DE69815997T2

DE69815997T2 - Mikrohergestellte Magnetteilchen

Info

Publication number: DE69815997T2
Application number: DE69815997T
Authority: DE
Inventors: Robert John Cupertino Wilson
Original assignee: International Business Machines Corp
Current assignee: International Business Machines Corp
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-11-19
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2018-11-20
Also published as: DE69815997D1; JPH11230965A; EP0919285A2; EP0919285B1; EP0919285A3; JP2994372B2; US5932097A; US6337215B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Magnetteilchen und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Magnetteilchen für Anwendungen der Affinitätsbindung.
Verfahren mit Magnetteilchen (auch als Magnetperlen bekannt) haben sich in mehreren Bereichen der Biotechnologie als wertvolle Werkzeuge etabliert. Die Leistungsfähigkeit dieser Verfahren leitet sich von der Grundeigenschaft ab, dass die Perlen an diverse biochemische Moleküle mit selektiven Zielerkennungseigenschaften (wie beispielsweise Proteine und Nukleinsäuren) chemisch angekoppelt oder gebunden und zu äußerst komplexen Reaktionsgemischen (wie beispielsweise Gesamtblut oder Zellfragmente in Lösung) hinzugefügt werden können, sodass aus den entstehenden affinitätsgebundenen Komplexen magnetische Einheiten werden. Bei Trennungen werden diese Komplexe zunächst durch ein Magnetfeld selektiv erfasst und dann von unerwünschten Verunreinigungen befreit. Außerdem gibt es weitere Anwendungen wie beispielsweise die räumliche Eingrenzung und die magnetisch induzierte Aggregatbildung.
Zu den Anwendungen der Magnetperlenverfahren in der Nukleinsäureforschung gehören Reinigungsverfahren zur DNA-Sequenzierung, zur gezielten RNA- oder Proteinisolierung bei der Differenzierung von Zelllinien, zum Erstellen differenzieller c-DNA-Bibliotheken, zum Sortieren von Chromosomen und großen DNA-Molekülen und zur Isolierung von DNA-bindenden Proteinen. Zur Zeit werden in der Medizin große Anstrengungen unternommen, um Ganzzellentrennungen für Therapien wie die Knochenmarktransplantation und die Organtransplantation mit verbesserter Gewebeverträglichkeit zu erreichen.
Eine der Einschränkungen der gegenwärtigen Technologie besteht darin, dass magnetische Trennungen jeweils nur an einem einzigen Zielobjekt durchgeführt werden können, wodurch mögliche Mehrfachtrennungen schwierig, zeitaufwändig und teuer werden. Ferner kann eine zweite Trennung an einem bestimmten Objekt keine optimalen Ergebnisse liefern, da sich die Fehler der Trennungen addieren können. Wenn man ausreichend unterscheidbare Magnetteilchen herstellen und mit ausgewählten „Erkennungs" molekülen koppeln könnte, wäre es möglich, die Teilchen und die daran gebundenen Zielobjekte in verschiedene Gruppen aufzutrennen, welche die Art und die Anzahl der gebundenen Magnetteilchen widerspiegeln. Ein Beispiel der durch diese Eigenschaft ermöglichten Vorteile findet man in der Literatur zur Knochenmarktransplantation. Hier hat man gefunden, dass Trennungen auf Basis eines Oberflächenmarkers für eine einzelne Zellenart routinemäßig mittels Magnetperlenverfahren durchgeführt werden, während Trennungen auf Basis von Oberflächenmarkern für mehrere Zellenarten auf Zellensortierer mit Fluoreszenzaktivierung zurückgreifen müssen, welche die Zellen einzeln analysieren müssen.
Dies zeigt, dass ein Bedarf an Magnetteilchen besteht, welche charakteristische und beherrschbare magnetische Eigenschaften aufweisen und an genetisches Material oder andere interessierende Objekte gekoppelt werden können.
In der US-Patentschrift A 5 662 824 werden Magnetteilchen mit einer Oberflächenbeschichtung und daran gekoppelten Bioaktivatoren beschrieben, die Zielmoleküle erkennen und binden.
In der Patentanmeldung WO-A-9 07 380 werden Verfahren und Materialien für die Hochgradienten-Magnettrennung (high gradient magnetic Separation, HGMS) von biologischen Materialien beschrieben. Aus superparamagnetischen Teilchen, die optional mit Polysacchariden oder anderen üblicherweise organischen Materialien beschichtet sind, kann mittels des HGMS-Verfahrens eine einheitliche Zusammensetzung mit homogenen Magnetisierungen dargestellt werden.
ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG
Um die oben beschriebenen Einschränkungen des Standes der Technik sowie weitere beim Lesen und Verstehen der vorliegenden Beschreibung zu Tage tretenden Einschränkungen zu überwinden, beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung einer Materialzusammensetzung, die Folgendes umfasst: ein Magnetteilchen, welches eine erste ferromagnetische Schicht mit einem in einer ersten Richtung ausgerichteten Moment, eine zweite ferromagnetische Schicht mit einem in einer zu der ersten Richtung im Allgemeinen antiparallelen zweiten Richtung ausgerichteten Moment umfasst und durch eine zwischen der ersten und der zweiten ferromagnetischen Schicht angeordnete unmagnetische Abstandsschicht gekennzeichnet ist, und wobei die Stärke des magnetischen Moments der ersten ferromagnetischen Schicht im Wesentlichen gleich der Stärke des magnetischen Moments der zweiten ferromagnetischen Schicht ist, sodass das Magnetteilchen bei Abwesenheit eines Magnetfeldes im Wesentlichen ein magnetisches Gesamtmoment von null aufweist, und wobei die Dicke des Magnetteilchens im Wesentlichen gleich der Gesamtdicke der Schichten ist, aus denen das Teilchen besteht; eine Beschichtung auf der Oberfläche des Magnetteilchens; und ein an die Beschichtung des Magnetteilchens gekoppeltes Molekül zur Erkennung der Bindungsaffinität, um dieses selektiv mit einem Zielmolekül zu verbinden.
Zum besseren Verständnis der Erfindung, ihrer Vorteile und der durch ihre Verwendung erreichten Ergebnisse sollte jedoch auf die einen weiteren Bestandteil der Erfindung bildenden Zeichnungen und die beiliegende Beschreibung Bezug genommen werden, in denen spezielle Beispiele gemäß der Erfindung veranschaulicht und beschrieben werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Gleiche Bezugsnummern stellen entsprechende Teile in den folgenden Zeichnungen dar, in denen:
1 das Verhalten des magnetischen Moments einer typischen Struktur der vorliegenden Erfindung bei Vorliegen eines entlang der magnetischen Fixierungsachse angelegten Magnetfeldes zeigt, die auch als freie Achse bezeichnet wird;
2 eine typische Schichtstruktur zeigt, wie sie zur Herstellung der Magnetteilchen der vorliegenden Erfindung verwendet wird;
3 die Magnetisierungskurve für den Fall der rechtwinkligen Ausrichtung zwischen dem angelegten Feld und der Fixierungsachse des Teilchens der vorliegenden Erfindung zeigt;
4 die Magnetisierungskurven für einzelne Teilchenarten zeigt, wobei das Magnetfeld parallel und senkrecht zu deren Fixierungsachsen liegt;
5A bis 5C eine mögliche Ausführungsart zur Trennung der Magnetteilchen der vorliegenden Erfindung unter Anwendung zeitabhängiger Magnetfelder veranschaulicht;
6 eine alternative Ausführungsart veranschaulicht, bei der zur Trennung von Teilchen der vorliegenden Erfindung die räumliche Abhängigkeit und statische Felder verwendet werden; und
7 die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendeten Verfahrensschritte veranschaulicht.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSART
Bei der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsart wird auf die einen Bestandteil der Erfindung bildenden beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen, in denen eine spezielle Ausführungsart veranschaulicht wird, nach der die Erfindung ausgeführt werden kann. Es ist klar, dass weitere Ausführungsarten verwendet und strukturelle Änderungen angebracht werden können, ohne vom Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Auf die Verwendung von Magnetteilchen oder anderer Marker zur Trennung erwünschter oder unerwünschter Moleküle, Antigene oder Antikörper aus menschlichem Blut oder Gewebe werden gegenwärtig große Anstrengungen verwendet. Die im Mittelpunkt der Untersuchungen stehenden Magnetteilchen sind einheitliche Polystyrolkugeln mit einem Durchmesser von etwa 5 μm, die durch Einfügen von bis zu 35 Gew.-% magnetischer Eisenoxide superparamagnetisch gemacht werden. Varianten des aktuellen Standes der Technik betreffen die Verwendung einer heterogenen Größenverteilung der Teilchen, die Verwendung kleiner (< 0,1 μm) superparamagnetischer Teilchen und die Verwendung entmagnetisierter ferromagnetischer Teilchen.
Bei der Anwendung von Magnetperlenverfahren in der Medizin zur Abtrennung intakter Zellen werden Magnetperlen verwendet, die mit monoklonalen Antikörpern oder anderen spezifischen Bindungspartnern für Antigene der Zellenoberfläche beschichtet sind und die Abtrennung von Zellen mit gewünschten Eigenschaften aus komplexen Gemischen ermöglichen.
Im Allgemeinen sind hierfür Proteinmarker an der Zellenoberfläche erforderlich, die nach einer Nomenklatur der Differenzierungscluster (z. B. CD21) bezeichnet werden, welche den Zellentyp jedes Markers angibt. Gegenwärtig werden umfangreiche kommerzielle Anstrengungen zur Entwicklung und Vermarktung von magnetischen Zellensortiergeräten unternommen, die für die Überwachung, Isolierung und Reinigung verschiedener Lymphozytenklassen im Immunsystem geeignet sind.
Besonders intensive Anstrengungen betreffen gegenwärtig die Trennung von Stammzellen (CD34) des Immunsystems, die vorwiegend im Knochenmark zu finden sind und durch Teilung und Differenzierung alle bei der Immunreaktion beteiligten Zellenklassen bilden. Der eigentliche Grund für diese Forschungen besteht darin, dass man solche Zellen aus einem Spender isolieren und im Immunsystem von Patienten wieder ansiedeln will, welches durch Strahlenbehandlung oder Chemotherapie Dosierungen ausgesetzt worden ist, die zum Untergang der Stammzellen geführt haben. Ähnliche Anstrengungen zielen auf die Beseitigung cytotoxischer T-Zellen von allogenen (mit fremden Genomen) Knochenmarkspendern.
Bei einigen dieser Anwendungen will man Zellen anhand des Vorhandenseins (oder Fehlens) von mehr als einem speziellen Zelloberflächenmarker abtrennen. Für solche Trennungen bedient man sich gegenwärtig der fluoreszenzaktivierten Zellensortierung, die Zelle für Zelle abläuft und bei klinischen Anwendungen eingesetzt wird. Leider ist die Arbeitsgeschwindigkeit beim Stand der Technik auf einige tausend Zellen je Sekunde beschränkt, sodass man nach einer kurzen Vorreinigung entsprechend der Zellendichte mittels Zentrifugierens auf eine Konzentration von etwa 1% einen Arbeitstag (Instrument und Bediener) benötigt, um ausreichend Zellen auszusortieren (typische Behandlungsdosen liegen bei 2 × 10⁶ Zellen). Bei neueren Magnetperlenverfahren braucht nicht jede einzelne Zelle untersucht zu werden, sodass weniger aufwändige Geräte und eine geringere Aufmerksamkeit seitens des Bedieners erforderlich sind, da die Trennung erfolgt, indem man die Lösung mit den Magnetperlen-Zellen-Komplexen einfach ungefähr eine Stunde lang in einen Magnetfeldgradienten bringt.
Ein begrenzendes Merkmal bisheriger Magnetperlenverfahren besteht darin, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt jeweils nur ein Zellenmarker angesprochen wird. Die vorliegende Erfindung verwendet hinreichend unterscheidbare Magnetteilchen, sodass mehrere solcher Trennungen parallel ausgeführt oder Anteile isoliert werden können, die an bestimmte Markerkombinationen gebunden sind. Die vorliegende Erfindung erreicht dieses Ziel durch Konstruieren von Teilchen, deren magnetische Momente sowohl bezüglich ihrer Stärke als auch ihrer Magnetfeldabhängigkeit mittels Verfahren beeinflusst werden können, die zur Stabilisierung von magnetischen Domänen in Sensoren für Anwendungen zur magnetischen Speicherung entwickelt wurden. Ein Hauptmerkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass mehrere Schichten aus ferromagnetischen Materialien, deren Eigenschaften durch antiferromagnetische Kopplung oder durch antiferromagnetische Austauschvormagnetisierung verändert wurden, zur gezielten Abstimmung des magnetischen Ansprechverhaltens von Teilchen für Mehrfachtrennungen oder andere Anwendungen verwendet werden. Dieses Merkmal fehlt beim Stand der Technik.
GRUNDLEGENDE PHYSIKALISCHE ÜBERLEGUNGEN
Auf in Lösung befindliche affinitätsgebundene Magnetperlen wirken Kräfte ein, die mit Magnetfeldern, der Schwerkraft, Zusammenstößen und elektrischen Wechselwirkungen mit anderen Lösungsbestandteilen und Behälterwänden zusammenhängen. Wandwechselwirkungen sind im Allgemeinen gut erklärbar, und die Lösungsumgebung wird hier nur bezüglich der Diffusions- und Viskositätswiderstandskräfte betrachtet. Elektrische Kräfte in ionischen wässrigen Medien haben im Allgemeinen eine kurze Reichweite und sind, obwohl in Bezug auf Kolloidstabilität und Wandwechselwirkungen brauchbar, in der Technik wohlbekannt. Die bei der vorliegenden Anwendung interessierenden magnetischen Kräfte resultieren aus dem angelegten Magnetfeld und aus den Magnetfeldern der Magnetperlen selbst. Die letzteren Kräfte sind insofern von Bedeutung, als sie zur Bildung von Aggregaten der Magnetpartikel und ihrer Komplexe führen können.
Eine Einfachtrennung wird durch Ausüben einer magnetischen Kraft ausgeführt, die nicht durch Gravitationskräfte übertroffen wird. Durch die Anwendung einer solchen magnetischen Kraft werden die Magnetperlen in einen durch das Magnetfeld beherrschten Bereich gezogen, sodass unmagnetische Komponenten ausgesondert werden können. Wenn alle Magnetperlen-Zielobjekt-Komplexe und die magnetischen Kräfte identisch sind und die Gravitation, die Diffusion und die Laminarströmung beherrscht werden, bewegen sich alle Komplexe mit derselben Geschwindigkeit entlang einer Trennsäule. Bei einer Einzeltrennung besteht das Ziel jedoch nicht so sehr darin, alle Perlen und Komplexe anzusammeln, sodass kein Bedarf an einer Säule, homogenen Perlen oder magnetischen Kräften besteht und den Aggregierungskräften nur geringes Interesse entgegengebracht wird, solange diese hinreichend schwach sind, sodass die Perlen zum Vermischen und Binden oder Trennen ihrer Zielobjekte in der Lage sind.
Um eine gleichzeitige Trennung mehrerer Zielobjekte durchzuführen, werden zwei magnetisch unterscheidbare Perlenarten verwendet, indem an einer Stelle in einer verallgemeinerten Trennsäule ein Gemisch der gebundenen Perlen eingesetzt wird. In diesem Fall unterscheiden sich die magnetischen Kräfte für die unterschiedlichen Perlenarten.
Wenn alle Perlen-Zielobjekt-Komplexe bezüglich der Viskositätskräfte und der Diffusion identisch sind, bewegen sich die beiden Arten der Perlen-Zielobjekt-Komplexe in dem angelegten Magnetfeld mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und trennen sich in Bänder auf. Es ist klar, dass im Fall der Mehrfachtrennung die Trennung umso unvollständiger ist, je stärker es zur Aggregierung der verschiedenen Perlenarten kommt. Ferner können sich durch die Aggregierung von Perlen derselben Art die an den Aggregaten angreifenden magnetischen und die Viskositätswiderstandskräfte ändern, wodurch sich die Geschwindigkeit der betroffenen Komplexe ändert, was wiederum zu einer Abweichung von der Idealtrennung in zwei Bänder führt.
Die Auswirkungen der Aggregierung im Fall einer Mehrfachtrennung hängen von der gewünschten Ausbeute und dem Reinheitsgrad der Trennung ab. Die Ausbeute und der Reinheitsgrad werden durch den Verlust von Komplexen aus den gewünschten Bändern bzw. durch das Auftreten unpassender Komplexe innerhalb der gewünschten Bändern begrenzt.
Schließlich kann man eine Trennung durchführen, bei der Objekte mit Mehrfachbindungsplätzen für jeden von zwei oder mehr unterschiedlichen Markern gleichzeitig an einem einzigen Zielobjekt auftreten. Die magnetischen Kräfte hängen dann sowohl von der Anzahl als auch von der Art der Magnetperlen im Komplex ab, sodass trotz identischer Viskositätswiderstandseffekte mehrere Bänder zu erwarten sind. Lässt man zu, dass die Perlen-Zielobjekt-Komplexe in Größe und Form variieren können, muss als weitere Komplikation in Betracht gezogen werden, dass es zu starken Unterschieden des Viskositätswiderstands kommt. In diesem Fall wird der Begriff der Trennung in Bänder fraglich und man greift für die Trennungen auf die fluoreszenzaktivierte Zellensortierung zurück. Bei diesem Verfahren werden Perlen verwendet, die durch unterschiedliche Fluoreszenzen markiert und ebenfalls mit speziellen Erkennungsmolekülen verbunden sind, sodass die Art und die Anzahl der angekoppelten Perlen anhand ihres optischen Fluoreszenzspektrums bzw. dessen Intensität unterschieden wird. Bei diesem Verfahren kommt es nicht zu starken Beeinträchtigungen infolge von Änderungen der Viskositätswiderstandkoeffizienten, jedoch müssen die Messung und die Trennung nacheinander an einzelnen Zellen durchgeführt werden.
Die Aussichten für die Erweiterung von Magnetperlenverfahren auf dieses Gebiet würden wesentlich verbessert, wenn Perlen mit hinreichend unterscheidbaren magnetischen Eigenschaften und Verfahren zur Lösung von Problemen verfügbar wären, die sich aus Änderungen der Viskositätswiderstandskoeffizienten ergeben können. Zuerst soll der Aspekt der unterscheidbaren magnetischen Eigenschaften betrachtet werden.
Die bei Anlegen eines Magnetfeldes auf eine Magnetperle einwirkende magnetische Kraft F ist: F = –∇(M – H).
Hierin ist H die äußere Feldstärke und M(H) das magnetische Moment der Perle. Für superparamagnetische Perlen, wie sie nach dem Stand der Technik bei Feldern weit unterhalb der Sättigungsfeldstärke (üblicherweise viele tausend Oersted) verwendet werden, gilt: M(H) = χHV
Wobei χ die superparamagnetische Suszeptibilität und V das Teilchenvolumen ist. Prinzipiell lassen sich unterschiedliche Arten von superparamagnetischen Perlen herstellen, zum Beispiel durch Änderung von χ bei der magnetischen Aufladung oder durch Änderung des Volumens, sodass Teilchen mit unterschiedlichen magnetischen Momenten gebildet werden. Das resultierende Moment einer Anordnung von zwei Arten solcher Teilchen, die n₁ Teilchen der Art i enthalten, beträgt M = n₁M₁ + n₂M₂. Im Idealfall, also wenn eine Säulentrennung für jedes mögliche M diskrete Bänder liefern würde, könnten n₁ und n₂ für jedes Band abgeleitet und entsprechend dem jeweiligen Gehalt indiziert werden, und zwar nach Fraktionen, die M₁ und M₂, M₁ ohne M₂ und M₂ ohne M₁ enthalten. Aus den obigen Überlegungen ergibt sich, dass diese einzelnen Fraktionen wegen der Schwankungen von n_i in mehreren Bändern vorkommen können, was oft unkritisch ist. Wenn die gewünschten Bänder durch Schwankungen der Viskositätswiderstandskoeffizienten der gebundenen Komplexe oder Schwankungen der Perlen selbst beeinträchtigt werden, kann dieses Verfahren versagen, da die Geschwindigkeit und der Ort eines bestimmten gebundenen Komplexes dann nicht ausreichend Informationen liefert, um das Vorhandensein und/oder Fehlen von M₁ und/oder M₂ festzustellen.
Die vorliegende Ausführungsart beinhaltet die Herstellung von Teilchen mit charakteristischen magnetischen Signaturen, sodass die Perlenart in einem Komplex unabhängig vom Wert n₁ bestimmt werden kann. Diese Teilchen sind Schichtstrukturen, in denen zur Minimierung von Aggregierungsproblemen mehrere ferromagnetische Schichten so getrimmt werden, dass sie bei einem Magnetfeld null ein resultierendes Magnetmoment von ungefähr null haben. Die Abhängigkeit des magnetischen Moments von der magnetischen Feldstärke unterscheidet sich für die einzelnen Teilchenarten und ist in dem leicht erreichbaren Bereich der magnetischen Feldstärken von über zehn bis zu mehreren hundert Oersted nichtlinear. Die charakteristischen effektiven Suszeptibilitäten gestatten eine unabhängige Bestimmung der in dem Komplex enthaltenen Perlenarten, wie sie auch durch die bei den fluoreszierenden Perlen ausgenutzten charakteristischen spektralen Eigenschaften möglich ist. Außerdem wird durch die nichtlinearen magnetischen Eigenschaften die Verwendung von Trennanordnungen ermöglicht, durch welche die mit der Schwankungsbreite des Viskositätswiderstandes verbundenen Probleme verringert werden können.
FÜR DIE TRENNUNG ERFORDERLICHE KRÄFTE
Bevor man zur Erklärung der vorgeschlagenen Strukturen übergeht, müssen einige physikalische Fakten und Grenzen aufgezeigt werden. Zuerst soll die Kolloidstabilität betrachtet werden, d. h. die Tendenz von Magnetteilchen, sich aus der Lösung abzusetzen. Eine grobe Stabilitätsabschätzung erhält man durch Vergleichen der Differenz der potentiellen Energie der Schwerkraft für ein Teilchen über einen Höhenbereich von einem Zentimeter mit der thermischen Energie kT, wobei k = 1,38 × 10^–16 erg·s/K die Boltzmannkonstante und T die Temperatur ist. Für eine Kugel mit dem Radius r und der Dichte ρ in einer Flüssigkeit der Dichte ρ₀ ist die Größe auf: r = 0,02 μmx(δρ)–1/3 beschränkt, wobei δρ = ρ – ρ₀ (in g/cm³) ist. Für die hier zur Bildung der magnetischen Strukturen verwendeten Materialien mit δρ = 10 kommt es zum Absetzen, wenn nicht sehr kleine Teilchen oder Beschichtungen mit niedriger Dichte verwendet werden. Um einfache Absetzeffekte zu verhindern, reicht jedoch leichtes Umrühren.
Ein wichtigeres Kriterium stellt jedoch die Tatsache dar, dass die magnetischen Kräfte mit den Gravitationskräften vergleichbar sein müssen, damit das Absetzen durch die Schwerkraft die magnetische Trennung nicht überwiegt. Durch Gleichsetzen der auf ein Teilchen einwirkenden magnetischen und der Gravitationskräfte erhält man: MV∇H = δρVg,wobei M die Magnetisierung, V das Teilchenvolumen, ∇H der Gradient des Magnetfeldes und g = 1000 cm/s² ist. Für ferromagnetische Materialien beträgt M etwa 10³ emu/cm³ und ρ = 10 g/cm³, sodass ∇H = 10 Oersted/cm beträgt. Dieser Magnetfeldgradient lässt sich leicht erzeugen. Diese Berechnung geht davon aus, dass die Teilchen lediglich aus ferromagnetischen Materialien bestehen, jedoch können andere Materialien in die Perlen einbezogen werden, wenn die Magnetfeldgradienten in geeigneter Weise geändert werden.
TEILCHENBEWEGUNG
Auch die magnetischen Kräfte müssen stark genug sein, damit die ausgelöste Bewegung nicht durch Diffusionsprozesse unterdrückt wird. Die Diffusionskonstante ist durch die Einstein-Smoluchowski-Gleichung: D = kT/fgegeben, wobei f der Koeffizient des Reibungswiderstands ist.
Für ein kleines Teilchen mit dem Radius r und einer niedrigen Geschwindigkeit v in einem wässrigen Medium mit der Viskosität η = 10^–2 ist die Reynoldszahl klein, sodass die Stokes'sche Gleichung gilt und f nur geringfügig von der Form abhängt. Für eine Kugel mit dem Radius r = 1 μm ist f = 6πη2r = 4 × 10^–5; daraus ergibt sich D zu ungefähr 10^–9 cm/s².
Da Δx = (2Dt)^1/2 = 0,6 μm·(t^1/2) ist, stellt die Diffusion für solche Teilchen einen langsamen Prozess dar.
Auch die Stokes'sche Gleichung liefert für eine Kraft F eine Translationsgeschwindigkeit eines Teilchens zu v = F/f. Die auf ein Teilchen mit einem Radius von 1 μm und ρ = 10 einwirkende Gravitationskraft beträgt 4 × 10–8 dyn, sodass sich v = 10^–3 cm/s ergibt. Diese Geschwindigkeit ist klein genug, um ausreichend Zeit für Trennungen bereitzustellen.
MAGNETISCHE AGGREGIERUNG BEI FELDSTÄRKE NULL
Befürchtungen zur Teilchenaggregierung sind bereits in unterschiedlichen Zusammenhängen geäußert worden. Um den Grund für diese Befürchtungen zu verstehen, müssen die Dipol-Dipol-Anziehungswechselwirkungen mit denen der thermischen Bewegung verglichen werden. Man setzt für ferromagnetische Eindomänenteilchen mit Magnetisierungen von M = 1000 emu/cm³ und dem Radius r die magnetische Dipol-Dipol-wechselwirkungsenergie bei Berührung M²/(2r)³ (M = 4/3xπr³M) gleich kT. Diese Gleichheitsbedingung ist für ein Teilchen mit dem Durchmesser von r = 0,003 μm erfüllt, was ein echt ferromagnetisches Teilchen mit äußerst geringen Abmessungen erfordern würde. Aus diesem Grund sind die meisten im vorliegenden Zusammenhang verwendeten Teilchen superparamagnetisch. Beim Superparamagnetismus unterliegt die Ausrichtung der inneren Spins durch die thermische Bewegung statistischen Schwankungen, sodass das resultierende magnetische Moment in einem Nullfeld verschwindet, aber bei einer Sättigungsfeldstärke von üblicherweise vielen Kilooersted monoton bis zu einem Sättigungswert ansteigt. Bei der vorliegenden Ausführungsart können die magnetischen Momente der einzelnen ferromagnetischen Schichten in einem Teilchen räumlich so ausgerichtet werden, dass das resultierende magnetische Moment beim Nullfeld verschwindet, aber die Sättigungsfeldstärken problemlos im Sub-Kilooersted-Bereich eingestellt werden können.
VERGLICH ZWISCHEN SUPERPARAMAGNETISMUS UND FERROMAGNETISMUS
Für superparamagnetische Perlen nach dem Stand der Technik erhält man für Feldstärken unterhalb der Sättigungsfeldstärke eine Magnetisierung von M = χH mit χ = 10^–2. Das magnetische Moment einer superparamagnetischen Perle mit einem Durchmesser von 5 μm beträgt dann ungefähr M = 6 × 10^–13 H emu. Für Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung kann man die volle Sättigungsmagnetisierung bereits bei mittleren Feldstärken erreichen, bei denen sich die inneren ferromagnetischen Schichten magnetisch ausrichten. Zum Vergleich soll eine etwa gleich große Perle nach der gegenwärtigen Technologie mit eine Permalloydünnschicht der Größe 5 μm × 5 μm × t nm betrachtet werden, bei dem M etwa 2 × 10^–11 (emu) beträgt, sodass eine ferromagnetische Dünnschicht der Dicke von 1 nm ein vergleichbar großes magnetisches Moment wie eine superparamagnetische Perle mit einem Durchmesser von 5 μm in einem Magnetfeld von 100 Oe hat. Somit ergibt sich ausreichend Freiraum zum Hinzufügen weiterer Materialien, um die inneren ferromagnetischen Dünnschichten zu verändern, während die magnetischen Momente und Abmessungen mit denen nach dem Stand der Technik vergleichbar bleiben. Solche hinzugefügten Materialien können auch Polymerumhüllungen und Materialien zur Erleichterung der nichtkovalenten oder kovalenten Ankopplung von biologischen Erkennungsmolekülen sein. Eine Übersicht über geeignete Verfahren zur Ankopplung von biologischen Erkennungsmolekülen wird weiter unten gegeben. Die Teilchenabmessungen können zur Leistungssteigerung oder Kostenverringerung auch angepasst werden. Bei Teilchen mit einem Durchmesser von 5 μm erhält man aus einer Dünnschicht von 1 cm² Fläche etwa 4 × 10⁶ Teilchen je cm², was der Überlebensdosis an Stammzellen für einen Menschen vergleichbar ist.
EIGENSCHAFTEN UND HERSTELLUNG VON MAGNETTEILCHEN
Im folgenden Abschnitt werden die Eigenschaften und in der vorliegenden Ausführungsart verwendete Herstellungsverfahren für das Magnetteilchen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
TEILCHENHSRSTELLUNG UND VERHINDERUNG DER AGGREGIERUNG
Die zur Herstellung bestimmter Arten von Magnetköpfen verwendeten Verfahren können direkt angepasst werden, um die Verwendung von stark ferromagnetischen Materialien in Strukturen zu ermöglichen, die im Nullfeld kein resultierendes Dipolmoment aufweisen. Diese Verfahren beruhen auf Materialien und Strukturen zur Herstellung ferromagnetischer Schichten, die sich im Nullfeld mittels des antiferromagnetischen Austauschs oder der magnetostatischen Kopplung durch unmagnetische Abstandsschichten getrennter magnetischer Schichten oder durch Austauschkopplung in verschiedenen Richtungen an antiferromagnetische Schichten „fixierter" ferromagnetischer Schichten antiparallel ausrichten. Ein Beispiel für den letzteren Typ von Struktur und Kopplungsmechanismus stellt das Spinventil dar. Hier liegt eine ferromagnetische Schicht vor, die durch Austauschkopplung entlang einer Fixierungsachse an einer antiferromagnetischen Schicht fixiert ist.
Ferner gibt es eine „freie" ferromagnetische Schicht, die von der fixierten Schicht durch eine unmagnetische Abstandsschicht isoliert ist. Jede ferromagnetische Schicht hat ein magnetisches Moment, das in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke eine Hystereseschleife M(H) zeigt. Die Schleife der freien Schicht ist bei niedrigen Feldstärken zentriert, während die Mitte der Schleife der fixierten Schicht durch die Verwendung der Austauschvormagnetisierung bis zu Feldstärken von mehreren tausend Oersted verschoben sein. Da die magnetischen Momente der beiden Schichten bei unterschiedlichen Feldstärken „kippen", können die Momente der Schichten je nach der angelegten Feldstärke in unterschiedlichen Richtungen ausgerichtet werden. Bei der vorliegenden Ausführungsart ist es erwünscht, die magnetische Aggregierung zu begrenzen, indem man sicherstellt, dass das resultierende Moment im Nullfeld klein ist. Um dieses Ziel zu erreichen, kann man zwei Schichten mit gleich großem magnetischem Moment in entgegengesetzten Richtungen fixieren, sodass man einen Einstellbereich hat, in dem die Magnetfelder entlang der freien Achse die Momente antiparallel lassen. 1 zeigt das magnetische Moment als Funktion des entlang der Fixierungsachse angelegten äußeren Feldes für ein Paar ferromagnetischer Schichten mit gleichem magnetischem Moment und entgegengesetzten Fixierungsfeldern H_p1 8 und H_p2 9. Feldstärken zwischen diesen Werten erzeugen kein resultierendes Moment, aber außerhalb dieses Bereichs liegende Feldstärken veranlassen die fixierten Schichten zu einer parallelen Ausrichtung. Desgleichen können andere Formen der magnetischen Kopplung verwendet werden, die die relative Ausrichtung geschichteter Magnetschichten in ähnlicher weise beeinflussen.
2 zeigt eine typische Schichtstruktur 10, wie sie für die Herstellung der Magnetteilchen der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Ein Substrat mit einer Ablösungsschicht 12 dient als Unterlage zum Aufwachsen oder Aufsputtern weiterer Schichten zur Bildung einer Gesamtstruktur 10. Auf die Ablösungsschicht 12 wird durch Sputtern, Vakuumabscheidung oder einen anderen Beschichtungsprozess eine Abstandsschicht 14 aufgebracht. Die Abstandsschicht 14 kann unter Umständen erforderlich sein, um die geeigneten magnetischen Eigenschaften einzustellen oder die Verbindung einer Beschichtung mit der Struktur zu unterstützen. Dann wird auf die Abstandsschicht 14 eine erste magnetische Schicht 16 aufgebracht. Die Dicke der magnetischen Schicht 16 hängt vom gewünschten Dipolmoment und der gewünschten Fixierungsfeldstärke, von den abgeschiedenen Materialien und vom Gesamtmoment der Struktur 10 ab. Typische Schichtdicken der magnetischen Schicht 16 liegen zwischen 1 und 50 nm.
Dann wird auf die erste magnetische Schicht 16 eine erste antiferromagnetische Schicht 18 aufgebracht. Die antiferromagnetische Schicht 18 richtet das Dipolmoment der magnetischen Schicht 16 in einer vorgegebenen Richtung aus, was als Fixierung des Dipolmoments der magnetischen Schicht 16 bezeichnet wird. Typische Schichtdicken der antiferromagnetischen Schicht 18 liegen zwischen 0 und 50 nm. Typische für die Austauschvormagnetisierung verwendete Antiferromagnete sind bestimmte Eisen- und Nickeloxide und verschiedene Manganlegierungen wie beispielsweise FeMn, NiMn, IrMn, PtMn usw.
Dann kann auf die antiferromagnetische Schicht 18 eine Abstandsschicht 20 aufgebracht werden. Die Abstandsschicht 20 bewirkt eine Trennung zwischen der antiferromagnetischen Schicht 18 und weiteren Schichten aus magnetischem Material und kann für das Festlegen der magnetischen Eigenschaften nachfolgender Schichten in der Struktur 10 von Nutzen sein. Auf diese Abstandsschicht kann man möglicherweise verzichten. Wenn beispielsweise die spontane antiferromagnetische Kopplung verwendet wird, kann man die antiferromagnetische Schicht 18 weglassen und die Dicke und die Zusammensetzung der Abstandsschicht 20 so einstellen, dass sich die gewünschte antiferromagnetische Kopplung ergibt.
Dann folgt in der Struktur 10 eine mit der Abstandsschicht 20 gekoppelte zweite magnetische Schicht 22, durch die das resultierende magnetische Moment der ferromagnetischen Schichten eingestellt werden kann, aus denen die Strukturen 10 bestehen. Um das Problem der Aggregierung abzumildern, ist die Ausrichtung des Dipolmoments der zweiten magnetischen Schicht 22 der Ausrichtung des Dipolmoments der ersten magnetischen Schicht 16 üblicherweise im Wesentlichen entgegengesetzt, kann jedoch je nach der Stärke des Dipolmoments und der für die Struktur 10 gewünschten Gesamteigenschaften andere Winkel einschließlich der parallelen Lage zum Dipolmoment der ersten magnetischen Schicht 16 einnehmen.
Dann kann auf die zweite magnetische Schicht 22 eine zweite antiferromagnetische Schicht 24 aufgebracht werden. Die zweite antiferromagnetische Schicht 24 hält das Dipolmoment der magnetischen Schicht 22 in einer vorgegebenen Richtung fest, was als Fixierung des Dipolmoments der magnetischen Schicht 22 bezeichnet wird. Auf diese zweite antiferromagnetische Schicht kann man möglicherweise verzichten, wenn durch den Einfluss der Abstandsschicht 20 oder durch Entmagnetisierungsfelder eine spontane antiferromagnetische Kopplung erreicht wird.
Dann wird auf die zweite antiferromagnetische Schicht 24 eine Abstandsschicht 26 aufgebracht. Die Abstandsschicht 26 kann unter Umständen von Nutzen sein, um die ferromagnetischen und die antiferromagnetischen Schichten zu schützen, und kann die Verbindung einer Beschichtung mit der Struktur unterstützen.
Die relativen Fixierungsrichtungen der ferromagnetischen Schichten 16 und 22 können sich voneinander unterscheiden und durch mehrere Verfahren eingestellt werden. Bei einigen antiferromagnetischen Materialien zur Austauschvormagnetisierung können die ferromagnetischen Schichten während der Herstellung der Struktur 10 in entgegengesetzte Richtungen eingestellt werden, indem während des Wachsens der zweiten magnetischen Schicht 22 ein angelegtes magnetisches Vormagnetisierungsfeld umgekehrt wird. Die Schichten können auch antiparallel eingestellt werden, nachdem die Struktur aufgebracht wurde, indem man für die Schichten 18 und 24 Antiferromagnete mit unterschiedlich hohen Sperrtemperaturen verwendet. In diesem Fall wird die Fixierung jeder einzelnen ferromagnetischen Schicht durch das Feld eingestellt, das vorhanden ist, während die Probe über die Sperrtemperatur ihres Vormagnetisierungs-Antiferromagneten hinaus abgekühlt wird.
Die in 2 gezeigte Struktur 10 wird nur zur Veranschaulichung gezeigt und soll den Geltungsbereich der Erfindung nicht einschränken. Andere Strukturen, die mehr oder weniger Abstandsschichten, mehr oder weniger magnetische Schichten mit unterschiedlichen magnetischen Feldstärken, unterschiedlichen Ausrichtungen der Dipolmomente und unterschiedlichen Anzahlen der antiferromagnetischen Schichten verwenden, stellen mögliche Alternativen dar.
Zur Herstellung der Strukturen 10 dienen einfach Sputter-, Vakuumabscheidungs-, Aufwachs-, Dampfabscheidungs- und epitaxiale Aufwachsverfahren. Die Struktur 10 kann als Dünnschicht aufgebracht und dann in einzelne Teilchen aufgetrennt werden, indem eine Anzahl von Verfahren einschließlich der Verwendung von Fotolackverfahren und subtraktiven Ätzverfahren mit einer geeigneten Schichtunterlage oder einer Trennschicht 12 zum Abheben vom Substrat eingesetzt werden. Alternativ kann man mittels einer Spritzgussschablone oder einer durch Fotolack strukturierten Schablone und einem Ablösemittel ein einfaches Ablösen von einer wiederverwendbaren Schablone erreichen. Die Abscheidung auf bearbeitete Teilchen stellt eine weitere Alternative dar.
Der Wert der Fixierungsfeldstärken lässt sich leicht abschätzen. Beispielsweise beträgt der Wert von H_p (in Ta/NiFe/MnFe/Ta-Schichtstrukturen) für eine NiFe-Schicht 80 : 20 (in 1 als Schichten 16 und 22 gezeigt) mit einer Schichtdicke von 5 nm, die durch eine MnFe-Schicht 50 : 50 mit einer Schichtdicke von 10 nm (in 1 als Schichten 18 und 24 gezeigt) fixiert wird, ungefähr 300 Oe und nimmt mit abnehmender Dicke der magnetischen Schicht zu. Das heißt, man kann dasselbe Moment durch Verwendung von zwei austauschvormagnetisierten NiFe-Dünnschichten mit der Schichtdicke von 2,5 nm erzielen, jedoch steigt die Fixierungsfeldstärke für jede Schicht auf ungefähr 600 Oe an. Es ist wohlbekannt, dass die magnetischen Momente von Dünnschichten in diesem Schichtdickenbereich nichtlinear sein können, aber die Einstellungen der physischen Dicke zum Ausgleich solcher Abweichungen sind nicht schwierig. Desgleichen ist wohlbekannt, dass der Wert der Austauschkopplung von der Struktur des abgeschiedenen Materials abhängt, aber das kann empirisch ermittelt und eingestellt werden. Durch Aufbringen unterschiedlicher Anzahlen solcher Schichten (16 und 22) mit unterschiedlichen Schichtdicken können sowohl die Sättigungsmomente als auch die Sättigungsfeldstärken variiert werden, an denen es zur ferromagnetischen Sättigung kommt. Wenn man mehrere Gruppen einzelner Teilchen herstellt und jede Strukturgruppe mit einzelnen biologischen Erkennungsmolekülen koppelt, ist die vorliegende Erfindung in der Lage, anhand der Feldstärkenabhängigkeit der Beweglichkeit jeder magnetischen Teilchengruppe die unterschiedlichen Träger der biologischen Marker auszusortieren.
BERECHNUNG DER ENERGIE EINES TEILCHENS IN EINEM ANGELEGTEN FELD
Gemäß dem in 1 gezeigten idealisierten magnetischen Verhalten gibt es Teilchen, deren magnetisches Moment plötzlich aktiviert wird, wenn das ansteigende angelegte Feld die Fixierungsfeldstärke durchläuft. Die obige einfache Erörterung trifft qualitativ für den Fall zu, dass das angelegte Feld entlang der Fixierungsachse ausgerichtet ist. Wenn sich die Teilchen jedoch in der Lösung frei bewegen, können sie ihre Fixierungsachsen frei aus der angelegten Feldrichtung drehen, um die Ausrichtung mit dem niedrigsten Energieniveau einzunehmen. Diese Drehung ergibt sich aus dem Drehmoment MxH. Bei kleinen Teilchen mit dem Radius r entspricht dieses Drehmoment einer Rotationskraft F_eff = MH/r, die groß ist im Vergleich zu den Kräften, die durch normale Magnetfeldgradienten verursacht werden. Wenn H/X den Magnetfeldgradienten darstellt, wird F_eff über die gradienteninduzierten Kräfte um das Verhältnis X/r erhöht, welches für x = 1 mm und r = 1 μm den Wert 1000 hat. Ein ähnliches Argument gilt, wenn ein Teilchen anfangs senkrecht zur angelegten Magnetfeldrichtung auf die Ausdehnung der dünnen Magnetschicht ausgerichtet ist und jetzt jedoch r durch t im Nanometerbereich ersetzt wird. Dadurch wirken bei der Ausrichtung der Teilchen sehr starke Drehmomente, sodass das angelegte Feld in der Ebene der ferromagnetischen Dünnschicht liegt. Somit wird die Ausrichtung der Teilchen stark durch die Forderung nach einem Drehmoment null beeinflusst, welches sich bei einer Anordnung mit dem niedrigsten Energieniveau einstellt. Die Energie zweier magnetisch entkoppelter, magnetisch weicher und entgegengesetzt fixierter Momente M₁, M₂ in einem angelegten Feld H_a, das unter einem Winkel θ zur Fixierungsachse ausgerichtet ist, kann wie folgt angegeben werden: E = –M{Hp1 2 + Ha 2 + 2Hp1Hacosθ)1/2 + (Hp2 2 + Ha 2 – 2Hp2Hacosθ)1/2}
Die richtige Lösung der Quadratwurzel findet man für H_a < H_P1,2, wobei H_p1,2 die Fixierungsfelder sind. Wenn H_p1 = H_p2 ist, bestimmt man dE/dθ für sin(θ) bzw. cos(θ) = 0. Bei sin(θ) = 0 richten sich die Teilchen mit ihren Fixierungsachsen entlang des angelegten Feldes aus, und die Energiezunahme für ein Moment gleicht genau die Abnahme für das andere Moment aus. Die Gesamtenergie hängt an diesem Punkt des maximalen Energiezustands nicht von der angelegten Feldstärke ab. Wenn cos(θ) = 0 ist, steht die Fixierungsachse senkrecht zum angelegten Feld. In diesem Fall drehen sich die beiden Momente beim Anlegen des Feldes so, dass eine Komponente entlang dem angelegten Feld von H_a/(H_a ² + H_p)^1/2 ausgerichtet ist. Die resultierende Magnetisierung nimmt anfangs linear zu, verläuft gleichmäßig von 0 bis 2 M und wird bei Feldstärken H_a > H_p allmählich gesättigt. Der plötzliche Übergang von der antiparallelen zur parallelen Ausrichtung bei H_p geht ganz offensichtlich verloren. Das Teilchen selbst kann dieselbe Drehrichtung beibehalten, wobei die Fixierungsachse während der Erhöhung der Feldstärke senkrecht zum Feld steht, da das resultierende Moment kein Drehmoment erzeugt. 3 zeigt die Magnetisierungskurve für den Fall der rechtwinkligen Ausrichtung der Felder des Teilchens der vorliegenden Ausführungsart.
Bei einem allgemeineren Fall mit H_p1 > H_p2 lässt sich einfach zeigen, dass sich bei Erhöhung der Feldstärke zunächst im rechten Winkel zur Fixierungsrichtung ein resultierendes Moment zeigt; da jedoch M₁ auf die Drehung kaum anspricht, richtet sich das Teilchen durch Drehung allmählich auf einen Winkel aus, bei dem das Moment zwischen der Fixierungsachse und ihrer Senkrechten liegt. Für diesen Fall lässt sich einfach zeigen, dass: cos(θ) = (H_a/2)(1/H_p2 – 1/H_p1) für H_a < H_p1, H_p2. Für den Extremfall H_p1 >> H_p2 zeigt dieser Ausdruck, dass sich das Teilchen aus der bei geringen Feldstärken bevorzugten rechtwinkligen Ausrichtung herausdreht, um das resultierende Moment bei hohen angelegten Feldstärken auf die Fixierungsachse auszurichten. Dadurch wird das magnetische Sättigungsmoment mit zunehmender Feldstärke schneller erreicht als im Falle H_p1 = H_p2. Das obige Modell erhebt nicht den Anspruch einer vollkommen quantitativen Beschreibung, da es Koerzitivkräfte, Anisotropien, Entmagnetisierungsfelder usw. vernachlässigt.
Bei Anwendung anderer Formen der antiferromagnetischen Kopplung ist ein qualitativ ähnliches Verhalten zu erwarten. Hierzu gehören die antiferromagnetische oder biquadratische Kopplung durch unmagnetische Abstandsschichten oder die antiferromagnetische magnetostatische Kopplung in Verbindung mit „magnetischen Ladungen" an strukturierten Oberflächen.
EINSCHRÄNKUNGEN BEI DER TEILCHENHERSTELLUNG
Die Dicke und der Schichtbildungsprozess von magnetischen Schichten unterliegt einigen Beschränkungen, da die durch die Teilchen selbst erzeugten magnetischen Felder sowohl das Magnetisierungsverhalten als auch die Teilchenaggregierung beeinflussen. Diese Felder entstehen durch äquivalente magnetische „Oberflächenladungen" an Kanten, wo die Magnetisierung senkrecht zur Oberfläche steht. Entmagnetisierungsfelder aus einer Schicht wirken auf die Schicht selbst ein und rufen Anisotropien hervor; sie wirken jedoch auch zwischen benachbarten Schichten und richten die Schichten antiparallel aus. Diese Entmagnetisierungsfelder liefern auch eine grobe Abschätzung für die Felder, wenn sich zwei Teilchen antiparallel in Form einer Kette oder nebeneinander zusammenlagern.
Im speziellen Fall einer antiferromagnetischen Austauschvormagnetisierung können diese Felder so schwach gehalten werden, dass sie im Vergleich zu den Fixierungsfeldern und den zur Steuerung der Teilchen angelegten Felder vernachlässigt werden können. Das Entmagnetisierungsfeld kann aus den an den Enden einer Schicht induzierten „magnetischen Oberflächenladungen" abgeschätzt werden. Für die Länge 1, die Breite w und die Dicke t ist die lineare Ladungsdichte über die Breite gleich Mlt. Die Feldstärke in der Mitte beträgt dann ungefähr Mwt/l². Eine bessere Abschätzung für eine ferromagnetischen NiFe-Schicht mit t < w < l und einer entlang w ausgerichteten Magnetisierung erhält man aus: Hd = π2M × (t/l) = 10 × t(nm)/l(μm) Oe.
Das Verhältnis t/l von Dicke zu Länge kann man in Grenzen halten, damit H_d einige zehn Oersted nicht übersteigt und ferner kleiner als H_p gehalten werden kann. Zur Änderung der Anisotropie und der Stärke und räumlichen Struktur der Entmagnetisierungsfelder können auch andere Formen wie beispielsweise Platten verwendet werden.
Wichtig ist die Erkenntnis, dass Teilchen, die ferromagnetische Schichtsysteme mit antiparallelen Momenten enthalten, äußere Magnetfelder erzeugen. Bei paralleler Ausrichtung des Moments ergibt sich ein resultierendes Moment von 2Mwtl, das als Dipolquelle wirkt, aus der sich äußere Felder leicht abschätzen lassen. Bei der antiparallelen Ausrichtung sind die äußeren Felder wesentlich schwächer, da es hier kein resultierendes Moment gibt. In diesem Zustand haben die „magnetischen Ladungen" an einem bestimmten Ende von zwei antiparallelen Schichten entgegengesetzte Vorzeichen. Bei antiparallelen Schichten im Abstand s liegen deshalb an jedem Ende des Teilchens entgegengesetzt gerichtete Dipole vor. Diese Dipole haben Momente von ungefähr Mwts = 10 bis 15 wts (mit w in μm und t und s in nm), deren Stärke im Vergleich zur parallelen Ausrichtung um den großen Wert l/s = 10³ verringert ist. In größerer Entfernung nehmen äußere Felder ferner Quadrupolcharakter an, da die Enddipole gegenseitig ausgerichtet sind.
Auch die Möglichkeiten einer spontanen Aggregierung von Teilchen müssen betrachtet werden. Ein Kriterium hierfür stellt das Verhältnis zwischen der Energie der Anziehungswechselwirkung und der thermischen Energie kT dar. Bei einer einzelnen magnetischen Schicht mit den Abmessungen 5 μm × 5 μm × 5 nm und einer Magnetisierung von 1000 emu erhält man für MH = kt eine Feldstärke von H = 4 × 10^–4 Oe. Unter der Voraussetzung, dass die geschätzten Entmagnetisierungsfeldstärken einige zehn Oersted nicht übersteigen, ist für diejenigen Teilchen eine Aggregierung zu erwarten, deren ferromagnetische Schichten durch ein Magnetfeld ausgerichtet werden. Bei der antiparallelen Ausrichtung werden die äußeren Felder um drei Größenordnungen verringert, und die thermischen Energien unterscheiden sich nur unwesentlich von den Wechselwirkungsenergien zwischen den Teilchen. Bei der antiparallelen Ausrichtung können die äußeren Felder weiter verringert werden, indem die Dipole durch Übereinanderstapeln mehrerer magnetischer Schichten in Quadrupole überführt werden. Es zeigt sich jedoch, dass die Aggregierung im entmagnetisierten Zustand kein Problem darstellt, da Teilchen, die sich durch Schwerkrafteinfluss zu dichten Ansammlungen abgesetzt haben, durch einfach leichtes Rühren bei niedrigen Feldstärken wieder zu isolierten Teilchen suspendiert werden können.
Aggregierungsprobleme sind bei der parallelen Ausrichtung von Bedeutung, da die Teilchen schließlich magnetisch zusammenklumpen und möglicherweise bestimmte Spezies binden, die man trennen möchte. Es werde angenommen, dass alle Phasen der Ankopplung von Teilchenerkennungsmolekülen und der Komplexbildung mit Zielobjekten durchgeführt und nichtaggregierte Komplexe in eine Trennvorrichtung gebracht werden und anschließend das Magnetfeld eingeschaltet wird. Um die Zeitspanne abzuschätzen, die vergeht, bis die Teilchen durch die magnetischen Kräfte zwischen den Teilchen angenähert werden, soll die durch die Stokes'sche Gleichung für eine wässrige Lösung mit magnetischen Dipolkräften zwischen zwei Teilchen mit dem magnetischen Moment M gegebene Lösungsgeschwindigkeit betrachtet werden. Als groben Näherungswert erhält man: 6πηa dR/dt = M2/R4,wobei a den Teilchendurchmesser und R den Trennungsgrad bedeuten. Durch Integration kann man eine Zeitspanne bis zum Kontakt zu t = πηa R₀ ⁵/M² abschätzen, wobei R₀ den anfänglichen Trennungsgrad bedeutet. Bei einer NiFe-Schicht mit den Maßen 5 μm × 5 μm × 5 nm beträgt die Magnetisierung bei Sättigung ungefähr 10^–10 (emu). Bei t = 10⁴ s fällt R₀ in den Mikrometerbereich, sodass für ein R₀ von 100 μm die Aggregierung auf Stunden hinaus kein Problem darstellen dürfte. Dies entspricht suspendierten Teilchen mit brauchbaren Dichten von ungefähr 10⁶/cm³. Um statistischen Schwankungen Rechnung zu tragen, können reale Dichten weiter verringert werden. Diese Behandlung geht davon aus, dass die Teilchen über Anziehungskräfte nach einer einfachen R^–4-Beziehung wechselwirken.
Bei magnetischen Dipolen sind die wirkenden Kräfte in Wirklichkeit wesentlich komplexer, da sie auf einige relative Ausrichtungen und Positionen der Dipole anziehend und auf andere abstoßend wirken. Es ist wohlbekannt, dass Dipole sich zu Ketten zusammenlagern können, in denen Teilchen mit parallelen Dipolen entlang ihrer gemeinsamen Dipolachse über Anziehungskräfte zwischen ihren jeweiligen Nord- und Südpolen miteinander verknüpft sind. Wenn jedoch in einer Kopf-Schwanz- Kette angeordnete parallele Teilchen vor der Zusammenlagerung durch Drehung des äußeren Feldes um 90 Grad gedreht werden, wirken die Kräfte abstoßend, wenn gleiche Pole nahe kommen. Somit eignen sich Drehungen und/oder kurzzeitige Richtungsänderungen des Magnetfeldes zur Begrenzung von Anlagerungserscheinungen.
HERSTELLUNG VON TEILCHEN ZU BEWERTUNGSZWECKEN
Durch Ionenstrahlsputtern als Abscheidungsquelle wurden Teststrukturen hergestellt. Zuerst wurden Si-Wafer gereinigt und mit einer 5 nm dicken Tantal-Schicht Ta beschichtet, damit darauf eine organische Trennschicht haften kann. Diese Schicht wurde durch Aufschleudern einer 1,4 μm dicken Schicht von vorgehärtetem Polyimid in Anisol aufgebracht und anschließend 30 Minuten bei 110°C getempert. Dann erfolgte die Metallisierung, um verschiedene Beispiele von magnetischen Strukturen herzustellen. Ein Beispiel mit der Bezeichnung S1 hatte die folgende Struktur:
Substrat/5Ta/tPy/9FeMn/3Ta/5Py/9FeMn/3Ta/5Py/9FeMn/*revH*/ 3Ta/5Py/9FeMn/3Ta/5Py/9FeMn/3Ta/5Py/9FeMn/5Ta
Hier wird zunächst die Materialdicke in Nanometern und dann die Elementzusammensetzung abgegeben. Polymer bezieht sich auf Permalloy der ungefähren Zusammensetzung von Ni : Fe wie 80 : 20, welches das ferromagnetische Material ausmacht. FeMn hatte eine Zusammensetzung von ungefähr 50 : 50 und diente als Antiferromagnet zum Fixieren. Ta-Abstandsschichten dienten zur Trennung der magnetischen Materialien, zur Erzeugung der für die Austauschvormagnetisierung vorteilhaften kristallinen Textur und als Schutzschicht. Die Bezeichnung *revH* bezieht sich darauf, dass zum Festlegen der Fixierungsrichtung während des Wachstums ein Magnetfeld von einigen zehn Oersted angelegt wurde, dessen Richtung nach Aufbringen der ersten Reihe von magnetischen Schichten umgekehrt wurde. Die Magnetisierungsschleifen dieser Probe wurden durch Schwingungsproben-Magnetometrie aufgezeichnet, bei der in 4(a) und 4(b) das Feld parallel bzw. senkrecht zur Fixierungsachse gezeigt wird. Eine zweite mit S3 bezeichnete Struktur wurde wie folgt erzeugt:
Substrat/3Ta/20Cu/5Ta/15Py/9FeMn/*revH*/3Ta/15Py/9FeMn/3Ta/20C u/5Ta. Die Gesamtdicke des Py ist bei S3 und S1 gleich, aber die zu erwartende FeMn-Austauschkopplung ist bei S3 schwächer, da die Py-Einzelschichten hier dicker sind. Die Cu-Schichten in S3 dienten dazu, dieselbe Dicke wie bei S1 beizubehalten sowie eine andere Farbe zu erzeugen. 4(c) und 4(c) zeigen das entsprechende magnetische verhalten von S3. Man erkennt deutlich, dass man unterschiedliche Fixierungsfeldstärken, 41 bis 44, und Sättigungsfeldstärken, 45 und 46 sowie geringe Magnetisierungen im Nullfeld erreichen kann. Bei den Werten der vorhergesagten Fixierungsfeldstärken und der magnetischen Momente erkennt man geringfügige Abweichungen, die sich jedoch durch empirische Änderung der Schichtdicken leicht korrigieren lassen.
Auf die Wafer wurde dann eine 1,3 μm dicke chemisch verstärkte Polyimid-Fotolackschicht aufgeschleudert und anschließend 5 Minuten bei 95°C getempert. Anschließend wurden die Wafer mit einer 1 cm² großen Schachbrettmaske mit 5 μm großen Öffnungen in Kontakt gebracht und etwa 1 Sekunde im UV-Licht mit einer Dosis von 50 mJ belichtet. Nach der Belichtung wurde 2 Minuten lang bei 95°C getempert und das Muster durch 30 Sekunden langes Eintauchen in einen alkalischen Entwickler entwickelt.
Das Fotolackmuster wurde in ein Metallmuster umgewandelt, indem die Metallschicht in den nicht durch den entwickelten Fotolack bedeckten Bereichen durch Ionenbeschuss abgetragen wurde. Die darunter liegende Trennschicht wurde unter Rühren in warmem n-Methylpyrrolidinon gelöst und das blanke Substrat der Lösung entnommen. Das die Teilchen enthaltende Lösungsmittel wurde in Teströhrchen überführt und dort die Magnetteilchen mit einem kleinen Magneten von 500 Oe Feldstärke gesammelt, sodass das organische Lösungsmittel abgetrennt und gegen Wasser ausgetauscht werden konnte. Zum Schluss wurden die einzelnen Teilchen mit einer geschätzten Dichte von 4 × 10⁶/cm³ in verschiedene Röhrchen gebracht, die jeweils 1 cm³ Wasser enthielten.
TRENNUNG VON TEILCHEN IN DER LÖSUNG
Ausgehend von der Kenntnis der magnetischen Eigenschaften der in der vorliegenden Beschreibung offengelegten gewünschten Struktur kann man nun den für solche Teilchen einzigartigen Mechanismus der physikalischen Trennung erörtern. Bei der vorliegenden Erörterung wird davon ausgegangen, dass das Magnetfeld aus zwei verschiedenen horizontalen Komponenten besteht, die in 5(a) dargestellt werden. Das erste Feld ist ein räumlich relativ homogenes Feld Hh 51, das zeitlich gepulst werden kann. Das zweite Feld Hg 52 hat einen relativen starken Gradienten, aber im interessierenden Bereich einen kleinen Wert und kann auch zeitlich gepulst werden. Zur Veranschaulichung ist zu beachten, dass die Teilchen in der Lösung beim Fehlen von Magnetfeldern unter dem Einfluss der Schwerkraft senkrecht nach unten sinken. Das homogene Feld Hh dient zum Induzieren eines magnetischen Moments in den suspendierten Teilchen, während durch das Gradientenfeld Hg eine Bewegung der magnetisierten Teilchen ausgelöst wird. Wenn das Gradientenfeld bei konstantem Feld Hh symmetrisch wechselseitig in entgegengesetzte Richtungen gepulst wird, ändert sich auch die seitliche Bewegungsrichtung der magnetischen Teilchen, sodass durch die Magnetfelder keine resultierende seitliche Verschiebung bewirkt wird. Wenn jedoch das Feld Hh synchron zur Änderung von Hg, 55 und 56, in
5(b) zwischen unterschiedlichen Werten, 53 und 54, schwankt, resultiert daraus eine seitliche Verschiebung, wenn das magnetische Moment vom Wert der Feldstärke Hh abhängt. Wenn also Hh oberhalb der Sättigungsfeldstärke einer Teilchenart bleibt, kommt es für diese Teilchenart nicht zu einer resultierenden seitlichen Verschiebung. Wenn Hh weit genug unterhalb der Sättigungsfeldstärke einer zweiten Teilchenart bleibt, dessen Moment daher ungefähr linear zu Hh ist, kommt es zur seitlichen Verschiebung.
Wenn die Struktur der Impulse asymmetrisch gestaltet wird, kann man leicht alternative Trennschemata erhalten. Man kann annehmen, dass Hh wie in 5(c) dargestellt zwischen H1 und 2H1 hin- und hergeschaltet wird, während Hg synchron dazu zwischen H2 und –H2/2 hin- und hergeschaltet wird. Dann erfahren Teilchen mit einem zu Hh linearen Moment im Gegensatz zu Teilchen, die gesättigt bleiben, keine seitlichen Verschiebungen. Die letzteren Teilchen bewegen sich tatsächlich während des umgekehrten Feldzyklus nur halb so schnell in seitlicher Richtung und damit nur halb so weit in horizontaler Richtung, sodass deutliche horizontale Verschiebungen erreicht werden können. Es ist klar, dass ähnliche Veränderungen möglich sind, wenn die Impulsbreiten für unterschiedliche Vorzeichen von Hg oder Vorzeichenänderungen von Hh zugelassen werden. Ferner ist klar, dass diese Trennschemata keine genaue Linearität oder keine vollständige Sättigung erfordern, da die realen magnetischen Eigenschaften durch Einstellung verschiedener Parameter ausgeglichen werden können. Und schließlich können die Feldrichtungen einfach bezüglich der Schwerkraft ausgerichtet oder andere Kräfte in diese Trennschemata einbezogen werden, um Systeme zu erhalten, in denen beispielsweise manche Spezies sich absetzen können, während andere in der Schwebe gehalten werden.
6 veranschaulicht eine mögliche Ausführungsart zur Trennung der Magnetteilchen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung räumlich getrennter statischer Felder.
Durch den Einlass 66 kann eine bestimmte Lösung, möglicherweise Humanblut mit Magnetperlenkomplexen, in einen Bereich 68 eintreten, auf den Magnetfelder einwirken. Lediglich zur Veranschaulichung ist das Magnetfeld in eine homogene und eine Gradientenkomponente Hh und Hg aufgeteilt und im Bereich 68 ein einzelnes Teilchen 80 zu Anfang der Trennung gezeigt.
Das magnetische Moment eines bestimmten Magnetteilchens 80 bewirkt in einem Dispersionsbereich 84 eine Geschwindigkeit des Magnetteilchens 80 in der Richtung 82. In ähnlicher Weise wird das Teilchen 80 im Bereich der Neufokussierung 86 in die Richtung 86 abgelenkt. Teilchen mit unterschiedlichen Momenten können um unterschiedliche Strecken von den vertikalen Bahnen seitlich abgelenkt werden, die mit dem durch die Schwerkraft bedingten Absetzen nach dem Einlass 66 zusammenhängen.
Während sich das Teilchen 80 durch den Dispersionsbereich 84 bewegt, unterliegt es dem Einfluss eines horizontalen Feldes Hh1 und eines Gradientenfeldes Hg1. Der Dispersionsbereich 84 lenkt das Teilchen 80 proportional zur Stärke des magnetischen Moments des Teilchens 80 und der angelegten magnetischen Feldstärke Hg in Richtung 82 ab. Die vertikal wirkende Kraft bleibt konstant und die Bahn 90 des Teilchens 80 kann eine Krümmung 92 aufweisen, die auf die Ungleichmäßigkeiten des gesamten Magnetfeldes zurückzuführen ist. Wenn Unterschiede der Zellengröße, der Dichte, der Viskositätswiderstandskräfte und der Anzahl der gebundenen Teilchen 80 vorliegen, laufen die Bahnen 90 unterschiedlicher Teilchen 80 auseinander.
Im Bereich der Neufokussierung 86 werden das Magnetfeld Hh2 oder das Gradientenfeld Hg2 umgekehrt. Die Bahn 90 kann für das Teilchen 80 neufokussiert werden, zum Beispiel wenn Hh1 = Hh2 und Hg1 = –Hg2 ist, da Diffusionswechselwirkungen und Wechselwirkungen zwischen den Teilchen vernachlässigt werden können. Dieser Bereich der Neufokussierung funktioniert nicht richtig, wenn sich die homogenen Magnetfelder im Dispersions- und im Fokussierungsbereich voneinander unterscheiden und die Perlen für eine nichtlineare Abhängigkeit von M in Hh ausgelegt sind.
Wenn beispielsweise Hh2 = 2Hh1 und Hg2 = –1/2Hg1 ist, kommt es zur Neufokussierung, wenn das magnetische Moment des Teilchens 80 unterhalb des wertes 2Hh1 linear zur Feldstärke H ist. Wenn dies der Fall ist, gelangt das Teilchen 80 zum Auslass 94, da es durch das Feld um denselben Betrag in die Richtung 88 verschoben wurde, wie es zuvor in die Richtung 82 verschoben worden war.
Wenn M bei Hh1 ungefähr gesättigt ist, ist die Neufokussierungsablenkung in die Richtung 88 nur halb so groß wie die Dispersionsablenkung in die Richtung 82. Somit können die gesättigten Teilchen 80, die nun „fokussierte Zellen" sind, als diejenigen Zellen am Auslass 96 gesammelt werden, die bei Feldstärken kleiner als 2Hh1 gesättigt sind. Die am Auslass 94 ankommenden und bei Feldstärken kleiner als 2Hh1 nicht gesättigten Teilchen können zur Sättigung bei höheren Feldstärken weiter getestet werden, indem der Auslass 94 als Einlass für eine weitere Kombination von unterschiedlichen Feldstärken dient, die der oben beschriebenen ähnlich ist. Natürlich sind auch alternative Schemata möglich. Zum Beispiel kann man die Einstellungen Hh2 = Hh1/2 und Hg2 = –Hg1 wählen, um am Auslass 94 Teilchen zu sammeln, die bei Feldstärken größer als Hh1/2 gesättigt sind.
Ohne Weiteres lassen sich Schemata zur Trennung bestimmter Markerarten vorschlagen, indem verschiedene Sortiervorrichtungen wie logische Bauelemente in Reihe geschaltet werden, um einzelne Perlenarten oder Kombinationen von Perlenarten zu gewinnen oder zu verwerfen. Zum Beispiel ist ein Fall denkbar, bei dem die Anwesenheit der Marker M1 und M2 gewünscht wird, während M3 ausgesondert werden soll. Angenommen, es handelt sich um Perlen, deren Sättigung bei 50, 150 und 450 Oe eintritt. Zuerst können selbstverständlich die unmagnetischen Spezies ausgesondert werden. Um die den Marker M3 enthaltenden Komplexe auszusondern, kann man für die mit M3 markierten Perlen die Sättigung bei 450 Oe ansetzen und durch Wahl der Bedingungen Hh1 = 900, Hh2 = 450 und Hg2 = –Hg1 alle den Marker M3 enthaltenden Komplexe aussondern und alle die Marker M1 und/oder M2 enthaltenden Komplexe zum Auslass 94 neufokussieren. Wenn die Sättigung des Marker M2 bei 150 Oe liegt, wählt man zur Isolierung von M2 die Bedingungen Hh1 = 50, Hh2 = 100 und Hg2 = Hg1/1. Jetzt werden nur die den Marker M2 enthaltenden Komplexe am Auslass 94 der zweiten Sortiervorrichtung neufokussiert und können separiert werden. Perlen, die nur den Marker M1 oder die beiden Marker M1 und M2 enthalten, können am Auslass 96 gesammelt und durch Wahl der Bedingungen Hh1 = 25, Hh2 = 50 und Hg2 = Hg1/2 weiter getrennt werden. Die neufokussierten Perlen am Auslass 94 dieser Stufe enthalten nur den Marker M1, sodass die gewünschte Fraktion mit den Markern M1 und M2 am Auslass 96 dieser Stufe ankommt. Der hier eingesetzte Neufokussierungsschritt zur positiven oder negativen Auswahl wird ausdrücklich erwähnt, da die an den Auslässen 94 ankommenden Fraktionen unabhängig von den Schwankungen des Wertes der Viskositätswiderstandskoeffizienten planmäßig zu ihren ursprünglichen seitlichen Positionen zurückkehren sollen.
Diese gezielte Trennung kann mit den gegenwärtig verwendeten superparamagnetischen Perlen nicht bei normalen Magnetfeldstärken erreicht werden, da diese sehr hohe Sättigungsfeldstärken aufweisen. Aus kleinen, statistisch ausgerichteten oder entmagnetisierten ferromagnetischen Teilchen bestehende Aggregate könnten auf ähnliche oder auf andere Probleme stoßen, wenn man die Teilchenform, die Sättigungsfeldstärken, die Koerzitivkräfte oder die irreversible Magnetisierung nicht beherrscht.
BEOBACHTUNGEN VON TESTTEILCHEN IN ANGELEGTEN MAGNETFELDERN
Die Teilchen konnten im remittierten Licht durch das unbewaffnete Auge leicht erkannt, aber nicht aufgelöst werden. Im Verlauf von mehreren zehn Minuten kam es zu deutlichen Absetzerscheinungen, jedoch wurden die Teilchen durch Schütteln leicht wieder suspendiert. Die Bewegung der Teilchen im Feld eines Alnico-Magneten mit einem Durchmesser von einem Zoll (25,4 mm) und einer Dicke von ½ Zoll (12,7 mm), der die Außenwand des Röhrchens berührte, konnte leicht beobachtet werden, wobei die Geschwindigkeit in der Größenordnung von 1 cm/s lag. Es wurde eine merkliche Zunahme der Reflexion der dispergierten Teilchen festgestellt. Wenn man ein schwaches Magnetfeld mit der Feldstärke von 1 Oe in einer Richtung anlegte, in der das Feld eine Ausrichtung der Teilchen auf das Magnetfeld in der Ebene der aufgebrachten Schichten bewirkte, wurde in Abhängigkeit von der Stellung der Lichtquelle und des Beobachters eine Erhöhung der Remission beobachtet. Sehr geringe Feldstärken reichen wie oben erwähnt aus, die Teilchen so auszurichten, dass das angelegte Feld in der Ebene der magnetischen Schichten liegt. Zur Beobachtung der Teilchen wurden optische Mikroskope in Reflexion und Transmission eingesetzt. Einige Beobachtungen wurden in angelegten Magnetfeldern in einer Vorrichtung durchgeführt, bei der zwei durch Impulsstromquellen gespeiste wassergekühlte Elektromagnete verwendet wurden, wie in 5(a) dargestellt ist. Der erste Elektromagnet hat zwei Spulen mit einem Durchmesser von 6 Zoll (152,4 mm) in einem Abstand von 4 Zoll (101,6 mm), die so geschaltet waren, dass sie ein relativ homogenes Feld von etwa 50 Oe/A lieferten. Der zweite Elektromagnet bestand aus 2 Spulen mit einem Durchmesser von 2 Zoll (50,8 mm) in einem Abstand von 2 Zoll (50,8 mm), die antiparallel geschaltet waren, um in der Mitte ein Feld mit der resultierenden Feldstärke null und einem Feldstärkegradienten von etwa 40 Oe/cm·A zu erhalten. Durch qualitative optische Beobachtungen konnte bestätigt werden, dass die Teilchengeschwindigkeiten die erwarteten charakteristischen Sättigungseigenschaften in Abhängigkeit vom homogenen Feld und die erwarteten linearen Schwankungen der Amplitude des Gradientenfeldes zeigten. Es wurden verschiedene Impulsszenarien untersucht, um die Umkehr der Teilchenbewegung infolge der Umkehr des Feldgradienten oder der Umkehr des homogenen Feldes zu bestätigen. Durch diese Beobachtungen wurde qualitativ bestätigt, dass sich die Teilchen wie erwartet verhielten.
Auch die Bildung von kettenähnlichen Aggregaten konnte beobachtet werden, wenn die abgesetzten Perlen ein- oder zweimal manuell aufgeschüttelt und dann mehrere zehn Minuten lang bei den oben angegebenen hohen Konzentrationen starken Feldern ausgesetzt wurden. Bei diesen Ketten konnten die für die Umkehr des homogenen Feldes erwartete Drehung der Ketten und die erwarteten Schwankungen des Vorzeichens der zwischen den Ketten wirkenden Kräfte in Abhängigkeit von der relativen Lage und Ausrichtung der näher liegenden Ketten leicht sichtbar gemacht werden. Außerdem ließen sich aus den Wechselwirkungen der Perlen und Ketten mit den Behälterwänden einige einfache Verfahren zur vorteilhaften Nutzung von Wandeffekten während der Trennungen ableiten. Zum Beispiel konnten das Magnetfeld und der Feldgradient leicht so eingestellt werden, dass die Bahnen bestimmter Perlenarten, die in einen gefüllten Behälter oben eingegeben wurden, gegen die Wände stießen, wenn der Behälter bewusst schräg gegen die durch die Schwerkraft verursachten vertikalen Bahnen gekippt wurde. Während die an die Wand stoßenden Spezies beim Kontakt mit der Wand drastisch gebremst oder aufgehalten wurden, konnten sich andere Perlen parallel zur gekippten Wand gleichmäßig nach unten weiterbewegen. Beim Impulsbetrieb, bei dem die seitliche Bewegung periodisch umgekehrt wurde, führte dies dazu, dass sich die mit der Wand zusammenstoßenden Perlen während der Umkehrbewegung des Impulszyklus frei bewegen konnten, sodass sie in ihrer Abwärtsbewegung systematisch gebremst wurden. Ebenso wurde gefunden, dass Felddrehungen wirksam zu einer Bewegungsart Anlass geben, die man als „Wandern" bezeichnen könnte. Dabei richtet sich eine Perle, die sich in Kontakt mit der Oberfläche und in einer ebenen Ausrichtung auf ein Feld parallel zur Wand befindet, auf, wenn das Feld um 90 Grad gedreht wird, und kehrt wieder zur ebenen Ausrichtung zurück, wenn das Feld auf 180 Grad gedreht wird. Die Perlenmitte wanderte während des Prozesses um einen halben Perlendurchmesser, da das in Kontakt mit der Oberfläche befindliche Perlenende stationär blieb. Bei den Beobachtungen der Wandeffekte wurde zwar eine gewisse Schwankungsbreite der Wandwechselwirkungen zwischen den Teilchen und/oder Wandbereichen festgestellt, jedoch wurden keine Anstrengungen unternommen, die vorliegenden Behälterwände zu behandeln oder zu reinigen.
7 veranschaulicht die Verfahrensschritte bei der Durchführung einer Ausführungsart der vorliegenden Erfindung.
Block 70 stellt den Schritt zur Herstellung einer Vielzahl erster Magnetperlen dar, wobei die ersten Magnetperlen mindestens zwei magnetische Schichten und mindestens eine unmagnetische Schicht aufweisen.
Block 72 stellt den Schritt der Ankopplung eines ersten Akzeptormoleküls an die ersten Magnetperlen dar.
Block 74 stellt den Schritt des Einbringens der ersten Magnetperlen in eine Lösung dar.
Block 76 stellt den Schritt des Anlegens eines äußeren Magnetfeldes an die Lösung dar, wodurch die ersten Magnetperlen zu einer Quelle des Magnetfeldes hingezogen werden.
ANKOPPLUNG UND VERWENDUNG AN MAGNETTEILCHEN GEBUNDENER AFFINITÄTSERKENNUNGSMOLEKÖLE
In den folgenden Abschnitten wird die Verwendung der oben beschriebenen Magnetteilchen als Kerne für Affinitätsmoleküle beschrieben, die an die Magnetteilchen der vorliegenden Erfindung gebunden sind. Magnetteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung werden wie oben erklärt an mindestens ein Affinitätserkennungsmolekül gekoppelt. Der hier verwendete Begriff „Affinitätserkennungsmolekül" bezieht sich auf ein Molekül, das ein anderes Molekül erkennt und durch spezifische dreidimensionale Wechselwirkungen bindet, welche sich durch eine Bindungsaffinität und einen spezifischen Bindungscharakter auszeichnen, wie sie der Bindung eines Antikörpers an sein entsprechendes Antigen oder eines Enzyms an sein Substrat vergleichbar sind. Üblicherweise ist die Bindung nichtkovalent, jedoch kann die Bindung auch kovalent sein oder im Verlauf der Wechselwirkung kovalent werden. Die nichtkovalente Bindung entsteht üblicherweise durch hydrophobe Wechselwirkungen, durch Wasserstoffbindungen oder durch ionische Bindungen. Die Kombination aus dem Affinitätserkennungsmolekül und dem mit ihm zu verbindenden Molekül wird mit dem Sammelbegriff „spezifisches Bindungspaar" bezeichnet. Jeder Partner des spezifischen Bindungspaars kann als Affinitätserkennungsmolekül bezeichnet werden; die Bezeichnung erfolgt aus praktischen Gründen je nach der bezweckten Wechselwirkung. Ein oder beide Partner des spezifischen Bindungspaars kann Teil einer größeren Struktur wie beispielsweise eines Virions, einer intakten Zelle, einer Zellmembran oder einer Zellorganelle wie eines Mitochondriums oder eines Chloroplasten sein.
Beispiele von Affinitätserkennungsmolekülen in der Biologie sind Antikörper, Enzyme, spezifische Bindungsproteine, Nukleinsäuremoleküle und Rezeptoren. Beispiele für Rezeptoren sind Viralrezeptoren und Hormonrezeptoren. Beispiele für spezifische Bindungspaare sind Antikörper-Antigen, Antikörperhapten, Nukleinsäuremolekül-komplementäres Nukleinsäuremolekül, Rezeptor-Hormon, Lectin-Kohlenhydrat-Komplex, Enzymsubstrat, Enzym-Inhibitor, Biotin-Avidin und Viruszellenrezeptor. Eine besonders wichtige Antigenklasse sind die Differenzierungscluster-Antigene (Cluster of Differentiation, CD), die in Zellen hämatopoetischen Ursprungs, insbesondere in Leukozyten, sowie in anderen Zellen gefunden wurden. Diese Antigene spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivität und der Regelung des Immunsystems. Ein besonders wichtiges CD-Antigen ist das in Stammzellen gefundene CD34. Diese Zellen sind Universalzellen, aus denen alle Zellen hämatopoetischen Ursprungs einschließlich Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten gebildet werden können.
Der hier verwendete Begriff „Antikörper" umfasst sowohl intakte Antikörpermoleküle mit der jeweiligen spezifischen Wirkung als auch Antikörperfragmente (einschließlich Fab-, F(ab')-, Fv- und F(ab')2-Fragmenten) sowie chemisch modifizierte intakte Antikörpermoleküle und Antikörperfragmente wie Fv-Fragmente einschließlich Hybridantikörpern, die durch Verbindung von Untereinheiten in vitro zusammengesetzt wurden. Der Begriff umfasst sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper. Außerdem gehören dazu auch genetisch veränderte Antikörpermoleküle wie beispielsweise Einzelketten-Antikörpermoleküle, die allgemein als sFv bezeichnet werden. Der Begriff „Antikörper" beinhaltet auch modifizierte Antikörper oder an Markierer oder andere Moleküle gekoppelte Antikörper, die die Bindungsfähigkeit des Antikörpers nicht blockieren.
Die hier verwendeten Begriffe „Nukleinsäuremolekül", „Nukleinsäureabschnitt" oder „Nukleinsäuresequenz" beinhalten, wenn nicht anders angegeben, sowohl DNA als auch RNA und, wenn nicht anders angegeben, sowohl Doppelstrang- als auch Einzelstrangnukleinsäuren. Ferner gehören dazu auch Hybride wie DNA-RNA-Hybride. Insbesondere ist unter DNA auch RNA zu verstehen, die entweder die äquivalente Basensequenz aufweist, ausgenommen die Substitution von Uracil und RNA gegen Thymin in DNA, oder eine komplementäre Basensequenz aufweist, ausgenommen die Substitution von Uracil gegen Thymin, wobei die Komplementarität durch die Basenpaarregeln von Watson-Crick bestimmt wird. Unter der Bezeichnung Nukleinsäuresequenzen können auch modifizierte Basen oder Molekülketten verstanden werden, solange die Modifizierungen nicht wesentlich gegen die Bindung eines Liganden wie eines Proteins durch die Nukleinsäure oder gegen die Basenpaarregel von Watson-Crick verstoßen.
Verfahren zur kovalenten Kopplung biologischer Erkennungsmoleküle an die Oberflächen von festen Phasen einschließlich der Magnetteilchen der vorliegenden Erfindung sind in der Technik wohlbekannt und können je nach den in dem biologischen Erkennungsmolekül und der Oberfläche der festen Phase vorhandenen funktionellen Gruppen ausgewählt werden.
Zur Ankopplung stehen sowohl an den Proteinverbindungen als auch an den Nichtproteinverbindungen zahlreiche reaktive Gruppen zur Verfügung.
Zum Beispiel können organische Gemische, die Carboxylgruppen enthalten oder carboxyliert werden können, mittels des Mischanhydridverfahrens, des Carbodiimidverfahrens unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und des N-Hydroxysuccinimidesterverfahrens angekoppelt werden.
Wenn der organische Komplex Aminogruppen oder reduzierbare Nitrogruppen enthält oder mit solchen Gruppen substituiert werden kann, lässt sich die Ankopplung durch eines von mehreren Verfahren erreichen. Aromatische Amine können durch langsame Addition von salpetriger Säure in Diazoniumsalze umgewandelt und dann bei einem pH-Wert von ungefähr 9 mit Proteinen umgesetzt werden. Wenn die organische Substanz aliphatische Amine enthält, können solche Gruppen mittels verschiedener Verfahren einschließlich mit Carbodiimid-, Toluol-2,4-diisocyanat- oder Maleinsäureimidverbindungen, insbesondere mit den N-Hydroxysuccinimidestern von Maleinsäureimidderivaten, an Proteine angekoppelt werden. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist die 4(N-Maleinsäureimidomethyl)-cyclohexan-1-carbonsäure. Ein weiteres Beispiel ist der m-Maleinsäureimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester. Ein weiteres brauchbares Reagens ist das N-Succininidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat. Ebenso können bifunktionelle Ester wie Dimethylpimelinsäureimidat, Dimethyladipinsäureimidat oder Dimethylsuberinsäureimidat zum Ankoppeln von Aminogruppen enthaltenden Substanzen an Proteine verwendet werden.
Außerdem können auch aliphatische Amine durch Reaktion mit p-Nitrobenzoylchlorid und anschließende Reduktion zu einem p-Aminobenzoylamid in aromatische Amine überführt und dann nach Diazotierung an Proteine gekoppelt werden.
Hydroxylgruppen enthaltende organische Komplexe können mittels einer Reihe von indirekten Verfahren vernetzt werden. Zum Beispiel wird durch die Umwandlung einer Alkoholspezies in den Halbester von Succinsäure (Hemisuccinat) eine für die Ankopplung verfügbare Carboxylgruppe eingeführt. Durch das bifunktionelle Reagens Sebacoyldichlorid wird Alkohol in ein Säurechlorid umgewandelt, das bei einem pH-Wert von 8,5 leicht mit Proteinen reagiert. Hydroxylgruppen enthaltende organische Komplexe können ebenfalls durch die hochreaktiven Chlorkarbonate angekoppelt werden, die durch eine äquimolare Menge Phosgen hergestellt werden.
Bei Keton- oder Aldehydgruppen enthaltenden organischen Komplexen können solche carbonylhaltigen Gruppen durch die Bildung von O-(Carboxymethyl)oximen zu Carboxylgruppen derivatisiert werden. Auch Ketongruppen können durch p-Hydrazinbenzoesäure zu Carboxylgruppen derivatisiert werden, die wie oben beschrieben an den spezifischen Bindungspartner gekoppelt werden können. Aldehydgruppen enthaltende organische Komplexe können durch die Bildung Schiffscher Basen direkt angekoppelt werden, die dann durch eine Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert werden.
Ein für Hydroxylgruppen enthaltende organische Komplexe besonders geeignetes Vernetzungsreagens ist das lichtempfindliche nichtspaltbare heterobifunktionelle Vernetzungsreagens Sulfosuccinimidy-6-(4¢-azido-2¢-nitrophenylamino]hexanoat. Weitere ähnliche Reagenzien werden in S. S. Wong, „Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking", (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL 1993) beschrieben. Weitere Verfahren zur Vernetzung werden auch in P. Tijssen, „Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", (Elsevier, Amsterdam, 1985), S. 221 bis 295, beschrieben.
Zum Einführen von Abstandshaltern zwischen dem organischen Komplex und dem biologischen Erkennungsmolekül können weitere Vernetzungsreagenzien verwendet werden. Die Länge der Abstandshalter kann so gewählt werden, dass die Aktivität der Partner des spezifischen Bindungspaars erhalten bleibt oder verstärkt wird oder im Gegenteil die Reaktivität begrenzt wird, wenn die spezifische Reaktion verstärkt und die Vernetzungsreaktivität abgeschwächt werden soll.
Obwohl die biologischen Erkennungsmoleküle üblicherweise kovalent an die Magnetteilchen gekoppelt werden, kann alternativ auch eine nichtkovalente Kopplung erfolgen. Verfahren zur nichtkovalenten Kopplung biologischer Erkennungsmoleküle an Magnetteilchen sind in der Technik wohlbekannt und brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden.
Die Kopplung biologischer Erkennungsmoleküle an Magnetteilchen wird in dem Ullman et al. erteilten US-Patent 4 935 147 und in dem Cox et al. erteilten US-Patent 5 145 784 beschrieben, die beide durch Bezugnahme in die vorliegende Erfindung einbezogen sind.
ANWENDUNGEN VON MAGNETTEILCHEN GEMÄSS DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Magnetteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung können in vielen analytischen und präparativen Anwendungen eingesetzt werden. Zu den analytischen Anwendungen gehören Prüfverfahren mit spezifischen Bindungen wie Immunoassays. Magnetteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung, an die ein Antikörper oder ein anderes biologisches Erkennungsmolekül gekoppelt ist, können in vielen Arten von Immunoassays eingesetzt werden. In der Technik sind Protokolle zur Durchführung solcher Immunoassays wohlbekannt und brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden. Bei den Immunoassays sind jedoch zwei Arten zu unterscheiden, und zwar Sandwich- und Konkurrenz-Immunoassays. Üblicherweise wird bei Sandwich-Immunoassays ein markierter Antikörper verwendet und ein ternärer Komplex nachgewiesen, der aus einem an einer festen Phase, dem Antigen, immobilisierten unmarkierten Antikörper und einem markierten Antikörper besteht, der auch an das Antigen gebunden ist. Zur Durchführung eines Sandwich-Immunoassays mit Magnetperlen gemäß der vorliegenden Erfindung wird der unmarkierte Antikörper an die Magnetperlen gekoppelt und ein markierter Antikörper verwendet. Der markierte Antikörper kann durch eine Enzymmarkierung, eine Fluoreszenzmarkierung, eine Chemilumineszenzmarkierung, eine Biolumineszenzmarkierung, eine radioaktive Markierung, eine Farbstoffmarkierung, eine Metallkolloidmarkierung oder eine andere in der Technik bekannte Markierung markiert werden. Bei den Konkurrenz-Immunoassays wird das zu analysierende Antigen oder Hapten üblicherweise auf einer festen Unterlage mit dem Antikörper und mit einer definierten Menge des markierten Analyten oder Analytanalogons gemischt. Das unmarkierte Antigen oder Hapten in der Probe konkurriert mit dem markierten Antigen oder Hapten um die Bindung zu dem auf der festen Unterlage befindlichen Antikörper. Magnetteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung können als feste Unterlage verwendet werden, an die der Antikörper gebunden wird. Die Magnetteilchen werden dann durch Anlegen von Magnetfeldern aus der Mischung von Antikörper, Teilchen und markierter Komponente abgetrennt und anschließend wird das Vorhandensein oder die Menge der mit den Magnetteilchen verbundenen Markierungen bestimmt, um den Analyt nachzuweisen oder zu bestimmen. Um den Untergrund zu verringern und die Reproduzierbarkeit des Immunoassays zu verbessern, können in das Verfahren verschiedene herkömmliche Waschschritte einbezogen werden.
Die obige Erörterung dient nur der Veranschaulichung und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit, und es gibt zahlreiche verschiedene Varianten solcher Immunoassays. Immunoassays unter Verwendung von Magnetteilchen werden in dem Ullman et al. erteilten US-Patent 4 935 147 sowie in der US-Patentschrift 5 145 784 beschrieben.
Magnetteilchen gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem biologischen Erkennungsmarker an ihrer Oberfläche können auch für präparative Zwecke, d. h. zur Isolierung und Reinigung einer durch das biologische Erkennungsmolekül spezifisch gebundenen Komponente, eingesetzt werden. Üblicherweise gehören zu der präparativen Prozedur die folgenden Schritte:

(1) Zusammenführen der Magnetteilchen mit einer Mischung, die eine Suspension der Komponente enthält, sodass die Komponente durch die Magnetteilchen gebunden werden kann;
(2) Trennen der Magnetteilchen aus der Suspension durch Anlegen von Magnetfeldern; und
(3) Eluieren der Komponente von den Magnetteilchen zur Reinigung der Komponente.

Üblicherweise wird die Komponente mittels Verfahren von den Magnetteilchen eluiert, welche die nichtkovalenten Bindungen zwischen der Komponente und dem biologischen Erkennungsmolekül an den Magnetteilchen aufbricht. Zu diesen Verfahren gehören unter Anderem, aber nicht ausschließlich, Änderungen des pH-wertes, Salzzugabe oder die Zugabe chaotropischer Agenzien wie Guanidiniumchlorid oder Natriumdodecylsulfat. Diese Verfahren sind in der Technik wohlbekannt und brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden.
Die zu isolierende Komponente kann ein Protein, ein Antigen, ein Hapten, ein Virus, ein Rezeptor, ein Kohlenhydrat, ein Hormon, eine Membran, eine Organelle, eine Bakterienzelle, eine Tierzelle oder ein Molekül oder eine Molekülanordnung sein, die durch das biologische Erkennungsmolekül spezifisch gebunden wird. Eine besonders wichtige zu isolierende Komponente stellen die Stammzellen des Immunsystems dar. Diese besitzen ein an ihrer Oberfläche befindliches Antigen mit der Bezeichnung CD34 und können mittels Antikörpern ausgewählt und isoliert werden, die mit diesem Antigen spezifisch reagieren. Mit den ausgewählten und isolierten Stammzellen des Immunsystems kann das Immunsystem eines Patienten nach extensiver Chemotherapie oder Bestrahlung wieder mit Zellen versorgt werden. Die Zellen werden vor der Behandlung isoliert und dem Patienten nach der Behandlung wieder zurück übertragen. Vorzugsweise wird eine ausreichende Menge von Stammzellen des Immunsystems gereinigt, um das Immunsystem eines Patienten wieder mit Zellen zu versorgen, dessen Stammzellen zuvor durch die Therapie abgetötet wurden.
SCHLUSSFOLGERUNG
Die Magnetteilchen der vorliegenden Erfindung können zur gleichzeitigen Durchführung von Mehrfachtrennungen und Reinigungen unterschiedlicher Komponenten wie beispielsweise Zellen verwendet werden, die verschiedene CD-Antigene tragen. Die Simultantrennungen erfolgen parallel. Es sind weitere Anwendungen möglich, welche die herausragenden und beherrschbaren magnetischen Eigenschaften ausnutzen.
Die obige Beschreibung der beispielhaften Ausführungsart der Erfindung dient der Veranschaulichung und der Beschreibung. Sie erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit und soll die Erfindung nicht auf die genau beschriebene Form einschränken. Angesichts der obigen Lehre sind zahlreiche Änderungen oder Varianten möglich. Der Geltungsbereich der Erfindung soll nicht durch vorliegende ausführliche Beschreibung, sondern nur durch die beiliegenden Ansprüche beschränkt werden.

Claims

Stoffzusammensetzung, die Folgendes umfasst: ein Magnetteilchen; eine Beschichtung auf der Oberfläche des Magnetteilchens; und ein auf der Beschichtung des Magnetteilchens angebrachtes Molekül zur Erkennung der Bindungsaffinität, um dieses selektiv mit einem Zielmolekül zu verbinden; dadurch gekennzeichnet, dass das Magnetteilchen eine erste ferromagnetische Schicht (16) mit einem in einer ersten Richtung ausgerichteten Moment; eine zweite ferromagnetische Schicht (22) mit einem in einer zu der ersten Richtung im Allgemeinen antiparallelen zweiten Richtung ausgerichteten Moment; eine zwischen der ersten und der zweiten ferromagnetischen Schicht (16, 22) befindliche unmagnetische Abstandsschicht (20) umfasst, wobei die Stärke des magnetischen Moments der ersten ferromagnetischen Schicht (16) im Wesentlichen gleich der Stärke des magnetischen Moments der zweiten ferromagnetischen Schicht (22) ist, so dass das Magnetteilchen bei Abwesenheit eines angelegten Magnetfeldes im Wesentlichen ein magnetisches Gesamtmoment von null aufweist, und wobei die Dicke des Magnetteilchens im Wesentlichen gleich der Gesamtdicke der Schichten ist, aus denen das Teilchen besteht.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Magnetteilchen ferner eine erste antiferromagnetische Schicht (18) zum Fixieren des magnetischen Moments der ersten ferromagnetischen Schicht (16) in der ersten Richtung umfasst, wobei sich die erste antiferromagnetische Schicht (18) in Kontakt mit der ersten ferromagnetischen Schicht befindet und mit dieser in Austauschwechselwirkung steht.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Magnetteilchen ferner eine zweite antiferromagnetische Schicht (24) zum Fixieren des magnetischen Moments der zweiten ferromagnetischen Schicht (22) in der zweiten Richtung umfasst, die sich in Kontakt mit der zweiten ferromagnetischen Schicht befindet und mit dieser in Austauschwechselwirkung steht.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Molekül zur Erkennung der Bindungsaffinität durch kovalente Bindung auf der Beschichtung des Magnetteilchens angebracht ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei das Molekül zur Erkennung der Bindungsaffinität aus der Gruppe der Antikörper, Antigene, Lektine, Hormone, Enzyme und Nukleinsäuren ausgewählt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Magnetteilchens, das Folgendes umfasst: Bilden einer ersten ferromagnetischen Schicht (16) mit einem in einer ersten Richtung ausgerichteten magnetischen Moment; Bilden einer zweiten ferromagnetischen Schicht (22) mit einem in einer zu der ersten Richtung im Allgemeinen antiparallelen zweiten Richtung ausgerichteten magnetischen Moment; Bilden einer zwischen der ersten und der zweiten ferromagnetischen Schicht (16, 22) angeordneten unmagnetischen Abstandsschicht (20), wobei die Stärke des magnetischen Moments der ersten ferromagnetischen Schicht (16) im Wesentlichen gleich der Stärke des magnetischen Moments der zweiten ferromagnetischen Schicht (22) ist, so dass das Magnetteilchen bei Abwesenheit eines angelegten Magnetfeldes im Wesentlichen ein magnetisches Gesamtmoment von null aufweist, und wobei die Dicke des Magnetteilchens im Wesentlichen gleich der Gesamtdicke der Schichten ist, aus denen das Teilchen besteht; Bilden einer Beschichtung auf der Oberfläche des Magnetteilchens; und ein auf der Beschichtung des Magnetteilchens angebrachtes Molekül zur Erkennung der Bindungsaffinität, um dieses selektiv mit einem Zielmolekül zu verbinden;
Herstellungsverfahren nach Anspruch 6, wobei das Magnetteilchen ferner eine erste antiferromagnetische Schicht (18) zum Fixieren des magnetischen Moments der ersten ferromagnetischen Schicht (16) in der ersten Richtung umfasst, wobei sich die erste antiferromagnetische Schicht (18) in Kontakt mit der ersten ferromagnetischen Schicht befindet und mit dieser in Austauschwechselwirkung steht.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Magnetteilchen ferner eine zweite antiferromagnetische Schicht (24) zum Fixieren des magnetischen Moments der zweiten ferromagnetischen Schicht (22) in der zweiten Richtung umfasst, wobei sich die erste antiferromagnetische Schicht (18) in Kontakt mit der zweiten ferromagnetischen Schicht befindet und mit dieser in Austauschwechselwirkung steht.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, wobei das Molekül zur Erkennung der Bindungsaffinität durch kovalente Bindung auf der Beschichtung des Magnetteilchens angebracht ist.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 6, 7, 8 oder 9, wobei das Molekül zur Erkennung der Bindungsaffinität aus der Gruppe der Antikörper, Antigene, Lektine, Hormone, Enzyme und Nukleinsäuren ausgewählt wird.