DE102009012108B4 - Vorrichtung und Verfahren zur Anreicherung und Erfassung von Zellen in strömenden Medien - Google Patents

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Abstract

Vorrichtung zur Anreicherung und kontinuierlichen Detektion/Erfassung von Zellen mit • einem Kanal (4) • einem Magnet (7) und • zumindest einem Magnetowiderstand (3), wobei • der Magnetowiderstand (3) an der Kanalwand angeordnet ist, • der Kanal ausgestaltet ist, eine laminare Strömung (5) eines Mediums mit magnetisch markierten Zellen (1) an dem Magnetowiderstand (3) vorbei zu führen, wobei • die Vorrichtung eine Steuereinrichtung zur Steuerung der Durchflussgeschwindigkeit des Mediums aufweist, und • der Magnet so außenseitig im Bereich des Kanals angeordnet ist, dass • der Magnetowiderstand (3) zwischen Kanalinnenwand und Magnet (7) liegt und • der Ursprung der Magnetfeldlinien des vom Magnet (7) erzeugten Magnetfeldes bei dem Magnetowiderstand liegt, so dass • die magnetisch markierten Zellen (1) aus der laminaren Strömung an den Magnetowiderstand (3) herangeführt werden und • die Kanalinnenwand eine Oberflächenfunktionalisierung aufweist, wobei die Oberflächenfunktionalisierung so ausgestaltet ist, dass die Zellen bei Kontakt mit der Kanalinnenwand in Rotation versetzt werden, so dass • die Zellen auf der Kanalinnenwand abrollen und somit • eine Einzelzellerfassung gewährleistet ist.

Description

  • Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Anreicherung und Erfassung von Zellen in strömenden Medien, insbesondere von markierten Zellen in komplexen Medien wie beispielsweise Blut.
  • Bisher gibt es keine nicht-optische Lösung um verlässliche Einzelzelldetektion mit magnetischen Durchflusszytometer in laminarer Strömung durchzuführen.
  • Die gegenwärtig bekannten technischen Lösungen zur Einzelzelldetektion sind vorwiegend optische Methoden, um Zellen mit fluoreszierenden Markern oder durch Streulicht aus einer Suspension in Durchflusskanälen zu detektieren. Magnetische Methoden beschränken sich vorwiegend auf Anreicherungen von magnetisch markierten Zellen sowie Biosensoren mit magnetoresistiven Transducer.
  • Folgende magnetische Methoden sind bekannt:
    • 1) Anlegen eines externen Magnetfeldes rechtwinklig zur Durchflussrichtung. In einem Gradientenfeld können zudem im eingeschränkten Masse Analyte nach Größe und magnetischem Moment sortiert werden, siehe dazu N. Pamme and A. Manz, Anal. Chem., 2004, 76, 7250.
    • 2) Einbau eines ferromagnetischen Leiters im Boden der Trennkammer. Durch den lokalen Feldgradienten werden magnetisierbare Zellen am Boden entlang des ferromagnetischen Leiters angereichert bei Durchflussraten von < 1 mm/s von unmarkierten Zellen getrennt D. W. Inglis, R. Riehn, R. H. Austin and J. C. Sturm, Appl. Phys. Lett., 2004, 85, 5093.
    • 3) Ein Stromleiter wird am Boden der Trennkammer eingebracht. Durch den Stromfluss wird ein Magnetfeld induziert, dass wiederum – wie unter Punkt 2 ausgeführt – verwendet werden kann, um Zellen anzureichern (Durchflussrate: 6 nl/min in Mikrofluidikkanälen) Pekas, N., Granger, M., Tondra, M., Popple, A. and Porter, M. D, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 293, pp. 584–588, (2005). c) M. Tondra, M. Granger, R. Fuerst, M. Porter, C. Nordman, J. Taylor, and S. Akou, IEEE Transactions an Magnetics 37, (2001), pp. 2621–2623.
  • Die Detektion markierter Zellen mit eingebetteten GMR Sensoren kann bisher nur statisch analog zu einem Assay und nicht dynamisch, also beispielsweise in laminarer Strömung, durchgeführt werden. siehe dazu: J. Schotter, P. B. Kamp, A. Becker, A. Puhler, G. Reiss and H. Brückl, Biosens. Bioelectron., 2004, 19, 1149.
  • Kommerzielle Hersteller von Sensoren mit magnetoresistiven Elementen bieten nur Assays für DNA und Proteinanalytik für die In-vitro-Diagnostik an. Dazu sei beispielsweise auf die Internet-Adressen von magnabiosciences.com, diagnsticbiosensors.com, seahawkbio.com und san.rr.com/magnesensors verwiesen.
  • In bekannten magnetischen Durchflusszytometer werden Zellen, die mit magnetischen, beispielsweise superparamagnetischen Labels, markiert sind, in einer Durchflusskammer oberflächennah über einen magnetoresistiven Sensor (z. B. GMR Sensor) transportiert wie z. B. N. Pekas, M. D. Porter, M. Tondra, A. Popple and A. Jander, Appl. Phys. Lett., 2004, 85, 4783 beschrieben.
  • So beschreibt auch die US 2007/0020770 A1 eine magnetische Vorrichtung zur Identifikation und Separation von Zellen in einem Magnetfeld. Die US 6 736 978 B1 behandelt eine magnetische Vorrichtung zur Detektion von Zellen im Fluss, wozu eine extrem feine Mikrofluidik verwendet wird um den Fluss in ausreichend geringem Abstand am Sensor vorbei zu führen. Dabei handelt es sich um eine stochastische Erfassung der Analytkonzentration und -verteilung. Eine Vorrichtung dieser Art birgt die Nachteile, dass reale Proben mit Hintergrund dazu neigen eine derart feine Mikrofluidik zu verstopfen, und dass keine eindeutige Einzelzelldetektion möglich ist.
  • Problematisch dabei ist, dass die erforderliche Nähe der markierten Zelle zum Sensor nicht erreicht wird, da das magnetische Streufeld durch die magnetischen Marker mit der dritten Potenz zum Abstand vom Sensor abfällt. Es können daher mit den bislang bekannten Verfahren in der Regel bei weitem nicht alle markierten Zellen erfasst werden.
  • Die US 2008/0191688 A1 beschreibt einen Biosensor, der auf magnetischer Detektion beruht, jedoch mit Immobilisation von Molekülen auf der Sensoroberfläche arbeitet.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Einzelzelldetektion im strömenden Medium anzugeben.
  • Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung, wie er in den Ansprüchen, der Beschreibung und den Figuren offenbart ist, gelöst.
  • Demnach ist Gegenstand der Erfindung eine Vorrichtung zur Anreicherung und Detektion von Zellen, wobei unterhalb eines Kanals, in dem eine laminare Strömung eines Mediums mit magnetisch markierten Zellen fließt, zumindest ein Magnetowiderstand in einem äußeren, ihn umgebenden Magnetfeld angeordnet ist. Außerdem ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung und Detektion von magnetisch markierten Zellen in einem laminar strömenden Medium, wobei Zellen an einem Magnetowiderstand durch ein äußeres Magnetfeld angereichert werden.
  • Die Erfindung offenbart also erstmalig die Technik, wie durch ein äußeres Magnetfeld eine Anreicherung von markierten Zellen direkt an den Magnetowiderständen erreicht wird, so dass eine nahezu 100% Erfassung der markierten Zellen erreichbar ist.
  • Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird das Magnetfeld so angelegt, dass eine Verstärkung des Gradienten des Magnetfelds direkt unterhalb der GMR-Sensoren so stattfindet, dass der Eintrittspunkt der Magnet-Feldlinien in den Probenraum möglichst nahe bei den GMR-Sensoren liegt.
  • Dazu wird nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Vorrichtung der Magnet direkt unterhalb der GMR-Sensoren angeordnet.
  • Insbesondere vorteilhaft ist die Ausführungsform, bei der der Magnet für das äußere, die Magnetowiderstände umgebende Magnetfeld an einer oder beiden Seiten angeschrägt wird, so dass daraus eine Flusskonzentration und ein Erhöhung des Magnetfeldgradienten resultiert.
  • Die Zelldetektion mit Magnetowiderständen erfolgt am einfachsten mit den technisch ausgereiften Sensoren wie den AMR, GMR, und/oder TMR-Sensoren, wobei die beiden letzteren vorteilhaft als sogenannte Spin Valves ausgeführt sind.
  • Die laminare Strömung bewirkt, dass die Zellen ohne Verwirbelung im Flüssigkeitsstrom transportiert werden. Jedoch werden Zellen, die in Kontakt mit der Oberfläche kommen, aufgrund auftretender Scherkräfte und dem Strömungsprofil in Rotation gebracht. Gemäß der Erfindung wird der Effekt ausgenutzt, um einerseits möglichst alle markierten Zellen an die Magnetowiderstände hinzu führen, und andererseits die statistisch verteilen immunmagnetischen Marker auf der Zelloberfläche durch „Abrollen” nahe an die GMR Sensoren heranzuführen.
  • Die Anreicherung von Zellen in einem Magnetfeldgradienten, die gegenwärtig nur für die Zellseparation eingesetzt wird, eignet sich, um gezielt in Abhängigkeit von Durchflussrate und Anzahl der magnetischen Labels pro Zelle die markierten Zellen aus der laminaren Strömung an die Substratoberfläche mit den Magnetowiderständen anzureichern. Darüber hinaus kann durch die die Durchflussgeschwindigkeit und die Stärke des Gradienten die Magnetkraft und damit die Scherkraft bzw. Haltekraft auf die angereicherten Zellen variiert werden ohne den Transport von umarkierten Zellen entlang des mikrofluidischen Kanals zu unterbinden.
  • Im Folgenden wird die Erfindung noch anhand einiger Figuren näher erläutert:
  • 1 zeigt die zwei Querschnitte durch eine Ausführungsform eines Mikrofluidkanals gemäß der Erfindung, links einen Querschnitt entlang der Strömungsrichtung und rechts einen Querschnitt senkrecht zur Strömungsrichtung.
  • 1 zeigt schematisch den Prozess der Zellanreicherung auf der Substratoberfläche 8 mit den GMR-Sensoren.
  • Zu erkennen ist ein im linken Teil der Figur ein längsseitiger Querschnitt eines Mikrofluidikkanals 4 in dem eine laminare Strömung, wie sie über den Pfeil 5 angezeigt wird, strömt. Dabei befinden sich in der Nähe zum Pfeil 5 markierte Zellen 1 und unmarkierte Zellen 2, die sich gleichmäßig verteilt in der laminaren Strömung bewegen. Etwas rechts davon und unterhalb des Mikrofluidikkanals 4 ist ein Magnet 7 angeordnet, man erkennt im Bild sofort die Anreicherung der markierten Zellen am Boden/Substrat 8 des Kanals innerhalb des Magnetfeldgradienten 7. Die GMR-Sensoren wie alle Magnetowiderstände können dabei auch an den Seitenwänden der Kanalwand und/oder oben am Kanal angeordnet sein. Wiederum etwas weiter rechts, also in Strömungsrichtung, befinden sich am Boden/Substrat 8 des Kanals mehrere GMR Sensoren 3. Durch das „Cell-Rolling” am Kanalboden und die Anreicherung der markierten Zellen durch das äußere Magnetfeld ist es möglich, dass möglichst viele der markierten Zellen auch tatsächlich von den GMR-Sensoren erfasst werden.
  • Hier wird die Anreicherung von Zellen mit superparamagnetischen Markern 1 aus einem komplexen Medium in einem Magnetfeld 9 gezeigt. Die laminare Strömung 5 verhindert eine Verwirbelung der Zellen 1 und 2. Durch Einstellung der Magnetfeldstärke können die Zellen 1, 2 entlang der Substratoberfläche 8 rollen und kommen so in engsten Kontakt mit den GMR Sensoren 3. Die Stärke des Magnetfeldes soll aber den Transport der markierten Zellen im Mikrofluidikkanal nicht behindern, was beispielsweise durch einen geeigneten Pulsbetrieb sowie durch die Symmetrie des Gradientenfeldes eingestellt werden kann.
  • Rechts und im Abstand zu dem linken Teil der 1 ist der Mikrofluidikkanal 4 im Querschnitt durch die Strömungsrichtung zu sehen. Zu erkennen sind die Feldlinien 9 des Magnetfeldes, die ihren Ursprung bei den GMR-Sensoren 3 haben und daher eine Gradientenverstärkung des Magnetfeldes bewirken. Dies ist maßgeblich darauf zurückzuführen, dass der Magnet 7 zu den GMR-Sensoren hin eine zumindest eine Schräge 6 hat, bevorzugt aber 2 Schrägen 6 wie gezeigt.
  • 2 zeigt das gleiche Bild wie 1 im Längsquerschnitt und verdeutlicht das Cell-Rolling innerhalb der laminaren Strömung 5. Zu erkennen sind die drei Phasen des Cell-Rollings, erstens (A) die Anreicherung der markierten Zellen 1 auf der Substratoberfläche des Bodens 8 des Mikrofluidikkanals 4 im Magnetfeld 9, dann (B) das Cell-Rolling über die Sensoroberfläche wobei die Zelldetektion stattfindet.
  • Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird, um eine Zelldetektion mit dem GMR Sensor (z. B. als Wheatstone-Brückenschaltung) vorzunehmen, beispielsweise für eine kontinuierliche Anreicherung der Zellen das Gradienten-Magnetfeld (~100 mT mit dB/dx von einigen 10–100 T/m; abhängig von der Beladung der Zellen mit superparamagnetischen Partikeln) gepulst. Die Detektion der markierten Zellen erfolgt in einem schwachen Mess-Magnetfeld von ~1 mT.
  • In 3 ist in in drei Magnetfeld-Zeit-Diagrammen (T-t-Diagrammen) identischer Skalierung die zeitliche Abfolge der Stärke des Magnetfeldes aufgetragen. Im oberen Diagramm ist ein starkes Magnetfeld für die Zellanreicherung, im mittleren Diagramm ein schwaches Magnetfeld für die Zelldetektion und im unteren Diagramm ist ein schwaches Magnetfeld mit geringerer Pulsdauer für die GMR-Messung gezeigt. Auf der X-Achse ist die Zeit aufgetragen, so dass zu erkennen ist, dass immer zwei Magnetfeldstärken, die zur Zellanreicherung und die zur Zelldetektion, im zeitlichen Wechsel angelegt werden. So kann ein Verfahren zur kontinuierlichen Zellanreicherung und Zelldetektion durch eine Abfolge von gepulsten Magnetfeldern durchgeführt werden.
  • Zu erkennen ist in 3 die zyklische Abfolge von (1) Anreicherung, (2) + (3) Messung für eine kontinuierliche Messung, die bildlich graphisch dargestellt ist. Die Messung und Anreicherung der Zellen kann damit unabhängig voneinander im kHz Bereich verfolgt bzw. gesteuert werden.
  • In 4 ist wieder ein Mikrofluidikkanal zu sehen, wieder im Querschnitt senkrecht zur Strömungsrichtung wie in 1 auf der rechten Seite.
  • Für die GMR Messung kann das Mess-Magnetfeld senkrecht (B) oder in gleicher Ebene (A) zu den GMR Sensoren angelegt werden (4). Dabei kann der Magnet (Magnetjoch) des Gradientenmagnetfeldes zur Einstellung eines Gradienten im Mess-Magnetfeld benutzt werden, um eine lokale Verstimmung der Brückenglieder der GMR Messbrücke zu erreichen. Diese Verstimmung stellt das Messsignal für die Konzentration der magnetischen Partikel im Sensorbereich dar. In einer möglichen Ausgestaltungsform kann das Mess-Magnetfeld zusätzlich noch zeitlich moduliert werden, um z. B. mittels Lock-in Technik messen zu können und die niederfrequenten Rauschanteile (1/f-Rauschen) zu unterdrücken, um das Signal-Rauschverhältnis zu verbessern.
  • Nach einer vorteilhaften Ausführungsform wird mit gepulsten Magnetfeldern angereichert und detektiert wie in 3 gezeigt. In 4 wird dabei die schematische Anordnung der Magnete oder Spulen 7, 10 und 11 zur Anreicherung und Detektion um den Mikrofluidikkanal 4 gezeigt. Dabei wird beispielsweise der Magnet 7 für das starke Magnetfeld zur Anreicherung unterhalb der GMR-Sensoren angelegt und die Spulen 10 und 11 für das schwache Magnetfeld zur Detektion senkrecht zum GMR Sensor angelegt. Beide Felder können getrennt mit 2 Magneten gesteuert werden, wobei bevorzugt das schwache Magnetfeld in der Sensorebene angelegt wird.
  • Die wesentlichen Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens sind wie folgt:
    • 1) Kontinuierliches Messverfahren um magnetisch markierte Zellen anzureichern und im Durchfluss zu erfassen.
    • 2) Die Anreicherung der Zellen bzw. die ausgeübte Scherkraft auf die Zellen kann durch die Magnetfeldstärke und die Durchflussgeschwindigkeit gesteuert werden.
    • 3) Markierte Zellen sind oberflächennah und können mit magnetoresistiven Bauteile sensitiv detektiert werden.
    • 4) Das vorgestellte Verfahren erlaubt eine großflächige Anwendung für Multiplexing (z. B. Array von GMR Sensoren).
    • 5) Das „Cell-Rolling” kann mit Hilfe von oberflächenfunktionalisierten Mikrofluidikkanälen an die Anwendung angepasst werden. Die Funktionalisierung kann beispielsweise mit Rezeptoren (Selektinen), biologische Komponenten (Proteinen, Polysaccharide), durch SAMs (self-assembled monolayer) oder durch Silanisierung durchgeführt werden.
    • 6) Eine Anreicherung von markierten Zellen, wie seltene Krebszellen (CTC; circulating tumor cells), Tumorstammzellen, Inflammationszellen, Stammzellen, Bakterien oder Hefen, kann der eigentlichen Detektion im strömenden Medium vorausgehen.
    • 7) Die magnetische Detektion kann mit optischen Methoden (FACS, Fluoreszenz, Absorption), und elektrischen Methoden (Impedanz, Dielektrophorese) kombiniert werden.
    • 8) Anwendungsfelder im Humanbereich sind unter anderem: Onkologie, regenerative Medizin, Infektiologie, klinische Diagnostik, klinische Chemie, Imaging.

Claims (12)

  1. Vorrichtung zur Anreicherung und kontinuierlichen Detektion/Erfassung von Zellen mit • einem Kanal (4) • einem Magnet (7) und • zumindest einem Magnetowiderstand (3), wobei • der Magnetowiderstand (3) an der Kanalwand angeordnet ist, • der Kanal ausgestaltet ist, eine laminare Strömung (5) eines Mediums mit magnetisch markierten Zellen (1) an dem Magnetowiderstand (3) vorbei zu führen, wobei • die Vorrichtung eine Steuereinrichtung zur Steuerung der Durchflussgeschwindigkeit des Mediums aufweist, und • der Magnet so außenseitig im Bereich des Kanals angeordnet ist, dass • der Magnetowiderstand (3) zwischen Kanalinnenwand und Magnet (7) liegt und • der Ursprung der Magnetfeldlinien des vom Magnet (7) erzeugten Magnetfeldes bei dem Magnetowiderstand liegt, so dass • die magnetisch markierten Zellen (1) aus der laminaren Strömung an den Magnetowiderstand (3) herangeführt werden und • die Kanalinnenwand eine Oberflächenfunktionalisierung aufweist, wobei die Oberflächenfunktionalisierung so ausgestaltet ist, dass die Zellen bei Kontakt mit der Kanalinnenwand in Rotation versetzt werden, so dass • die Zellen auf der Kanalinnenwand abrollen und somit • eine Einzelzellerfassung gewährleistet ist.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der das Medium ein komplexes Medium wie Blut ist.
  3. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Kanal (4) ein Mikrofluidikkanal ist.
  4. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei zur Erzeugung des umgebenden Magnetfeldes zumindest ein Magnet (7) unterhalb des zumindest einen Magnetowiderstandes (3) angeordnet ist.
  5. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Magnetowiderstand (3) ein GMR-Sensor ist.
  6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein weiteres Magnetfeld vorgesehen ist.
  7. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein weiteres Magnetfeld durch eine in unmittelbarer Nähe zum Magnetowiderstand angeordnete Spule (10, 11) erzeugt wird.
  8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Spule (10, 11) senkrecht zu dem Magnetowiderstand angeordnet ist.
  9. Verfahren zur Anreicherung und kontinuierlichen Detektion von magnetisch markierten Zellen, mit folgenden Schritten: • Führung einer laminaren Strömung eines Mediums mit magnetisch markierten Zellen (1) in einem Kanal (4) an wenigstens einem Magnetowiderstand (3) vorbei, • Erfassung der magnetisch markierten Zellen mit dem Magnetowiderstand (3), • Steuerung der Durchflussgeschwindigkeit des Mediums, • Erzeugung eines äußeren Magnetfeldes (9) durch einen Magneten (7), • das Heranführen der magnetisch markierten Zellen aus der laminaren Strömung an die Kanalinnenwand mit dem Magnetowiderstand (3), • gleichzeitige Gewährleistung des Weitertransports unmarkierter Zellen und • Versetzen der magnetisch markierten Zellen in Rotation bei Kontakt mit der Kanalinnenwand, so dass • die Zellen auf der Kanalinnenwand abrollen und dadurch eine Einzelzellerfassung gewährleistet ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der zumindest eine Magnetowiderstand im Kanal in gepulstem Betrieb von zumindest zwei Magnetfeldern umgeben ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die zumindest zwei Magnetfelder, die gepulst angelegt werden, sich in Größenordnungen an Stärke unterscheiden.
  12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die zumindest zwei Magnetfelder sich in ihrer Stärke um zumindest einen Faktor 100 unterscheiden.
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