CN1553903A

CN1553903A - 四唑鎓化合物的保存方法、其中使用的稳定剂、以及使用该方法的四唑鎓化合物试剂溶液

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Publication number: CN1553903A
Application number: CNA028176197A
Authority: CN
Inventors: 石丸香; 米原聪
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2004-12-08
Anticipated expiration: 2022-09-25
Also published as: US8192996B2; DE60224839T2; US20090215026A1; JP4336886B2; EP1464643B1; CN1291980C; EP1464643A4; EP1464643A1; ATE384705T1; US20040157285A1; WO2003029229A1; JPWO2003029229A1; DE60224839D1

Abstract

本发明提供一种稳定保存四唑鎓化合物的方法。在使四唑鎓和叠氮化钠共存的状态下保存。四唑鎓化合物和叠氮化钠的添加比例(A∶B)范围为1∶0.02～1∶6.2。在以溶液状态保存的情况下，所述叠氮化钠的浓度范围为0.08～3.3mmol/L。四唑鎓化合物优选2－(4－碘苯基)－3－(2，4－二硝基苯基)－5－(2，4－二磺苯基)－2H－四唑鎓盐。

Description

四唑鎓化合物的保存方法、其中使用的稳定剂、以及使用该方法的四唑鎓化合物试剂溶液

技术领域

本发明涉及一种稳定保存四唑鎓化合物的方法、其中使用的稳定剂、以及使用所述方法的四唑鎓化合物试剂。

背景技术

四唑鎓化合物一般地被用作氧化还原色素(发色基质)(color-developing substrate)或还原剂等。在这种情况下，通常将四唑鎓化合物溶解在水中，作为液体试剂使用。

但是，如果长时间保存所述四唑鎓化合物溶液，所述溶液的pH值在接近中性的情况下，四唑鎓化合物的稳定性差，例如出现由于四唑鎓化合物的自然发色(spontaneous color development)而使所述溶液着色，或者失去了还原剂的作用等问题。为此，在使用四唑鎓化合物溶液时，只能使用在每次使用时配制的、或者可以使液体状态的四唑鎓化合物稳定的酸性条件下保存的溶液。

发明内容

将四唑鎓化合物用在酶反应体系中时，需要根据反应设定各种条件。特别是酶具有各自适宜的pH值或pH值稳定性，它不仅限于在酸性附近，许多是在碱性附近、特别是在中性附近。为此，在中性附近进行酶反应时，对酸性的四唑鎓化合物溶液，在使用时需要调整反应体系的pH值，操作烦琐。

本发明的目的是提供一种不限于在酸性范围，而且在其它pH值条件下，能够稳定保存四唑鎓化合物的方法。

为了实现所述目的，本发明的四唑鎓化合物的保存方法是一种稳定地保存四唑鎓化合物的方法，其特征在于使其和叠氮化钠共存。这样只要使四唑鎓化合物和叠氮化钠共存，就能在不仅限于酸性范围内，而且在其它pH值条件下，能抑制四唑鎓化合物的自然发色，并维持其性能，从而实现在稳定化的状态下进行保存。

另外，本发明中的保存形态可以是溶液状态，也可以是干燥状态。在干燥状态下保存时，也可以在含有四唑鎓化合物的溶液中添加叠氮化钠，使混合液在保持原状下干燥，被滤纸等多孔性材料等含浸之后，使其干燥，然后保存。

通常，所述叠氮化钠被用作防腐剂。但是，本发明中添加叠氮化钠不是防腐的目的，而是为了在抑制四唑鎓化合物的自然发色，并在维持其性能的稳定化的状态下保存而添加。为此，叠氮化钠使四唑鎓化合物稳定化是本发明者最早发现的。

本发明的保存方法中，四唑鎓化合物(A)和叠氮化钠(B)的添加比例(摩尔比A∶B)范围优选1∶0.02～1∶6.2。

本发明的保存方法中，在使四唑鎓化合物和叠氮化钠在溶液中共存，稳定地保存所述四唑鎓的时候，优选设定叠氮化钠的浓度范围为0.08～3.2mmol/L，更优选0.08～0.8mmol/L。因为只要是所述浓度就能够更稳定地保存四唑鎓化合物。另外在将叠氮化钠如前所述作为防腐剂使用时，为了显示防腐效果需要添加浓度为约0.05～0.2重量％(7.7～31mol/L)。但是本发明中叠氮化钠的浓度为0.08～3.2mmol/L时，四唑鎓化合物显示极佳的稳定性。相反地，在该浓度几乎没有发现防腐剂的效果。总之，不能根据叠氮化钠的防腐效果来说明实现了四唑鎓化合物的稳定化。所述防腐效果和四唑鎓化合物的稳定化效果可以说是完全不同的作用效果。

本发明的保存方法中，四唑鎓化合物的浓度范围优选0.5～8mmol/L。

本发明的保存方法中，相对于四唑鎓化合物1mmol，优选添加叠氮化钠的浓度范围为0.02～6.2mmol/L。

本发明的保存方法中，对所述溶液的pH值没有特别的限定，例如可以是5.0～7.5的范围、优选5.0～7.0的范围，更优选5.5～6.5的范围。

本发明的保存方法中四唑鎓化合物优选2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。

其次，本发明的稳定剂是一种用于稳定地保存四唑鎓化合物的稳定剂，含有叠氮化钠。因为如前所述叠氮化钠可以使四唑鎓化合物稳定。

其次，本发明的四唑鎓化合物试剂是一种将四唑鎓化合物溶解在水性溶剂中的试剂溶液，而且是一种溶解有叠氮化钠的试剂溶液。这样的试剂，即使是溶液，也可以使保存中产生的四唑鎓化合物自然发色、性能的丧失得到抑制。为此不需要在每次使用时配制溶液试剂，使用四唑鎓化合物来进行的各种测定反应等操作简单化。

另外，本发明的干燥试剂是一种含有四唑鎓化合物的试剂。是一种使溶解有四唑鎓化合物和叠氮化钠的水性溶剂干燥的干燥试剂。溶解有四唑鎓化合物和叠氮化钠的所述水性溶剂可以保持原状态使其干燥，也可以使其含浸在滤纸等中进行干燥。

附图说明

图1是显示本发明的保存方法的一个实施例中与糖化血红蛋白量相应的吸光度随时间变化的曲线图。

图2是显示前述实施例中与糖化血红蛋白量相应的吸光度随时间变化的曲线图。

图3是本发明的保存方法的其它的实施例中显示吸光度变化的曲线图，显示的(A)图是WST-3浓度为0.5mmol/L、叠氮化钠为0.05g/L时的结果、(B)图是WST-3浓度为2.0mmol/L、叠氮化钠为0.1g/L时的结果。

具体实施方式

本发明的保存方法中，所述四唑鎓化合物优选具有在四唑环至少2个位置上具有环结构取代基的结构，特别优选在3个位置具有环结构取代基的结构。

所述四唑鎓化合物如前所述在所述四唑环的至少2个位置具有环结构取代基时，优选在所述四唑环的2位和3位上具有所述取代基。另外，在所述四唑环的至少3个位置具有环结构取代基时，优选在所述四唑环的2位、3位和5位上具有所述取代基。

四唑鎓化合物中，至少2个环结构取代基的环结构优选为苯环。所述苯环之外的环结构取代基例如有在环骨架上含有S或O，而且为共振结构的取代基，例如噻嗯基、噻唑基等。

另外，所述四唑鎓化合物优选在四唑环的至少3个位置上具有环结构取代基，所述环结构取代基中至少2个环结构取代基的环结构为苯环。

再者，优选至少1个环结构取代基含有官能团，更优选有多个所述官能团。

所述官能基团优选吸电子的官能基团，例如卤素基、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。除此之外例如有：过氧羟基、羟基、环氧基、环二氧基、桥氧基等含有氧的特性基团，或巯基、烷硫基、甲基硫甲基、硫代基、亚磺基、苯磺酰基、苯基磺酰基、p-甲苯磺酰基、p-甲苯磺酰基、对甲苯磺酰基、氨磺酰、异硫氰酸酯基等含有硫的特性基团。这些吸电子官能团中优选硝基、磺基、卤素基、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基。另外除所述吸电子官能团之外，例如还有苯基(C₆H₅-)、苯乙烯基(C₆H₅CH＝CH-)等不饱和烃基。另外所述官能团基也可以通过解离而离子化。

另外，所述四唑鎓化合物优选在四唑环的2位和3位上具有苯环，所述苯环中至少一方含有选自卤素基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基和乙氧基之中的至少一种官能团。另外所述两方的苯环也可以具有所述官能团。在所述苯环中，在任何位置(邻-、间-、对-)上也可以具有所述官能团。官能基团数也没有限制，可以具有相同的官能团，也可以具有不同的官能团。

所述四唑鎓化合物，例如作为所述四唑环的2位、3位和5位上具有苯环结构取代基的化合物例如有：2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3’-(1，1’-联苯-4，4’-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3’-[3，3’-双甲氧基-(1，1’-联苯)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)-四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(p-二苯基)四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-(p-二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(m-甲苯基)四唑鎓盐以及2，5-二苯基-3-(p-甲苯基)四唑鎓盐等。

另外，所述四唑鎓化合物不限于上述的化合物，除此之外也可以使用在所述四唑环的2个位置上具有苯环结构取代基和1个位置上具有其它的环结构取代基的化合物，例如有：2，3-二苯基-5-(2-噻嗯基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-硫代乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐、2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-双[4-二(2-硫代乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-联苯撑)二四唑鎓盐以及3-(4，5-二甲基-2-氨基甲酰基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。

也可以使用在所述四唑环的2个位置上具有苯环结构取代基和1个位置上具有不是环结构的取代基的四唑鎓化合物。例如有：2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。

所述的四唑鎓化合物中如前所述优选具有3个环结构取代基的化合物，特别优选环结构具有3个苯环取代基且具有多个吸电子官能团，特别优选2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。另外，这样的四唑鎓化合物可以是盐，也可以是离子化的状态等。

本发明的四唑鎓化合物的保存是，例如将所述四唑鎓化合物和稳定剂叠氮化钠溶解在水性溶剂中，配制四唑鎓化合物水溶液，将其保存即可。所述水溶液中的四唑鎓化合物的浓度没有特别限定，但考虑四唑鎓化合物相对水的溶解度等，如前所述浓度范围例如为0.5～8mmol/L。

另一方面，叠氮化钠的浓度范围如前所述例如为0.08～3.2mmol/L、优选0.08～0.8mmol/L。

叠氮化钠相对四唑鎓化合物的添加比例范围是，相对四唑鎓化合物1mmol/L，叠氮化钠例如优选为0.02～6.2mmol/L。

所述水性溶剂例如可以使用水、各种缓冲溶液等。所述缓冲液例如可以使用磷酸缓冲液、配好的缓冲液(MES、MOPSO、MOPS、DIPSO、TES、POPSO、HEPES)等，优选使用MES、MOPS，更优选使用MES。所述缓冲液的pH值范围例如5.0～7.5，优选5.0～7.0，特别优选5.5～6.5。

所述四唑鎓化合物只要使其和叠氮化钠共存，就可以不用将水溶液的pH值设定在以前的酸性范围而稳定地保存，因而配制的水溶液的pH值没有特别限定，例如为5.0～7.5的范围，优选5.0～7.0的范围，更优选5.5～6.5的范围。

使所述四唑鎓化合物和叠氮化钠共存的水溶液的保存温度没有特别限定，例如优选4～60℃。

将所述水溶液保存在4℃时，结果显示例如至少在90天以上的期间内能够抑制自然发色，并且可以维持四唑鎓化合物的性能。

按照这样的方法保存的四唑鎓化合物，长时间以溶液状态进行保存，可以如前所述抑制自然发色，维持其性能，因而作为液体的四唑鎓化合物试剂是有用的。所述四唑鎓化合物试剂的用途没有限定，例如可以作为如前所述的发色基质或还原剂等。

另外如前所述，通过按原样干燥所述水溶液，或者使其含浸在滤纸等中进行干燥，也可以作为干燥试剂使用。

实施例

(实施例1和比较例1)

本实施例是在叠氮化钠存在下，以水溶液的状态保存四唑鎓化合物，考察所述水溶液的着色变化的例子。作为所述四唑鎓化合物，使用商品名WST-3(同仁化学社制造、以下相同)。

叠氮化钠添加到预定的浓度(0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.20g/L)，配制如下组成的样品，将其在40℃保存8天。然后利用分光光度计(商品名Lambda20：パ-キンェルマ-社制造，以下相同)测得这些样品在450nm处的吸光度。将结果示于下表中。另外，不添加叠氮化钠(0g/L)作为比较例1。

(样品的组成)

PIPES缓冲液(pH7.5) 5mmol/L

四唑鎓化合物 0.5mmol/L

叠氮化钠预定浓度

表1

叠氮化钠(g/L) 0 0.01 0.03 0.05 0.07 0.10 0.20

吸光度 0.352 0.207 0.181 0.202 0.192 0.196 0.264

如表1所示，只要叠氮化钠存在，在水溶液状态下也可以抑制WST-3发色，从而稳定地保存，而且与已有技术不同的是不限于酸性条件，即使在中性附近也可以充分稳定地保存。叠氮化钠的添加量范围相对0.5mmol/L的WST-3优选0.01～0.2g/L。

(实施例2、实施例3和比较例2)

本实施例是在叠氮化钠存在下，以溶液状态保存四唑鎓化合物和金属蛋白酶，考察所述溶液有无着色、四唑鎓化合物的性能维持情况的例子。

(保存方法)

按照如下组成配制含有四唑鎓化合物的酶试剂。在预定的温度(4℃、25℃)下保存这些试剂，按不同的时间取样。对于在各保存时间取出的每个酶试剂，如下所示，确认试剂发色，再测定使用了所述试剂的糖化血红蛋白。比较例2除不添加叠氮化钠之外，其余和所述实施例2和3一样进行酶试剂的配制、保存、着色确认并测定糖化血红蛋白。作为下述的金属蛋白酶，一个商品名为“Metalloproteinase”(TOYOBO公司制造)的产品已被使用。

(含有四唑鎓化合物的酶试剂的组成)

实施例2 实施例3 比较例2

金属蛋白酶 2.0g/L O O O

WST-3 2.0mmol O O O

MOPS缓冲液(pH6.5) 5.0mmol O - -

MOPS缓冲液(pH6.5) 5.0mmol - O O

NaN₃ 0.05g/L O O -

CaCl₂ 1.0mmol O O O

NaCl 300.0mmol O O O

A着色的确认方法

对于所述取样的酶试剂(保存天数33天)，使用所述分光光度计，测定吸光度(波长450nm)。结果示于下表2中。

(表2)

吸光度的变化(单位：吸光度)

实施例2 实施例3 比较例2

4℃ 25℃ 4℃ 25℃ 4℃ 25℃

配制后33天 0.191 0.284 0.081 0.201 0.299 1.911

B糖化血红蛋白的测定

在使用氧化还原反应的测定方法中，试样中存在抗坏血酸或血红蛋白等还原物质时，作为测定对象物的氧化物被所述还原物质还原，或者使发色基质发色。相反由于所述发色消失，有时不能进行正确地测定。这种情况下，四唑鎓化合物具有排除所述还原物质产生的反应阻碍或误发色等的影响的机能，由此起到提高测定精度的作用。因而在叠氮化钠存在下，使用以溶液状态保存的四唑鎓化合物，测定使用所述氧化还原反应的糖化血红蛋白，由此考察通过所述的保存，四唑鎓化合物的机能是否能够维持。

该糖化血红蛋白的测定方法是利用蛋白酶分解糖化血红蛋白，使分解物中的氨基酸残基糖化的侧链基和果糖氨基酸氧化酶(以下称为FAOD)发生作用，使产生的过氧化氢和发色基质进行氧化还原反应，测定所述基质的发色量，由此测定糖化血红蛋白。下面说明测定方法。

首先将下述测定试样用水稀释2倍(体积)后的稀释液25μL，与取出的前述保存后的酶试剂60μL及下述发色试剂25μL混合。然后利用生化自动分析仪(商品名JCA-BMB：日本电子社制造)，使该混合液(110μL)在37℃下反应15分钟，测定在主波长751nm和副波长805nm处的吸光度。

将结果示于下述表3、4和图1、2。下述表3和图1为含有所述四唑鎓化合物酶试剂4℃保存时的吸光度结果。下述表4和图2为所述酶试剂25℃保存时的吸光度结果。

(测定试样的配制)

按照下述组成配制测定试样。将血液冻结保存后，溶解，使血球溶血，由此配制下述溶血试样。

溶血试样(Hb浓度100g/L) 50μL、150μL、250μL

20重量％聚环氧十二烷基醚 84μL

1mol/L甘氨酰胺缓冲液(pH9.0) 81μL

水余量

总量 750μL

(发色试剂的组成)

FAOD 26.0KU/L

过氧化酶(POD) 78.0KU/L

发色基质 0.052mmol/L

磷酸缓冲溶液(pH6.9) 0.20mmol/L

作为所述的FAOD，一个商品名为“Fructosyl Amino Acid Oxidase”(爱科来株式会社制造)的产品已被使用，作为所述发色基质，一个商品名为DA-64(和光纯药工业社制造)的产品已被使用。

(表3)

保存温度：4℃

吸光度

保存天数实施例2 实施例3 比较例2

0天 0.01159 0.00994 0.01652

5天 0.01797 0.01315 0.00480

9天 0.03295 0.02392 0.00967

20天 0.03591 0.02350 0.00058

26天 0.03502 0.02263 -0.0081

33天 0.01934 0.01338 -0.0033

(表4)

保存温度：25℃

吸光度

保存天数实施例2 实施例3 比较例2

0天 0.01159 0.00994 0.01652

5天 0.01888 0.01335 0.00096

9天 0.04028 0.02840 0.01206

20天 0.03220 0.02172 0.00298

26天 0.02792 0.02076 -0.0051

33天 0.01439 0.01125 -0.0048

首先，关于在溶液状态下保存的四唑鎓化合物的自然发色，如前述表2所示，与比较例对照，实施例可以显著地抑制自然发色，可以稳定地保存。关于测定糖化血红蛋白，从比较例中可见随着保存天数增加吸光度减小，四唑鎓化合物排除还原物质影响的机能逐渐消失。相反地，实施例中保存30天后，显示和0天大致相同的吸光度，可以稳定地保持四唑鎓化合物的性能。对于保存条件，与pH5.5相比，认为中性附近的pH6.5的稳定性更好。而且，如图1和图2所示，在实施例2和3中可见到吸光度增加，在保存开始后10天到26天之间，维持相当高的吸光度。由此可见，使四唑鎓化合物和叠氮化钠在溶液中共存保存，不仅可以保持稳定，而且也可以提高测定灵敏度。

(实施例4、比较例3)

本实施例是在叠氮化钠存在下，在预定pH值的水溶液中保存四唑鎓化合物，考察所述水溶液的吸光度变化的例子。

配制样品(A1～A3、B1～B3)为以下组成，在40℃保存，利用所述分光光度计测定这些样品在450nm处的吸光度，测定5天间吸光度的变化。

(实施例4的样品组成)

A1 A2 A3 B1 B2 B3

缓冲液的种类 MES MOPS PIPES MES MOPS PIPES

缓冲液的pH值 5.5 6.5 7.5 5.5 6.5 7.5

WST-3(mmol/L) 0.5 0.5 0.5 2.0 2.0 2.0

NaN₃(g/L) 0.05 0.05 0.05 0.1 0.1 0.1

作为比较例3，除叠氮化钠不添加之外，其它和所述实施例4相同地配制样品，将其制成与实施例的各样品(A1～A3、B1～B3)对应的比较例的样品(a1～a3、b1～b3)。在同样的条件下保存，求得吸光度的变化。将结果示于下述表5和图3。在同一图中，(A)为样品A1～A3和a1～a3的结果，(B)为样品B1～B3和b1～b3的结果。

(表5)

吸光度变化(5天)

实施例4 比较例3

A1 0.036 a1 0.093

A2 0.083 a2 0.105

A3 0.133 a3 0.258

B1 0.033 b1 0.058

B2 0.023 b2 0.161

B3 0.430 b3 0.663

如前述表5所示，实施例4的各样品(A1～A3、B1～B3)和对应的比较例3样品(a1～a3、b1～b3)相比，吸光度变化被抑制。因而可以认为使其和叠氮化钠共存，可以稳定地保存四唑鎓化合物。

如上所述，利用本发明的保存方法，不限于在酸性范围，而且在其它pH值条件下，可以稳定地保存四唑鎓化合物。为此，即使是需要四唑鎓化合物的液体试剂的场合，也不需要每次配制试剂，因而可以降低试剂的成本，操作简便。

Claims

1、一种稳定地保存四唑鎓化合物的方法，其特征在于，使四唑鎓化合物和叠氮化钠共存。

2、如权利要求1所述的保存方法，其中，四唑鎓化合物(A)和叠氮化钠(B)的添加比例以摩尔比A∶B计是在1∶0.02～1∶6.2的范围。

3、如权利要求1或2所述的保存方法，其中使四唑鎓化合物和叠氮化钠在溶液中共存，且四唑鎓化合物的浓度范围是0.5～8mmol/L。

4、如权利要求1～3任意一项所述的方法，其中使四唑鎓化合物和叠氮化钠在溶液中共存，且叠氮化钠的浓度范围为0.08～3.2mmol/L。

5、如权利要求3或4所述的方法，其中溶液的pH值范围为5.0～7.5。

6、如权利要求1～5任意一项所述的方法，其中四唑鎓化合物是2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。

7、如权利要求1～6任意一项所述的方法，其中保存温度范围为4℃～60℃。

8、一种用于稳定地保存四唑鎓化合物的稳定剂，其含有叠氮化钠。

9、一种试剂溶液，其是通过将四唑鎓化合物溶解在水性溶剂中，再使该水性溶剂溶解叠氮化钠而成。

10、一种含有四唑鎓化合物的干燥试剂，其是通过将溶解有四唑鎓化合物和叠氮化钠的水性溶剂干燥后得到。