen Analyseverfahren, aber auch bei anderen Analyseverfahren mit molekularen Reaktionen einsetzbar.

Wesentlich ist bei der Erfindung, dass die Vorrichtung Magnetmittel zur Erzeugung eines im Analysebereich wirksamen, insbesondere inhomogenen Magnetfeldes sowie weiterhin eine geeignete Ablaufsteuerung aufweist. Vorzugsweise umfassen die Magnetmittel ein erstes, aus zwei axial beabstandeten, mit ihren Windungsebenen etwa parallel zur Planebene des Analysebereichs angeordneten, das Substrat zwischen sich einschließenden Spulen gebildetes Spulenpaar, wobei die auf der Analyseseite des Substrats angeordnete Spule einen kleineren Durchmesser aufweist als die andere Spule. Ein damit erzeugtes Magnetfeld ist hinsichtlich seiner Feldstärke inhomogen, z. B. anisotrop. Die Feldstärke nimmt dabei beispielsweise in Richtung der Normalen des – im Wesentlichen in einer Planebene verlaufenden – Analysebereichs zu.

Vorzugsweise ist zur Erzeugung eines umgekehrt ausgerichteten inhomogenen Magnetfeldes ein zweites konzentrisches Spulenpaar vorhanden, das wie das erste Spulenpaar ausgestaltet und angeordnet ist, wobei jedoch die Spule mit dem größeren Durchmesser auf der Analyseseite des Substrats angeordnet ist. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden vorteilhafterweise zwei Spulenpaare, die gespiegelt angeordnet sind, eingesetzt. Die jeweils oberen und unteren Spulen können zu zwei Spulensystemen zusammengefasst werden.

Mit einer solchen Anordnung lässt sich insbesondere auch ein homogenes Magnetfeld erzeugen, indem die beiden großen und/oder die beiden kleinen Spulen angesteuert bzw. bestromt werden, was einzeln oder gleichzeitig erfolgen kann. Die so erzeugten achsensymmetrischen inhomogenen oder homogen Felder lassen sich schnell umschalten und können daher als genau vorgebbare Magnetkräfte zur Bestimmung von Bildungskräften in Molekülen dienen.

Eine alternative Ausgestaltung des Magnetmittels zur Erzeugung homogener und inhomogener Magnetfeldverteilungen besteht aus länglichen Spulen, vorzugsweise ähnlich einem Rechteck. Diese sind vergleichbar mit den konzentrischen Spulen zu Paaren angeordnet: Jeweils liegt eine kleinere Spule einer Größeren gegenüber und bildet mit dieser ein Spulenpaar. Das erzeugte Magnetfeld einer Spule verläuft symmetrisch zur Symmetrieebene und ist näherungsweise homogen in der Spulenebene. Es ist also homogen in einer Fläche ähnlich einem Rechteck. Gegenüber liegt eine Spule, deren Magnetfeld ebenfalls ein homogenes Rechteck, aber mit erheblich kleinerer Schmalseite ist. Dadurch ergibt sich ein keilförmiger Magnetfeldverlauf. Durch Spiegelung und Zusammenfassung der breiteren und der schmaleren Spule werden Spulensysteme beschrieben. Es können inhomogene Keilfelder in verschiedenen Richtungen, aber auch homogene Felder durch gemeinsame Beschaltung der breiten und schmalen Spulen erzeugt werden.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist im Analysebereich mindestens ein Magnetfeldsensor zum Auslesen eines Analyseergebnisses vorhanden. Der eigentliche Analysebereich in einem eine Ein- und eine Ausströmöffnung aufweisenden Gehäuse für den zu untersuchenden Analyten angeordnet.

Bei den mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchzuführenden Verfahren ist vorgesehen, dass vor und/oder nach einer Detektion von Reaktionsereignissen der Analysebereich mit einem inhomogenen Magnetfeld beaufschlagt wird. Ein solches Magnetfeld ruft ein ungleichmäßig über den Markerpartikel-Umfang verteiltes Streufeld hervor. Die Folge ist, dass ein Markerpartikel mit einer in Richtung zunehmender Feldstärke wirkenden Kraft beaufschlagt wird. Dieser Effekt lässt sich in verschiedener Weise ausnutzen, insbesondere bei solchen Verfahren, bei denen die Bindung von Zielmolekülen an im Ana lysebereich immobilisierten Sondenmolekülen vorgesehen ist.

Bei einer ersten bevorzugten Verfahrensvariante wird in einem Reinigungsschritt ein inhomogenes Magnetfeld derart erzeugt, dass auf die Markerpartikel eine diese vom Analysebereich entfernende Kraft einwirkt. Auf dieses Weise lassen sich beispielsweise an der Oberfläche des Analysenbereiches absorbierte Markerpartikel oder mit Markerpartikeln versehene nichtgekoppelte Zielmoleküle aus dem Analysebereich entfernen. Diese werden somit bei einer nachfolgenden Auslesung von Bindungsereignissen nicht mit erfasst, was die Aussagekraft und Reproduzierbarkeit eines Analysenergebnisses erhöht. Für eine Reinigung eines Analysenbereiches auf die erwähnte Art und Weise ist es vorteilhaft, wenn das Magnetfeld so ausgerichtet wird, dass seine Feldstärke in Richtung der Normalen des Analysebereichs zunimmt. Dadurch ist gewährleistet, dass Markerpartikel quasi nach oben aus dem Sondenmolekülrasen herausgezogen werden, ohne das sie in nennenswertem Ausmaß durch Sondenmoleküle behindert werden. Der Reinigungsprozess wird zweckmäßigerweise durch die Applikation eines Spülfluids unterstützt. Bei einem Reinigungsschritt der genannten Art wird die Stärke des Magnetfeldes so gewählt, dass die auf ein markiertes Zielmolekül einwirkende Kraft geringer ist, als die zur Trennung einer Bindung zwischen dem Zielmolekül und dem Sondenmolekül eines Kopplungspaares erforderliche Kraft. Dadurch ist gewährleistet, dass zwar nicht gekoppelte, insbesondere an die Oberfläche des Analysebereiches adsorbierte Markerpartikel entfernt, nicht jedoch die Bindung zwischen dem markierten Zielmolekül und dem Sondenmolekül eines Kopplungspaares getrennt wird. Die Adsorptionskraft eines Markerpartikels im Bereich der Oberfläche des Analysebereiches liegt bei etwa 1 bis ≤ 10 pN. Mit einem entsprechend ausgelegten inhomogenen Magnetfeld werden Markerpartikel mit hoher Zuverlässigkeit entfernt, ohne das dabei Bindungspaare getrennt werden. Besonders zweckmäßig ist es, wenn vor und nach einem Reinigungsschritt die Belegung des Analysebereiches mit Markerpartikeln ermittelt wird. Wenn sich diese vor und nach einem Reinigungsschritt nicht wesentlich ändert, kann davon ausgegangen werden, dass im Analysebereich bzw. auf dessen Oberfläche keine das Messergebnis verfälschende Markerpartikel mehr vorhanden sind.

Bei Bindungsreaktionen zwischen insbesondere biochemischen Molekülen und Strukturen tritt das Problem auf, dass ein Bindungs- bzw. Kopplungsereignis nicht nur dann stattfindet, wenn Ziel- und Sondenmoleküle 100%ig zueinander passen. Auch bei einem geringeren Grad an Übereinstimmung kann es zu einer Bindung kommen. Solche unspezifischen Bindungsereignisse werden mit bisherigen Analyseverfahren miterfasst. Um diesbezüglich eine Selektion vornehmen zu können, wird bei einer weiteren bevorzugten Verfahrensvariante die Magnetfeldstärke so gewählt und eingestellt, dass ein an ein Zielmolekül gekoppeltes Markerpartikel mit einer Kraft beaufschlagt wird, die ausreicht, um ein spezifisch oder unspezifisch gebundenes Zielmolekül von einem Sondenmolekül zu trennen. Ein solches Verfahren lässt sich auch im Sinne einer Kraftspektroskopie derart anwenden, dass die Stärke des Magnetfelds in Stufen erhöht wird, wobei die Feldstärke jeder Stufe so gewählt wird, dass auf ein Markerpartikel eine zur Trennung einer bestimmten spezifischen oder unspezifischen Bindung erforderliche Kraft einwirkt. Dabei erfolgt zweckmäßigerweise vor und nach einer stufenartigen Erhöhung der Feldstärke eine Auslesung, deren Ergebnis durch die Anzahl der jeweils vorhandenen Bindungspaare bestimmt ist. Es kann auf diese Weise innerhalb unspezifischer Bindungsereignisse eine Selektion nach Bindungsstärke bzw. nach Übereinstimmungsgrad zwischen Ziel- und Sondenmolekül oder innerhalb spezifischer Bindungsereignisse eine Selektion nach Bindungspaaren mit unterschiedlichen Zielmolekülen vorgenommen werden.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass an die Zielmoleküle erst nach der Bildung von Bindungspaaren Markerpartikeln angekoppelt werden. Beispielsweise wird dabei dem Analysebereich eine Analytlösung mit Zielmolekülen zugeführt, an welche ein Koppelmolekül gebunden ist, das an ein Markerpartikel ankoppeln kann. Im Anschluss an die Bildung von Bindungspaaren wird eine Markerpartikel enthaltende Lösung auf den Analysebereich appliziert. Dieser Verfahrensweise liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass die im Vergleich zu den Zielmolekülen erheblich größeren Markerpartikel die Beweglichkeit der Zielmoleküle einschränken und dadurch deren Reaktion mit Sondenmolekülen behindern bzw. verlangsamen. Bei allen hier beschriebenen Verfahrensvarianten werden bevorzugt mit Streptavidin umhüllte Magnetitpartikel verwendet, die über Biotin an das Zielmolekül gekoppelt sind.

Bei einer weiteren Verfahrensvariante wird während der Durchführung einer Analyse ein inhomogenes Magnetfeld erzeugt, dessen Feldstärke entgegen der Normalen des Analysebereichs zunimmt. In einem derartigen Feld werden Markerpartikel der Oberfläche des Analysebereiches angenähert. Bei entsprechend dichter Belegung des Analysebereiches mit Markerpartikeln bilden diese eine im Wesentlichen geschlossene Schicht, wobei zwischen dieser und der Oberfläche des Analysebereiches ein eingeschränktes Probenvolumen mit erhöhter Reaktionsdichte zur Verfügung steht.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der Figurenbeschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen.
Es zeigen:
1 ein Blockschaltbild für eine erfindungsgemäße Vorrichtung, geeignet für magnetische Messungen in einer Durchflusszelle,
2 das Prinzip der Erzeugung von inhomogenen Magnetfeldern (Keil/Kegel),
3 ein Spulenpaar/-system mit kreisförmigen Spulen,
4 ein Spulenpaar/-system mit rechteckförmigen Spulen,
5 der Aufbau einer zur Durchführung eines biochemischen Verfahrens geeigneten Vorrichtung,
6, 7 Vorrichtungen entsprechend 5, die zur Erzeu gung eines inhomogenen Magnetfelds ertüchtigt sind, sowie
8, 9 schematische Darstellungen eines ersten mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausführbaren biochemischen Analyseverfahrens,
10, 11 schematische Darstellungen einer Variante des Analyseverfahren von 8/9 und
12 eine schematische Darstellung einer weiten Variante des Analyseverfahrens von 8/9.
Es soll eine Vorrichtung zur vereinfachten Durchführung eines Analyseverfahrens geschaffen werden, bei dem magnetische Messmethoden und Messtechnik eingesetzt werden. Mit dem Verfahren sollen insbesondere Bindungskräfte bei Reaktionsereignissen durch Magnetkräfte bestimmt werden.
Insbesondere sollen mit der Vorrichtung aber biochemische Analyseverfahren durchgeführt werden, um biochemischer Moleküle oder Strukturen in einer Analytlösung zu erkennen. Dabei spielen neben der in der Biochemie üblichen Fluidregelung für die Analytlösung die Erzeugung von im Analysebereich wirksamen Magnetfeldern, die Magnetfeldsteuerung und/oder Magnetfeldmessung mit einer gemeinsamen Ablaufsteuerung sowie die Erfassung und Auswertung der Messwerte eine besondere Rolle.
In 1 ist eine Einrichtung zur Magnetfelderzeugung mit 100 bezeichnet, der eine Steuereinrichtung 101 sowie eine Steuerelektronik 110 als Ablaufsteuerung zugeordnet ist. Mit 102 ist ein Magnetfeldsensor zur Messung des Magnetfeldes bezeichnet.
Als Einrichtung zur Magnetfelderzeugung werden wenigstens zwei Spulen ungleicher Bauart verwendet, so dass zumindest ein inhomogenes Magnetfeld erzeugt werden kann. Darauf wird weiter unten im Einzelnen eingegangen.
Eine Durchflusszelle 106 mit Pumpe 107 für einen Analyten weist einen Analysebereich auf, dem hochauflösende Sensor für kleinste Magnetfeldänderungen zugeordnet sind.
Die Messsignale für das Magnetfeld und die im Analysebereich 104 bewirkten Magnetfeldänderungen werden in eine Auswerteeinheit 110 gegeben. In der Auswerteeinheit 110 erfolgt die Auswertung konform zur Ablaufsteuerung entsprechend einer in der Einheit 115 vorgegebenen Eingabe, wobei in einer Ausgabeeinheit 120 die Ergebnisse aufgezeigt werden.
Für die auszuführenden Analyseverfahren werden insbesondere inhomogene Magnetfelder benötigt. Derartige Felder können entweder als Kegelfeld oder als Keilfeld erzeugt werden, was anhand 2 verdeutlicht wird.
In 2 bedeutet 200 einen Wafer, auf dessen Messfläche 201 ein Sensor gebildet werden soll. Das Kegelfeld ist mit A und das Keilfeld mit B bezeichnet. In der Ebene der Messfläche 201 des Wafers 200 (sog. Schichtebene) ergibt sich also im ersten Fall ein zylinder- oder achsensymmetrisches Analysenfeld 202 und im zweiten Fall ein rechteckiges, ebenensymmetrisches Analysenfeld 203.
Bei achsensymmetrische Magnetfeldanordnungen ist die Homogenität im Bereich der Zentralachse ist sehr gut. Für Analysebereiche << Durchmesser der kleineren Spule kann von einem homogenen Feld mit nur geringsten Feld-Komponenten in der Chip-Ebene ausgegangen werden. Die Fertigung konzentrischer Spulen ist einfach zu bewerkstelligen.
Das näherungsweise rechteckige Feld hat Vorteile bei Analysebereichen, die den Spulenabmaßen ähneln. Bei Flusszellen sind rechteckige Abmaße die Regel. Aus Platzgründen kann in der Praxis eine kleine, rechteckig angepasste Spulenanordnung erforderlich sein, deren Homogenität über den Chip besser ist als es bei einer gleich großen achsensymmetrischen Magnetfeldanordnung der Fall wäre.
In 3 ist zur praktischen Realisierung gezeigt, dass bei einer Anordnung aus im Abstand angeordneten Spulen jeweils zwei in einer Ebene konzentrische Spulen 309, 310 bzw. 312, 313 ein Spulensystem und zwei in unterschiedlichen Ebenen liegenden ungleichen Spulen 309, 312, bzw. 310, 312 ein Spulenpaar bilden. Mit einer solchen Anordnung können bei Ansteuerung eines Spulenpaares in homogene Magnetfelder mit unterschiedlichen Gradienten generiert werden. Es ist auch möglich, durch Ansteuerung gleich großer Spulen homogene Magnetfelder zu erzeugen.
Das Prinzip von Spulenpaar/Spulensystem ermöglicht, in einfacher Weise geeignete Magnetfelder im Analysebereich der Durchflusszelle zu erzeugen und wird weiterhin als sog. Magnetfeldmittel bezeichnet. Mit dieser einfachen Anordnung können wahlfrei homogene und inhomogene Felder mit Feldänderungen im Mikrosekundenbereich erzeugt werden, indem wahlweise jeweils die geeigneten Spulen angesteuert bzw. bestromt werden, was einzeln oder gleichzeitig erfolgen kann.
Diese Mittel umfassen also ein erstes, aus zwei axial beabstandeten, mit ihren Windungsebenen etwa parallel zur Planebene des Analysebereichs angeordneten, das Substrat zwischen sich einschließenden Spulen gebildetes Spulenpaar, wobei die auf der Analyseseite des Substrats angeordnete Spule einen kleineren Durchmesser aufweist als die andere Spule. Ein damit erzeugtes Magnetfeld ist hinsichtlich seiner Feldstärke anisotrop. Diese nimmt in Richtung der Normalen des – im Wesentlichen in einer Planebene verlaufenden – Analysebereichs zu. Vorzugsweise ist zur Erzeugung eines umgekehrt ausgerichteten Magnetfeldes ein zweites Spulenpaar vorhanden, das wie das erste Spulenpaar ausgestaltet und angeordnet ist, wobei jedoch die Spule mit dem größeren Durchmesser auf der Analyseseite des Substrats angeordnet ist. Es ergeben sich also zwei Spulenpaare, die gespiegelt angeordnet sind. Die jeweils oberen und unteren Spulen können zu zwei Spulensystemen zusammengefasst werden.
Eine alternative Ausgestaltung des Magnetmittels zur Erzeu gung homogener und inhomogener Magnetfeldverteilungen besteht aus länglichen Spulen 409, 410, 412, 413, vorzugsweise ähnlich einem Rechteck, was anhand 4 verdeutlicht wird. Die Spulen 409, 410, 412, 413 sind vergleichbar mit den konzentrischen Spulen 309, 310, 312, 313 aus 3 zu Paaren angeordnet: Jeweils liegt eine kleinere Spule einer Größeren gegenüber und bildet mit dieser ein Spulenpaar. Das erzeugte Magnetfeld einer Spule ist näherungsweise homogen in der Spulenebene, ist also homogen in einer Fläche ähnlich einen Rechteck. Gegenüber liegt eine Spule, deren Magnetfeld ebenfalls ein homogenes Rechteck, aber mit erheblich kleinerer Schmalseite ist. Dadurch ergibt sich ein keilförmiger Magnetfeldverlauf. Durch Spiegelung und Zusammenfassung der breiteren und der schmaleren Spule werden Spulensysteme beschrieben. Es können inhomogene Keilfelder in verschiedenen Richtungen, aber auch homogene Felder durch gemeinsame Beschaltung der breiten und schmalen Spulen erzeugt werden.
Zum Auslesen eines Analyseergebnisses ist im Analysebereich mindestens ein Magnetfeldsensor vorhanden. Weiterhin ist der Analysebereich in einem eine Ein- und eine Ausströmöffnung aufweisenden Gehäuse angeordnet. Die Vorrichtung enthält also Mittel zur Fluidiksteuerung und/oder -regelung, zur Generierung und Steuerung geeigneter Magnetfelder, zum Auslesen von Magnetsensoren und/oder zur Speicherung und Verarbeitung ausgelesener Zustände der Magnetsensoren und zur Erfassung und Auswertung von Messwerten. Für den bestimmungsgemäßen Zweck werden damit die Magnetfelder mit den Bindungskräften korreliert.
Es können Statistik-Software enthaltende Mittel zur Bewertung der Zustände und Veränderungen der Zustände vorhanden sein. Die genannten Mittel werden durch wenigstens einen Controller oder Mikrocontroller mit zugehöriger Software gebildet.
Es ergeben sich somit für unterschiedliche Analyseverfahren spezifische Abläufe, die sich durch Flussdiagramme verdeutlichen lassen. Allgemein gilt für die Ablaufsteuerung bei spielsweise zur Messung der Bindungsstärke:

a) START
b) Pumpen von Analytlösung
c) Anlegen eines definierten homogenen Magnetfeldes durch Ansteuern der Spulen, ggf. Nachregeln auf Basis der gemessenen Magnetfeldstärke
d) Messen der Markerpartikelbelegung im Analysebereich und Ausgabe der Ergebnisse
e) Endesignal erreicht, z. B. keine Markerpartikel mehr gefunden
f) Anlegen eines definierten inhomogenen Magnetfeldes (Waschfeld), Testen der Bindungskraft von Reaktionsereignissen durch magnetische Kräfte
e) Wiederhole ab Schritt b) oder ab Schritt c) bis Signal für Ende erfolgt
f) ENDE

Eine solche Ablaufsteuerung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden, z. B. von einem Bediener oder einer Schaltmatrix. Vorteilhaft ist der Einsatz eines Mikrocontrollers mit entsprechender Software. Neben der Messung der Bindungsstärke kann die Software weitere Aufgaben bzw. die oben genannten Ablaufpunkte verbessert erledigen:

– sanfte Anlauf bzw. Stoppcharakteristik der Fluidik
– Regeln, An- und Abschalten des Magnetfeldes ohne Überschwinger (aktive Kompensation des induktiven Verhaltens der Spulen)
– Bereithalten einer Datenbank mit Referenzwerten
– Zurückfaltung (Dekonvolution) des Einflusses der nicht ideal homogenen Magnetfeldverteilung zum verbesserten Bestimmen der Markerpositionen
– exaktere Bestimmung der Markerbelegung durch Anwendung von Software-Statistik-Modulen zur Markerbelegung auf einem Sensor, z. B. Berücksichtigung verschiedener Lagen des Markers relativ zu unterschiedlich empfindlichen Bereichen des Sensors, oder in einem Sensorarray, z. B. Mittelwertbildung mehrerer Sensoren
– Berechnung der wirksamen Kraft in N aus der gemessenen inhomogenen magnetischen Feldstärken in T (bzw. H)
– Abspeichern aller aufgenommenen Daten zur nachträglichen Auswertung
– automatische Berechnung von sog. Fit-Parametern für die Auswertung
– zusätzlich: graphische Darstellung der Markerbelegung als Funktion der anliegenden Kräfte

Die angeführten Punkte sind wesentlich und zeigen den Grundgedanken der Softwaresteuerung eines vorhandenen Mikrokontrollers bzw. der für diesen Zweck verwendeten Programmstruktur. Weitere Punkte, z. B. eine Temperaturregelung, sind möglich
Ein erstes Beispiel ist ein Reinigungsschritt durch Magnetfeld und Applikation eines Spülfluids für unspezifische Adhäsionen. Es gilt:

a) START
b) Pumpen der Analytlösung
c) Anlegen eines definierten homogenen Magnetfeldes und Messen der Markerpartikelbelegung und Ausgabe der Ergebnisse
d) Anlegen eines definierten inhomogenen Magnetfeldes (Waschfeld) Markerpartikel mit unspezifischen Adhäsionen werden durch magnetische Kräfte entfernt
e) Pumpen eines Spülfluids
f) Anlegen eines definierten homogenen Magnetfeldes und Messen der Markerpartikelbelegung und Ausgabe der Ergebnisse
g) ENDE

Ein zweites Beispiel ist ein Reinigungsschritt durch Magnetfeld und Applikation eines Spülfluids für unspezifische DNA-Bindungen. Es gilt:

a) START
b) Pumpen der Analytlösung
c) Anlegen eines definierten homogenen Magnetfeldes und Messen der Markerpartikelbelegung und Ausgabe der Ergebnisse
d) Anlegen eines definierten inhomogenen Magnetfeldes einer ersten, geringen Stärke (Waschfeld) Markerpartikel mit unspezifischen Adhäsionen werden durch magnetische Kräfte entfernt
e) Pumpen eines Spülfluids
f) Anlegen eines definierten homogenen Magnetfeldes und Messen der Markerpartikelbelegung und Ausgabe der Ergebnisse
g) Anlegen eines definierten inhomogenen Magnetfeldes einer zweiten, größeren Stärke als das Waschfeld (Versuch der Trennung von kurzen Sequenzen von AT- bzw. CG-Paaren: sog. Trennfeld). Dabei werden Markerpartikel an unspezifischen DNA-Bindungen durch magnetische Kräfte entfernt
h) Wiederhole Schritte ab e) bis Signal für Ende erfolgt, da z. B. keine Markerpartikel mehr gefunden.
i) ENDE

Die vorgesehenen Mittel zur Magnetfeldsteuerung und -Messung erlauben den gezielten Einsatz von Magnetfeldern als Kraftquelle, vorzugsweise in senkrechter Richtung zum Analysebereich. In einer ersten Überlegung werden adhäsiv gebundene magnetische Markerpartikel von einem Magnetfeld erster, noch geringer Stärke entfernt. Dies wird als (stringente) Waschung bezeichnet.
Zurückbleibende Marker sind mit stärkeren Mechanismen im Analysebereich gebunden, aber auch diese Bindungskräfte sind endlich. Besonders interessant ist eine Analyse dieser Kräfte, da diese einen Rückschluss auf die Bindungsart zulässt. Beispielsweise zeigen DNA-Ketten verschiedener Länge eine berechenbare Bindungskraft. Ausgenutzt werden kann dies z. B. bei biochemischen Untersuchungen für die SNP-Analyse.
Anschließend an den Waschschritt werden sukzessiv ansteigende inhomogene Magnetfelder (bzw. die zugeordneten Kräfte) ange legt, und die Markerbelegung jeweils bestimmt. Werden Beads auf diese Weise entfernt, wurde folglich eine hinreichende Kraft ausgeübt und die Bindung getrennt. Daher ist eine Sequenz von angelegten Trennfeldern mit der Veränderung der Markerbelegung eine Art Kraftspektroskopie der wirksamen Bindungskräfte.
Die in praktischen Versuchen eingesetzte Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens umfasst gemäß 5 ein etwa plattenförmig ausgebildetes Substrat 1. Auf einer Flachseite des Substrates 1 ist ein Analysebereich 2 definiert, auf dem Sondenmoleküle 19 (s. 8) immobilisiert sind. Der Analysebereich 2 ist von einer Sensorschicht 4 bedeckt, welche wenigstens einen Magnetfeldsensor 4a enthält.
Möglich ist auch, dass der Analysebereich von einem Array aus einer Vielzahl von Analysepositionen gebildet ist, wobei jeder Analyseposition ein Magnetfeldsensor 4_ik zugeordnet ist. Als Sensoren kommen beispielsweise Hall-Sensoren oder XMR-Sensoren, insbesondere AMR-, GMR- und TMR-Sensoren, in Betracht. Letztere beruhen auf verschiedenen Magnetowiderstands-Effekten, der in Schichtsystemen mit sehr dünnen Schichten auftritt.
Wie der Prinzipskizze gemäß 8 entnehmbar ist, sind Sondenmoleküle 19, beispielsweise DNA-Oligomere, mit Hilfe eines Spacers 5 an die Oberfläche der Sensorschicht 4 auf bekannte, hier nicht detailliert beschriebene Weise gebunden. Verschiedene kovalente, ionische od. dgl. Bindungsarten sind möglich, z. B. Gold-Thiol-Bindungen. Der Analysebereich 2 ist von einem Gehäuse 6 fluiddicht umfasst, welches eine Einströmöffnung 7 und eine Ausströmöffnung 8 aufweist. Mit Abstand zum Analysebereich 2 sind zwei Magnetspulen 9, 10 und mit Abstand zur Rückseite 11 des Substrats 1 zwei weitere Magnetspulen 12, 13 vorhanden. Die Windungsebenen der Spulen 9, 10, 12, 13 verlaufen parallel zur Planebene 14 des Analysebereichs 2 bzw. des Substrats 1, wobei von den zwei einer Seite des Substrats 2 zugeordneten Spulen jeweils eine Spule 10, 13 einen größeren Durchmesser aufweist und die jeweils kleinere Spule 9, 12, konzentrisch umfasst. Die größeren Spulen 10, 13 weisen außerdem eine größere Windungszahl auf, als die von ihnen umfassten kleineren Spulen 9, 12.
Die Spulen 9, 10, 12, 13 sind über eine anhand der 1 sowie 5 bis 7 bereits erläuterte Steuereinrichtung zur Erzeugung des Magnetfeldes paarweise ansteuerbar. Ein homogenes Magnetfeld, etwa zur Detektion der Belegung des Analysebereiches 2 mit Markerpartikeln, kann erzeugt werden, wenn entweder die kleineren Spulen 9, 12 oder die größeren Spulen 10, 13 zusammen ein Helmholtz-Spulenpaar bilden.
Soll dagegen ein inhomogenes Magnetfeld erzeugt werden, wird die in 5 oberhalb des Substrates und oberhalb des Gehäuses 6 angeordnet Spule 9 mit der unterhalb des Substrats 1 positionieren größeren Spule 13 bzw. die von dieser umfasste kleinere Spule 12, mit der oberhalb des Substrats 1 angeordneten größeren Spule 10 zu einem Spulenpaar verschaltet. Wie in 2 und 3 angedeutet ist, ergibt sich beim Spulenpaar 9/13 ein Magnetfeld 20, dessen Feldstärke von der Spule 13 zur Spule 9 hin bzw. in Richtung der Normalen 22 des Analysebereiches zunimmt. Ein Magnetfeld 20a mit umgekehrten Verhältnissen wird erreicht, wenn die Spule 12 mit der Spule 10 zu einem Spulenpaar zusammengefasst wird (7).
In 6 und 7 ist die in einer Richtung zunehmende Feldstärke des Magnetfeldes 20, 20a durch konvergierende Feldlinien 15 angedeutet. Vorzugsweise ergibt sich jeweils in linearer Gradient des Magnetfeldes.
Bei der Anordnung gemäß den 6 oder 7 können inhomogene Magnetfelder in mehreren Richtungen erzeugt werden. Die Inhomogenität kann durch entsprechende Spulengeometrien oder Jochgeometrien eingestellt werden. Entsprechend 2 bieten sich kegelförmige (achsensymmetrische) oder keilförmige (flächensymmetrische) Feldverläufe an, was in den Figuren jeweils schematisch verdeutlicht wird.
Im Anschluss an vorstehende Beschreibung der neuen Vorrichtung wird nunmehr auf spezifische Anwendungen eingegangen. Anhand einer ersten Verfahrensvariante wird die Arbeitsweise eines spezifischen Verfahrens näher erläutert.
Eine häufig gestellte Analyseaufgabe besteht darin, DNA-Oligomere 16 mit einer bestimmten Basensequenz als Zielmoleküle 3 zu erkennen. Die DNA-Oligomere 16 sind beispielsweise Ausschnitte aus längeren DNA-Strängen, welche daraus mit bekannten Methoden herausgeschnitten wurden. An die DNA-Oligomere 16 sind Koppelmoleküle 17 kovalent gebunden, welche an entsprechend vorbereitete Markerpartikel bzw. Beads 18 ankoppeln können. Beads sind Partikel mit einem Durchmesser von einigen hundert nm, die in Abwesenheit eines äußeren Magnetfeldes nur gering oder gar nicht magnetisiert sind. Es handelt sich dabei z. B. um Partikel, die vollständig aus Magnetit bestehen. Die Beads 18 können aber auch eine Kunststoffmatrix enthalten, in die Magnetit eingelagert ist. Sie sind mit einer Beschichtung versehen, an die ein Koppelmolekül ankoppelt. Durchgesetzt hat sich hier bisher vor allen Dingen eine Beschichtung der Beads mit Streptavidin, welches mit Biotin als Koppelmolekül eine feste kovalente Bindung eingeht. Auf dem Analysebereich 2, der vorzugsweise durch eine ebene Fläche gebildet ist, bzw. auf der Oberfläche der Sensorschicht 4 sind Sondenmoleküle 19 über bereits eingangs erwähnte Spacer 5 immobilisiert. Bei den Sondenmolekülen 19 handelt es sich z. B. um synthetisch erzeugte DNA-Moleküle, die genau die gesuchte Sequenz von Basen 30 aufweisen. Über die Einströmöffnung 7 des Gehäuses 6 wird dem Analysebereich 2 eine die oben erwähnten DNA-Oligomere 16 als Zielmoleküle enthaltende Analytlösung zugeführt.
Zu diesem Zweck wird auf ein eine Regel- und Steuereinrichtung umfassendes Pumpsystem, das anhand 1 im Einzelnen beschrieben wurde, zurückgegriffen, wie es aus der biochemischen Messtechnik bekannt ist.
DNA-Oligomere, deren Basensequenz mit jener der Sondenmoleküle 19 zumindest teilweise übereinstimmt, werden in einer so genannten Hybridisierungsreaktion an die Sondenmoleküle 19 gebunden.
Vor einer Auslesung der Belegung des Analysebereiches 2 mit Beads 18 wird durch Bestromung des Spulenpaares 9/13 ein inhomogenes Magnetfeld 20 (s. 6) erzeugt, dessen Feldstärke in Richtung der Normalen 22 des Analysenbereiches 2 zunimmt. Das aufgrund des inhomogenen Magnetfelds 20 an den Beaus 18 erzeugte Streufeld ist in Bezug auf die Umfangsfläche eines Beads 18 ungleich derart verteilt, dass sich eine Kraftwirkung in Richtung der Normalen 22 ergibt. Die Stärke des inhomogenen Magnetfelds 20 wird so gewählt, dass auf das mit einem DNA-Oligomer 16 verbundene Bead 18 eine Kraft wirkt, die geringer ist, als die zur Trennung einer Bindung zwischen dem DNA-Oligomer 16 und dem Sondenmolekül 19 eines Bindungspaares 21 erforderliche Kraft. Die Adsorptionskraft beschichteter Beads 18 im Bereich der Oberfläche des Analysebereiches 2 liegt in der Größenordnung von > 1 pN, wogegen die Bindungskräfte zwischen Ziel- und Sondenmolekülen in einem Bereich von mindestens 100 pN liegen.
Wenn somit das inhomogene Magnetfeld 20 so gewählt wird, dass auf die Beads 18 eine Kraft von etwa 70 pN wirkt, ist gewährleistet, dass ausschließlich markierte DNA-Oligomere 16 oder auch einzelne, nicht an ein DNA-Oligomer 16 gekoppelte Beads 18 aus dem Analysebereich 2 entfernt werden, ohne dabei Bindungspaare 21 zu trennen. Um den Erfolg eines Reinigungsschrittes zu kontrollieren, wird vor und nach diesem Schritt die Belegung des Analysenbereiches 2 mit Beads 18 detektiert. Wenn sich nach einem Reinigungsschritt zwischen der Belegung vorher und der Belegung nachher kein signifikanter Unterschied ergibt, kann davon ausgegangen werden, dass die detektierte Bead-Belegung ausschließlich auf Bindungspaare 21 zurückzuführen ist.
Die Detektion der Bead-Belegung des Analysenbereiches 2 sowie die Differenzbildung zwischen zwei Belegungszuständen, etwa der Belegung vor und nach einem Reinigungsschritt, erfolgt unter Zuhilfenahme üblicher Controller. Diese gestatten auch die Anwendung von Statistiksoftware zur Bewertung von Bewegungszuständen und deren Veränderungen.
Ein zweites Verfahrensbeispiel ist in den 10 und 11 verdeutlicht. Es geht dabei um die Suche nach bestimmten Antigenen in Analytlösungen. Auf dem Analysebereich 2 sind Antikörper 25, wiederum über einen Spacer 5 immobilisiert. Das Gehäuse 6 wird über seine Einströmöffnung 7 mit einer Antigene 24 enthaltenden Analytlösung beschickt. Zu den Antikörpern 25 passende Antigene 24a lagern an diese unter Bildung von Bindungspaaren 21 an. Nach Spülung des Analysebereiches 2 mit einer Reinigungslösung, etwa mit destilliertem Wasser, wird das Gehäuse 6 mit einer Lösung beschickt, die den immobilisierten Antigenen 25 entsprechende, mit Beads 18 markierte Antigene 25a enthält. Die Antikörper 25a lagern sich an das Antigen 24a eines Bindungspaares 21 an. Die Bindungspaare 21 können nun mit Hilfe eines homogenen Magnetfeldes und mit Magnetfeldsensoren detektiert werden. Auch hier kann es zweckmäßig sein, nicht gebundene markierte Antikörper 25b mit Hilfe eines inhomogenen Magnetfeldes 20, wie bereits weiter oben beschrieben, in einem Reinigungsschritt zu entfernen und dadurch die Aussagekraft der Detektion insbesondere in quantitativer Hinsicht zu verbessern.
Bei vielen biochemischen Reaktionen, die auf dem Schlüssel-Schloss-Prinzip basieren, etwa Antikörper-Antigenreaktionen oder die Hybridisierung von DNA-Sequenzen, findet eine Bindung auch dann statt, wenn die Übereinstimmung zwischen den bindungsrelevanten Bereichen der Bindungspartner nicht 100 ist. Solche unspezifischen Bindungen sind oft unerwünscht. Bei einer weiteren bevorzugten Verfahrensvariante kann eine Selektion hinsichtlich der Bindungsqualität vorgenommen werden, in dem vor dem Auslesen eines Analyseergebnisses ein inhomogenes Magnetfeld erzeugt und dessen Feldstärke so gewählt wird, dass die Beads 18 von Kopplungspaaren 21 in Richtung der Normalen 22 mit einer Kraft beaufschlagt werden, die geringer ist als die zur Trennung einer spezifischen Bindung zwischen einem Zielmolekül und einem Sondenmolekül erforderliche Kraft.
Im Falle einer Hybridisierung eines DNA-Oligomers 16 mit einem Sondenmolekül 19 mit einer komplementären Basenfrequenz können somit solche Bindungspaare 21 detektiert werden, bei denen die gegenseitigen Basensequenzen voneinander abweichen. Die Bindungskräfte zwischen zwei komplementären Basenpaaren (Adinin-Thymin, Zytosin-Guanin) sind bekannt, so dass die zum „Abreißen" einer unspezifischen Bindung erforderliche Kraft berechnet werden kann. Durch Anlegen eines eine entsprechende Abreißkraft erzeugenden inhomogenen Magnetfeldes können somit alle Zielmoleküle, die einen vorgegebenen Übereinstimmungsgrad unterschreiten, aus dem Analysebereich 2 entfernt werden.
Durch eine Detektion der Beadbelegung vor und nach einem solchen Selektionsschritt kann festgestellt werden, ob sämtliche Bindungen mit einem vorgegebenen Übereinstimmungsgrad getrennt wurden. Außerdem lässt sich eine quantitative Aussage darüber machen, welchen Anteil die jeweils entfernten unspezifisch gebundenen Zielmoleküle im Vergleich zu spezifisch gebundenen Zielmolekülen haben. Eine weitere Ausgestaltung dieser Verfahrensvariante sieht vor, dass die Feldstärke des inhomogenen Magnetfeldes in Stufen erhöht wird, wobei die Feldstärke einer Stufe so gewählt wird, dass auf die Markerpartikel jeweils eine zur Trennung einer bestimmten unspezifischen Bindung erforderliche Kraft einwirkt.
Auf diese Weise kann nach Art einer Spektroskopie festgestellt werden, ob und gegebenenfalls mit welchen Anteil bestimmte unspezifische Bindungen vorhanden sind.
Bei einer weiteren Verfahrensvariante wird während der Durchführung einer Analyse ein inhomogenes Magnetfeld erzeugt, dessen Feldstärke entgegen der Normalen 22 des Analyseberei ches 2 zunimmt. Bei einem solchen Magnetfeld wirkt auf ein Bead 18 eine Kraft ein, die es an den Analysebereich 2 annähert. Dadurch wird zwischen den Beads 18 und dem Analysebereich 2 ein eingehängtes Probenvolumen 26 geschaffen.
Letzteres kann etwa bei folgendem Verfahrensbeispiel nutzbringend angewendet werden: Um die Spaltungsspezifität einer Protease festzustellen, werden mit jeweils einem Bead 18 markierte Polypeptide 27 an der Oberfläche des Analysebereiches 2 immobilisiert. Diese weisen eine Vielzahl möglicher Spaltungsstellen 28 auf, an welchen eine Protease 29 wirksam werden kann. Indem die Beads 18 mit Hilfe eines inhomogenen Magnetfeldes 20a (s. 7) zur Oberfläche des Analysebereiches 2 hin bewegt werden, bildet sich ein verengtes Probenvolumen 26 aus. In diesem liegt zwar die gleiche Konzentration an Proteasen vor wie in dem Restvolumen des Gehäuses 6. Durch die Annäherung der Beads 18 an die Oberfläche des Analysebereiches 2 werden die Polypeptide 27 unter Ausbildung einer Vielzahl von Schlingen gestaucht. Die vorher über ein größeres Volumen verteilten Spaltungsstellen sind nun in dem kleineren Probenvolumen angeordnet, was einer erhöhten Konzentration an Spaltungsstellen 28 bzw. Reaktionsdichte entspricht. Dementsprechend findet eine Protease 29 aufgrund des größeren Angebots schneller eine geeignete Spaltungsstelle 28.
Zur Auswertung des Analyseergebnisses wird ein inhomogenes Magnetfeld entsprechend 6 oder 7 erzeugt, wobei Beads 18 von durchtrennten Polypeptiden 27 vom Analysebereich 2 und durch einen Spülvorgang aus dem Gehäuse 6 entfernt werden. Auch bei dieser Verfahrensvariante kann ein der Detektion vorgeschalteter Reinigungsschritt unter Anwendung eines Magnetfeldes 20 entsprechend 6 zweckmäßig sein.
Anhand der 8 bis 12 wurden speziell biochemische Analyseverfahren beschrieben. Ebenso gut ist die erfindungsgemäße Vorrichtung auch in der allgemeinen Analytik einsetzbar. Besonders vorteilhaft ist, dass das Magnetfeld nach Art und Stärke wahlfrei in der Normalenrichtung fes Analysenbereiches vorgegeben werden kann. Daher ergeben sich bereite Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei durch extern angelegte Kräfte Bindungskräfte bestimmt werden können.

Claims

Vorrichtung zur Durchführung eines Analyseverfahrens, bei dem – auf einem Substrat (1) innerhalb eines Analysebereichs immobilisierte Sondenmoleküle (19), insbesondere biochemisch wirksame Moleküle und Strukturen, mit einer – Zielmoleküle (3) als Reaktionspartner enthaltenden Analytlösung in Kontakt gebracht werden und – Reaktionsereignisse zwischen Ziel- und Sondenmolekülen mit Hilfe von an die Ziel- oder die Sondenmoleküle gekoppelten magnetisierbaren Markerpartikeln (18) detektiert, – bei dem die Bindungskraft der Reaktionsereignisse durch magnetische Kräfte bestimmt werden, gekennzeichnet durch – eine Flusszelle (106, 6, 7, 8) mit der Analytlösung, – ein Substrat (102, 1) innerhalb der Flusszelle (106, 6, 7, 8) mit einem Analysebereich (102, 2) sowie im Analysebereich (102, 2) immobilisierte Sondenmolekülen (19) – magnetfeldsensitiven Sensoren (104, 4, 4a, ...) zur Magnetfeldmessung, wobei – erste Mittel (110) zur Fluidiksteuerung und/oder -regelung, – zweite (Magnetfeld) Mittel (100, 9/13; 10/12) zumindest zur Erzeugung eines im Analysebereich (2) zumindest zeitweise wirksamen inhomogenen Magnetfeldes (20, 20a), – dritte Mittel (101) zur Magnetfeldsteuerung, – vierte Mittel (110) zur Erfassung und Auswertung von Messwerten und – fünfte Mittel zur Korrelation von Magnetfeld und Bindungskraft vorhanden sind, – wobei die ersten bis fünften Mittel eine Ablaufsteuerung zur Bestimmung der Bindungskräfte der Reaktionsereignissen bilden.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Magnetfeldmittel ein erstes, aus zwei axial beabstandeten, mit ihren Windungsebenen etwa parallel zu einer Planebe ne (14) des Analysebereichs (2) angeordneten, das Substrat (1) zwischen sich einschließenden Spulen (9, 13) gebildetes Spulenpaar umfasst, wobei die auf der Analyseseite des Substrats (1) angeordnete Spule (9) einen kleineren Durchmesser aufweist als die andere Spule (13).
Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites Spulenpaar (10/12), das wie das erste Spulenpaar (9/13) ausgestaltet und angeordnet ist, wobei jedoch die Spule (10) mit dem größeren Durchmesser auf der Analyseseite des Substrats (1) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spulen (9–12) des/der Spulenpaars/-paare (10/12; 9/13) einen kreisrunden Querschnitt haben.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Spulen (9–12) des/der Spulenpaars/-paare (10/12; 9/13) einen rechteckförmigen Querschnitt haben.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweils einer Seite des Substrats (1) zugeordneten Spulen (9, 10 bzw. 12, 13) konzentrisch zueinander angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erzeugung eines homogenen Magnetfelds die großen Spulen (10, 13) und/oder die kleine Spulen (9, 12) jeweils separat ansteuerbar sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Magnetfeldmittel durch geeignete Ansteuerung der Spulen (9–12) entweder ein homogenes oder ein inhomogenes Magnetfeld, insbesondere zeitlich nacheinander bzw. alternierend, generierbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das durch die Magnetfeldmittel erzeugte Magnetfeld eine Symmetrie entweder zur Achse des Analysebereiches (2) oder zu einer Ebene senkrecht zum Analysebereich (2) des Substrates (1) hat.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Analysebereich (2) eine Messschicht (4) mit mindestens einem Magnetfeldsensor (4a, ...) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mehrzahl von Magnetfeldsensor (4ik) ein zweidimensionales Array bilden.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchflusszelle (106; 6, 7, 8) mit dem Analysebereich (2) durch ein eine Ein- und eine Ausströmöffnung (7, 8) aufweisendes Gehäuse (6) gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zur Magnetfeldmessung ein Hall-Sensor (102) ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel zur Messung von Magnetfeldänderungen sog. XMR-Sensoren verwendet werden.
Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die XMR-Sensoren AMR-, GMA- und/oder TMA-Sensoren Sind.
Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die XMR-Sensoren ein ein- oder zweidimensionales Array bilden, das im Analysenbereich das Messfeld abdeckt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Auslesen der Magnetsensoren gleichermaßen zur Speicherung ausgelesener Zustände der Magnetsensoren geeignet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Bewertung der Zustände eine Statistik-Software enthalten.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Mittel zur Veränderungen der Zustände vorhanden sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Erfassung und Auswertung der Messwerte von wenigstens einem Controller oder Mikrocontroller (120) gebildet sind, der mit der Statistik-Software betreibbar ist.
Mit der Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 20 durchführbares Analyseverfahren, bei dem auf einem Substrat (1) innerhalb eines Analysebereichs (2) immobilisierte Sondenmoleküle (19), insbesondere biochemisch wirksame Moleküle mit einer Zielmoleküle (3) als Reaktionspartner enthaltenden Analytlösung in Kontakt gebracht und Reaktionsereignisse zwischen Ziel- und Sondenmolekülen mit Hilfe von an die Ziel- oder die Sondenmoleküle gekoppelten magnetisierbaren Markerpartikeln (18) detektiert werden, wobei vor und/oder nach einer Detektion der Analysebereich mit einem inhomogenen Magnetfeld beaufschlagt wird.
Analyseverfahren nach Anspruch 21, bei dem die Reaktionsereignisse die Bindung von Zielmolekülen an im Analysebereich (2) immobilisierten Sondenmolekülen (19) sind.
Analyseverfahren nach Anspruch 21 oder 15, bei dem in einem Reinigungsschritt vor einer Detektion ein inhomogenes Magnetfeld derart erzeugt wird, dass auf die Markerpartikel (18) eine diese vom Analysebereich (2) entfernende Kraft einwirkt.
Analyseverfahren nach Anspruch 23, bei dem ein inhomoge nes Magnetfeld (21) mit einer in Richtung der Normalen (22) des Analysebereichs (2) zunehmenden Feldstärke erzeugt wird.
Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, bei dem in einem Reinigungsschritt die Stärke des Magnetfelds so gewählt wird, dass die auf ein an ein Zielmolekül gekoppeltes Markerpartikel (18) einwirkende Kraft geringer ist, als die zur Trennung einer Bindung zwischen dem Zielmolekül (3) und dem Sondenmolekül (19) eines Kopplungspaares (21) erforderliche Kraft.
Analyseverfahren nach Anspruch 25, bei dem jeweils vor und nach einem Reinigungsschritt die Belegung des Analysebereichs (2) mit Markerpartikeln (18) ermittelt wird.
Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, bei dem ein inhomogenes Magnetfeld erzeugt und dessen Feldstärke so gewählt wird, dass ein an ein Zielmolekül gekoppeltes Markerpartikel (18) mit einer Kraft beaufschlagt wird, die ausreicht, um ein spezifisch oder unspezifisch gebundenes Zielmolekül (3) eines Bindungspaares (21) vom Sondenmolekül (19) zu trennen.
Analyseverfahren nach Anspruch 27, bei dem die Feldstärke des Magnetfelds in Stufen erhöht wird, wobei die Feldstärke jeder Stufe so gewählt wird, dass auf ein Markerpartikel eine zur Trennung einer bestimmten spezifischen oder unspezifischen Bindung zwischen dem Zielmolekül (3) und dem Sondenmolekül (19) eines Bindungspaares (21) erforderliche Kraft einwirkt.
Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 28, bei dem auf den Analysebereich eine Analytlösung mit markerfreien Zielmolekülen aufgebracht wird und danach Bindungspaare mit Markerpartikeln markiert werden.
Analyseverfahren nach Anspruch 21, bei dem während der Durchführung einer Analyse ein inhomogenes Magnetfeld erzeugt wird, dessen Feldstärke entgegen der Normalen (22) des Analysebereichs (2) zunimmt.
Analyseverfahren nach Anspruch 21, bei dem die Analytlösung Zielmoleküle (3) enthält, welche mit einem Koppelmolekül (17) verknüpft sind, das eine Bindung zu einem Markerpartikel (18) eingehen kann.