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Diese Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Abbilden von fluoreszierenden Teilchen, und insbesondere ein
Gefäß zum Aufnehmen
von fluoreszierenden Teilchen wie Leukozyten oder dergleichen, die
mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt sind, um die fluoreszierenden
Teilchen abzubilden.
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Im medizinischen Bereich werden eine
Plättchenpräparation
und eine Erythrozytenpräparation hergestellt
durch Extrahieren von Plättchen
und Erythrozyten aus dem ganzen Blut. Diese Plättchen- und Erythrozytenpräparationen
werden jeweils für
Bluttransfusionen verwendet, und es ist für jede Präparation unerwünscht, dass
diese Leukozyten enthält.
Es ist daher von Bedeutung, wissen zu können, wie viele Leukozyten
die Präparationen
enthalten. Herkömmlicherweise
wird dies bewerkstelligt durch Anordnen einer Probenplättchenpräparation
in einer NAGEOTTE-Kammer, Färben
mit einem fluoreszierenden Farbstoff, Projizieren eines Anregungslichts
auf die Probe und Zählen
der Leukozyten mittels eines Mikroskops. Im Besonderen wird eine
50-Mikroliter-Probe
aus einem 200- oder 400-Milliliter-Beutel einer Plättchenpräparation
entnommen und werden die Leukozyten in der Probe gezählt und
zu einer Leukozytenzählung
für den
ganzen Beutel gewandelt. Dies ist eine ermüdende, ineffiziente und zeitraubende
Aufgabe, die durch Fachpersonal zu erledigen ist.
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Es wurde eine Vorrichtung vorgeschlagen, um
zu ermöglichen,
Leukozyten zu zählen,
stattdessen, durch Färben
der Leukozyten mit einem fluoreszierenden Farbstoff, Beleuchten
der Probe mit einem Anregungslicht mit vorbestimmten Wellenlängen, unter
Verwendung einer CCD-Kamera oder dergleichen zum Abbilden der Probe
und dann Analysieren der Bilder, um eine Zählung der Leukozyten zu erhalten. Die
Lösung,
welche die gefärbten
Leukozyten enthält,
enthält
jedoch auch fluoreszierenden Farbstoff, welcher ebenfalls Fluoreszenzlicht
emittiert. Da nicht lediglich die gefärbten Leukozyten sondern auch
der fluoreszierende Farbstoff selbst durch das Anregungslicht angeregt
wird, gibt es somit einen deutlichen Abfall im Kontrast der Leukozyten,
die man beobachten oder abbilden möchte. In einigen Fällen kann
der Kontrast sich zu dem Punkt verschlechtern, an welchen die Leukozytenbilder
so in den Hintergrund versenkt werden, dass diese nicht herausgegriffen
werden können,
was ein Zählen
der Leukozyten unmöglich
macht.
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US
5242837 beschreibt ein Verfahren und ein Gefäß zur Erfassung
von Analyten unter Verwendung von lichtschwächenden magnetischen Teilchen,
bei welchen markierte Analyte mittels eines Strahls angeregt werden,
der auf eine optisch transparente Oberfläche gerichtet wird. Eine durch
die Anregung erzeugte Signalstrahlung kehrt durch die Oberfläche hindurch
zurück
und wird längs
dergleichen Achse der Anregung durch herkömmliche spektroskopische Mittel
erfasst. Diese Veröffentlichung
offenbart alle Merkmale des Oberbegriffs von Anspruch 1.
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EP 661532 A beschreibt eine transparente Küvette zum
Messen von Bestandteilen durch Anwenden eines Lichtstrahls durch
eine erste flache Oberfläche
der Küvette
hindurch, durch die in der Küvette
enthaltenen Bestandteile hindurch und durch eine gegenüberliegende,
zweite Oberfläche
der Küvette
hindurch, so dass die Messung uniaxial ist.
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EP 671622 A beschreibt ein optisches Messinstrument
und ein Verfahren hierfür,
bei welchem ein Prisma zum Einleiten eines Anregungslichts als ein einheitlicher
Körper
an einem plattenförmigen
Wellenleiter ausgebildet ist und ein Reaktionsgefäß an einer
Seite des Wellenleiters ausgebildet ist. Markierte Antikörper werden
in dem Reaktionsgefäß nahe des
Wellenleiters gehalten und ein Anregungslicht wird in das Prisma
entlang des Wellenleiters gerichtet. Durch die Anregung erzeugte
Signalstrahlung kehrt entlang des Wellenleiters zurück und verlässt das
Prisma zur Messung. Eine ähnliche
Anordnung ist aus
US 5677196 bekannt.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, ein Gefäß zur Aufnahme
von fluoreszierenden Teilchen bereitzustellen, welches es ermöglicht,
dass die fluoreszierenden Teilchen gut abgebildet werden, indem
der Effekt von Hintergrundlicht reduziert wird.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird ein Verfahren zum Abbilden von fluoreszierenden Teilchen bereitgestellt,
die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt sind, wobei die Teilchen
in einem Fluid enthalten sind und das Fluid auch den fluoreszierenden
Farbstoff enthält,
wobei das Verfahren umfasst:
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Anordnen des Fluids in einem Gefäß, und
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Sammeln der fluoreszierenden Teilchen
in einem Bodenabschnitt eines durch das Gefäß eingeschlossenen Volumens,
dadurch gekennzeichnet, dass es ferner umfasst:
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Führen
einer Anregungsstrahlung zum Anregen der fluoreszierenden Teilchen
durch das Gefäß, wobei
von dem durch das Gefäß eingeschlossenen Volumen
die Strahlung in einer Richtung von der Seite des Gefäßes direkt
und nur durch den Bodenabschnitt geführt wird, so dass der fluoreszierende Farbstoff,
der in irgendeinem Teil des Fluids angeordnet ist, der von dem Bodenabschnitt
verschieden ist, nicht wesentlich angeregt wird, und Messen einer Strahlung
von den fluoreszierenden Teilchen von unterhalb des Bodenabschnitts.
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Um die obige Aufgabe zu erfüllen, stellt
die vorliegende Erfindung ein Gefäß zum Abbilden von fluoreszierenden
Teilchen bereit, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt sind
und durch Anregungslicht beleuchtet werden, wobei die fluoreszierenden
Teilchen in einem Bodenabschnitt eines durch das Gefäß eingeschlossenen
Volumens enthalten sind und von unterhalb des Bodenabschnitts abgebildet
werden, wobei ein seitlicher Teil der Außenfläche
des Gefäßes, welche
den Bodenabschnitt einschließt,
als eine Anregungslichteintrittsfläche ausgebildet ist.
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Gemäß dieser Anordnung, da die
fluoreszierenden Teilchen, die das Objekt des Interesses sind, in
dem unteren Teil des Abbildungsgefäßes angesammelt werden, und
der Bodenabschnitt des Gefäßes eine
externe Seitenfläche
aufweist, welche eine Eintrittsfläche für das Anregungslicht ist, wird
lediglich der Bodenabschnitt des Gefäßes durch das Anregungslicht
beleuchtet, so dass Hintergrundlicht reduziert werden kann, wodurch
es ermöglicht
wird, Bilder mit hohem Kontrast der fluoreszierenden Teilchen in
dem Gefäß zu erhalten.
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Hintergrundlicht kann weiter um ein
beträchtliches
Ausmaß reduziert
werden, indem ein Abschirmteil verwendet wird, um Teile des Abbildungsgefäßes abzudecken,
die verschieden von der Nachbarschaft des Bodenabschnitts sind.
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Es ist bevorzugt, den Bodenabschnitt
derart auszubilden, dass dieser einen quadratischen oder rechteckigen
Horizontalquerschnitt besitzt, bei welchem eine Seite eine Anregungslichteintrittsfläche bildet.
Dem Bodenabschnitt kann auch ein Horizontalquerschnitt mit einer
runden Gestalt verliehen werden, wobei eine negative Zylinderlinse
an der Seite angeordnet ist, von welcher der Bodenabschnitt durch
den Anregungsstrahl beleuchtet wird.
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Weitere Merkmale der Erfindung, deren
Wesen und verschiedene Vorteile werden ersichtlicher aus den beigefügten Zeichnungen
und der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung.
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1 ist
ein Blockdiagramm, das die Gesamtgestaltung einer Vorrichtung zum
Abbilden von fluoreszierenden Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung
zeigt.
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2 ist
eine Frontansicht der Vorrichtung, die zum Analysieren und Anzeigen
erhaltener Bilder von fluoreszierenden Teilchen verwendet wird.
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3 ist
eine Darstellung, die eine Anordnung einer Abdeckung veranschaulicht,
die zum Abschirmen des oben Teils des Abbildungsgefäßes verwendet
wird.
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4 ist
eine Darstellung, die eine weitere Anordnung zum Abschirmen des
oberen Teils des Abbildungsgefäßes von
Beleuchtungslicht veranschaulicht.
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5 ist
eine Darstellung eines optischen Systems, welches zur Formung eines
streifenförmigen
Anregungslichtstrahls verwendet wird.
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6 ist
eine Darstellung eines weiteren optischen Systems, welches zur Formung
eines streifenförmigen
Anregungslichtstrahls verwendet wird.
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7 ist
eine Darstellung, welche die Gestaltung von optischen Elementen
zeigt, die zum Formen eines streifenförmigen Anregungslichtstrahls verwendet
werden.
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8a ist
eine perspektivische Außenansicht
des Abbildungsgefäßes.
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8b ist
eine Querschnittsansicht des Gefäßes.
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8c ist
eine untere Ansicht des Gefäßes.
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9 ist
eine Querschnittshorizontalansicht eines Abbildungsgefäßes entsprechend
einer weiteren Gestaltung.
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10 ist
eine Querschnittsansicht eines Abbildungsgefäßes entsprechend einer noch
weiteren Gestaltung.
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Die 1 und 2 zeigen die Anordnung einer ersten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. In diesen Zeichnungen bezeichnet die
Bezugszahl 1 eine Laserlichtquelle, wie beispielsweise
einen YAG-Laser, der einen grünen
Laserstrahl erzeugt. Der Laserstrahl von der Laserlichtquelle 1 trifft
auf, und wird zerstreut durch eine Zerstreuungsplatte 2, die
aus mattem Glas oder einem anderen solchen Teil gebildet ist, welches
zum Zerstreuen von Licht geeignet ist. Das somit zerstreute Licht
wird auf einen Bodenabschnitt 3' eines Abbildungsgefäßes 3 projiziert,
dessen oberer Teil durch einen Deckel 4 abgedeckt ist.
Fluoreszierende Teilchen sammeln sich in dem Bodenabschnitt des
Abbildungsgefäßes 3 an und
diese fluoreszierenden Teilchen fluoreszieren, wenn diese durch
den Laserstrahl beleuchtet werden. Die Bilder der durch den Laserstrahl
beleuchteten fluoreszierenden Teilchen gelangen über ein Abdeckglas 5 und
eine Objektivlinse 6 zu einem Spiegel 7, der die
Bilder zu einem Sperrfilter 8 reflektiert, welches Licht
in einem vorbestimmten Frequenzband transmittiert, und werden dann
durch eine CCD-Kamera 9 aufgenommen.
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Die durch die CCD-Kamera 9 aufgenommenen
Bilder der fluoreszierenden Teilchen werden über eine Signalleitung 10 zu
einer Videoaufnahmeeinrichtung 11 eines Computers 12 geleitet,
wo diese durch eine Bildverarbeitungsschaltung 13 (2) verarbeitet werden um
zu ermöglichen,
dass die fluoreszierenden Teilchen erkannt werden. An der Stelle, an
der sich ein fluoreszierendes Teilchen befindet, gibt es eine Veränderung
in der Helligkeit, so dass die fluoreszierenden Teilchen, beispielsweise
unter Verwendung der Differenziation der Signalwerte, erkannt werden
können,
um die Positionskoordinaten der Teilchen zu erfassen. Die somit
erkannten fluoreszierenden Teilchen werden auf einem Monitor 14 angezeigt. 2 zeigt das Bild 15 des
Bodenabschnitts des Gefäßes zusammen
mit einer Mehrzahl von darin befindlichen fluoreszierenden Teilchen 15a,
angezeigt auf dem Monitor 14. Die fluoreszierenden Teilchen 15a werden
gezählt
und die Zählung
wird auch im unteren Teil 16 des Monitors 14 angezeigt.
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Das Abbildungsgefäß 3 ist in einem Stück geformt
aus transparentem Polystyrolharz, Glas oder Acrylharz, bevorzugt
Polystyrolharz. In das Abbildungsgefäß 3 eingesetzt sind
eine Plättchenpräparationsprobe
(z. B. 100 Mikroliter), eine Chemikalie (Triton X), welche Plättchen-
und Leukozyten-Zytoplasma
auflöst,
und ein fluoreszierender Farbstoff (Propidium Iodide) zum Anfärben des
Leukozytenkerns. Das Abbildungsgefäß 3 wird dann einer
Zentrifugalseparation in einer Zentrifuge (nicht gezeigt) unterzogen,
was ein Ansammeln der Leukozytenkerne im unteren Abschnitt des Abbildungsgefäßes 3 bewirkt. Sämtliche
der Leukozytenkerne können
in dem Bodenabschnitt 3' des
Abbildungsgefäßes 3 durch
Anwenden einer vorbestimmten Zentrifugalkraft gesammelt werden.
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Der Deckel 4 wird dann dazu
verwendet, das Abbildungsgefäß 3 abzudecken,
in welchem die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbten Leukozytenkerne
im Bodenabschnitt 3' davon
gesammelt werden, und das Abbildungsgefäß 3 wird an der Abbildungsvorrichtung
angebracht. Zum Abbilden wird die Laserlichtquelle 1 aktiviert,
was einen Laserstrahl erzeugt, der durch die Zerstreuungsplatte 2 zerstreut wird
und auf den Bodenabschnitt 3' des
Abbildungsgefäßes 3 projiziert
wird. Da die Kerne der Leukozyten im Bodenabschnitt 3' des Abbildungsgefäßes 3 mit
einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt wurden, emittieren diese,
wenn sie durch den Strahl des Anregungslichtes beleuchtet werden,
Fluoreszenzlicht mit einer Frequenz von ungefähr 600 nm. Dies wird über das
Abdeckglas 5, die Objektivlinse 6, den Spiegel 7 und
das Sperrfilter 8 unterhalb des Abbildungsgefäßes 3 aufgenommen.
Das Sperrfilter 8 transmittiert lediglich Licht mit der
Frequenz des Fluoreszenzlichts, was ein Abblocken von Licht von
schädlichen Frequenzen
an dieser Stelle erlaubt.
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Der Laserstrahl wird nur auf den
Bodenabschnitt des Gefäßes projiziert,
was die dort gesammelten Leukozyten effektiv beleuchtet. Deshalb, selbst
wenn es in der Lösung
strömenden
fluoreszierenden Farbstoff in dem Abbildungsgefäß 3 gibt, ist es möglich, zu
verhindern, dass der fluoreszierende Farbstoff schädliches
Hintergrundlicht bildet, was es erlaubt, die Bilder mit verbessertem
Kontrast zu erhalten.
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Bezug nehmend auf 2 werden die somit durch die CCD-Kamera 9 erhaltenen
Bilder von fluoreszierenden Teilchen über eine Signalleitung 10 zu einer
Videoaufnahmeeinrichtung 11 eines Computers 12 geleitet,
wo diese durch eine Bildverarbeitungsschaltung 13 für eine Zählung der
Anzahl von Leukozyten 15a verarbeitet werden.
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Gemäß der oben beschriebenen Anordnung wird
der Laserstrahl lediglich auf den Bodenabschnitt des Abbildungsgefäßes projiziert
und beleuchtet nicht den oberen Teil des Gefäßes. Wie es in 3 gezeigt ist, kann der Effekt des Umstands,
dass lediglich der Bodenabschnitt beleuchtet wird, verstärkt werden,
indem eine Abdeckung 20 vorgesehen wird, welche alle Teile
von dem beleuchtenden Lichtstrahl abschirmt, die verschieden von
dem Bodenabschnitt sind.
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Anstelle der Abdeckungsanordnung
von 3 kann eine Anordnung
wie die in 4 gezeigte verwendet
werden. Bei dieser Anordnung wird eine Maske 21 mit einer
zentralen schlitzförmigen Öffnung 21a verwendet.
Der Laserstrahl von der Laserlichtquelle 1 passiert durch
die Öffnung 21a hindurch, was
es gewährleistet,
dass lediglich der Bodenabschnitt 3' des Abbildungsgefäßes 3 beleuchtet
wird.
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Ein linearer oder linienförmiger Lichtstrahl würde mehr
von dem Bodenabschnitt des Abbildungsgefäßes beleuchten als ein punktförmiger Strahl. 5 zeigt die Art von Anordnung,
die in einem solchen Fall verwendet werden könnte, wobei ein Laserstrahl 30 zu
einem flachen Strahl 33 geformt wird durch eine Passage
durch Zylinderlinsen 31 und 32 hindurch, und wobei
der flache Strahl 33 zum Beleuchten des Bodenabschnitts 3' des Abbildungsgefäßes 3 verwendet
wird.
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6 zeigt
eine weitere Anordnung, bei welcher ein Abtastspiegel 40 zum
Ablenken des Laserstrahls 30 verwendet wird, der durch
eine Linse 41 hindurch passiert, um den Bodenabschnitt
des Abbildungsgefäßes abzutasten.
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7 zeigt
eine weitere Anordnung, welche ein Bündel von optischen Fasern verwendet.
Bei dieser Anordnung sind die Fasern am Eintrittsende 50, von
welchem aus der Laserstrahl eintritt, in einer runden Konfiguration
angeordnet, wohingegen am Austrittsende 51 die Fasern in
einer geraden Linie angeordnet sind, wobei das Austrittsende 51 in
der Nähe des
Bodenabschnitts des Abbildungsgefäßes angeordnet ist, um dessen
Bodenabschnitt zu beleuchten.
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Bei jeder dieser Ausführungsformen
wird lediglich der Bodenabschnitt des Gefäßes, oder die Nachbarschaft
desselben, durch einen streifenförmigen
Strahl beleuchtet, was es ermöglicht,
Bilder der fluoreszierenden Teilchen mit einem guten Kontrast zu
erhalten. Außerdem,
falls eine Zerstreuungsplatte 2 zum Zerstreuen des Laserstrahls
eingesetzt wird, ermöglicht
dies eine gleichmäßige Beleuchtung
des Bodenabschnitts des Abbildungsgefäßes.
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8 zeigt
eine bevorzugte Ausführungsform
des Abbildungsgefäßes 3,
welches bevorzugt als ein einstückiges
Formteil aus Polystyrolharz ausgebildet ist. Das Gefäß besitzt
einen ringförmigen oberen
Abschnitt 3a mit einer Kerbe 3f zu Positionierzwecken.
Das Abbildungsgefäß 3 umfasst
einen zylindrischen Abschnitt 3b, welcher sich von dem oberen
Abschnitt 3a über
einen Neigungsabschnitt 3c vertikal nach unten zu einem
Abschnitt 3d mit kleinem Durchmesser erstreckt. Ein im
Wesentlichen quadratischer oder rechteckiger Blockabschnitt 3e ist an
dem unteren Ende Ausgebildet. Eine Seite des Blockabschnitts 3e ist
für eine
Beleuchtung durch einen Laserstrahl, gekennzeichnet durch einen
Pfeil, angeordnet. Wenn fluoreszierende Teilchen abzubilden sind,
wird das Abbildungsgefäß 3 an
der Vorrichtung angefügt,
wobei die Kerbe 3f dazu verwendet wird, das Abbildungsgefäß 3 zu
positionieren. Wenn das Gefäß 3 passend
in seine Position gebracht wurde, ist eine flache Fläche des
Blockabschnitts 3e orthogonal zur Richtung der Laserstrahlbeleuchtung und
bildet die Eintrittsoberfläche
für den
einfallenden Strahl. Somit beleuchtet der Laserstrahl lediglich
den Bodenabschnitt 3g des Abbildungsgefäßes 3.
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Der Bodenabschnitt kann auch durch
eine Anordnung wie die in 9 gezeigte
beleuchtet werden, bei welcher der Blockabschnitt 3e einen
runden Querschnitt besitzt und eine negative Zylinderlinse 60 an
der Seite angeordnet ist, von welcher der Bodenabschnitt durch den
Anregungsstrahl beleuchtet wird.
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Bei der in 10 gezeigten Anordnung wird eine Abdeckung 70 dazu
verwendet, Teile des Abbildungsgefäßes 3 von dem Laserstrahl
abzuschirmen, die verschieden von dem Bodenabschnitt sind. In diesem
Fall kann die Abdeckung 20, die in 3 gezeigt ist, weggelassen werden. Die
Abdeck- oder Abschirmfunktion kann realisiert werden durch Aufbringen
einer Lichtabschirmbeschichtung an dem Gefäß oder durch einen Anstrich
des Gefäßes mit
einer abschirmenden Farbe.
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Wenngleich bevorstehend die Erfindung
mit Bezug auf Leukozyten als die fluoreszierenden Teilchen beschrieben
wurde, so ist es verständlich,
dass die Erfindung nicht darauf eingeschränkt ist sondern für andere
fluoreszierende Teilchen eingesetzt werden kann.
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Wie es vorstehend beschrieben wurde,
werden gemäß der vorliegenden
Erfindung abzubildende fluoreszierende Teilchen in dem Bodenabschnitt
des Abbildungsgefäßes gesammelt.
Ein Teil der Außenoberfläche des
Bodenabschnitts ist eine Anregungslichteintrittsfläche, so
dass lediglich der Bodenabschnitt des Gefäßes durch den Anregungslichtstrahl beleuchtet
wird. Hintergrundlicht wird dadurch reduziert, was es ermöglicht,
Bilder der in dem Gefäß enthaltenen
fluoreszierenden Teilchen mit hohem Kontrast zu erhalten.