DE60224839T2

DE60224839T2 - Verfahren zur lagerung von tetrazoliumverbindungen, dafür bestimmter stabilisator und nach dem verfahren aufbewahrte tetrazoliumverbindungsreagenzlösung

Info

Publication number: DE60224839T2
Application number: DE60224839T
Authority: DE
Inventors: Kaori Kyoto-shi ISHIMARU; Satoshi Kyoto-shi YONEHARA
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: EP1464643B1; US20040157285A1; JP4336886B2; EP1464643A1; ATE384705T1; JPWO2003029229A1; DE60224839D1; CN1553903A; EP1464643A4; WO2003029229A1; CN1291980C; US20090215026A1; US8192996B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung, einen bei dem Verfahren verwendeten Stabilisator und eine Reagenzlösung einer Tetrazoliumverbindung, die sich des Verfahrens bedient.
STAND DER TECHNIK
Tetrazoliumverbindungen werden im Allgemeinen als Redoxfarbstoff (farbentwickelndes Substrat), Reduktionsmittel oder dergleichen verwendet. Hierzu verwendet man üblicherweise ein flüssiges Reagenz, das man durch Auflösen einer Tetrazoliumverbindung in Wasser erhält.
Wenn jedoch der pH der Lösung der Tetrazoliumverbindung annähernd neutral ist, zeigt die Tetrazoliumverbindung eine geringe Stabilität. Wenn man die Lösung der Tetrazoliumverbindung daher über eine längere Zeit aufbewahrt, entsteht das Problem, dass sich die Lösung aufgrund einer spontanen Farbentwicklung der Tetrazoliumverbindung verfärbt oder die Lösung beispielsweise nicht mehr als Reduktionsmittel wirkt. Beim Einsatz einer Lösung einer Tetrazoliumverbindung ist es daher unvermeidlich, eine Lösung der Tetrazoliumverbindung für jede Verwendung frisch anzusetzen oder eine Lösung der Tetrazoliumverbindung zu verwenden, die als saure Lösung aufbewahrt wird, weil die Tetrazoliumverbindung unter sauren Bedingungen auch in Form einer Lösung stabil ist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Wenn man eine Tetrazoliumverbindung jedoch in einem Enzymreaktionssystem einsetzt, müssen verschiedene Bedingungen entsprechend der Reaktion eingestellt werden. Insbesondere haben Enzyme ihren eigenen optimalen pH-Wert und pH-Stabilität, und dieser optimale pH-Wert und pH-Stabilität sind nicht notwendigerweise sauer. Tatsächlich sind die optimalen pH-Werte und pH-Stabilitäten vieler Enzyme alkalisch, und es gibt insbesondere eine große Zahl von Enzymen, deren optimalen pH-Werte und pH-Stabilität annähernd neutral sind. Wenn man daher eine Enzymreaktion bei annähernd neutralem pH ablaufen lässt, ist es bei der Verwendung einer eine Tetrazoliumverbindung enthaltenden sauren Lösung erforderlich, den pH des Reaktionssystems beim Einsatz der Lösung anzupassen. Dies erschwert die Durchführung.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung nicht nur unter sauren Bedingungen, sondern auch unter anderen pH-Bedingungen bereitzustellen.
Zur Lösung der vorstehenden Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung bereit, bei dem man die Tetrazoliumverbindung in Gegenwart von Natriumazid aufbewahrt. in Gegenwart des Natriumazids kann man die Tetrazoliumverbindung in einem stabilisierten Zustand aufbewahren, in dem z. B. die spon tane Farbentwicklung unterdrückt und ihre Funktionsweise nicht nur unter sauren Bedingungen, sondern auch unter anderen pH-Bedingungen erhalten bleibt.
Erfindungsgemäß kann man die Tetrazoliumverbindung in Form einer Lösung oder im Trockenzustand aufbewahren. Bei der Aufbewahrung der Tetrazoliumverbindung im Trockenzustand kann man die Tetrazoliumverbindung beispielsweise aufbewahren, indem man Natriumazid zu einer die Tetrazoliumverbindung enthaltenden Lösung gibt und dann dieses Gemisch als solches trocknet. Alternativ kann man Filterpapier oder dergleichen mit dem Gemisch tränken und dann trocknen.
Natriumazid wird im Allgemeinen als Antiseptikum verwendet. In der vorliegenden Erfindung wird Natriumazid jedoch nicht zur Erlangung eines antiseptischen Effekts zugesetzt, sondern um die Tetrazoliumverbindung in einem stabilisierten Zustand aufzubewahren, wobei die spontane Farbentwicklung unterdrückt und ihre Funktionsweise erhalten bleibt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, dass Natriumazid eine Tetrazoliumverbindung stabilisieren kann.
Im erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, dass die Tetrazoliumverbindung (A) und Natriumazid (B) in einem Verhältnis (molares Verhältnis A:B) im Bereich von 1:0,02 bis 1: 6,2 vorliegen.
Wenn im erfindungsgemäßen Verfahren die Tetrazoliumverbindung und das Natriumazid in einer Lösung vorliegen, so dass die Tetrazoliumverbindung stabil aufbewahrt wird, ist es bevorzugt, dass die Konzentration des Natriumazids im Bereich von 0,08 bis 3,2 mmol/l, insbesondere 0,08 bis 0,8 mmol/l liegt. Dies liegt daran, dass die Tetrazoliumverbindung noch stabiler aufbewahrt werden kann, wenn die Konzentration des Natriumazids im vorstehend beschriebenen Bereich liegt. Andererseits muss die Konzentration des Natriumazids, wenn das Natriumazid, wie vorstehend beschrieben, als Antiseptikum verwendet wird, etwa 0,05 bis 0,2 Gew.-% (7,7 bis 31 mol/l) betragen, um einen antiseptischen Effekt hervorzubringen. In der vorliegenden Erfindung übt das Natriumazid jedoch einen besonders herausragenden Effekt der Stabilisierung der Tetrazoliumverbindung aus, wenn seine Konzentration im Bereich von 0,08 bis 3,2 mmol/l liegt. Innerhalb dieses Bereichs zeigt das Natriumazid im Wesentlichen keinen antiseptischen Effekt. Das heißt, man geht davon aus, dass die Stabilisierung der Tetrazoliumverbindung nicht durch den antiseptischen Effekt des Natriumazids erreicht wird, und man kann sagen, dass der antiseptische Effekt und der Effekt der Stabilisierung der Tetrazoliumverbindung voneinander völlig verschieden sind.
Andererseits ist es im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass die Konzentration der Tetrazoliumverbindungen im Bereich von 0,5 bis 8 mmol/l liegt.
Außerdem ist es im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass man die Lösung mit dem Natriumazid versetzt, so dass dessen Konzentration im Bereich von 0,02 bis 6,2 mmol/l pro 1 mmol/l der Tetrazoliumverbindung liegt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren unterliegt der pH der Lösung keinen besonderen Beschränkungen, liegt aber beispielsweise im Bereich von 5,0 bis 7,5, vorzugsweise 5,0 bis 7,0 und insbesondere 5,5 bis 6,5.
Im erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, dass es sich bei der Tetrazoliumverbindung um 2-(4-Iodphenyl)3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumsalz handelt.
Ein erfindungsgemäßer Stabilisator ist ein Stabilisator zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung, der Natriumazid umfasst. Der Grund dafür liegt darin, dass das Natriumazid die Tetrazoliumverbindung stabilisieren kann, wie vorstehend beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes Reagenz einer Tetrazoliumverbindung ist eine Reagenzlösung, die ein wässriges Lösungsmittel und eine in dem wässrigen Lösungsmittel gelöste Tetrazoliumverbindung umfasst, wobei in dem wässrigen Lösungsmittel außerdem Natriumazid gelöst ist. In diesem Reagenz kann man die spontane Farbentwicklung der Tetrazoliumverbindung oder den Verlust der Funktionsweise der Tetrazoliumverbindung unterdrücken, auch wenn das Reagenz in Form einer Lösung vorliegt. Daher entfällt das Erfordernis, eine Reagenzlösung für jede Verwendung anzusetzen, so dass Verfahrensschritte unter Verwendung einer Tetrazoliumverbindung, wie verschiedene Messreaktionen, einfach ausgeführt werden können.
Ein erfindungsgemäßes Trockenreagenz ist ein eine Tetrazoliumverbindung enthaltendes Reagenz, das durch Trocknen eines wässrigen Lösungsmittels erhalten wird, in dem die Tetrazoliumverbindung und Natriumazid gelöst sind. Das wässrige Lösungsmittel, in dem die Tetrazoliumverbindung und das Natriumazid gelöst sind, kann als solches getrocknet werden. Alternativ kann man Filterpapier oder dergleichen mit dem wässrigen Lösungsmittel imprägnieren und dann trocknen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die die zeitliche Veränderung der Absorption, die einer Menge glykosiliertem Hämoglobin entspricht, in einem Verfahren zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung gemäß einem erfindungsgemäßen Beispiel zeigt.
2 ist eine graphische Darstellung, die die zeitliche Veränderung der Absorption, die einer Menge glykosiliertem Hämoglobin entspricht, im gleichen Beispiel wie in 1 zeigt.
3a und 3b sind graphische Darstellungen, die die Veränderung der Absorption in einem Verfahren zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Beispiel zeigen, wobei 3a das Ergebnis bezüglich einer Probe mit einer WST-3-Konzentration von 0,5 mmol/l und einer Natriumazidkonzentration von 0,05 g/l und 3b das Ergebnis bezüglich einer Probe mit einer WST-3-Konzentration von 2,0 mmol/l und einer Natriumazidkonzentration von 0,1 g/l zeigt.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM
Die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung zu verwendende Tetrazoliumverbindung enthält vorzugsweise an wenigstens zwei Positionen ihres Tetrazolrings Substituenten, insbesondere z. B. an drei Positionen ihres Tetrazolrings.
Für den Fall, dass die Tetrazoliumverbindung an wenigstens zwei Positionen ihres Tetrazolrings Substituenten enthält, wie vorstehend beschrieben, ist es bevorzugt, dass sich die Ringsubstituenten an der 2-Position und 3-Position am Tetrazolring befinden. Für den Fall, dass die Tetrazoliumverbindung an drei Positionen an ihrem Tetrazolring Ringsubstituenten enthält, ist es bevorzugt, dass sich die Ringsubstituenten an der 2-Position, 3-Position und 5-Position am Tetrazolring befinden.
Außerdem ist es bevorzugt, dass wenigstens zwei Ringsubstituenten der Tetrazoliumverbindung eine Benzolringstruktur aufweisen. Außer der Benzolringstruktur können die Ringsubstituenten eine Resonanzstruktur aufweisen, die z. B. S oder O im Ringgerüst enthält. Beispiele für Ringsubstituenten mit einer derartigen Resonanzstruktur umfassen eine Thienylgruppe, Thiazolylgruppe und dergleichen.
Außerdem ist es bevorzugt, dass die Tetrazoliumverbindung an wenigstens drei Positionen an ihrem Tetrazolring Ringsubstituenten enthält und wenigstens zwei der Ringsubstituenten eine Benzolringstruktur aufweisen.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass wenigstens ein Ringsubstituent eine funktionelle Gruppe enthält; eine größere Zahl funktioneller Gruppen ist stärker bevorzugt.
Als funktionelle Gruppe wird vorzugsweise eine elektronenziehende funktionelle Gruppe verwendet. Z. B. kann man eine Halogengruppe, Ethergruppe, Estergruppe, Carboxygruppe, Acylgruppe, Nitrosogruppe, Nitrogruppe, Hydroxygruppe, Sulfogruppe und dergleichen verwenden. Außer diesen Gruppen kann man z. B. auch charakteristische Sauerstoff enthaltende Gruppen, wie eine Hydroperoxygruppe, Oxygruppe, Epoxygruppe, Epidioxygruppe, Oxogruppe und dergleichen und charakteristische Schwefel enthaltende Gruppen, wie eine Mercaptogruppe, Alkylthiogruppe, Methylthiomethylgruppe, Thioxogruppe, Sulfinogruppe, Benzolsulfonylgruppe, Phenylsulfonylgruppe, p-Toluolsulfonylgruppe, p-Tolylsulfonylgruppe, Tosylgruppe, Sulfamoylgruppe, Isothiocyanatgruppe und dergleichen verwenden. Unter diesen elektronenziehenden funktionellen Gruppen sind eine Nitrogruppe, Sulfogruppe, Halogengruppe, Carboxygruppe, Hydroxygruppe, Methoxygruppe, Ethoxygruppe bevorzugt. Neben den vorstehend erwähnten elektronenziehenden funktionellen Gruppen kann man beispielsweise auch ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppen wie z. B. eine Phenylgruppe, (C₆H₅-), Styrylgruppe (C₆H₅CH=CH-) und dergleichen verwenden. Es ist anzumerken, dass diese funktionellen Gruppen durch Dissoziation ionisiert sein können.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass die Tetrazoliumverbindung an der 2-Position und 3-Position ihres Tetrazolrings Benzolringe enthält und wenigstens einer der Benzolringe wenigstens eine funktionelle Gruppe enthält, die unter einer Halogengruppe, Carboxygruppe, Nitrogruppe, Hydroxygruppe, Sulfogruppe, Methoxygruppe und Ethoxygruppe ausgewählt ist. Es ist hier anzumerken, dass beide Benzolringe die funktionelle Gruppe enthalten können. Außerdem kann die funktionelle Gruppe an beliebigen Positionen (ortho-, metha-, para-) am Benzolring enthalten sein. Ferner unterliegt die Zahl der funktionellen Gruppen keinen besonderen Beschränkungen, und der Benzolring kann entweder die gleichen oder unterschiedliche funktionelle Gruppen aufweisen.
Beispiele für die Tetrazoliumverbindung, die Ringsubstituenten mit einer Benzolringstruktur an der 2-Position, 3-Position und 5-Position an ihrem Tetrazolring aufweist, umfassen:
2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumsalz;
2-(4-Iodphenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumsalz;
2-(2-Methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumsalz;
2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumsalz;
3,3'-(1,1'-Biphenyl-4,4'diyl))-bis(2,5-diphenyl)-2H-tetrazoliumsalz;
3,3'-[3,3-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'diyl])-bis[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumsalz];
2,3-Diphenyl-5-(4-chlorphenyl)tetrazoliumsalz;
2,5-Diphenyl-3-(p-diphenyl)tetrazoliumsalz;
2,3-Diphenyl-5-(p-diphenyl)tetrazoliumsalz;
2,5-Diphenyl-3-(4-styrylphenyl)tetrazoliumsalz;
2,5-Diphenyl-3-(m-tolyl)tetrazoliumsalz; und
2,5-Diphenyl-3-(m-tolyl)tetrazoliumsalz.
Die Tetrazoliumverbindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen beschränkt. Neben den vorstehend erwähnten Tetrazoliumverbindungen kann man auch eine Tetrazoliumverbindung verwenden, die Ringsubstituenten mit einer Benzolringstruktur an zwei Positionen und einen Ringsubstituenten mit einer von einer Benzolringstruktur verschiedenen Struktur an einer Position ihres Tetrazolrings aufweist. Beispiele für eine derartige Tetrazoliumverbindung umfassen:
2,3-Diphenyl-5-(2-thienyl)tetrazoliumsalz;
2-Benzothiazoyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazoliumsalz;
2,2'-Dibenzothiazoyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylen)ditetrazoliumsalz; und
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumsalz.
Außerdem kann man auch eine Tetrazoliumverbindung verwenden, die Ringsubstituenten mit einer Benzolringstruktur an zwei Positionen und einen Substituenten ohne Ringstruktur an einer Position ihres Tetrazolrings aufweist. Beispiele einer derartigen Tetrazoliumverbindung umfassen:
2,3-Diphenyl-5-cyano-tetrazoliumsalz;
2,3-Diphenyl-5-carboxy-tetrazoliumsalz;
2,3-Diphenyl-5-methyl-tetrazoliumsalz; und
2,3-Diphenyl-5-ethyl-tetrazoliumsalz.
Unter den vorstehend erwähnten Tetrazoliumverbindungen sind die Tetrazoliumverbindung mit drei Ringsubstituenten bevorzugt, wie vorstehend beschrieben. Darunter sind die Tetrazoliumverbindungen mit drei Ringsubstituenten mit einer Benzolringstruktur und einer großen Zahl elektronenziehender funktioneller Gruppen stärker bevorzugt und 2-(4-Iodphenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumsalz ist am meisten bevorzugt. Es ist hier anzumerken, dass die vorstehend erwähnten Tetrazoliumverbindungen beispielsweise als Salz vorliegen oder ionisiert sein können.
Die erfindungsgemäße Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung kann z. B. durch Auflösen einer Tetrazoliumverbindung und von Natriumazid als Stabilisator in einem wässrigen Lösungsmittel und Aufbewahren der so erhaltenen wässrigen Lösung der Tetrazoliumverbindung erfolgen. Die Konzentration der Tetrazoliumverbindung in der wässrigen Lösung unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, liegt aber aufgrund der Wasserlöslichkeit der Tetrazoliumverbindung oder dergleichen, z. B. im Bereich von 0,5 bis 8 mmol/l, wie vorstehend beschrieben.
Andererseits liegt die Konzentration des Natriumazids z. B. im Bereich von 0,08 bis 3,2 mmol/l, insbesondere 0,08 bis 0,8 mmol/l, wie vorstehend beschrieben.
Außerdem versetzt man die Lösung vorzugsweise mit dem Natriumazid, so dass dessen Konzentration beispielsweise in den Bereich von 0,02 bis 6,2 mmol/l pro 1 mmol/l der Tetrazoliumverbindung fällt.
Als wässriges Lösungsmittel kann man beispielsweise Wasser, verschiedene Puffer und dergleichen verwenden. Als Puffer kann man einen Phosphatpuffer, Good's Puffer (MES, MOPSO, MOPS, DIPSO, TES, POPSO und HEPES) und dergleichen verwenden. Darunter sind MES und MOPS bevorzugt und MES stärker bevorzugt. Der pH des Puffers liegt beispielsweise im Bereich von 5,0 bis 7,5, vorzugsweise 5,0 bis 7,0 und insbesondere 5,5 bis 6,5.
In Gegenwart von Natriumazid kann die Tetrazoliumverbindung ohne Einstellung des pH der wässrigen Lösung auf saure Werte, wie herkömmlich erforderlich, stabil aufbewahrt werden. Daher unterliegt der pH der wässrigen Lösung keinen besonderen Beschränkungen, liegt aber z. B. im Bereich von 5,0 bis 7,5, vorzugsweise 5,0 bis 7,0 und insbesondere 5,5 bis 6,5.
Die Lagertemperatur der die Tetrazoliumverbindung und das Natriumazid enthaltenden wässrigen Lösung unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, liegt aber vorzugsweise im Bereich von 4°C bis 60°C.
Für den Fall, dass die wässrige Lösung bei 4°C aufbewahrt wird, kann man diese z. B. wenigstens 90 Tage aufbewahren, wobei eine spontane Farbentwicklung der Tetrazoliumverbindung unterdrückt ist und die Funktionsweise der Tetrazoliumverbindung erhalten bleibt.
Die in der vorstehend beschriebenen Weise aufbewahrte Tetrazoliumverbindung eignet sich als flüssiges Reagenz einer Tetrazoliumverbindung, weil eine spontane Farbentwicklung der Tetrazoliumverbindung unterdrückt ist und die Funktionsweise der Tetrazoliumverbindung wie vorstehend beschrieben erhalten bleibt, auch wenn man die Tetrazoliumverbindung über einen langen Zeitraum als Lösung aufbewahrt. Die Anwendung des Reagenzes der Tetrazoliumverbindung unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Z. B. kann man das Reagenz der Tetrazoliumverbindung als farbentwickelndes Substrat, als Reduktionsmittel oder dergleichen verwenden, wie vorstehend beschrieben.
Außerdem kann man durch Trocknen der wässrigen Lösung als solche oder Trocknen von Filterpapier oder dergleichen, das mit der wässrigen Lösung wie vorstehend beschrieben imprägniert ist, die Tetrazoliumverbindung als ein Trockenreagenz verwenden.
BEISPIELE
(Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1)
Im Beispiel 1 bewahrte man eine Tetrazoliumverbindung als wässrige Lösung in Gegenwart von Natriumazid auf und bestimmte die Veränderung der Farbe in der wässrigen Lösung. Als Tetrazoliumverbindung verwendete man ein Erzeugnis der Bezeichnung „WST-3" (hergestellt von Dojindo Laborstories, ebenso im Folgenden).
Proben der folgenden Zusammensetzungen wurden durch Versetzen mit Natriumazid hergestellt, so dass die Proben das Natriumazid in jeweils vorbestimmten Konzentrationen enthielten (0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,10, 0,20 g/l). Man bewahrte diese Proben 8 Tage bei 40°C auf.
Nach der Aufbewahrung bestimmte man die Absorption dieser Proben bei der Wellenlänge 450 nm mit einem Spektrophotometer (Lambda 20, hergestellt von PerkinElmer, Inc., ebenso im Folgenden). Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. Die Probe ohne Natriumazid (0 g/l) wurde als Vergleichsbeispiel 1 betrachtet. (Zusammensetzung der Proben)

PIPES-Puffer (pH 7,5) 5 mmol/l

Tetrazoliumverbindung 0,5 mmol/l

Natriumazid vorbestimmte Konzentration

(TABELLE 1)

Natriumazid (g/l) 0 0,01 0,03 0,05 0,07 0,10 0,20

Absorption 0,352 0,207 0,181 0,202 0,192 0,196 0,264
Wie in Tabelle 1 gezeigt, konnte man in Gegenwart des Natriumazids das WST-3 stabil aufbewahren, wobei die Farbentwicklung des WST-3 unterdrückt war, obwohl das WST-3 als wässrige Lösung aufbewahrt wurde. Außerdem konnte das WST-3 ausreichend stabil aufbewahrt werden, obwohl der pH der Proben annähernd neutral und nicht sauer war, wie herkömmlich erforderlich. Außerdem kann man aus den Ergebnissen schließen, dass die Menge des zugesetzten Natriumazids vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 0,2 g/l pro 0,5 mmol/l des WST-3 liegt.
(Beispiel 2, Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 2)
In diesen Beispielen bewahrte man eine Tetrazoliumverbindung und eine Metalloprotei nase als wässrige Lösung in Gegenwart von Natriumazid auf und bestimmte, ob die wässrige Lösung verfärbt und ob die Funktionsweise der Tetrazoliumverbindung erhalten war.
(Aufbewahrungsverfahren)

Man stellte Tetrazoliumverbindung enthaltende Enzymreagenzien her, so dass sie die folgenden Zusammensetzungen aufwiesen. Diese Reagenzien wurden bei vorbestimmten Temperaturen (4°C und 25°C) aufbewahrt, und nach vorbestimmten Zeitspannen nach Beginn der Aufbewahrung entnahm man Proben. Bezüglich der nach den vorbestimmten Aufbewahrungsspannen entnommenen Proben bestimmte man in folgender Weise, ob die Proben verfärbt waren. Außerdem erfolgte in der folgenden Weise die Bestimmung von glykosiliertem Hämoglobin unter Verwendung jeder dieser Proben. In Vergleichsbeispiel 2 stellte man ein Enzymreagenz in gleicher Weise wie in den Beispielen 2 und 3 her, wobei jedoch kein Natriumazid zugesetzt wurde, das in gleicher Weise wie in den Beispielen 2 und 3 aufgewahrt und dem Nachweis einer Verfärbung und der Bestimmung von glykosiliertem Hämoglobin unterworfen wurde. Als nachstehend gezeigte Metalloproteinase verwendete man ein Erzeugnis der Bezeichnung „Metalloproteinase" (Toyobo Co., Ltd.). (Zusammensetzung des eine Tetrazoliumverbindung enthaltenden Enzymreagenzes)

		Beisp. 1	Beisp. 2	Vergleichsbeisp. 3
Metalloproteinase	2,0 g/l	o	o	o
WST-3	2,0 mmol/l	o	o	o
MOPS-Puffer (pH 6,5)	5,0 mmol/l	o	-	-
MES-Puffer (pH 5,5)	5,0 mmol/l	-	o	o
NaN₃	0,05 g/l	o	o	-
CaCl₂	1,0 mmol/l	o	o	o
NaCl	300,0 mmol/l	o	o	o

A. Verfahren zum Nachweis einer Verfärbung
Bezüglich der Enzymreagenzprobe (Aufbewahrungsdauer: 33 Tage) bestimmte man die Absorption (bei der Wellenlänge 450 nm) mit dem vorstehend beschriebenen Spektrophotometer. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. (TABELLE 2) Veränderung der Absorption (Einheit: Absorption)

Bespiel 2 Beispiel 3 Vergleichsbeispiel 2

4°C 25°C 4°C 25°C 4°C 25°C

33 Tage nach Herstellung 0,191 0,284 0,081 0,201 0,299 1,911
B. Bestimmung von glykosiliertem Hämoglobin
Bei der Bestimmung eines Analyten in einer Probe mittels einer Redoxreaktion kann die Messung nicht genau durchgeführt werden, wenn die Probe eine reduzierende Substanz, wie Ascorbinsäure oder Hämoglobin enthält, weil die reduzierende Substanz beispielsweise einen Analyten in Form eines Oxids reduzieren kann, ein farbentwickelndes Substrat Farbe entwickeln kann oder beispielsweise eine entwickelte Farbe verschwinden kann. In diesen Fällen ist eine Tetrazoliumverbindung geeignet, weil sie den Einfluss der reduzierenden Substanz, z. B. eine Reaktionshemmung oder einen vorstehend beschriebenen Farbentwicklungsfehler, eliminieren und so die Genauigkeit der Messung verbessern kann. Wenn man daher die Bestimmung von glykosiliertem Hämoglobin mittels einer Redoxreaktion unter Verwendung einer Tetrazoliumverbindung durchführt, die in Form einer wässrigen Lösung in Gegenwart von Natriumazid aufbewahrt wurde, kann man bestimmen, ob die Tetrazoliumverbindung ihre Funktionsweise nach der Aufbewahrung noch aufweist.
Bei dieser Bestimmung von glykosiliertem Hämoglobin bestimmt man die Menge von glykosiliertem Hämoglobin, indem man das glykosilierte Hämoglobin mit einer Protease abbaut, eine Fructosylaminosäureoxidase (im Folgenden als „FAOD" bezeichnet) mit einer glykosilierten Seitenkettengruppe eines Aminosäurerestes im Abbauprodukt umsetzt, so dass Wasserstoffperoxid erzeugt wird, eine Redoxreaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und einem farbentwickelnden Substrat ablaufen lässt und dann die Farbentwicklung des Substrats bestimmt. Spezielle Vorgehensweisen für diese Bestimmung sind nachstehend beschrieben.
Zuerst verdünnte man jede nachstehend gezeigte Bestimmungsprobe zweifach (nach Volumen) und mischte 25 μl dieser verdünnten Lösung mit jeweils 60 μl der Enzymreagenzproben, die nach der Aufbewahrung über vorbestimmte Zeitspannen entnommen waren, und 25 μl eines nachstehend gezeigten Farbentwicklungsreagenzes. Man ließ die erhaltenen Gemische (110 μl) 15 min bei 37°C reagieren. Anschließend bestimmte man die Absorption der Gemische bei der Hauptwellenlänge 751 nm und der Nebenwellenlänge 805 nm mit einer automatischen biochemischen Analysevorrichtung („JCA-BM 8", hergestellt von Japan Electron Optics Laborator Co. Ltd.).
Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 3 und 4 sowie den 1 und 2 gezeigt. Die Tabelle 3 und 1 zeigen das Ergebnis der Absorptionsmessung für den Fall, dass die die Tetrazoliumverbindung enthaltenden Enzymreagenzproben bei 4°C aufbewahrt wurden und Tabelle 4 und 2 zeigen das Ergebnis der Absorptionsmessung für den Fall, dass die die Tetrazoliumverbindung enthaltenden Enzymreagenzproben bei 25°C aufbewahrt wurden.
(Herstellung der Bestimmungsprobe)

Man stellte die Bestimmungsproben so her, dass sie die folgenden Zusammensetzungen aufwiesen. Die nachstehend gezeigte Hämolysat-Probe wurde hergestellt, indem man Blut einfror, lagerte und dann schmolz, um die Blutzellen zu hämolysieren.

Hämolysat-Probe (Hb-Konzentration 100 g/l	50 μl, 150 μl, 250 μl
20 Gew.-% Polyoxylaurylether	84 μl
1 mol/l Glycinamid-Puffer (pH 9,0)	81 μl
Wasser	Differenz
Gesamtmenge	750 μl

(Zusammensetzung des Farbentwicklungsreagenz)

FAOD	26,0 KU/l
Peroxidase (POD)	78,0 KU/l
Farbentwicklungssubstrat	0,052 mmol/l
Phosphatpuffer (pH 6,9)	0,20 mmol/l

Als FAOD verwendete man ein Erzeugnis der Bezeichnung "Fructosyl Amino Acid Oxidase" (ARKRAY, INC.). Außerdem verwendete man als Farbentwicklungssubstrat ein Erzeugnis der Bezeichnung „DA-64” (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). (TABELLE 3) Aufbewahrungstemperatur: 4°C

	Absorption
Aufbewahrungsdauer	Beispiel 2	Beispiel 3	Vergleichsbeisp. 2
0 Tage	0,01159	0,00994	0,01652
5 Tage	0,01797	0,01315	0,00480
9 Tage	0,3295	0,02392	0,00967
20 Tage	0,03591	0,02350	0,00058
26 Tage	0,03502	0,02263	–0,0081
33 Tage	0,01934	0,01338	–0,0033

(TABELLE 4) Aufbewahrungstemperatur: 25°C

	Absorption
Aufbewahrungsdauer	Beispiel 2	Beispiel 3	Vergleichsbeisp. 2
0 Tage	0,01159	0,00994	0,01652
5 Tage	0,01888	0,01335	0,00096
9 Tage	0,4028	0,02840	0,01206
20 Tage	0,03220	0,02172	0,00298
26 Tage	0,02792	0,02076	–0,0051
33 Tage	0,01439	0,01125	–0,0048

Bezüglich der spontanen Farbentwicklung der Tetrazoliumverbindung für den Fall, dass die Tetrazoliumverbindung als Lösung aufbewahrt wurde, war die Farbentwicklung in den Beispielen 2 und 3 stärker unterdrückt als im Vergleichsbeispiel 2, wie aus Tabelle 2 ersichtlich. Hinsichtlich der Bestimmung des glykosilierten Hämoglobins nahm im Vergleichsbeispiel 2 die Absorption mit der Zeit ab, was bedeutet, dass die Tetrazoliumverbindung ihre Funktionsweise allmählich verlor, den Einfluss der reduzierenden Substanz zu eliminieren. In den Beispielen 2 und 3 war die Absorption nach 30-tägiger Aufbewahrung im Wesentlichen die gleiche wie nach 0 Tagen Aufbewahrung, was bedeutet, dass die Funktionsweise der Tetrazoliumverbindung stabil erhalten war. Hinsichtlich der Aufbewahrungsbedingungen fanden wir außerdem, dass die Tetrazoliumverbindung bei pH 6,5, der näher am Neutralpunkt ist, eine höhere Stabilität zeigt als bei pH 5,5. Wie aus den 1 und 2 ersichtlich ist, wurde in den Beispielen 2 und 3 eine Zunahme der Absorption beobachtet und eine besonders hohe Absorption blieb 10 bis 26 Tage nach Beginn der Aufbewahrung erhalten. Aus diesem Umstand kann geschlossen werden, dass bei Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung in Form einer Lösung in Gegenwart von Natri umazid die Tetrazoliumverbindung stabilisiert werden kann und daneben die Empfindlichkeit der Messung verbessert werden kann
(Beispiel 4 und Vergleichsbeispiel 3)
In Beispiel 4 bewahrte man eine Tetrazoliumverbindung als wässrige Lösung mit einem vorbestimmten pH in Gegenwart von Natriumazid auf und untersuchte die Änderung der Absorption der wässrigen Lösung.

Die Proben (A1 bis A3, B1 bis B3) wurden so hergestellt, dass sie die folgenden Zusammensetzungen aufwiesen, und bei 40°C aufbewahrt. Die Absorption dieser Proben bei der Wellenlänge 450 nm wurde 3 Tage und 8 Tage nach dem Beginn der Aufbewahrung mit dem vorstehend beschriebenen Spektrometer gemessen. Die Veränderung der Absorption jeder Probe über 5 Tage wurde bestimmt. (Zusammensetzung der Proben im Beispiel 4)

	A1	A2	A3	B1	B2	B3
Art der Pufferlösung	MES	MOPS	PIPES	MES	MOPS	PIPES
pH der Pufferlösung	5,5	6,5	7,5	5,5	6,5	7,5
WST-3 (mmol/l)	0,5	0,5	0,5	2,0	2,0	2,0
NaN₃ (g/l)	0,05	0,05	0,05	0,1	0,1	0,1

Im Vergleichsbeispiel 3 stellte man darüber hinaus Proben in gleicher Weise wie im Beispiel 4 her, wobei jedoch kein Natriumazid zugegeben wurde. Die so erhaltenen Proben (a1 bis a3, b1 bis b3) des Vergleichsbeispiels 3 entsprechen den Proben (A1 bis A3, B1 bis B3) des Beispiels 4. Die Proben a1 bis a3 und b1 bis b3 wurden unter den gleichen Bedingungen aufbewahrt wie diejenigen in Beispiel 4, und die Veränderung der Absorption jeder Probe wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 und den 3A und 3B gezeigt. Die 3A zeigt das Ergebnis bezüglich der Proben A1 bis A3 und a1 bis a3, und 3B zeigt das Ergebnis bezüglich der Proben B1 bis B3 und b1 bis b3. (TABELLE 5) Veränderung der Absorption (5 Tage)

Beispiel 4 Vergleichsbeispiel 3

A1 0,036 a1 0,093

A2 0,083 a2 0,105

A3 0,133 a3 0,258

B1 0,033 b1 0,058

B2 0,023 b2 0,161

B3 0,430 b3 0,663
Wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist, war die Veränderung der Absorption in den Proben (A1 bis A3 und B1 bis B3) des Beispiels 4 weniger ausgeprägt als in den entsprechenden Proben (a1 bis a3 und b1 bis b3) des Vergleichsbeispiels 3. Daraus kann man schließen, dass eine Tetrazoliumverbindung in Gegenwart von Natriumazid stabil aufbewahrt werden kann.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Wie vorstehend im Einzelnen beschrieben, kann man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Tetrazoliumverbindung nicht nur unter sauren Bedingungen, sondern auch unter anderen pH-Bedingungen stabil aufbewahren. Wenn ein eine Tetrazoliumverbindung enthaltendes flüssiges Reagenz erforderlich ist, ist es daher nicht notwendig, ein Reagenz für jede Anwendung herzustellen. Dies erlaubt die kostengünstige Herstellung des Reagenzes und vereinfacht außerdem die Arbeitsweise.

Claims

Verfahren zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung, bei dem man die Tetrazoliumverbindung in Gegenwart von Natriumazid aufbewahrt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Tetrazoliumverbindung (A) und das Natriumazid (B) in einem Verhältnis (molares Verhältnis A:B) im Bereich von 1:0,02 bis 1:6,2 vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Tetrazoliumverbindung und das Natriumazid in einer Lösung vorliegen und eine Konzentration der Tetrazoliumverbindung im Bereich von 0,5 bis 8 mmol/l liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Tetrazoliumverbindung und das Natriumazid in einer Lösung vorliegen und eine Konzentration des Natriumazids in einem Bereich von 0,08 bis 3,2 mmol/l liegt.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei ein pH der Lösung in einem Bereich von 5,0 bis 7,5 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei der Tetrazoliumverbindung um 2-(4-Iodphenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazoliumsalz handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Aufbewahrungstemperatur in einem Bereich von 4°C bis 60°C liegt.
Stabilisator zur stabilen Aufbewahrung einer Tetrazoliumverbindung, umfassend Natriumazid.
Reagenzlösung, umfassend ein wässriges Lösungsmittel und eine im wässrigen Lösungsmittel gelöste Tetrazoliumverbindung, wobei in dem wässrigen Lösungsmittel außerdem Natriumazid gelöst ist.
Trockenreagenz, enthaltend eine Tetrazoliumverbindung, erhalten durch Trocknen eines wässrigen Lösungsmittels, in dem die Tetrazoliumverbindung und Natriumazid gelöst sind.