DE19706617C1 - Verfahren zur Zählung mikroskopischer Objekte - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zählung mikro­ skopischer Objekte, insbesondere von biologischen Zellen wie Blutzellen und Biopartikeln.

Mikroskopische Objekte werden vielfältig durch zellbio­ logische und medizinische Untersuchungsverfahren ge­ zählt. Überwiegend wurden dabei bisher menschliche Beob­ achter an einem Mikroskop eingesetzt. Die von ihnen aus­ geübte Arbeit des Zählens ist jedoch mühsam und langwie­ rig.

Ein Verfahren und eine Apparatur zur Unterscheidung ver­ schiedener Zell-Subpopulationen sind bereits aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 33 31 017 A1 bekannt, in der Antikörper-Proteine mit Fluorochromen markiert werden. Zur Unterscheidung zwischen Antigen-negativen und - positiven Zellen werden Zellpopulationen mit spe­ zifischem Fluorochrom (z. B. FITC-AK : Fluoreszien­ isothiocyanat-konjugierter Antikörper) markiert; jedes der Fluorochrome besitzt ein charakteristisches Emissions- und/oder Anregungsspektrum. Das Verfahren ist unter dem Namen "Fluorescence Activated Cell Sorter" ("FACS") bekannt. Die Apparatur enthält dann eine Vor­ richtung zum getrennten Nachweis des mit den einzelnen Teilchen verbundenen Fluorochroms. Dabei wird die Menge der Fluoreszenz, die den jeweiligen Teilen anhaftet, ge­ messen.

Weiter ist die WO 95/24648 zu nennen, in der bereits ein Verfahren zur Auffindung spezifischer sogenannter "Target-Zellen" unter Benutzung paramagnetischer Parti­ kel beschrieben ist, insbesondere aber diese Vorrich­ tung mit einer zellfilternden Einrichtung versehen ist, und die Zellen in sogenannten Multiwells im wesentli­ chen ortsfest gehalten werden.

In einem Artikel Eur. J. Pharm. Biopharm (1995), 41(1), 55-61 haben die Erfinder zudem bereits eine magneti­ sche, bioabbaubare, biokompatible Albumin-Nanosphäre für das Zell-Labeling und immunomagnetische Separation vorgeschlagen.

Zur universellen Anwendung einer automatischen Zählappa­ ratur auflebende Zellen, chemisch fixierte Zellen oder andere Partikel, die in Suspensionen dispergiert sind, ergeben sich jedoch häufig Probleme dadurch, daß fluo­ reszierende Moleküle bereits natürlicherweise innerhalb der Zellen in unvorhersagbarem Umfang vorhanden sind. Das sich dadurch ergebende Problem der Autofluoreszenz von nicht markierten Zellen, die nicht gezählt werden sollen, verfälscht die Meßwerte.

Insbesondere ergeben sich Probleme, wenn die Autofluo­ reszenz und das besondere Signal eines Immunoreagens sich einander überlagern. Statistische Auswahlmethoden haben bisher keine befriedigenden Fortschritte gebracht, da subjektiv entschieden werden muß, wo die Grenzwerte gesetzt werden, um zu entscheiden, ob es sich um Auto­ fluoreszenz handelt oder nicht. Dies bringt naturgemäß zusätzlich erhebliche Fehlerquellen ein.

Die magnetische Sortierung makroskopischer Teilchen stellt eines der größten industriellen Anwendungsgebiete des Magnetismus dar. Durch die Möglichkeit, stärkere Feld­ gradienten zu verwenden, wurde es möglich, auch mikro­ skopische Partikel mit geringen magnetischen Momenten zu sortieren. Damit wurde das Verfahren auch auf biologi­ schem Gebiet einsetzbar. So werden für präparative Zell­ trennung und die Trennung kleiner Gewebsverbände bereits magnetische Sortierverfahren nach der Methode von Molday et al. (Nature 268: 437, 1977) und Müller-Ruchholtz et al. (Transplant. Proc. 19: 911-915, 1987) beschrieben.

Während man bei den ersten mikroskopischen Anwendungen die magnetischen Eigenschaften der zu sortierenden Mate­ rialien direkt ausnutzte, setzt sich in der Biologie und Medizin in neuerer Zeit ein Sortierverfahren durch, bei dem "Beads" eingesetzt werden, die superparamagnetische Fe₃O₄-Kristalle enthalten. Um eine Aggregation der Beads aufgrund der Van-der-Waals'schen Wechselwirkung zu ver­ hindern, werden sie hydrophil beschichtet. An die Hydro­ xylgruppen wird z. B. Toluolsulfonsäurechlorid gebunden, dessen funktionelle Gruppen dann die Bindung verschiede­ ner chemischer Substanzen (z. B. Antikörper) erlauben.

Aufgabe ist es daher, das Zählen dahingehend zu automa­ tisieren, daß es von einer Maschine selbständig durchge­ führt werden kann.

Dazu wird vorgeschlagen, zuerst eine Markierungstechnik mit magnetischen Partikeln zur Unterscheidung der Zell-Subpopulationen zu etablieren. Dann ist das Zählen der markierten und unmarkierten Zellen zu automatisieren, so daß es von einer Maschine selbsttätig durchgeführt wer­ den kann.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1. Das erfindungsgemäße Verfah­ ren ermöglicht hohe Spezifität auf der Basis spezifi­ scher Liganden und kann dabei bereits einzelne Moleküle an der Zelloberfläche detektieren.

Zunächst werden die zu untersuchenden Objekte markiert, d. h. insbesondere biologische Zellen mit magnetischen Immunoreagenzien in Kontakt gebracht. Dabei entstehende Magnetreagenz-Komplexe werden in einem Magnetfeld ausge­ lenkt, während nichtmarkierte Zellen unbeeinflußt blei­ ben.

Das hierbei verwendete Prinzip der Magnetophorese (MP) beruht auf der Bewegung einer Zelle, die durch ein ma­ gnetisches Feld verursacht wird. Die Magnetophorese von Zellen, indem diese mit magnetischen Mikrospheres mar­ kiert werden, ist durch die Erfinder vorliegenden Ver­ fahrens erstmals evaluiert worden. Diese magnetischen Mikrospheres bestehen z. B. aus Albumin als Matrix und Magnetit als eingelagerten magnetischen Teilchen, insbe­ sondere superparamagnetischen Teilchen wie z. B. Fe₃O₄). Nach einer thermischen Härtung wird an Hydroxylgruppen ein Haftvermittler (z. B. Toluolsulfonsäurechlorid) auf­ gebracht, dessen funktionelle Gruppen dann die chemische Bindung verschiedener Liganden (z. B. Antikörper, Lekti­ ne) ermöglichen.

Dabei ist darauf zu achten, daß nicht durch eine zu gro­ ße Beladung mit magnetischen Mikrospheres nicht ein so großes magnetisches Moment entsteht, daß die Verbindun­ gen im Komplex aufreißen. Vorteilhaft ist insbesondere die Benutzung von Mikrospheres mit Durchmessern von ca. 0,3 bis 0,6 µm.

Zu einer Zellmarkierung wurden zuerst magnetische Mi­ krosheres mit einem Durchmesser von 0,6 µm verwendet. Mittlerweile können auch Partikelgrößen mit einem Durch­ messer von 0,3 µm und Mikrospheres unterschiedlicher Ma­ trix im vorliegenden Verfahren eingesetzt werden.

Magnetische Mikrospheres werden also an der Oberfläche mit verschiedenden Liganden (z. B. Antikörpern, Lekti­ nen) konjungiert, die mit Molekülen an der Zelloberflä­ che spezifisch reagieren. Diese Mikrospheres werden als magnetische Immunomikrospheres (MIMS) oder magnetische Reagenzien bezeichnet.

Experimentell wurde dies bei HLA-Bw6-positiven Target-Zellen der leukämischen Zellinie REH untersucht. Die MIMS waren mit monoklonalen Anti-Bw6-Antikörpern konju­ giert. Die Versuche wurden in einer Zellsuspension mit 10⁶ Zellen in 500 µl Medium durchgeführt, nachdem bei 4°C (oder auch bei Raumtemperatur) für 15 Minuten auf einem Walzen-Inkubator inkubiert worden war. Mit der er­ findungsgemäßen Markierung von Zellen mit Mikrospheres ist es sogar möglich, einzelne Zellen zu erfassen, die durch das mikroskopische Sichtfeld innerhalb einer Glas­ kapillare in laminarer Bewegung hindurchtreten.

Eine Aggregation von MIMS aufgrund der van der Waals'schen Wechselwirkung wurde im Gegensatz zu anderen magnetischen mikroskopischen Objekten (z. B. paramagneti­ schen Fe₃O₄-Kristallen im Inneren von Polystyrol-Beads) nicht beobachtet. Eine hydrophile Beschichtung, die an sich denkbar ist, wurde daher bisher nicht vorgeschla­ gen.

Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung wieder. Insbesondere wird durch die "Aus­ blendung" bestimmter magnetisch markierter Zellen auch eine Durchflußzählung möglich (wenn zusätzlich in­ termitterend die Kapillare gespült wird).

Außer dem Beobachten eines Bildfeldes zur Erfassung der Lage und/oder Zahl der Objekte im Einfluß des Magnetfel­ des und Vergleich mit einer entsprechenden Referenz ist es auch möglich, daß die Beobachtung (1) in einem strö­ menden Medium erfolgt, wobei ein optischer Abtaster die Gesamtzahl aller Objekte in einem ersten Bildfeld ohne magnetische Beeinflussung bestimmt, und ein zweites Bildfeld derart zu einem Magnetfeld angeordnet ist, daß die magnetisch beladenen Objekte in einem Strom an dem Bildfeld vorbei gelenkt werden.

Weiter ist es (2)) möglich, die Bildfelder vorteilhaf­ terweise strichartig als mit CCDs gebildete Schranken an einer durchströmten Glaskapillare vorzusehen.

Wenn die mikroskopischen Bildfelder strichartig durch aus linearen CCD-Sensoren gebildeten Schranken an einer durchströmten Glaskapillare abgetastet werden (während der Beeinflussung durch ein Magnetfeld), kann die Zahl der Zählobjekte durch Subtrahieren der Zählobjekte der zweiten Schranke von den Zählobjekten der ersten Schran­ ke bestimmt werden.

Bei einer doppelten Abtastung eines einzigen Bildfeldes wird zu berücksichtigen sein, daß gegenüber der ersten Abtastung ohne Einfluß eines Magnetfeldes bei der zwei­ ten nach/mit Einwirkung eines Magnetfeldes auch magneti­ sche Objekte "ins Bild einwandern können". Gegenüber der Referenzaufnahme werden die durch Überlagerung vergli­ chenen Bilder daher in allen Abweichungen von magneti­ schen Teilchen auszugehen haben, nicht nur bei solchen, bei denen Teilchen ihren relativen Platz verlassen ha­ ben.

Eine "Quasi-Durchflußmethode" kann durch ein intermit­ tierendes Hindurchpumpen des Probenvolumens im "stop and go"- Verfahren erreicht werden. Also erlaubt dieser Zählvorgang eine statistische Bildauswertung.

Hinsichtlich der beabsichtigten Vorrichtung wird vorge­ schlagen, die Magnetpole mit dreieckigem Querschnitt längs der Kapillare so anzuordnen, daß sich eine Längs­ kante entlang der Erstreckung dieser erstreckt. Die Glaskapillare kann zur Vermeidung des Anhaftens innen beispielsweise mit Dichlordimethylsilan oder äquivalen­ ten Substanzen behandelt werden.

Vorteilhaft ist insbesondere ein magnetisches Feld mit hohem Feldgradienten innerhalb der Glaskapillare, wobei aber ein geringes Störfeld außerhalb existieren soll, so daß sich die magnetischen Zellen dort nicht unerwünscht ansammeln. Aber schon durch Wahl einer schmalen Kapilla­ re und Hindurchführung aller Probenflüssigkeit, wobei man in geeigneten Abständen beobachtet, läßt sich diese Beeinflussung wirksam ausschalten. Auch eine Abschirmung des optischen Systems mit unmagnetisierbarem Material auf Vorder- und Rückseite der Glaskapillare wird vorge­ schlagen.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus nachfolgender Beschreibung eines bevorzugten Ausfüh­ rungsbeispiels anhand der beigefügten Zeichnung. Dabei zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung zur Durchfüh­ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens,

Fig. 2 in schematischer Weise die Bewegungen magnetischer Zellen (mit "b" bezeichnet) und nicht-magnetischer Zellen (mit "a" bezeich­ net) in einem magnetischen Feld und unter Gravitation,

Fig. 3 schematisch das Verfahren der Zählung der wie in Fig. 2 bewegten Zellen,

Fig. 4 eine Darstellung, die eine Messung erläutert, bei der die Zählung mittels eines statisti­ schen Bildanalyse-Verfahrens erfolgt,

Fig. 5 eine Darstellung, die eine Online-Messung mit zwei optischen Schranken erläutert,

Fig. 6 die schnelle Verminderung des statistischen Fehlers bei Benutzung der erfindungsgemäßen Methode, und

Fig. 7 die überlegene Genauigkeit der erfindungsge­ mäßen Methode gegenüber der FACS-Methode nach dem Stand der Technik.

Die in der Fig. 1 schematisch dargestellte Vorrichtung zur Ausführung der Erfindung nach einem ersten Ausfüh­ rungsbeispiel besteht aus den folgenden Bestandteilen: einem hydraulischen System mit einem Probenbehälter 104, einer Glaskapillare 102, einer Pumpe 103, sowie einem magnetischen System, das entweder aus Magnetpolen (100 und 101 in Fig. 2), einem Magnetkern, elektrischen Spu­ len oder auch Permanentmagneten erzeugt wird, sowie ei­ nem optischen System 106 zur Abbildung der Zellen auf einen Zähler, an den sich ein Computer oder eine auswer­ tende Bedienperson anschließt.

Aus einem Probengefäß 104 wird das mit den zu zählenden Zellen beladene Medium durch die Glaskapillare 102, an der sich der Beobachtungsort befindet, durch eine Pumpe 103 abgesaugt, um dann direkt in ein Auffanggefäß wieder abgegeben zu werden.

In der Fig. 2 wird schematisch dargestellt, wie sich ei­ ne magnetisch beladene Zelle (mit Bezugszeichen "b" be­ zeichnet) bewegen kann, und wie sich im Vergleich dazu eine nicht-magnetische (mit "a" bezeichnet) im magneti­ schen Feld und unter den Gravitationsbedingungen bewegt (die Pfeile zeigen die Bewegungsrichtungen an).

Weitere Einzelheiten der Vorrichtung sind die mit Be­ zugszeichen 100 und 101 bezeichneten magnetischen Pole, eine Lichtquelle 108 oberhalb der Glaskapillare zur rückwär­ tigen Beleuchtung, eine Linse 106, die vor einem opto­ elektronischen Gerät 107 angeordnet ist, das die Licht­ signale in elektrische Signale umwandelt. Daran an­ schließend ist ein Zähler vorgesehen, der zum Beispiel einen Computer umfaßt, der derart programmiert ist, daß er Zellen auf Videobildern oder optischen Sensoren er­ fassen kann, oder es kann eine Person auch manuell die in das Sichtfeld gelangenden Zellen zählen. Das Sichtfeld ist durch die unterbrochenen Linien 105 schematisch dar­ gestellt.

Die aus der Zellsuspension herausfraktionierten Zellen werden ggf. nach Beendigung eines jeden Meßvorgangs mit Pufferlösung herausgespült.

In Fig. 2 wird schematisch ein Beispiel des magnetischen Systems dargestellt, bei dem die Magnetpole nicht­ symmetrisch einander gegenüberstehen, um eine ponderomo­ tive magnetische Kraft auf (beispielsweise) den linken Pol aufzubringen. Das Magnetsystem wird zur Erzeugung dieser magnetischen Kraft ausgelegt, damit diese stark genug ist, die Gravitation zu überwinden. Eine nicht­ magnetische Zelle "a" wird dann nur unter dem Einfluß der Strömung und der Schwerkraft sich bewegen, während magnetische Zellen "b" durch die Strömung, die Gravitati­ on und das magnetische Feld gleichzeitig beeinflußt wer­ den.

Daher wird sich eine Zelle "b" unter der magnetischen Kraft nach kurzer Zeit in der Nähe des magnetischen Pols 100 an der Wand der Kapillare befinden. Diese Zellen, die aus dem Volumen der Kapillare heraus bewegt werden, werden an der Kapillarwand durch die magnetische Kraft festgehalten. Nicht-magnetische Zellen werden durch die­ se magnetische Kraft in keiner Weise beeinflußt und wer­ den sich durch die Gravitation nach unten bewegen, wie dies durch den nach unten gerichteten Pfeil dargestellt ist. Das optoelektronische System, zum Beispiel das Mi­ kroskop oder die Linse 106, die vorteilhafterweise an einem Videoaufzeichnungssystem 107 angesetzt sind, wird nun dazu benutzt, ausschließlich Lichtsignale der Zellen im Beobachtungsfeld auf einen Zähler zu leiten. Aufgrund der Unterschiede in der Bewegung der magnetischen und nicht-magnetischen Zellen werden die magnetischen Zellen auf der linken Seite der Kapillare außerhalb des Beob­ achtungsfeldes angesammelt, während nicht-magnetische Zellen sich an dem Boden der Kapillare ansammeln.

In der Fig. 3 ist nun in Draufsicht auf das Beobach­ tungsfeld das mikroskopisch-optische Bildfeld darge­ stellt. Das Bildfeld wird durch die beiden geraden hori­ zontalen Linien "A" und "B" begrenzt, die eine Lücke zu der Wandung der Kapillare 102 belassen, durch die es ma­ gnetisch angezogenen Zellen erlaubt wird, außerhalb des mikroskopischen Bild-Feldes unbeobachtet vorbeizupassie­ ren. Derartig bewegte Zellen werden also bei einer ech­ ten durchflußtechnischen Messung im Bildfeld nicht er­ scheinen und daher auch nicht gezählt werden. Die Bewe­ gungsabläufe magnetischer "b" und nicht-magnetischer "a" Zellen sind durch unterbrochene Linien dargestellt. Der Pfad für die Zelle "a" zeigt (unterbrochene Linie), daß die nicht-magnetische Zellen "a" ohne jede Ablenkung ge­ rade hindurchwandert, während die Zelle "b" (unterbro­ chene Linie) durch die Magnetkräfte zur Zellwand abge­ lenkt und dicht an der Kapillarwand entlang bewegt wird.

Daher werden magnetische Zellen nicht gezählt werden, während nicht-magnetische Zellen auf der Bildfläche er­ scheinen und gezählt werden.

In der Fig. 4 ist ein schematisches Prinzip für die Durchführung der Online-Bilddatenanalyse im statisti­ schen Bildanalyse-Verfahren dargestellt. Die Probe wird schrittweise durch eine Pumpe eingegeben. Magnetische Zellen (b' in Fig. 4B), wandern im eingeschalteten Ma­ gnetfeld, während nichtmagnetische Zellen (a' und c') in der Fig. 4B unbeeinflußt bleiben. Ein Scanning-System detektiert nun Bild A vor der Magnetfeldeinwirkung und Bild B nach Magnetfeldeinwirkung und registriert die ab­ weichende Lage der Zellen.

Ein Computer-Programm wurde zur Online-Bilddatenanalyse entwickelt, welches in Verbindung mit einer "Frame­ grabber-card" visuelle Bilder analysieren kann. In einer solchen Ausführung wird eine Videokamera in eine mikro­ skopische Vorrichtung eingebaut, um Objekte in Form von elektrischen Signalen in ein Scanner-Programm aufzuneh­ men. Der Computer übernimmt dabei die Kontrolle des Ma­ gnetfeldes und der Pumpenaktivität sowie die Archivie­ rung der anfallenden Meßergebnisse und ihrer Versuchspa­ rameter.

Zusätzlich können alle Bildinformationen und Auswertun­ gen im Computer als digitale Signale gespeichert werden, um ggf. später Meßdaten zu korrigieren.

In den Fig. 4A und 4B wird der Mittelpunkt jedes gefun­ denen Zellpaares nach seinen X/Y-Koordinaten vermerkt. Aus dieser Information läßt sich später nach Vergleich zweier Bilder vor/nach Einschalten des Magnetfeldes ab­ leiten, wie viele magnetische und nicht-magnetische Zel­ len in einer Probe prozentual dargestellt werden.

Bei einer doppelten Abtastung eines einzigen Bildfeldes wird zu berücksichtigten sein, daß gegenüber der ersten Abtastung ohne Einfluß eines Magnetfeldes bei der zwei­ ten Abtastung nach/mit Einwirkung des Magnetfeldes auch magnetische Objekte "ins Bild einwandern können". Gegen­ über der Referenzaufnahme werden daher alle Abweichungen als magnetische Partikel zu behandeln sein; nicht nur die Ortsverlagerung von solchen Teilen, die ihren rela­ tiven Platz verlassen haben.

Eine "Quasi-Durchflußmethode" kann durch intermittieren­ des Hindurchpumpen des Probenvolumens im "stop and go"- Verfahren erreicht werden.

In der Fig. 5 ist das Prinzip für die Durchführung der Online-Bilddatenanalyse schematisch dargestellt.

Die Probe wird mit einer kontinuierlich betriebenen Pum­ pe gefördert und das Magnetfeld wird während der Probenanalyse dauernd aktiviert gehalten.

Zellen (a, b, c) wandern ins visuelle Bildfeld über eine erste optische Schranke ein. Sobald eine magnetische Zelle (positive Zelle) in den Bereich des Magnetfeldes eintritt, wird sie durch die Magnetkraft angezogen (b; Fig. 5B). Die übrigen Zellen wandern in einer laminaren Strömung an einer zweiten Schranke vorbei.

In der Fig. 6 ist eine Auswertung für eine statistisch signifikante Anzahl von gezählten Zellen dargestellt. Entsprechend der gewählten Aufbereitung, bei der in ei­ nem ersten Schritt die Kapillare durch Einpumpen von 100 µl einer Zellsuspension aus dem Probengefäß gefüllt und einige Sekunden später durchgepumpt und ein Zählen im Bildfeld durchgeführt wurde, wurden jeweils schrittweise beispielsweise 3 µl Volumen aus dem Probengefäß durch die Kapillare durchgepumpt.

Ein selbstentwickeltes Computerprogramm wurde zur Online-Bilddatenanalyse entwickelt, welches in Verbin­ dung mit einer "Frame-Grabber-Card" optische Bilder ana­ lysieren kann. Man kann mit einem solchen optischen Scanning-System pro Minute 15 Abtastungen des Bildfeldes vornehmen und dann jeweils weiteres Volumen aus dem Pro­ begefäß untersuchen, wobei davon ausgegangen wird, daß das Probengefäß homogen mit Zellen beladen ist. Das Ver­ fahren und die Vorrichtung liefern pro Schritt zwei Bil­ der: ein erstes Bild vor dem Einschalten und ein zweites Bild nach dem Einschalten des Magnetfeldes. Die beiden Bilder werden hinsichtlich der erfaßten Positionen mit­ einander verglichen. Der Mittelpunkt jedes gefundenen Zellpaares (z. B. b zu b') wird mit X/Y-Koordinaten er­ rechnet (siehe Fig. 4A und 4B). Aus dieser Information läßt sich eine Aussage ableiten, wie viele magnetische und unmagnetische Zellen in einer Probe prozentual vor­ handen sind.

Durch diese Art der mehrfachen Zählung nähert sich der gezählte Wert dem tatsächlichen Wert sehr schnell an. Insgesamt waren 10⁵ magnetische Erythrozyten in 250 µl physiologisch gepufferter Salzlösung (PBS) aus menschli­ chen Erythrozyten aufbereitet worden (Details der Aufbe­ arbeitung sind zum Beispiel im J. Clin. Lab. Anal. 9, 42-46 (1995) beschrieben). Verfahren und Vorrichtung liefern zuverlässige Meßergebnisse, wenn mehr als 200 Zellen gezählt werden.

Eine andere Online-Bilddatenanalyse verwendet einen op­ tischen Sensor als Abtaster in Verbindung mit einem selbstentwickelten Computer-Programm (siehe Fig. 5A und 5B). Dabei sollen zwei oder mehr lineare CCD-Sensoren je einen Teil des mikroskopischen Feldes abtasten. Die Art der Bildauswertung ist eine durchflußtechnische Bildaus­ wertung. Das Magnetfeld wurde zwischen der ersten und zweiten gebildeten Schranke eingebracht und ständig ein­ geschaltet. Vor der ersten Schranke ist kein Magnetfeld vorhanden. Alle Zellen passieren zuerst die erste Schranke. Sie werden durch lineare CCD-Sensoren abgeta­ stet und im Computer-Programm gezählt. Sobald magneti­ sche Zellen ins Magnetfeld eintreten, werden sie durch den Einfluß des Magnetfeldes angezogen. Unmagnetische Zellen wandern in laminaren Strömungen an der zweiten Schranke weiter, wobei sie gezählt werden. Magnetische und unmagnetische Zellen werden prozentual ermittelt.

In der Tabelle 1 ist das erfindungsgemäße Verfahren in Untergruppen menschlicher Blutlymphozyten getestet wor­ den.

In einer parallelen Untersuchung wurde durch die FACS-Methode eine Kontrollmessung durchgeführt. Wie in der Tabelle ersichtlich, liefern sowohl Immunofluoreszenz, als auch die erfindungsgemäße immunomagnetische Technik Daten, die innerhalb des statistischen Fehlers ver­ gleichbar sind.

In einem weiteren Beispiel, das in der Fig. 7 darge­ stellt wurde, kann auch gezeigt werden, daß die immuno­ magnetischen Techniken im Vergleich mit den immunofluo­ reszenten Techniken in einer heterogenen Zellpopulation überlegen sind. In der beiliegenden Figur wird darge­ stellt, daß Daten, die durch die Fluoreszenz erhalten werden, irreführend sein können, während die Daten, die durch die hier erstmals entwickelten immunomagnetischen Techniken ermittelt werden, den tatsächlichen Prozent­ zahlen entsprechen.

Das biologische Modell bestand hierbei aus HLA-Bw6- Antigen-negativen Zellen großen Durchmessers (K562 Zell­ kultur) und HLA-Bw6-Antigen-positiven Zellen (REH Zell­ kultur) relativ kleinen Durchmessers. Zellen der Leukämie-Zellkulturen, REH- und K562 Zellen, wurden be­ nutzt, um Mixturen herzustellen, die positive und nega­ tive Zellen mit verschiedenen Anteilen (0%, 10%, 20% usw.) enthielten. Magnetische Immunomikrospheres, die mit Anti-Bw6 monoklonalen Antikörpern konjugiert wurden, waren jeder Zellmixtur hinzugesetzt, um Antigen-positive REH Zellen magnetisch zu markieren. In einer vollständig automatisierten Messung wurden dann die dargestellten Meßwerte ermittelt. Zunächst wurden ohne magnetisches Feld Zellen für 30 Szenen gezählt, wobei die Summe der Zahlen der magnetischen und nicht-magnetischen Teilchen im Bildfeld ermittelt wurde. Anschließend wurden im ma­ gnetischen Feld die Zellen, die verblieben waren, im Bildfeld gezählt, um so die Anzahl der nicht-magne­ tischen Zellen zu bestimmen.

Die Daten aus vier verschiedenen Präparationen, die sich durch die Immunofluoreszenz ergeben haben, wurden durch Punkte in Fig. 7A dargestellt, wobei alle Messungen vierfach wiederholt wurden, um die Punkte als Mittelwert zu erhalten.

Tabelle 1

Claims (8)

1. Verfahren zur Zählung mikroskopischer Objekte, gekennzeichnet durch

• - Markieren der mikroskopischen Objekte mit Magnet­ partikeln,
• - Auslenken entstandener Magnetreagenz-Komplexe innerhalb eines Gemenges der Objekte durch ein Magnetfeld, und
• - Beobachten eines Bildfeldes in dem Gemenge der Objekte zur Erfassung der Lage und/oder Zahl der Objekte im Einfluß des Magnetfeldes.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Beobachtung in einem strömenden Medium er­ folgt, wobei ein optischer Abtaster die Gesamtzahl al­ ler Objekte in einem ersten Bildfeld ohne magnetische Beeinflussung bestimmt, und ein zweites Bildfeld der­ art zu einem Magnetfeld angeordnet ist, daß die magne­ tisch beladenen Objekte in einen Strom an dem Bildfeld vorbeigelenkt sind.

3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein einziges Bildfeld dop­ pelt abgetastet wird, einmal ohne Einfluß eines Magnetfeldes und einmal nach/mit Einwirkung eines Magnetfeldes, die erzielten Bilder durch entsprechende Überlagerung verglichen werden, und so nicht­ übereinstimmende Zählobjekte als magnetisch betrachtet werden können.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenvolumen inter­ mittierend im "stop and go"- Verfahren durchgepumpt wird.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mikroskopischen Bild­ felder strichartig durch aus linearen CCD-Sensoren ge­ bildeten Schranken an einer durchströmten Glaskapilla­ re abgetastet werden, mit anhaltendem Einfluß eines Magnetfeldes, wobei die Zahl der Zählobjekte durch Subtrahieren der Zählobjekte erhalten wird, die an der zweiten Schranke gezählt werden, von den Zählobjekten, die an der ersten Schranke gezählt werden.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenvolumen bei einem anhaltenden Magnetfeld während der Messung in einem durchflußtechnischen Verfahren durchgepumpt wird.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Zählung bestimmter mikroskopischer Objekte nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein optisches System zum Beobachten eines Bildfeldes eines Gemenges in einer Glaskapillare (102), einer Einrich­ tung zur Erzeugung eines Magnetfeldes, einer Pumpe zum Bewirken eines Durchflusses, sowie optischen Sensoren zur Beobachtung des Bildfeldes, wobei Magnetpole (100, 101) mit dreieckigem Querschnitt ausgebildet sind, de­ ren eine Längskante sich entlang der Erstreckung der Glaskapillare (102) erstreckt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7 dadurch gekennzeich­ net, daß die Glaskapillare (102) innen mit Dichlordi­ methylsilan behandelt ist.