CN1243982C - 利用氧化还原反应的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质的方法，该方法可得到可信性优异的测定值。在所述氧化还原反应之前，在表面活性剂存在下，向样品中添加四唑鎓化合物，以排除所述样品中含有的血红蛋白以及血红蛋白分解物作为还原物质的影响，然后由所述测定对象物质产生还原物质或氧化物质，通过氧化还原反应测定该量，由该测定值确定所述测定对象物质的量。本方法可以防止因表面活性剂与血红蛋白混在而产生的浑浊，因此如图1所示，可以抑制因浑浊而导致的吸光度上升。所述表面活性剂可以使用聚氧乙烯醚等。

Description

利用氧化还原反应的测定方法
技术领域
本发明涉及利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质的方法。
背景技术
利用氧化还原反应对样品中的测定对象物质的量进行测定的方法已得到广泛应用，例如也适用于生化分析或临床检验等中的糖基化蛋白质的测定。
例如，血液中的糖基化蛋白质，特别是红细胞中的糖基化血红蛋白反映了生物体内血糖值的过去的情况，因此被作为糖尿病诊断、治疗等的重要指标。这类红细胞中的糖基化蛋白质可以如下所示利用上述氧化还原反应进行测定。
首先配制红细胞溶血后的样品，将该溶血样品用果糖氨基酸氧化酶(以下称为“FAOD”)进行处理，使之与糖基化蛋白质的糖基化部分作用而产生过氧化氢。该过氧化氢量对应于上述糖基化蛋白质的量。然后在该样品中添加过氧化酶(以下称为“POD”)以及还原剂，将上述POD作为催化剂使上述过氧化氢和上述还原剂发生氧化还原反应。此时，如果上述还原剂使用因氧化而发色的发色性底物，则通过对该发色进行测定，可以测定上述过氧化氢量，结果可得知红细胞中的糖基化蛋白质的量。
但是，血液中通常存在抗坏血酸(AsA)、胆红素等各种还原物质，红细胞中还存在有谷胱甘肽(GSH)等各种还原物质。这些还原物质也会例如还原产生的上述过氧化氢，阻碍上述氧化还原反应，或再度还原因氧化而发色的上述发色性底物而褪色。因此，存在难以准确测定红细胞中的糖基化蛋白质的量的问题。
另外由于每个样品中所含的上述还原物质的浓度也不是一定的，因此也存在测定精度差的问题。
为了避免这些问题，提出了将各种氧化剂添加到上述样品中的方法。例如，特开昭56-151358号公报中公开了用碘酸或高碘酸等卤素氧化物作为氧化剂的方法，特开昭57-13357号公报、特开昭57-161650号公报、特开昭59-193354号公报、特开昭62-169053号公报、特开平3-30697号公报中公开了用钴、铁、铈等金属络合物作为氧化剂的方法。
发明的公开
但是，即使是经这样改良的传统方法仍然存在因样品不同而无法充分提高测定精度的情况。另外，如上所述，血液中的糖基化蛋白质被作为糖尿病诊断、治疗等的重要指标，因此希望利用氧化还原反应测定糖基化蛋白质的测定方法进一步提高测定精度。
因此，本发明的目的在于提供利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质的方法，该方法可获得可信性优异的测定值。
为了达到上述目的，本发明的测定方法利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质，其特征在于：在上述氧化还原反应之前，在表面活性剂的存在下，向样品中添加四唑鎓化合物以排除上述样品中的还原物质的影响，之后通过氧化还原反应测定由上述测定对象物质产生的还原物质或氧化物质的量，由该测定值确定上述测定对象物质的量。上述四唑鎓化合物是指具有四唑环结构的化合物。另外，本发明中的“由测定对象物质产生的还原物质或氧化物质”是指测定对象物质本身或其中的氧化还原物质，或由测定对象物质利用氧化还原酶等产生的氧化还原物质双方。
本发明者们发现：上述传统的方法虽然排除了上述GSH、AsA这样的低分子量还原物质的影响，但并未排除蛋白质等高分子量还原物质的影响。而另一方面，如果用上述四唑鎓化合物进行处理，则不仅能排除上述低分子量还原物质，还可以排除上述高分子量还原物质，特别是血红蛋白和血红蛋白分解物(以下将两者一并称为“血红蛋白”)作为还原物质的影响。关于上述内容，本申请人正另行申请专利(特开2000-210100号公报)。然而，由于该方法虽然排除了血红蛋白等高分子量还原物质的影响，但还未能充分提高测定精度，或者希望进一步提高测定精度，本发明者们进行了更深入的研究。结果发现：通过上述四唑鎓化合物的处理可以排除例如血红蛋白等高分子量还原物质的影响，通过将上述两者混合可以查明反应液中产生了浑浊，并且可以通过表面活性剂来防止该浑浊的发生，从而实现了本发明。根据本发明所述的测定方法，通过四唑鎓化合物排除还原物质的影响，并抑制由于上述四唑鎓化合物的处理而产生的浑浊，因此可以防止因还原物质以及浑浊双方对测定的妨碍，可以进行更高精度的测定。因而本发明的测定方法适用于如上所述的临床医疗等中的各种检查，特别是如果适用于糖基化血红蛋白的测定，则会提高作为糖尿病诊断等指标的可信性。
本发明的测定方法中，上述样品是含有血红蛋白以及血红蛋白分解物的样品，优选排除上述样品中的血红蛋白以及血红蛋白分解物作为还原物质的影响。特别是可以排除样品中的血红蛋白作为还原物质的影响，并可排除因上述两者引起的浑浊。因而可以说对后面所述的血液样品是有用的测定。
本发明的测定方法中，向样品中添加四唑鎓化合物之后，也可以再向产生了浑浊的混合液中添加表面活性剂，但从可抑制产生浑浊本身来讲，优选将上述两者同时添加，或向事先添加了表面活性剂的样品中添加四唑鎓化合物。
本发明的测定方法中，根据上述氧化还原反应进行的测定优选对由上述反应产生的发色物质的吸光度进行测定。
进行上述吸光度测定时通常以双波长测定为主要方式。上述双波长测定是将表示待测定对象物质(例如发色性底物等发色物质)的最大吸收的波长作为主波长，对上述对象物质进行测定，再将与上述主波长不同的波长作为副波长，测定其电气干扰、样品的浊度、光量的变化等，对上述主波长的测定值进行校正。因而，副波长是例如其他混在的物质不显示吸收的波长，且优选将其设定为与主波长相差至少约80nm。因此，本发明者们进一步研究的结果发现：在不存在表面活性剂的条件下用四唑鎓化合物处理Hb，则在约700-900nm，特别是约760nm-900nm的波长处可见这些反应物的吸收，虽然用该波长测定是困难的，但如果在表面活性剂存在的条件下进行四唑鎓化合物处理，则在上述波长未见吸收。因此，如果将上述发色物质的测定波长(主波长、副波长)设定在该约700nm-900nm的吸收波长处，则不仅可以防止上述浑浊，更可不受Hb的吸收的影响，高精度地进行吸光度的测定。
本发明的测定方法中，测定上述发色物质的吸光度的测定波长优选650-900nm，更优选650-800nm，特别优选690-760nm。另外，以上述波长为主波长时，副波长优选比上述主波长长，例如优选730-900nm，更优选800-900nm，特别优选800-850nm。
本发明的测定方法中，优选上述表面活性剂为选自非离子型表面活性剂、烷基硫酸盐以及高分子化合物中的至少一种表面活性剂。
上述非离子型表面活性剂有例如聚氧乙烯醚、脱水山梨糖醇脂肪酸酯等，优选聚氧乙烯醚。
上述聚氧乙烯醚[CLHM-O-(CH2CH2O)NH]是指聚氧乙烯链和烃链以醚键连接，上述烃链有例如烷基、烷基苯基等。优选上述聚氧乙烯链的重均聚合度(N)为8-23，另一方的烃链中的碳原子数(L)为8-18；更优选上述重均聚合度(N)为8-15，烃链中的碳原子数(L)为8-16；特别优选上述重均聚合度(N)为8-10，烃链的碳原子数(L)为8-14。另外，上述烃链例如可以是直链，也可以有支链。上述聚氧乙烯醚的具体例子有例如聚氧乙烯-对-叔辛基苯基醚、聚乙二醇(10)月桂基醚、聚乙二醇(9)月桂基醚等。
上述脱水山梨糖醇脂肪酸酯有例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇烷基酯等。
上述烷基硫酸盐有例如月桂基硫酸钠、月桂基苯磺酸钠、2，4-二甲基苯磺酸钠等。
上述高分子化合物可以使用例如水溶性明胶、支链淀粉等生物高分子化合物，以及聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮等合成高分子化合物。聚乙二醇的重均聚合度例如为100-30,000，优选600-6000。支链淀粉为多糖类，是指麦芽三糖残基通过α1-6键连接的水溶性α-葡聚糖。
本发明的测定方法优选以0.05-5mmol/mL样品的范围添加上述表面活性剂，更优选0.1-3mmol/mL样品的范围，更加优选0.2-1.5mmol/mL样品的范围。另外，优选以0.2-15mol/mol四唑鎓化合物的范围添加上述表面活性剂，更优选0.5-10mol/mol四唑鎓化合物的范围，更加优选0.7-5mol/mol四唑鎓化合物的范围。
优选本发明的测定方法中使用的上述四唑鎓化合物例如在四唑环的至少2个位置具有环结构取代基，更优选在3个位置具有环结构取代基。
如前所述，当上述四唑鎓化合物在上述四唑环的至少2个位置具有环结构取代基时，优选上述取代基位于上述四唑环的2位以及3位。另外，当上述四唑鎓化合物在3个位置具有环结构取代基时，优选上述取代基位于上述四唑环的2位、3位以及5位。
另外，至少2个环结构取代基的环结构优选苯环。另外，苯环以外的环结构取代基有例如环骨架中含有S或O，且为共振结构的取代基，例如噻吩基、噻唑基等。
上述四唑鎓化合物优选四唑环的至少3个位置有环结构取代基，上述环结构取代基中至少2个环结构取代基的环结构是苯环。
优选至少1个环结构取代基具有官能团，更优选上述官能团数目多。
上述官能团优选吸电子性的官能团，例如卤代基、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。除此之外还包括例如氢过氧基、氧基、环氧基、环二氧基、氧代基等含氧的特性基，以及巯基、烷硫基、甲硫基甲基、硫代基、亚磺基、苯磺酰基、苯基磺酰基、对甲苯磺酰基、对甲苯基磺酰基、甲苯磺酰基、氨磺酰基、异硫氰酸酯基等含硫的特性基等。在这些吸电子性的官能团中，优选硝基、磺基、卤代基、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基。另外，除上述吸电子性的官能团之外，还包括例如苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不饱和烃基等。上述官能团也可以通过离解而离子化。
上述四唑鎓化合物在四唑环的2位及3位具有苯环，优选上述苯环中的至少一个具有选自卤代基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基以及乙氧基的至少一个官能团。也可以上述两个苯环均具有上述官能团。上述苯环中，可以在任何位置(邻-、间-、对-)具有上述官能团。另外，官能团的数量并无限定，可以具有相同的官能团，也可以具有不同的官能团。
上述四唑鎓化合物作为在上述四唑环的2位、3位以及5位具有苯环结构取代基的化合物，包括例如2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3′-(1，1′-联苯-4，4′-基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1，1′-联苯基)-4，4′-基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐]、2，3-二苯基-5-(4-氯代苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(间-甲苯基)四唑鎓盐以及2，5-二苯基-3-(对-甲苯基)四唑鎓盐等。
另外，上述四唑鎓化合物并不限于上述化合物，除此之外还可以使用在上述四唑环的2个位置具有苯环结构取代基，以及在1个位置具有其他环结构取代基的化合物，例如：2，3-二苯基-5-(2-噻吩基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺基乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐、2，2′-二苯并噻唑基-5，5′-双[4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亚联苯基)二四唑鎓盐以及3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。
另外，也可以使用在上述四唑环的2个位置具有苯环结构取代基，以及在1个位置具有不是环结构的取代基的四唑鎓化合物，包括例如2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。
如前所述，上述四唑鎓化合物优选具有3个环结构取代基的化合物；更优选具有3个环结构为苯环的取代基，且含有较多吸电子性官能团的化合物；特别优选2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。
这样的四唑鎓化合物可以是盐，也可以是离子化状态等。另外，并不只限于一种，也可以两种以上并用。
本发明的测定方法中，上述四唑鎓化合物的添加量并无特别限定，例如可以根据样品的种类或上述样品中含有的血红蛋白、其他还原物质的量适当决定。具体地说，例如优选按0.001-100μmol/μL样品的范围添加上述四唑鎓化合物，更优选0.005-10μmol/μL样品的范围，特别优选0.01-1μmol/μL样品的范围。
本发明的测定方法中，上述样品为全血的情况下，优选按0.001-10μmol/μL全血的范围添加上述四唑鎓化合物，更优选0.005-5μmol/μL全血的范围，特别优选0.01-2μmol/μL全血的范围。全血的血细胞浓度通常可以推定为50％重量。具体地说，当上述四唑鎓化合物为2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐时，优选按0.02-10μmol/1μL全血的范围添加，更优选0.05-3μmol/1μL全血的范围，特别优选0.1-2μmol/1μL全血的范围。
上述表面活性剂的添加量可以根据四唑鎓化合物的添加量调整，例如可以调整为如上所述的摩尔比。
本发明中，由如上所述的氧化还原反应产生的发色物质的吸光度测定，优选例如通过使用氧化还原酶的上述还原物质或氧化物质与发色性底物的氧化还原反应，对发色的上述发色性底物(即发色物质)的吸光度进行测定。
具体地说，优选由上述测定对象物质产生的氧化物质是过氧化氢，使用因氧化而发色的发色性底物作为上述发色性底物，使上述过氧化氢与上述发色性底物通过氧化还原酶进行氧化还原发应。
上述氧化还原酶并无特别限定，优选例如POD；由于上述因氧化而发色的发色性底物能够高灵敏度检出，优选例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)联苯胺钠。
本发明的测定方法中，上述测定样品并无特别限定，除全血、血浆、血清、血细胞等血液样品外，也包括例如尿、脑脊液、唾液等生物样品以及果汁等的饮料、酱油、调味汁等食品类等。另外，测定血细胞内成分时，例如可以将全血溶血后作为样品，也可以从全血中分离红细胞，将上述红细胞溶血后作为样品。
本发明的测定方法中，上述测定对象物质只要利用上述氧化还原反应即可，并无特别限定，例如全血中成分、红细胞内成分、血浆中成分、血清中成分等，优选红细胞内成分。具体地说例如：糖基化血红蛋白或糖基化白蛋白等糖基化蛋白质、糖基化肽、糖基化氨基酸、葡萄糖、尿酸、胆固醇、肌酸酐、肌氨酸、甘油等；更优选糖基化蛋白质；特别优选糖基化血红蛋白。
本发明的测定方法中，测定对象物质是糖基化蛋白质时，优选将上述糖基化蛋白质的糖基化部分用FAOD进行氧化分解而生成过氧化氢。另外，测定对象物质是上述糖基化肽、糖基化氨基酸时，也同样优选用FAOD进行作用。根据需要，优选在上述FAOD处理之前用蛋白酶处理上述糖基化蛋白质或糖基化肽。
上述FAOD优选是催化下式(1)所示反应的FAOD。
    …(1)
上式(1)中，R1表示羟基或来源于糖基化反应前的糖的残基(糖残基)。当反应前的糖为醛糖时，上述糖残基(R1)是醛糖残基；当反应前的糖为酮糖时，上述糖残基(R1)是酮糖残基。例如：反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利重排使反应后的结构为果糖结构，此时糖残基(R1)为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)可以用例如
-[CH(OH)]n-CH2OH
表示，n为0-6的整数。
上式(1)中，R2并无特别限定，例如是糖基化氨基酸、糖基化肽或糖基化蛋白质时，其中α-氨基被糖基化的情况与α-氨基之外的氨基被糖基化的情况不同。
上式(1)中，当α-氨基被糖基化时，R2是下式(2)所示氨基酸残基或肽残基。
-CHR3-CO-R4    …(2)
上式(2)中，R3表示氨基酸侧链基。另外，R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可用下式(3)表示。下式(3)中，n是至少为0的整数，R3与前述相同，表示氨基酸侧链基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH    …(3)
另外，上式(1)中，当α-氨基以外的氨基被糖基化(氨基酸侧链基被糖基化)时，R2可用下式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7    …(4)
上式(4)中，R5表示氨基酸侧链基中被糖基化的氨基以外的部分。例如被糖基化的氨基酸是赖氨酸时，R5是
-CH2-CH2-CH2-CH2-，
例如被糖基化的氨基酸是精氨酸时，R5是
-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
另外，上式(4)中，R6是氢、氨基酸残基或肽残基，例如可用下式(5)表示。下式(5)中，n是至少为0的整数，R3与前述相同，表示氨基酸侧链基。
-(CO-CHR3-NH)n-H    …(5)
另外，上式(4)中，R7是羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下式(6)表示。下式(6)中，n是至少为0的整数，R3与前述相同，表示氨基酸侧链基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH    …(6)
附图的简单说明
图1表示在本发明测定方法的一个实施例中，在TritonX-100存在下使溶血样品与WST-3反应时的吸光度随时间变化的图。
图2表示在本发明测定方法的上述实施例中，在Tween20存在下使溶血样品与WST-3反应时吸光度随时间变化的图。
图3表示在本发明测定方法的上述实施例中，在聚氧乙烯二醇月桂基醚存在下使溶血样品与WST-3反应时吸光度随时间变化的图。
图4表示在比较例中，在未添加表面活性剂的条件下使溶血样品与WST-3反应时吸光度随时间变化的图。
实施发明的最佳方式
下面，以测定血细胞中的糖基化蛋白质为例对本发明的测定方法进行说明。
首先，使全血溶血，或将用离心分离等常用方法从全血中分离出的血细胞部分溶血，配制溶血样品。该溶血方法并无特别限定，可以使用例如使用表面活性剂的方法、超声波法、利用渗透压差的方法等。其中优选上述使用表面活性剂的方法。
溶血用的表面活性剂并无特别限定，但从操作简便性考虑，优选使用与后述的通过四唑鎓化合物进行前处理时相同的表面活性剂。上述溶血处理的条件，通常在处理溶液中的血细胞浓度为1-10％体积的情况下添加上述表面活性剂，使上述处理溶液中的浓度为0.01-5％重量，在室温下搅拌数秒(约5秒)-10分钟即可。
接下来，在表面活性剂存在的条件下向上述溶血样品中添加具有上述四唑环结构的四唑鎓化合物，进行上述溶血样品的前处理。
上述表面活性剂可以使用如前所述的表面活性剂。具体地说，可以使用例如市售的Triton系表面活性剂聚氧乙烯-对-叔辛基苯基醚；市售的Tween系表面活性剂聚氧乙烯脱水山梨醇烷基酯；市售的Brij系表面活性剂聚氧乙烯烷基醚等。除此之外也可以使用例如聚氧乙烯(10)月桂基醚、商品名为Nikkol BL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N为9：和光纯药工业社制造)等的聚氧乙烯(9)月桂基醚、商品名为Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N约为10.5：ナカライテスク社制造)以及商品名为Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N为20：ナカライテスク社制造)的聚氧乙烯辛基苯基醚等。
上述表面活性剂的添加比例如前所述。具体地说，前处理溶液中的血细胞浓度为1-10％体积时，表面活性剂浓度为2-150mmol/L，优选5-100mmol/L，特别优选10-50mmol/L。上述溶血样品的配制(溶血处理步骤)中，当使用与该前处理相同的表面活性剂时，也可以事先在上述溶血处理步骤添加上述表面活性剂，以达到前处理所需浓度。另外，还可以将四唑鎓化合物以及上述表面活性剂共同添加到溶血处理前的样品中，使溶血处理与前处理同时进行。
上述四唑鎓化合物可以使用上述的物质，例如前处理溶液中的血细胞浓度为1-10％体积时，优选以达到浓度0.02-2000mmol/L，更优选0.1-1000mmol/L，特别优选0.4-200mmol/L的比例进行添加。具体地说，上述四唑鎓化合物为2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐时，优选以达到浓度0.02-80mmol/L，更优选0.1-20mmol/L，特别优选0.2-15mmol/L的比例进行添加。
上述四唑鎓化合物可以化合物本身的形态使用，但从操作的简便性及处理效率等角度来看，优选使用溶解在溶剂中的四唑鎓化合物溶液。上述溶液浓度可以根据四唑鎓化合物的种类(例如分子量等)适当决定，例如：可以是0.01-120mmol/L，优选0.1-50mmol/L，更优选0.2-20mmol/L。上述溶剂可以使用例如蒸馏水、生理盐水、缓冲液等，上述缓冲液可以使用例如后面所述的缓冲液等。
该前处理通常在缓冲液中进行。上述缓冲液可以使用例如胺类缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液以及CHES、CAPS和CAPSO等优质(グッド)缓冲液等，优选胺类缓冲液及CHES缓冲液。上述胺类缓冲液的缓冲剂包括例如甘氨酸、乙胺、二乙胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三羟基氨基甲烷、三乙醇胺、甘氨酰胺等，优选甘氨酸、甘氨酰胺、三乙醇胺。
上述缓冲液的pH值优选pH7-12，更优选pH8-11，特别优选pH8-10。
该前处理条件并无特别限定，但通常温度在10℃-37℃，处理时间在10秒-60分钟。
下面，对该前处理完毕的溶血样品进行蛋白酶处理。这是为了使后面的处理中使用的FAOD容易作用于测定对象物质的糖基化部分。
上述蛋白酶可以使用例如丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶等，具体地说，可以使用金属蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶、胃蛋白酶等。
在糖基化蛋白质为糖基化血红蛋白的情况下，优选选择性地分解上述糖基化Hb的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、来源于猪胰脏的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subillis)的蛋白酶等，更优选金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，特别优选金属蛋白酶。如果这样使用选择性分解的蛋白酶，则可以选择性地配制糖基化Hb分解物，由于其它糖基化蛋白质难于被分解，因而可以进一步提高测定精度。上述来源于枯草芽孢杆菌的蛋白酶包括商品名プロテア一ゼN(例如フルカ社制造)、商品名プロテア一ゼN「アマノ」(天野制药社制造)等。上述金属蛋白酶包括来源于芽孢杆菌属(Bacillus)的金属蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如东洋纺社制造的商品名トヨチ-ム)等。
蛋白酶处理的条件根据例如所用蛋白酶的种类、作为测定对象物质的糖基化蛋白质的种类及其浓度等适当决定。
具体地说，例如用蛋白酶K作为上述蛋白酶对上述前处理完毕的溶血样品进行处理时，通常反应液中的蛋白酶浓度为10-30,000mg/L (1KU/L-250MU/L)，反应液中的血细胞浓度为0.05-15％体积，反应温度为15-37℃，反应时间为1分钟-24小时，pH值在6-12范围内。该蛋白酶处理通常在缓冲液中进行。上述缓冲液可以使用例如与上述前处理相同的缓冲液。
另外，例如用金属蛋白酶作为上述蛋白酶对上述前处理完毕的溶血样品进行处理时，通常反应液中的蛋白酶浓度为0.02g-6g/L(40KU/L-40MU/L)，反应液中的血细胞浓度为0.05-15％体积，反应温度为15-37℃，反应时间为1分钟-24小时，pH值在6-12范围内。
下面，将由上述蛋白酶处理获得的分解物用上述FAOD进行处理。通过该FAOD处理来催化上式(1)所示反应。
该FAOD处理优选与上述蛋白酶处理同样在缓冲液中进行。该处理条件根据所用FAOD的种类、作为测定对象物质的糖基化蛋白质的种类及其浓度等适当决定。
具体地说，反应液中的FAOD浓度为50-50,000U/L，反应液中的血细胞浓度为0.01-1％体积，反应温度为15-37℃，反应时间为1-60分钟，pH值在6-9范围内。上述缓冲液的种类也无特别限定，可以使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。
下面，使用氧化还原酶以及上述因氧化而发色的发色性底物通过氧化还原反应测定由上述FAOD处理生成的过氧化氢。
上述氧化还原酶可以使用例如POD等。
上述发色性底物包括例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)联苯胺钠、邻对苯二胺(OPD)、トリンダ一试剂和4-氨基安替比林组合而成的底物等。上述トリンダ一试剂包括例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除上述氨基安替比林之外，也可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在这些发色底物中，如前所述，特别优选N-(羧甲基氨基羰基)-4，4′-双(二甲氨基)联苯胺钠。
上述氧化还原反应通常在缓冲液中进行，其条件根据上述生成的过氧化氢的浓度等适当决定。通常，反应液中的氧化还原酶浓度为10-100,000IU/L，发色性底物浓度为0.005-30mmol/l，反应温度为15-37℃，反应时间为6秒-30分钟，pH值为5-9。另外，上述缓冲液并无特别限定，可以使用例如与上述蛋白酶处理及FAOD处理等相同的缓冲液等。
上述氧化还原反应中，例如使用上述发色性底物时，可以通过用分光光度计测定上述反应液的发色程度(吸光度)来测定过氧化氢的量。然后可以用该过氧化氢浓度与校准曲线等求出样品中的糖基化蛋白质的量。
另外，除上述使用POD等的酶法外，也可以通过例如电气方法测定上述过氧化氢量。
该测定方法中，如前所述，由上述四唑鎓化合物进行的前处理步骤只要在实际发生氧化还原反应之前，则并无特别限定，但由于上述FAOD处理后产生过氧化氢，优选在上述FAOD处理前进行。另外，各处理步骤可如前所述分别进行，也可按如下所示的组合同时进行。
1：溶血处理+前处理
2：溶血处理+前处理+蛋白酶处理
3：蛋白酶处理+FAOD处理
4：FAOD处理+发色反应
5：蛋白酶处理+FAOD处理+发色反应
另外，四唑鎓化合物与表面活性剂的添加顺序、上述FAOD、氧化还原酶以及发色性底物的添加顺序也无特别限定。
采用这样的方法，通过使四唑鎓化合物与上述样品接触，不仅GSH、AsA、二硫苏糖醇、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等低分子量还原物质，特别是还可以充分排除血红蛋白以及血红蛋白分解物作为还原物质的影响。同时可以防止因四唑鎓化合物和血红蛋白混在而产生的浑浊。因此可以不对上述吸光度测定产生任何影响，高精度地进行测定。
另外，在采用上述四唑鎓化合物进行的前处理步骤中，还可以与例如上述四唑鎓化合物以外的氧化剂并用。上述氧化剂可以使用例如碘乙酸钠、碘酸、高碘酸等卤素氧化物、EDTA-Fe、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶等。这些氧化剂的添加量为0.001-0.1mg/μL样品。
本发明的测定方法中，测定对象物质只要利用氧化还原反应即可，并无特别限定，除上述糖基化蛋白质之外，如前所述，还包括糖基化肽、糖基化氨基酸、葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酸酐、肌氨酸、甘油等。
通过产生过氧化氢对上述各测定对象物质的量进行测定时，可以分别将葡糖氧化酶作用于上述葡萄糖、将胆固醇氧化酶作用于上述胆固醇、将尿酸酶作用于上述尿酸、将肌氨酸氧化酶作用于上述肌酸酐、将肌氨酸氧化酶作用于上述肌氨酸、将甘油氧化酶作用于上述甘油，产生过氧化氢。该过氧化氢量的测定方法可以与上述同样进行。另外，糖基化肽、糖基化氨基酸也可与上述糖基化蛋白质的测定同样进行测定。
另外，用上述四唑鎓化合物对样品中的血红蛋白以及血红蛋白分解物处理后，由测定对象物质产生还原物质，通过氧化还原反应对该还原物质的量进行测定，由该测定值确定上述测定对象物质的量时，可以如下所示进行测定。
例如，上述测定对象物质为葡萄糖时，在例如NAD+或NADP+等存在下，用葡糖脱氢酶产生NADH或NADPH等还原物质。然后使用例如心肌黄酶和因还原而发色的底物，通过氧化还原反应测定由上述测定对象物质产生的还原物质NADH或NADPH。然后，如前所述，可以用由该测定对象物质产生的还原物质的浓度和校准曲线等求出样品中测定对象物质的量。另外，例如测定对象物质为胆固醇时，可以使用胆固醇脱氢酶；为肌氨酸时，可以使用肌氨酸脱氢酶。
上述因还原而发色的底物并无特别限定，也可使用例如为了排除上述样品中的血红蛋白以及血红蛋白分解物的影响而添加的发色性四唑鎓化合物。另外，根据各测定波长，也可以使用与上述样品的前处理中所用四唑鎓化合物种类不同的发色性四唑鎓化合物。除上述发色性四唑鎓化合物之外，也可以使用例如2，6-二氯苯酚靛酚等。为了获得可信性更为优异的测定值，优选例如在对由上述测定对象物质产生的还原物质进行测定之前事先测定吸光度。
(实施例)
下面，结合比较例对实施例进行说明。
(实施例1)
该实施例是在各种表面活性剂存在下，将血细胞样品用四唑鎓化合物进行前处理，检查有无浑浊。以下表示使用的样品、试剂以及方法。
(样品的配制)
采集健康者的全血，通过离心分离(1500G(3000rpm)、3分钟)回收血细胞，向该血细胞中添加31倍体积的精制水，进行稀释及溶血，将该物质作为测定样品。
(表面活性剂溶液)
将下表1中所示各种表面活性剂溶解于精制水，分别配制2.4％重量的表面活性剂溶液。
下表1中所示表面活性剂中，商品名TritonX-100、商品名Brij35、商品名Nikkol BL-9EX以及2，4-二甲基苯磺酸钠为和光纯药工业社制造，商品名TritonX-114、商品名TritonN-101、商品名Tween20、商品名Tergitol NPX、商品名Tergitol NP-40、聚乙二醇月桂醚、月桂基苯磺酸钠、商品名PEG1000以及商品名PEG6000为ナカライテスク社制造，商品名Brij58、商品名Brij98以及商品名Arlasolve 200为SIGMA社制造，商品名プルランPI-20为林原研究所社制造。
(缓冲液)
CHES缓冲液(pH 9.0)    0.2mol/L
(WST-3溶液：以下相同)
将下述化学式(7)表示的2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐(商品名WST-3、同仁化学研究所社制造)溶解于精制水中，配制浓度为1.66mmol/L的溶液。
Figure C0181637700201
(浑浊的确认方法)
将345μL测定样品、150μL表面活性剂溶液、300μL缓冲液以及900μL WST-3溶液混合，在37℃下保温5分钟后目视确认该混合溶液的浑浊，按照下述评价标准进行评价。另外，除添加精制水代替表面活性剂之外，将按相同方法配制的混合溶液作为比较例同样进行评价。结果表示在下表1。
(浑浊的评价)
○：未产生浑浊
×：产生了浑浊
(表1)
  表面活性剂(比较例1) 浑浊评价
×
  未添加表面活性剂(实施例1)
  TritonX-100TritonX-114TritonN-101Tween 20Brij 35Brij 58Brij 98Tergitol NPXTergitol NP-40Arlasolve 200聚乙二醇月桂醚脱氧胆酸Nikkol BL-9EX月桂基硫酸钠月桂基苯磺酸钠2，4-二甲基苯磺酸钠プルランPI-20PEG 1000PEG 6000 ○○○○○○○○○○○○○○○○○○○
如上表1所示，在表面活性剂存在下用WST-3处理，可以防止浑浊的发生。
(实施例2、比较例2)
该实施例改变表面活性剂的添加量，进行四唑鎓化合物处理。以下表示使用的样品、试剂以及方法等。
(测定样品的配制)
与上述实施例1相同，向回收的血细胞(血红蛋白浓度约为300g/L)中添加22倍体积的精制水，进行稀释及溶血，配制测定样品(血红蛋白浓度约为13.6g/L)。
(表面活性剂溶液)
与实施例1相同，将表面活性剂分别溶解于0.2mol/L CHES缓冲液(pH 9.0)，配制规定浓度(1.0％重量和2.4％重量)的表面活性剂溶液。
将上述测定样品用精制水稀释2倍后的稀释液25μL、15μL表面活性剂溶液以及45μL WST-3溶液混合，在37℃下保温3分钟。混合液中表面活性剂的最终浓度是0.176％重量和0.424％重量。保温后，在波长884nm下测定上述混合液的吸光度，并与上述实施例1同样进行浑浊的评价。另外，作为比较例2，在未添加表面活性剂的条件下，与上述同样进行吸光度测定以及浑浊评价。该结果表示在下表2中。
(表2)
表面活性剂(比较例2)                     最终浓度 浑浊评价
    0.176％重量(吸光度)     0.424％重量(吸光度)
             0.075 ×
  未添加表面活性剂(实施例2)
  TritonX-100TritonN-101Tween 20Brij 35Brij 58Brij 98Tergitol NPXTergitol NP-40Arlasolve 200聚乙二醇月桂醚Nikkol BL-9EX月桂基硫酸钠月桂基苯磺酸钠2，4-二甲基苯磺酸钠プルランPI-20PEG 1000PEG 6000     0.0070.0180.0350.0170.0090.0090.0080.0070.0080.0070.0150.0110.0110.0120.0070.0080.007     0.0070.0130.0320.0120.0110.0110.0070.0070.0080.0070.0110.0170.0170.0120.0080.0090.008 ○○○○○○○○○○○○○○○○○
另外，对于分别使用了TritonX-100、Tween20以及聚氧乙烯二醇月桂醚的实施例，在图1-图3表示测定其在884nm、845nm以及805nm下的吸光度随时间变化的情况。图1表示TritonX-100随时间变化的情况，图2表示Tween20随时间变化的情况，图3表示聚氧乙烯二醇月桂醚随时间变化的情况。未添加表面活性剂条件下随时间变化的情况作为比较例在图4表示。
如上表2所示，如果在表面活性剂存在下进行WST-3处理，则不会产生浑浊，另外与未添加表面活性剂的情况相比吸光度保持较低。另外还可以看出：由图4比较例随时间变化的图可见吸光度显著增加，而添加了表面活性剂的图1-图3实施例随时间变化的图中吸光度充分减少，排除了浑浊的影响。
(实施例3、比较例3)
该实施例是在表面活性剂存在下，将添加了糖基化氨基酸的溶血样品进行WST-3处理，对上述糖基化氨基酸进行测定。
(氧化还原试剂)
POD(东洋纺社制造)                  132KU/L
FAOD(旭化成社制造)                 44KU/L
商品名DA-64(和光纯药工业社制造)    0.088mmol/L
磷酸钾缓冲液(pH 8.0)               0.2mol/L
(糖基化缬氨酸溶液的配制)
根据以往已知的方法配制糖基化缬氨酸(以下称“FV”)，将其溶解于精制水中，配制成糖基化缬氨酸溶液。
(表面活性剂溶液)
将商品名TritonX-100、商品名Nikkol BL-9EX以及商品名Tween20分别溶解于0.2mol/L CHES缓冲液(pH9.0)中，配制规定浓度(1.0％重量和2.4％重量)的表面活性剂溶液。
(样品的配制)
与实施例1同样，向回收的血细胞中添加上述FV溶液使溶液体积达到22倍，进行稀释及溶血，以此作为样品。配制Hb浓度及FV浓度不同的下述4种(a-d)样品。
    FV浓度(μmol/L)     Hb浓度(g/L)
样品a样品b样品c样品d     993636     6.813.66.813.6
(测定方法)
在12.5μL上述样品中加入12.5μL精制水，再添加15μL表面活性剂溶液，之后添加45μL上述WST-3溶液，在37℃下保温3分钟。向该混合液中添加25μL上述氧化还原反应试剂，反应1分钟，测定反应后的吸光度(主波长751nm和884nm)。该反应液中表面活性剂的最终浓度是0.114％重量和0.273％重量。另外作为比较例3，用上述CHES缓冲液代替表面活性剂，同样进行吸光度测定。结果表示在下表3中。
在下表3中，表面活性剂的浓度单位表示为％重量。另外，表中括号内的数值(％)表示样品b及d(Hb浓度13.6g/L)的吸光度分别除以样品a及c(Hb浓度6.8g/L)的吸光度的值(b/a、d/c)的百分率(％)，得到接近100％的优异的测定精度。即，由于样品中的FV量是一定的，即使Hb的量为二倍，依赖于FV的吸光度(发色量)仍是同样程度，如果接近100％，则可以说充分防止了浑浊的产生，可以高精度地测定FV。
(表3)
 样品     FVμmol/L Hbμmol/L                       实施例3 比较例3
      TritonX-100        NikkolBL-9EX
    0.114％   0.273％  0.114％  0.273％
 波长751nm
 abcd     993636     6.813.66.813.6     0.0660.0570.2020.189   0.0630.0580.1840.182  0.0620.0550.2010.185  0.0580.0510.2010.185     0.0690.0740.1920.179
 波长884nm
 abcd     993636     6.813.66.813.6     0.0040.0080.0060.009  0.0040.0060.0060.008  0.0040.0070.0060.008  0.0040.0070.0060.008     0.0190.0400.0200.044
 波长751-884nm
 abcd     993636     6.813.66.813.6     0.0620.049(79％)0.1970.180(92％)  0.0580.052(89％)0.1790.174(97％)  0.0580.048(82％)0.1950.176(90％)  0.0540.045(83％)0.1950.177(91％)     0.0500.034(68％)0.1720.135(78％)
如上表3所示，在表面活性剂存在下进行了WST-3处理的实施例3中防止了浑浊的发生，特别是在884nm下Hb的吸收降低。由此可知与表面活性剂不存在的比较例3相比，括号内的值(％)高，可以高精度进行测定。
产业上的可利用性
如上所述，本发明的测定方法在表面活性剂的存在下，通过将上述四唑鎓化合物添加到样品中，可以排除样品中还原物质的影响，并且可以防止因四唑鎓化合物与血红蛋白等还原物质的混在而产生的浑浊，因此可以进行可信性优异的测定。从而，本发明的测定方法可以适用于例如临床医疗中的各种分析，特别是适用于糖尿病诊断中重要的红细胞中糖基化血红蛋白等糖基化蛋白质的测定。

Claims (19)

1.一种利用氧化还原反应测定样品中的测定对象物质的测定方法，该方法是在所述氧化还原反应之前，在表面活性剂的存在下，将四唑鎓化合物添加到样品中，以排除所述样品中的还原物质的影响，然后通过氧化还原反应测定由所述测定对象物质产生的还原物质或氧化物质的量，由该测定值确定所述测定对象物质的量。
2.权利要求1的测定方法，其中所述样品含有血红蛋白以及血红蛋白分解物，排除了所述样品中的血红蛋白以及血红蛋白分解物作为还原物质的影响。
3.权利要求1的测定方法，其中所述通过氧化还原反应进行的测定是对所述反应产生的发色物质的吸光度进行测定。
4.权利要求3的测定方法，其中所述发色物质是通过使用氧化还原酶，使还原物质或氧化物质与发色性底物发生氧化还原反应而发色的发色性底物。
5.权利要求3的测定方法，其中所述吸光度测定中的测定波长在650-900nm范围内。
6.权利要求3的测定方法，其中所述吸光度测定中的主波长在650-800nm范围内，副波长比所述主波长长且在730-900nm范围内。
7.权利要求1的测定方法，其中所述表面活性剂为选自非离子型表面活性剂、烷基硫酸盐以及高分子化合物的至少一种表面活性剂。
8.权利要求7的测定方法，其中所述非离子型表面活性剂是聚氧乙烯链和烃链以醚键连接的聚氧乙烯醚。
9.权利要求8的测定方法，其中所述聚氧乙烯链的重均聚合度为8-23，烃链中碳原子数为8-18。
10.权利要求8的测定方法，其中所述烃链包括烷基以及烷基苯基的至少一方。
11.权利要求8的测定方法，其中所述烃链具有支链。
12.权利要求7的测定方法，其中所述高分子化合物是选自水溶性明胶、支链淀粉、聚乙二醇以及聚乙烯基吡咯烷酮的至少一种化合物。
13.权利要求7的测定方法，其中测定样品含有血细胞，相对于血细胞浓度1-10％体积，所述表面活性剂以2-150mmol/L的范围添加。
14.权利要求1的测定方法，其中所述四唑鎓化合物在四唑环的2位及3位带有苯环，所述苯环中至少一方具有选自卤代基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基以及乙氧基的至少一个官能团。
15.权利要求1的测定方法，其中所述四唑鎓化合物是2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓盐。
16.权利要求3的测定方法，其中所述由测定对象物质产生的氧化物质是过氧化氢，使用因氧化而发色的发色性底物，使所述过氧化氢与所述发色性底物通过氧化还原酶发生氧化还原反应。
17.权利要求1的测定方法，其中所述测定样品含有血细胞。
18.权利要求1的测定方法，其中所述测定对象物质是糖基化蛋白质。
19.权利要求1的测定方法，其中所述测定对象物质是糖基化血红蛋白。
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