HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft Färbemittel zur biologischen Färbung von
roten Blutzellen, weißen Blutzellen, epithelialen Zellen oder dergleichen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Färbemittel für Bioproben, wie Harn, der
extrazelluläre greifbare Komponenten wie Kristalle oder Auswürfe bzw.
abgestoßene Haut enthält; diese Komponenten sind von Farbstoffausfällungen,
abgeschiedenen oder koagulierten Harnkomponenten, Verunreinigungen, wie Stäuben,
etc., die in der gleichen biologischen Probe zusätzlich zu den zuvor genannten
zellulären Komponenten enthalten sein können, schwer unterscheidbar. Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung derartiger
Färbemittel und deren Verwendung.
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Die nachstehende Beschreibung beschreibt weiterhin eine Apparatur zur Partikel-
Bildanalyse, in der Bilder von in strömenden Fluiden suspendierten Partikeln
fotografiert werden und die Bilder der Partikel analysiert werden, und insbesondere
eine Apparatur zur Analyse von Partikelbildern, die dazu geeignet ist, die Art von
Zellen oder Partikeln in Blut oder Harn oder Kulturzellen etc. und den
Lebenszustand oder Tod dieser Zellen zu erkennen.
Beschreibung der verwandten Technik
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Zur Klassifizierung und Analyse von Zellen in Blut oder von Zellen und Partikeln
in Harn, die im Stand der Technik eingesetzt worden sind, wird eine Probe auf ein
Objektglas gebracht und mikroskopisch beobachtet. Im Falle von Harn mit einer
niedrigen Partikeldichte darin wird eine Harnprobe zuvor mit einer Zentrifuge
zentrifugiert und die auf diese Weise aufkonzentrierte Probe wird mikroskopisch
beobachtet. Diese Arbeitsvorgänge zur Beobachtung und Prüfung sind unter
Verwendung einer Apparatur automatisiert worden durch die Schritte des
Aufbringens einer Probe, wie Blut, auf ein Objektglas, des Setzens des Objektglases in ein
Mikroskop, des automatischen Scannens einer Mikroskoptisches, um ihn bei der
Position anzuhalten, bei der Partikel vorliegen, des Aufnehmens von unbewegten
Bildern der Partikel und des Klassifizierens der Partikel in der Probe unter
Verwendung charakteristischer Extraktions- und Bilderkennungstechniken durch
Bildverarbeitung. Jedoch bringt ein solches Verfahren die Probleme mit sich, daß
es zur Herstellung einer Probe dauert und darüber hinaus zusätzliche
Arbeitsvorgänge zur Lokalisierung der Partikel erforderlich sind, während der
Mikroskoptisch mechanisch bewegt wird und die Partikel auf eine geeignete Zone zur
Bildeingabe übertragen werden. Somit wird die Zeitdauer zur Analyse verlängert
und der Mechanismus der Apparatur wird kompliziert.
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Die Fließcytometrie zur optischen Analyse eines in einer Fluidprobe
suspendierten Analyten, während die Probe in einer Durchflußzelle fließt, ist bekannt. Bei
der Fließcytometrie ist es nicht erforderlich, irgendeinen Abstrich herzustellen
und statt dessen wird die Fluoreszenz- oder Streuintensität jedes Partikels in einer
Probe bestimmt. Ein Fließcytometer hat die Fähigkeit, 1000 Partikel pro Sekunde
zu verarbeiten. Jedoch ist es noch schwierig, Informationen zu erhalten, die das
morphologische Verhalten von Partikeln widerspiegeln. Die Fließcytometrie ist
somit nicht in der Lage, Partikel durch ihr morphologisches Verhalten zu
klassifizieren, wie es bis jetzt wirksam mit mikroskopischer Beobachtung erfolgte.
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Es wurde der Versuch unternommen, eine Fotografie von Partikelbildern in einer
kontinuierlich strömenden Probe aufzunehmen und zu analysieren und die
Partikel anhand der jeweiligen Partikelbilder zu klassifizieren, vergleiche japanische
Patentanmeldung KOHYO SP-A-57-500995 und japanische Patentanmeldung
KOKAI (offengelegt) JP-A-63-94156.
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Die japanische Patentanmeldung KOHYO JP-A-57-500995 offenbart ein
Verfahren zur Partikelanalyse, das folgende Schritte umfaßt: das Passieren einer Probe
durch einen Pfad mit einer speziellen Form, das Strömen der Partikel in der Probe
dort in einer breiten Zone zum Fotografieren, das Aufnehmen eines Bildes von
unbewegten Bildern durch eine Blitzlampe und das Analysieren der Bilder.
Gemäß dem Verfahren emittiert die Blitzlampe, bei der es sich um eine
Pulslichtquelle handelt, periodisch Licht durch Synchronisieren mit einer CCD-Kamera
und vergrößerte Bilder von Probenpartikeln werden auf die CCD-Kamera unter
Verwendung eines Mikroskops projiziert. Die Emissionszeit der Pulslichtquelle
ist kurz, so daß unbewegte Bilder erhalten werden können, selbst wenn die
Partikel kontinuierlich fließen. Darüber hinaus können 30 Blätter/s unbewegte Bilder
mit einer CCD-Kamera fotografiert werden.
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Die japanische Patentanmeldung KOKAI JP-A-63-94156 offenbart ein Verfahren,
das folgende Schritte umfaßt: Bereitstellen eines Partikel erfassenden optischen
Systems, das anders ist als ein System, das ein unbewegtes Bild fotografiert,
stromaufwärts einer Zone zum Fotografieren von Partikelbildern in einer
Strömung der Probe, vorheriges Erfassen der passierenden Partikel an der
Partikelerfassungszone und Aufblitzen einer Lampe mit einer zweckmäßigen Zeitsteuerung,
wenn die Partikel die Zone zum Fotografieren der Partikelbilder erreichen. Gemäß
diesem Verfahren können die passierenden Partikel ohne periodische Emission
einer Pulslichtquelle erfaßt werden und unbewegte Bilder können nur fotografiert
werden, wenn die Partikel die Fotografierzone erreichen. Dem gemäß können
Partikelbilder wirksam erhalten werden. Selbst wenn eine Probe eine niedrige
Konzentration aufweist, besteht keine Chance, bedeutungslose Bilder zu
verarbeiten, auf denen keine Partikel vorliegen.
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Andererseits ist, wenn Harnsedimente in Harn analysiert werden, eine
mikroskopische Beobachtung ohne Einsatz irgendeiner Färbelösung üblich; nur wo es
schwierig ist, einen Analyten zu unterscheiden, wird ein Färbemittel für
Harnsedimente eingesetzt. Bezüglich dieser Technik wird Bezug genommen auf z. B.
"KENSA-TO-GIJUTSU", Igaku Shoin Publishing Co., vol. 10, No. 9 (1982 : 9),
846-850 und die japanische Patentanmeldung KOKAI JP-A-5-40118.
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Wie in den vorstehenden Veröffentlichungen aufgelistet, umfassen herkömmliche
Färbemittel für Harnsedimente das Sternheimer-Färbemittel, das
Neu-Sternheimer-Färbemittel, das Sternheimer-Malbin-Färbemittel, etc.
Das Sternheimer-Färbemittel besteht aus Lösung I: 2%iger wäßriger National-
Echtblau-Lösung und Lösung II: 1,5%iger wäßriger Pyronin B-Lösung. Zur
Herstellung des Färbemittels wurde Lösung I mit Lösung II im Verhältnis 1 : 1
vermischt.
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Das Neu-Sternheimer-Färbemittel besteht aus Lösung I: 2%iger wäßriger Alcian-
Blaulösung und Lösung II: 1,5%iger wäßriger Pyronin B-Lösung. Zur Herstellung
des Färbemittels wurde Lösung I mit Lösung II im Verhältnis 2 : 1 vermischt.
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Das Sternheimer-Malbin-Färbemittel besteht aus Lösung I, die durch Lösen von
3,0 g Kristall-Violett in 20,0 ml 95%igem Ethanol, Zugeben von 0,8 g
Ammoniumoxalat zu der Lösung und Verdünnen des Gemisches mit 80,0 ml gereinigtem
Wasser erhalten wird, und Lösung II, die durch Lösen von 0,25 g Safranin O in
10,0 ml 95%igem Ethanol und Verdünnen der Lösung mit 100,0 ml gereinigtem
Wasser erhalten wird. Zur Herstellung des Färbemittels wurde Lösung I mit
Lösung II im Verhältnis 3 : 97 vermischt.
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Bei der Fließcytometrie, bei der Harnsedimente in kontinuierlich strömendem
Harn fotografiert werden und die Sedimente analysiert und anhand der jeweiligen
Bilder der Sedimente klassifiziert werden, hängt eine Verbesserung bei der
Bildverarbeitungswirksamkeit vom Ausschneiden der zu analysierenden Bilder, der
Extraktion von charakteristischen Parametern, wie Farbe, Form, Größe, etc. ab. Es
ist somit unbedingt erforderlich, den Analyten zur Verbesserung der
Bildverarbeitungswirksamkeit zu färben.
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Das Färben von Harnsedimenten unter Verwendung eines herkömmlichen
Sternheimer-Färbemittels und eines Neu-Sternheimer-Färbemittels ist ein äußerst
nützliches Verfahren zur Supravitalfärbung, die bei der visuellen Erkennung von
Sedimentkomponenten in Harn ausgezeichnet ist.
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Jedoch bestehen diese Färbemittel aus polaren Molekülen, in denen Ladungen in
den konstituierenden Farbstoffmolekülen lokalisiert sind. Als Ergebnis davon
wird, wenn Färbemittel mit Harn vermischt werden, eine Agglutination von
Proteinen, Zuckern, Glykoproteinen, etc., die im Harn gelöst sind, unter Bildung der
Agglutinationsprodukte verursacht. Aus diesem Grund stören bei dem Versuch,
Partikelbildern von mit diesen Färbemitteln gefärbten Harnnsedimenten zu
fotografieren, die Agglutinationsprodukte als Verunreinigungen, um die
Nachweiswirksamkeit von Harnsedimenten ernstlich zu verringern oder ein Verklumpen des
Strömungspfades zu verursachen. Darüber hinaus kann, in Abhängigkeit von den
Agglutinationsprodukten, deren Form als Auswürfe falsch gelesen werden; oder,
wo Zellen, Auswürfe oder Blutzellen in einer Agglutinationsmasse versteckt sind,
können diese Komponenten übersehen werden. Zusätzlich involviert die
Fließcytometrie das Problem, daß eine Hämolyse zu einer ungenauen Zählung der
roten Blutzellen führt. Weiterhin können die Agglutinationsprodukte, die verworfen
werden sollten, ebenfalls in einem Schritt der Bildverarbeitung markiert werden,
so daß die Geschwindigkeit für die Klassifizierungsverarbeitung abnimmt oder
die Bildspeicherkapazität nicht mehr ausreichend ist.
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Andererseits ist das Färben von Harnsedimenten unter Verwendung des
Sternheimer-Malbin-Färbemittels bei der visuellen Erkennung von unterscheidbaren
Komponenten im Hain dem vorstehend genannten Färben unterlegen. Darüber
hinaus werden manchmal Tyrosin-ähnliche Nadeln gebildet und können als von
Hain abgeleitete Kristalle falsch gelesen werden. Weiterhin involviert das
Sternheimer-Malbin-Färbemittel das ernsthafte Problem, daß die Zählung von roten
Blutzellen aufgrund der durch das Färbemittel verursachten Hämolyse ungenau
wird, wie bei dem vorstehend beschriebenen Färben.
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Wie oben festgestellt wurde, konnten die herkömmlichen Färbemittel keine
zufriedenstellenden Ergebnisse in einer Apparatur zur Bildanalyse von gefärbten
Partikeln bzw. Färbepartikeln vom Fließtyp, bei der eine Analytenkomponente in
einer kontinuierlich strömenden Probe fotografiert wird, um eine Bildanalyse
durchzuführen, liefern.
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US-A-3 961 039 offenbart ein Färbemittel für unfixiertes, feuchtes Harnsediment
und zelluläre Elemente von serösen Effusionen, das eine wäßrige Lösung mit
einem pH-Wert von 2 bis 5 enthält, die in Kombination einen Kupfer-
Phthalocyanin-Farbstoff und einen roten Xanthenfarbstoff in einem definierten
Gewichtsverhältnis einschließt. In der EP-A-0 556 971 wird eine Apparatur zur
Untersuchung von Partikeln in einem Fluid, z. B. Harnsedimenten in Harn,
beschrieben, die eine definierte Führungseinrichtung, einen definierten
Teilchendetektor, eine definierte Bildeinrichtung und Analyseeinrichtung umfaßt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Lösung der
vorhergehenden technischen Probleme und der Bereitstellung eines Färbemittels mit Vorteilen,
das keine Agglutination von Farbstoffen in dem Mittel verursacht, keine
Koaggulation der Proteine, Zucker, Glykoproteine, etc., die in Hain gelöst sind,
verur
sacht, keine Hämolyse verursacht, jedoch bei der visuellen Erkennung von
unterscheidbaren Komponenten in Harn ausgezeichnet ist, eine genaue Zählung von
roten Blutzellen ermöglicht und ebenso für die Bildverarbeitung geeignet ist.
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Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein Färbemittel zum Färben einer
biologischen Probe, wie in Anspruch 1 definiert.
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Weiterhin wird auch eine Apparatur zur Bildanalyse von gefärbten Partikeln bzw.
Farbpartikeln bzw. Färbepartikeln vom Fließtyp beschrieben, die aufweist: eine
Durchflußzelle zum Strömen von in einer Fluidprobe suspendierten Partikeln, eine
Einrichtung zum Erfassen der Partikel, die durch eine Zone zum Erfassen der
Partikel in der Durchflußzelle strömen, eine Einrichtung zum Fotografieren eines
unbewegten Bildes der erfaßten Partikel in der Durchflußzelle, die durch die
Fotografierzone strömen, und eine Einrichtung zur Bildverarbeitung des
Teilchenbildes, das zur morphologischen Klassifizierung fotografiert wurde, wobei die
Apparatur weiterhin einen Färbemechanismus aufweist, der ein Färbemittel zum
Färben der Partikel, eine Flasche für das Färbemittel, einen Mechanismus für das
Zuführen des Färbemittels und ein Färbemittelgefäß umfaßt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 zeigt ein Diagramm, das die relativen Farbschattierungen von Zytoplasma
und die relativen Farbschattierungen eines Zellkerns zeigt.
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Fig. 2 zeigt ein Diagramm, das die Beziehung zwischen gefärbtem Harn und
Agglutinationsprodukten in dem Harn zeigt.
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Fig. 3 zeigt ein Diagramm, das die Beziehung zwischen jedem Färbemittel und
einer lebensfähigen Rate von roten Blutzellen zeigt.
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Fig. 4 zeigt ein Diagramm, das eine lebensfähige Rate von roten Blutzellen bei
Zugabe eines Fixiermittels zu Phloxin zeigt.
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Fig. 5 zeigt ein Diagramm, das die relativen Flächen der erhaltenen Bilder und die
relativen Farbschattierungen der Bilder zeigt.
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Fig. 6 zeigt die gesamte Apparatur zur Bildanalyse von gefärbten Partikeln vom
Fließtyp.
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Fig. 7 ist eine perspektivische Ansicht, die den Aufbau einer Durchflußzelle zeigt.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
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Das Färbemittel der vorliegenden Erfindung, wie in Anspruch 1 definiert, enthält
Farbstoffe zum Färben von Zellen und Geweben, einen pH-Puffer und einen
Stabilisator. Die Farbstoffe zum Färben von Zellen und Geweben umfassen eine
Vielzahl von nichtpolaren molekularen Farbstoffen zum Färben. Selbst wenn
diese Farbstoffe vermischt werden, reagieren die Farbstoffe nicht miteinander,
verursachen keine Agglutination oder Sedimentation, fällen in der biologischen Probe
gelöste Zucker, Proteine oder Glykoproteine nicht aus oder agglutinieren sie nicht
und können im Fall einer Vielzahl von zu färbenden Objekten in
unterschiedlichem Ausmaß in der Farbschattierung oder in der Färbeintensität in Abhängigkeit
von den jeweiligen Objekten färben, und die im Falle des gleichen Objekts zum
Färben die jeweiligen Komponenten, die das Objekt bilden, in unterschiedlichem
Ausmaß in der Farbschattierung oder in der Färbeintensität färben können.
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Die Apparatur zur Bildanalyse dient zur Durchführung einer morphologischen
Klassifizierung von Partikeln, indem in einer Fluidprobe suspendierte Partikel in
eine Durchflußzelle strömen, die Partikel, die durch eine Zone zum Erfassen der
Partikel in der Durchflußzelle strömen, erfaßt werden, ein unbewegtes Bild der
erfaßten Partikel in der Durchflußzelle, die durch die Fotografierzone strömten,
fotografiert wird und das fotografierte Partikelbild analysiert wird.
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Bei den Farbstoffen zum Färben handelt es sich um Azofarbstoffe und
Xanthenfarbstoffe, verwendet für Supravitalfärbung, wobei entweder der Azofarbstoff
Evans-Blau ist und der Xanthenfarbstoff aus Erythrosin, Phloxin und Eosin
ausgewählt ist oder der Azofarbstoff Trypan-Blau ist und der Xanthenfarbstoff
Erythrosin ist.
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Bei dem pH-Puffer handelt es sich vorzugsweise um einen Phosphatpuffer, einen
Succinatpuffer oder einen Tris-Säure-Puffer.
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Das Färbemittel der vorliegenden Erfindung kann einen Stabilisator enthalten. Bei
dem Stabilisator handelt es sich vorzugsweise um ein antibakterielles Mittel. Als
antibakterielles Mittel ist Natriumazid, para-Hydroxyphenylessigsäure,
Dehydroessigsäure oder Ethylendiamintetraessigsäure bevorzugt.
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Das Färbemittel der vorliegenden Erfindung wird wie folgt hergestellt. Ein
Volumen von etwa 0,2 bis 10,0 · 10&supmin;² Mol/l Evans-Blau oder Trypan-Blau wird mit
etwa 0,5 bis 2,0 Volumen von etwa 0,2 bis 10,0 · 10&supmin;² Mol/l Erythrosin vermischt.
Bei dieser Stufe ist es bevorzugt, den pH-Wert auf 5,7 bis 7,9 unter Verwendung
von 1/30 bis 1/5 Mol/l eines Phosphatpuffers, eines Succinatpuffers oder eines
Tris-Säure-Puffers als Lösungsmittel einzustellen. Natriumazid, para-
Hydroxyphenylessigsäure, Dehydroessigsäure oder Ethylendiamintetraessigsäure
können dem Lösungsgemisch aus Evans-Blau oder Trypan-Blau und Erythrosin in
einer Konzentration von etwa 0,01 bis 1,0% zugefügt werden.
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Wo Phloxin, das das Objekt färbt und gleichzeitig das Objekt zerstört, als der
Xanthenfarbstoff ausgewählt wird, wird ein Fixiermittel dem Färbemittel
einverleibt, so daß das Objekt ohne Zerstörung gefärbt werden kann. Ein derartiges
Färbemittel kann wie folgt hergestellt werden. Das heißt, ein Volumen von etwa 0,2
bis 10,0 · 102 Mol/l Evans-Blau wird mit etwa 0,5 bis 2,0 Volumina von etwa 0,2
bis 10,0 · 10&supmin;² Mol/l Phloxin vermischt. Dann kann Natriumazid, para-
Hydroxyphenylessigsäure, Dehydroessigsäure oder Ethylendiamintetraessigsäure
wahlweise dem Lösungsgemisch in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 1,0%
zugefügt werden. So dann wird der pH-Wert auf 5,7 bis 7,9 unter Verwendung
von 1/30 bis 1/5 Mol/l eines Phosphatpuffers, eines Succinatpuffers oder eines
Tris-Säure-Puffers als Lösungsmittel eingestellt. Schließlich wird Glutaraldehyd,
Formaldehyd oder Paraformaldehyd als Fixiermittel dem Gemisch in einer
Konzentration von 0,02 bis 5,0% zugefügt.
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Wo Eosin, das eine niedrige Färbespezifität aufweist, als der Xanthenfarbstoff
ausgewählt wird, werden ein oberflächenaktives Mittel und ein Fixiermittel dem
Färbemittel einverleibt, so daß ein nichtgleichmäßiges Färben verhindert werden
kann und das Objekt ohne Zerstörung des Objekts gefärbt werden kann. Ein
derartiges Färbemittel kann wie folgt hergestellt werden. Ein Volumen von etwa 0,2
bis 10,0 · 102 Mol/l Evans-Blau wird mit etwa 0,5 bis 2,0 Volumina von etwa 0,2
bis 10,0 · 102 Mol/l Eosin vermischt. Dann können Natriumazid, para-
Hydroxyphenylessigsäure, Dehydroessigsäure oder Ethylendiamintetraessigsäure
wahlweise dem Lösungsgemisch in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 1,0%
zugefügt werden. Daraufhin wird der pH-Wert auf einen Bereich von 5,7 bis 7,9
unter Verwendung von 1/30 bis 1/5 Mol/l eines Phosphatpuffers, eines
Succinatpuffers oder eines Tris-Säure-Puffers als Lösungsmittel eingestellt. Schließlich
werden Glutaraldehyd, Formaldehyd oder Paraformaldehyd als Fixiermittel und
Natriumdodecylsulfat als oberflächenaktives Mittel dem Gemisch in einer
Konzentration von 0,02 bis 5,0% bzw. in einer Konzentration von 0,01 bis 0,5%
zugefügt.
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Bei den Objekten zum Färben in einer biologischen Probe handelt es sich
vorzugsweise um unterscheidbare Komponenten in Harnsedimenten oder in Blut,
Zellen oder Kulturzellkomponenten.
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Die Zusammensetzung des Färbemittels zum Färben von Harnsedimenten gemäß
der vorliegenden Erfindung wurde wie folgt bestimmt. Das Färbemittel wurde wie
folgt hergestellt.
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Etwa 40 Farbstoffe mit einer Struktur, bei der die Ladungen Lösungsmittels nicht
als in dem Molekül lokalisiert angesehen werden, werden aus den zum Färben
von Zellen und Gewebe verwendeten Farbstoffen ausgewählt, wie
Azinfarbstoffen, Xanthenfarbstoffen, Azofarbstoffen, Thiadiazinfarbstoffen,
Triphenylmethanfarbstoffen, etc. Nachdem 200 ul Harn, die von einem gesunden Spender
gesammelt wurden, 80 ul einer in einer Konzentration von 6,3 · 10&supmin;³ Mol/l hergestellten
Färbelösung zugefügt worden waren, wurde eine mikroskopische Beobachtung
durchgeführt, um zu untersuchen, ob eine Agglutination von Proteinen, Zuckern,
Glykoproteinen oder dergleichen, die in dem Harn gelöst waren, stattfindet. Als
Ergebnis wurden 13 Farbstoffe (6 rote Farbstoffe und 7 blaue Farbstoffe), die in
Tabelle 1 gezeigt sind, als Farbstoffe gefunden, die keine Agglutination
verursachen. Tabelle 1 zeigt eine Liste der Farbstoffe, die keine Agglutination der in dem
Harn gelösten Stoffe verursachen, als Ergebnis von Zell- und Gewebefärbetests.
In Tabelle 1 ist die Color Index Nummer (Farbindexnummer) als C. LNr.
abgekürzt.
Tabelle 1
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Als nächstes wurde gemäß der in Tabelle 2 gezeigten Matrix eine mikroskopische
Beobachtung durchgeführt, um zu sehen, ob aufgrund einer Agglutination von
roten Farbstoffen in Kombination mit blauen Farbstoffen Sedimente gebildet
werden. Färbelösungen, von denen jede in einer Konzentration von 6,3 · 10&supmin;³ Mol/l
hergestellt wurde, wurden mit 50 ul von jeder vermischt. Auf diese Weise wurde
bestätigt, daß 25 Kombinationen der mit O oder gezeigten Farbstoffe keine den
Farbstoffen inhärenten Sedimente oder Kristalle bildeten. Tabelle 2 zeigt die
Ergebnisse davon, ob Ausfällungen bei der Kombination von Farbstoffen gebildet
wurden oder nicht, wobei die Symbole anzeigen:
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x Ausfällungen wurden gebildet
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O Keine Ausfällungen wurden gebildet
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Keine Ausfällungen wurden gebildet und die Zellfärbung war gut
Tabelle 2
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Um einige Kombinationen mit einer guten Färbung aus den obigen 25
Kombinationen zu erhalten, wurden 80 ul einer Färbelösung mit 200 ul Harn von einem
gesunden Spender vermischt, um zu sehen, ob der Zellkern und das Zytoplasma
der epithelialen Zellen deutlich bzw. verschieden gefärbt wurden. Als Ergebnis
wurde eine gute Färbung bei den vier Kombinationen erhalten, die mit dem
Symbol in Tabelle 2 oben gezeigt sind. Fig. 1 zeigt ein Diagramm, das die relativen
Farbschattierungen des Zytoplasmas und die relativen Farbschattierungen des
Zellkerns zeigt in Fig. 1 ist das Verhältnis des Peaks von Evans-Blau zu dem
Peak von Erythrosin gezeigt, indem die Farbschattierung des Zellkerns und des
Zytoplasmas von epithelialen Zellen mit einem Mikroskopspektrometer mit etwa
2 um eines Beleuchtungspunkts gemessen wurde, wenn mit der Kombination von
Evans-Blau und Erythrosin gefärbt wurde. Der Test bestätigte, daß das
Färbemittel der vorliegenden Erfindung den Zellkern blau und das Zytoplasma rot färbt.
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Wenn Trypan-Blau an Stelle von Evans-Blau verwendet wird, werden ähnliche
Ergebnisse erhalten.
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Zwei Kombinationen von Evans-Blau und Erythrosin und von Evans-Blau und
Phloxin wurden aus den vier Farbstoffkombinationen ausgewählt, die eine gute
Färbeeigenschaft zeigten und mit dem Neu-Sternheimer-Färbemittel und dem
Steruheimer-Malbin-Färbemittel bezüglich der Koagulation von Stoffen
(Proteinen, Zuckern, Glykoproteinen, etc.), die in Harn gelöst sind, verglichen. Nachdem
400 ul jeder unten stehend beschriebenen Färbelösung mit 1 ml Harn von einem
gesunden Spender vermischt worden war, wurde die Anzahl der Partikel mit einer
Partikelzählvorrichtung gezählt. Die Zusammensetzung jeder Färbelösung ist wie
folgt.
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Färbelösung 1... Sternheimer-Malbin-Färbemittel
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Färbelösung 2... Evans-Blau und Phloxin
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Färbelösung 3... Evans-Blau und Erythrosin
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Färbelösung 4... Neu-Sternheimer-Färbemittel
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Als Kontrollösung wurde 400 ul physiologische Kochsalzlösung verwendet.
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Harn von einem gesunden Spender, der mit den Färbelösungen 1 bis 4 gefärbt
wurde, ist mit gefärbter Harn 1 bis 4 in dieser Reihenfolge bezeichnet. Fig. 2 zeigt
ein Diagramm, das die Beziehung zwischen gefärbtem Harn und
Agglutinationsprodukten in dem Harn zeigt. Wie durch die graphische Darstellung mit Balken in
Fig. 2 gezeigt, zeigte die Zählung von mit dem Neu-Sternheimer-Färbemittel
gefärbten Harn 196 Partikel/ul, nämlich 90 mal die Zahl (2 Partikel/gl) von
nichtgefärbtem Harn; damit wurde bestätigt, daß die in Harn gelösten Stoffe koaguliert
waren. Andererseits wurde damit bestätigt, daß die zwei oben beschriebenen
Kombinationen, Färbelösungen 2 und 3, keine Koagulation verursachten (die Zahl
betrug in beiden Fällen 2 Partikel/gl), obgleich die Färbeeigenschaft mit der des
Neu-Stemheimer-Färbemittels vergleichbar war. Ähnliche Ergebnisse wurden
auch unter Verwendung von Trypan-Blau anstelle von Evans-Blau erhalten. Zur
Verbesserung des Färbevermögens des Sternheimer-Malbin-Färbemittels wurde
die Menge an dem Färbemittel erhöht. Es wurde bestätigt, daß die in Harn
gelösten Stoffe koaguliert wurden und daß die unerwünschte Koagulation mit der
erhöhten Menge an dem Färbemittel zunahm.
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Zur Untersuchung der Wirkung der Färbemittel auf rote Blutzellen wurden jeweils
400 ul Trypan-Blau, Evans-Blau, Erythrosin, Phloxin, Eosin, des Sternheimer-
Färbemittels und des Sternheimer-Malbin-Färbemittels zu 1 ml einer Probe
zugefügt, die durch Zugabe von Vollblut, das von einem gesunden Spender gesammelt
wurde, zu physiologischer Kochsalzlösung erhalten wurde, und hämolysefreie,
rote Blutzellen wurden mit einem Fuchs-Rosenthal-Hämacytometer gezählt. Fig.
3 zeigt ein Diagramm, das die Beziehung zwischen jedem Färbemittel und einer
lebensfähigen Rate von roten Blutzellen zeigt. Wie durch die graphische
Darstellung mit Balken in Fig. 3 gezeigt, wurde bestätigt, daß die Hämolyse mit dem
Sternheimer-Färbemittel, dem Sternheimer-Malbin-Färbemittel und Phloxin
bemerkt wurde, aber andere Farbstoffe keine Hämolyse zeigen. Was Phloxin
anbe
langt, wurde Glutaraldehyd in einer Konzentration von 3% zugefügt, zu dem
Zweck die Form der roten Blutzellen zu erhalten. Fig. 4 zeigt ein Diagramm, das
eine lebensfähige Rate von roten Blutzellen zeigt, wenn das Fixiermittel zu
Phloxin zugefügt wurde. Wie in Fig. 4 gezeigt, verhinderte das Fixiermittel
deutlich eine Hämolyse.
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Der Kombination von entweder Evans-Blau oder Trypan-Blau und Eosin, die ein
kleines, niedriges Färbevermögen aufweist, wurde Natriumdodecylsulfat in einer
Konzentration von 0,1% zu dem Zweck einer Verbesserung des Färbevermögens
zugefügt. Es wurde visuell durch mikroskopische Beobachtung bestätigt, daß
verschiedene unterscheidbare Komponenten gleichmäßig gefärbt wurden. In diesem
Fall wurden 3% Glutaraldehyd zur Erhaltung der Form der roten Blutzellen
zugefügt.
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Das erfindungsgemäße Färbungsmittel kann, wenn mit z. B. Harnsedimenten oder
einer Harnprobe vor dem Zentrifugieren vermischt, spezifisch und selektiv nur
unterscheidbare Komponenten färben, um Färbemuster bzw. Färbebilder mit einer
guten visuellen Erkennungseigenschaft bereitzustellen.
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Fig. 5A und Fig. 5B zeigen je ein Diagramm, das relative Flächen von den durch
Bildverarbeitung ausgeschnittenen Bildern und relative Farbschattierungen der
Bilder zeigt.
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Mit der Kombination von Trypan-Blau und Erythrosin gefärbte Harnsedimente in
Fig. 5A und mit dem Sternheimer-Malbin-Färbemittel gefärbte Harnsedimente in
Fig. 5B läßt man in einer Durchflußzelle strömen, um die Harnsedimente zu
erfassen, die durch eine Partikelerfassungszone in der Durchflußzelle strömen. Wenn
die Harnsedimente durch eine Fotograflerzone in der Durchflußzelle strömen,
werden unbewegte Bilder der Harnsedimente wirksam fotografiert und die auf
diese Weise erhaltenen Bilder der Harnsedimente werden einer Bildverarbeitung
unterworfen, um dadurch die charakteristischen Muster bzw. Bilder zu extrahieren
und eine Beziehung zwischen relativen Flächen der objektiven Bilder und
relativen Farbschattierungen der Bilder zu erhalten. Wie in Fig. 5A und 5B gezeigt,
wurde bestätigt, daß das erfindungsgemäße Färbemittel die Harnsedimente in
unterschiedlichem Ausmaß in der Farbschattierung und in der Färbeintensität
deutlich färben kann, in Abhängigkeit von deren Arten, so daß charakteristische, für
eine Bildverarbeitung wirksame Parameter bereit gestellt werden können.
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Darüber hinaus koaguliert das erfindungsgemäße Färbemittel nicht Zucker,
Proteine, Glykoproteine, etc. die in Harn gelöst sind, so daß das Färbemittel ein
Verklumpen in dem Strömungssystem aufgrund koagulierter Stoffe verhindern kann.
Weiterhin führt das Färbemittel zu keiner unrichtigen Erfassung aufgrund von
koagulierten Stoffen, so daß Harnsedimente wirksam erfaßt werden können und
Bilder der Harnsedimente genau fotografiert werden können.
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Darüber hinaus kann bei der Stufe der Bildverarbeitung die Zeitdauer zur
Verarbeitung, die durch koagulierte Stoffe zusätzlich erforderlich sein könnte, verkürzt
werden und die Bildspeicherkapazität kann garantiert werden.
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Die koagulierten Stoffe könnten unrichtig als Auswürfe in Abhängigkeit von ihrer
Form aufgefaßt werden oder könnten verschiedene unterscheidbare
Komponenten, wie Zellen, Auswürfe, Blutzellen, etc., einer Koagulationsmasse einverleiben,
um einen Widerspruch zwischen der tatsächlichen Zahl und der gezählten Zahl zu
verursachen. Das Färbemittel der vorliegenden Erfindung kann von solchen
Problemen befreien.
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Darüber hinaus kann durch das Auswählen von Farbstoffen, die zu keinen
Kristallen führen, die sich von einer Färbelösung ableiten, oder durch das Auswählen
einer Kombination von Farbstoffen, deren Gemisch zu keinen Sedimenten führt,
das Auftreten von Artefakten, die sich von einer Färbelösung herleiten, verhindert
werden und die deutliche Erkennung von extrazellulären Komponenten, die in
einer Probe vorliegen, kann präziser werden.
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Weiterhin kann durch Auswählen von Farbstoffen, die nicht mit Hämolyse
verbunden sind, eine Hämolyse von roten Blutzellen verhindert werden; alternativ
kann eine Hämolyse von roten Blutzellen auch verhindert werden, indem
Farbstoffen, die Hämolyse aufweisen, ein Fixiermittel zugefügt wird.
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Wo Farbstoffe mit einem niedrigen Färbevermögen eingesetzt werden, kann die
Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels eine nichtgleichmäßige Färbung
verhindern, um das Färbevermögen zu verbessern.
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Gemäß der Apparatur zur Bildanalyse von gefärbten Partikeln vom Fließtyp
können die Komponenten von Harnsedimenten analysiert und klassifiziert werden auf
der Grundlage von Bildern der Harnsedimente, indem Bilder der Harnsedimente
fotografiert werden, während Partikel erfaßt bzw. detektiert werden, wenn die
kontinuierlich strömenden Harnsedimente durch die Partikelerfassungszone bzw.
Partikeldetektionszone strömen.
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Eine Ausführungsform der Apparatur zur Bildanalyse von gefärbten Partikeln
vom Fließtyp ist unten unter Bezugnahme auf die Fig. 6 und 7 beschrieben.
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Zuerst wird der Aufbau der Apparatur zur Bildanalyse von gefärbten Partikeln
vom Fließtyp unter Bezugnahme auf Fig. 6, die die gesamte Struktur zeigt,
erläutert. Wie in Fig. 6 gezeigt, umfaßt die Apparatur zur Bildanalyse von gefärbten
Partikeln vom Fließtyp: eine Durchflußzelle 100 für die Zufuhr einer Fluidprobe,
in der Partikel suspendiert sind, eine Einrichtung 101 zum Fotografieren von
Bildern, eine Einrichtung 102 zur Analyse von Partikeln, eine Einrichtung 103 zum
Erfassen bzw. Detektieren von Partikeln und eine Einrichtung 104 zum Färben
von Partikeln.
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Die Fotografiereinrichtung 101 wirkt auch als Mikroskop und ist ausgerüstet mit:
einer Blitzlampe 1, bei der es sich um eine Pulslichtquelle bzw. Impulslichtquelle
handelt, einem Blitzlichtlampenantriebsstromkreis bzw. -schaltkreis 1a, der die
Blitzlampe 1 aufblitzen läßt, einer Vorderlinse bzw. Feldlinse 2, die den Pulsfluß
10 von der Blitzlampe 1 parallel macht, einer Mikroskop-Kondensor-Linse 3, die
den parallelen Pulsfluß von der Vorderlinse 2 auf eine Strömung 110 der
Fluidprobe in der Durchflußzelle 100 kondensiert bzw. verdichtet, einer
Mikroskop-Objektiv-Linse 5, die den Pulsfluß, der auf die Strömung 110 der Fluidprobe
ausgestrahlt wird, sammelt, um ihn auf eine Bild bildende Position 6 zu
kondensieren, einer TV-Kamera 8, die das Bild an der Bild bildenden Position 6
aufnimmt, das durch eine Projektionslinse 7 durch ein vernetztes System projiziert
wird, um es in ein elektrisches Bilddatensignal umzuwandeln, einer Sehfeldblende
11, die die Breite des Pulsflußes 10 beschränkt, und einer Öffnungsblende 12. Als
obige TV-Kamera 8 wird allgemein eine CCD-Kamera verwendet, die weniger
Nachbilder hat.
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Die Partikelanalyseeinrichtung 102 umfaßt: einen AD-Umwandler 24, der das
durch die TV-Kamera 8 übermittelte Bilddatensignal in ein digitales Signal
umwandelt, einen Bildspeicher 25, der die Daten auf der Grundlage des Signals aus
dem AD-Umwandler 24 in eine definierte Adresse speichert, einen
Steuerstromkreis 26 für die Bildverarbeitung, der Daten auf den Bildspeicher schreibt und
liest, einen charakteristischen Extraktionstromkreis 27 und einen
Diskriminierungsstromkreis 28, die die Zahl der Partikel bestimmen und die Partikel durch
Bildverarbeitung auf der Grundlage des Signals aus dem Bildspeicher 25
klassifizieren, eine Partikelzählzone 40, die die Zahl der Partikel in einer Fluidprobe
bestimmt, und eine zentrale Steuereinheit 29, die die Fotograflerbedingungen der
TV-Kamera 8, die Bedingungen für eine Strömung einer Fluidprobe in der
Durchflußzelle 100 und den Steuerstromkreis 26 für die Bildverarbeitung steuert, und
die die Ergebnisse der Bildverarbeitung aus dem Diskriminierungsstromkreis 28
speichert, Daten durch die Partikelzählzone 40 abgibt und aufnimmt und auf einer
Displayzone 50 darstellt.
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Die Partikelerfassungeinrichtung 103 umfaßt: einen Halbleiterlaser 15, bei dem es
sich um eine Lichtquelle zum Emittieren von Laserlicht als Detektionslicht
han
delt, eine Kollimatorlinse 16, die das Laserlicht aus dem Halbleiterlaser 15 in
einen parallelen Laserfluß 14 umwandelt, eine zylindrische Linse 17, die nur eine
Richtung des Laserflusses von der Kollimatorlinse 16 kondensiert, einen
Reflexionsspiegel 18, der den Fluß von der zylindrischen Linse 17 reflektiert, einen
Mikroreflexionsspiegel 19, der den Laserfluß von dem Reflektionsspiegel 18, der
zwischen der Mikroskopkondensorlinse 3 und der Durchflußzelle 100
bereitgestellt wird, zu einer Position nahe der Einlaufstrecke einer Bildaulhahmezone auf
die Strömung 110 der Fluidprobe lenkt, eine Mikroskopobjektivlinse 5, die das
Laserlicht des oben genannten Laserflusses, der durch die Partikel gestreut wird,
sammelt, einen Strahlteiler 20, der das gestreute Licht, das auf diese Weise durch
die Mikroskopobjektivlinse 5 kondensiert wird, reflektiert, einen optischen
Detektions- bzw. Erfassungsstromkreis 22, der das Licht empfängt, das von dem
Strahlteiler 20 durch eine Blende 21 gestreut wird, und ein elektrisches Signal auf
der Grundlage seiner Stärke ausgibt, und einen Ein-Aus-Steuerstromkreis 23 für
eine Blitzlampe, der einen Antriebsstromkreis 1a für eine Blitzlampe auf der
Grundlage des elektrischen Signals von dem optischen Detektionsstromkreis 22
betreibt. Die Mikroskopobjektivlinse 5 wird üblicherweise ebenfalls als die
Bildfotografiereinrichtung 101 betrieben.
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Die Partikelfärbeeinrichtung 104 umfaßt: eine Flasche 30 für Färbemittel, eine
Flasche 31 für Fixiermittel, eine Probenspritze 35, die das Färbemittel aus einer
Flasche 32 für oberflächenaktives Mittel in ein Färbegefäß 34 durch eine
Färbemittelentleerungspumpe 33 austrägt und andererseits eine Entnahme einer
Fluidprobe, in der die Partikel suspendiert sind, vornimmt, und eine
Probenausflußöffnung bzw. Probendüse 36.
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Eine Mantel- bzw. Hüllenlösung wird der Durchflußzelle 100 zusammen mit einer
Fluidprobe zugeführt, um eine Strömung der Fluidprobe, die in der Mantellösung
eingeschlossen ist, auszubilden. Die Fluidprobenströmung 110 wird eine stabile
konstante Strömung (Mantelströmung), die einen vertikal flachen Querschnitt
gegen die optische Achse (optische Achse des Mikroskops) 9 der
Bildfotogra
fiereinrichtung 101 hat. Die Fluidprobenströmung wird somit abwärts der
Papieroberfläche am Zentrum der Durchflußzelle 100 geschickt. Die
Strömungsgeschwindigkeit der Fluidprobenströmung 110 wird unter den Bedingungen
gesteuert, die an der zentralen Steuereinheit 29 vorgegeben werden.
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Die Funktion der Durchflußzelle 100 wird unter Bezugnahme auf die
perspektivische Ansicht in Fig. 7, die den Aufbau einer Durchflußzelle zeigt, erläutert. Die
Durchflußzelle 100 ist allgemein aus Glas hergestellt. Die Durchflußzelle 100 hat
eine Aufgabeöffnung 112 für Mantellösung für die Zufuhr der Mantellösung zu
der Durchflußzelle und eine Aufgabeöffnung 114 für eine Fluidprobe für die
Zufuhr der Partikel enthaltenden Probe zu der Durchflußzelle. Die Mantellösung
fließt im Inneren der Durchflußzelle derart, daß sie die Fluidprobe unter
Ausbildung einer sogenannten laminaren Strömung einschließt, wodurch sowohl die
Fluidprobe als auch die Mantellösung stromabwärts ohne Verzerrung der
Strömung fließen. Die innere Form der Durchflußzelle ist so ausgelegt, daß sie eine
kondensierte bzw. verdichtete Strömung nach einer Richtung der laminaren
Strömung hin ausbildet. Als Ergebnis davon wird die Fluidprobenströmung zu einer
dünnen jedoch breiten und flachen Strömung in der Bildfotografierzone 90
ausgebildet. Die Breite der flachen Strömung wird nicht durch die kondensierte bzw.
verdichtete Strömung beeinträchtigt, um die Größe der Breite gleich zu der der
Aufgabeöffnung 114 für die Fluidprobe, in vertikale Richtung gegen die
Richtung, die die kondensierte bzw. verdichtete Strömung empfängt, aufrecht zu
erhalten. In Wirklichkeit kann jedoch eine stabile und konstante Breite wegen
komplizierter Strömungen um die Aufgabeöffnung 114 für die Fluidprobe bei
unterschiedlichen Analysearten nicht aufrecht erhalten werden. Dem gemäß ragt ein
Probenführungselement 113 gegen die Probenaufgabeöffnung zur Stabilisierung
der Breite hervor. Die Position, auf der der Laserfluß in dem
Partikeldetektionssystem kondensiert wird, ist eine Partikelerfassungsposition 80.
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Eine Grundvorgehensweise, durch die die Apparatur zur Bildanalyse von
Partikeln vom Fließtyp, die den oben beschriebenen Aufbau besitzt, betrieben wird,
wird nachstehend erläutert.
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Jedes Reagenz wird aus der Flasche 30 für Färbemittel, der Flasche 31 für
Fixiermittel und der Flasche 32 für oberflächenaktives Mittel zu dem Färbegefäß 34
durch die entsprechende Entleerungspumpe 33 ausgetragen. So dann wird eine
Probe einer Probensuspension, in der Partikel suspendiert sind, durch die
Probenspritze 35 und die Probenausflußöffnung 36 genommen, in das Färbegefäß 34
ausgetragen, umgerührt und dort stehen gelassen, wodurch die Partikel gefärbt
werden.
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Der Halbleiterlaser 15 oszilliert konstant kontinuierlich und beobachtet immer die
Partikel in der Probe, die durch die Erfassungszone strömen. Der Laserfluß aus
dem Halbleiterlaser 15 wird durch die Kollimatorlinse 16 in einen parallelen
Laserfluß 14 umgewandelt, der dann in nur eine Richtung des Flusses durch die
zylindrische Linse 17 kondensiert bzw. verdichtet wird. Der Laserfluß wird durch
den Reflexionsspiegel 18 und den Mikro-Reflexionsspiegel 19 reflektiert und
wird auf die Probenströmung 110 in der Durchflußzelle 100 ausgestrahlt. Die
bestrahlte Position ist die Partikelerfassungsposition 80, auf der der Laserfluß durch
die zylindrische Linse 17 kondensiert wird und die nahe der Einlaufstrecke der
Bildfotografierzone 90 auf der Probenströmung 110 angeordnet ist.
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Wenn die zu erfassenden Partikel quer über den Laserfluß strömen, wird der
Laserfluß durch die Partikel gestreut. Das gestreute Licht wird durch den Strahlteiler
20 reflektiert und auf dem optischen Detektionsstromkreis 22 empfangen, in dem
das gestreute Licht in elektrische Signale auf der Grundlage ihrer Stärke
umgewandelt wird.
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In dem optischen Detektionsstromkreis 22 wird weiter bestimmt, ob das erfaßte
elektrische Signal größer als ein definiertes Signalniveau ist; wenn das erfaßte
Signal größer als das definierte Signalniveau ist, wird von dem Stromkreis
beachtet, daß die zu einem Bild zu verarbeitenden Partikel durchgeströmt sind, und
das erfaßte Signal wird zu dem Ein-Aus-Steuerstromkreis 23 für die Blitzlampe
und der Partikelzählzone 40 gesandt. In dem Ein-Aus-Steuerstromkreis 23 für die
Blitzlampe werden die Partikel nach einer definierten Verzögerungszeit, die durch
den Abstand zwischen der Partikelerfassungsposition und der Bildaufnahmezone
und durch die Strömungsgeschwindigkeit der Fluidprobe bestimmt wird, zu dem
Antriebsstromkreis 1a für die Blitzlampe in derartiger Weise gesandt, daß die
Blitzlampe 1 aufblitzt, um ein Bild der Partikel aufzunehmen, wenn die Partikel
die Position erreichen, die in der Bildaufnahmezone der TV-Kamera 8 gegeben
ist. Die Verzögerungszeit ist extrem kurz, da der Abstand zwischen der
Partikelerfassungsposition und der Bildaufriahmezone sehr kurz ist, so daß die Erfassung
der Partikel oder die analytische Genauigkeit nicht durch die
Strömungsgeschwindigkeit der Fluidprobe oder durch die Konzentration der Partikel
beeinträchtigt wird. Gleichzeitig mit dem oben beschriebenen erfaßten Signal wird ein
Blitz-Fertig-Signal von dem Ein-Aus-Steuerstromkreis 23 für die Blitzlampe
gesandt, um die Blitzzeitsteuerung der Blitzlampe auf der Grundlage der
Zeitsteuerung des Feldsignals durch das vernetzte System zu steuern. Das Erfassungssignal
in dem Ein-Aus-Steuerstromkreis 23 für die Blitzlampe wird zu dem
Steuerstromkreis 26 für die Bildverarbeitung gesandt.
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Wenn das Erfassungssignal zu dem Antriebsstromkreis 1a für die Blitzlampe
gesandt wird, läßt der Antriebsstromkreis 1a für die Blitzlampe die Blitzlampe 1
aufblitzen. Das aus der Blitzlampe 1 austretende Pulslicht bzw. Impulslicht läuft
auf der optischen Achse 9 des Mikroskops und geht durch die Sehfeldlinse 2, um
ein paralleles Licht zu ergeben. Das parallele Licht wird durch die
Mikroskopkondensorlinse 3 kondensiert und das kondensierte Licht wird auf die
Probenströmung 110 in der Durchflußzelle 100 ausgestrahlt. Die Breite des Pulsflusses
10 wird durch die Sehfeldblende 11 und die Öffnungblende 12 beschränkt. Der
auf die Probenströmung 110 in der Durchflußzelle 100 ausgestrahlte Pulsfluß wird
durch die Mikroskopobjektivlinse 5 gesammelt und bildet ein Bild an der
bildbil
denden Position 6. Das Bild an der bildbildenden Position 6 wird auf die
Fotografieroberfläche der TV-Kamera 8 durch die Projektionslinse 7 projiziert und in ein
Bilddatensignal durch das vernetzte System umgewandelt. Durch diese
Vorgehensweise werden unbewegte Bilder der Partikel fotografiert. Die Bedingungen
zum Fotografieren durch die TV-Kamera 8 werden vorher auf die zentrale
Steuereinheit 29 programmiert, wodurch das Fotografierverhalten der TV-Kamera 8
gesteuert wird.
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Mit der Apparatur zur Bildanalyse von gefärbten Partikeln vom Fließtyp, die zur
morphologischen Klassifizierung von Partikeln verwendet wird, indem unbewegte
Bilder der erfaßten Partikel, die durch die Fotografierzone in der Durchflußzelle
strömen, fotografiert werden und die Partikelbilder durch Bildverarbeitung
analysiert werden, werden das Färbemittel, das eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist, und ein Verfahren zur Herstellung des Färbemittels nachstehend
erläutert.
Beispiel 1
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Das Färbemittel, bei dem es sich um eine Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung handelt, und seine Herstellung werden nachstehend gezeigt.
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Das Färbemittel zum Färben von Harnsedimenten wurde wie folgt hergestellt.
Ein Volumen Lösung I enthaltend 3,2 · 10&supmin;² Mol/l Evans-Blau wurde mit 1
Volumen Lösung II enthaltend 6,3 · 10&supmin;² Mol/l Erythrosin unter Verwendung von
1/15 Mol/l Phosphatpuffer (pH-Wert 6,8) als Lösungsmittel vermischt. Nachdem
Natriumazid als Stabilisator weiterhin dem Gemisch in einer Konzentration von
0,1% zugefügt worden war, wurde das Gemisch filtriert und in einer
lichtbeständigen Flasche aufbewahrt.
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Das oben beschriebene Färbemittel wurde mit Harnsedimenten oder mit einer
Harnprobe vor einem Zentrifugieren in einem Volumenverhältnis von 1 zu 10
vermischt. Ohne Herbeiführung einer Koagulation von Zuckern, Proteinen und
Glykoproteinen, die in der Probe gelöst waren, konnten nur die unterscheidbaren
Komponenten in der Probe mit guter visueller Erkennung gefärbt werden.
Beispiel 2
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Das Färbemittel, das eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
ist, und seine Herstellung und Verwendung werden nachstehend erläutert.
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Das Färbemittel zum Färben von Harnsedimenten wurde wie folgt hergestellt. Ein
Volumen Lösung I enthaltend 3,2 · 10&supmin;² Mol/l Evans-Blau wurde mit 1 Volumen
Lösung II enthaltend 6,3 · 102 Mol/l Phloxin unter Verwendung von 1/15 Mol/l
Phosphatpuffer (pH-Wert 6,8) als Lösungsmittel vermischt. Nachdem
Natriumazid als Stabilisator weiterhin zu dem Gemisch wie in Beispiel 1 zugefügt worden
war, wurde das Gemisch filtriert und in einer lichtbeständigen Flasche
aufbewahrt.
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Das oben beschriebene Färbemittel wurde mit Harnsedimenten oder mit einer
Harnprobe vor einem Zentrifugieren in einem Volumenverhältnis von 1 zu 10
vermischt. Ohne Herbeiführung einer Koagulation von Zuckern, Proteinen und
Glykoproteinen, die in der Probe gelöst waren, konnten nur die unterscheidbaren
Komponenten in der Probe mit guter visueller Erkennung gefärbt werden.
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Jedoch verursacht die Phloxin-Lösung als Färbemittel eine Hämolyse der roten
Blutzellen. Daher wurde Glutaraldehyd in einer Konzentration von 3% als
Fixiermittel zum Schutz der roten Blutzellen zugegeben, wodurch die
unterscheidbaren Komponenten stabilisiert wurden.
Beispiel 3
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Das Färbemittel, bei dem es sich um eine weitere Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung handelt, und seine Herstellung und Verwendung werden
nachstehend erläutert.
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Das Färbemittel zum Färben von Harnsedimenten wurde wie folgt hergestellt. Ein
Volumen Lösung I enthaltend 3,2 · 10&supmin;² Mol/l Evans-Blau wurde mit 1 Volumen
Lösung II enthaltend 6,3 · 10&supmin;² Mobil Eosin unter Verwendung von 1/15 Mobil
Phosphatpuffer (pH-Wert 6,8) als Lösungsmittel vermischt. Der Stabilisator
wurde weiterhin mit dem obigen Gemisch wie in Beispiel 1 vermischt. Das
resultierende Gemisch wurde filtriert und in einer lichtbeständigen Flasche aufbewahrt.
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Das oben beschriebene Färbemittel wurde mit Harnsedimenten oder mit einer
Harnprobe vor einem Zentrifugieren in einem Volumenverhältnis von 1 zu 10
vermischt. Ohne Herbeiführung einer Koagulation von Zuckern, Proteinen und
Glykoproteinen, die in der Probe gelöst waren, konnten nur die unterscheidbaren
Komponenten in der Probe mit guter visueller Erkennung gefärbt werden.
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Jedoch färbt die Eosin-Lösung als Färbemittel nicht gleichförmig verschiedene
unterscheidbare Komponenten. Um eine gleichförmige Färbung zu bewirken,
wurde Natriumdodecylsulfat weiterhin als oberflächenaktives Mittel dem obigen
Gemisch in einer Konzentration von 0,1% zugefügt, wodurch die stabile Färbung
erhalten wurde. Weiterhin wurde zum Zweck der Aufrechterhaltung der Form
Glutaraldehyd dem System in einer Konzentration von 3% zugefügt.
Beispiel 4
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Das Färbemittel zum Färben von Harnsedimenten wurde wie folgt hergestellt.
Lösung I enthaltend 2,0 · 10&supmin;² Mobil Trypan-Blau wurde mit Lösung II enthaltend
0,42 · 10 Mol/l Erythrosin in einem Verhältnis von 1 : 1 unter Verwendung von
1/15 Mobil Phosphatpuffer (pH-Wert 6,8) als Lösungsmittel vermischt. Das
Gemisch wurde filtriert und in einer lichtbeständigen Flasche aufbewahrt. Das auf
diese Weise erhaltene Färbemittel wurde in die Apparatur zur Bildanalyse von
gefärbten Partikeln vom Fließtyp eingebracht.
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Das oben beschriebene Färbemittel wurde mit Harnsedimenten oder mit einer
Harnprobe vor einem Zentrifugieren in einem Volumenverhältnis von 1 zu 10
vermischt. Ohne Herbeiführung einer Koagulation von Zuckern, Proteinen und
Glykoproteinen, die in der Probe gelöst waren, konnten nur die unterscheidbaren
Komponenten in der Probe mit guter visueller Erkennung gefärbt werden.