CN1214246C - 血红蛋白的测定方法和血红蛋白糖化率的测定方法 - Google Patents

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Abstract

提供没有环境上的问题、能够容易且准确测定试料中的血红蛋白量的Hb量测定方法。用四唑鎓化合物使试样中的血红蛋白变性，在对所得到的变性血红蛋白特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量，就可以从此光学变化量算出前述试样的血红蛋白量。前述测定波长在520nm～670nm的范围为好。由此方法可以如图1所示那样以高精度测定Hb量。

Description

血红蛋白的测定方法和血红蛋白糖化率的测定方法
技术领域
本发明涉及测定试样中的血红蛋白(Hb)量的方法。
背景技术
由于血液中的Hb承担着把氧从肺输运到身体的各器官的重要作用，所以例如关系到白血病和贫血等疾病。为此，测定其量已经在临床分析领域受到非常重视。还有，由于糖化的Hb反映生物体血糖值的过去的历史，成为诊断和治疗糖尿病等的指标，因此，此糖化率的测定也变得很重要。而且，在此糖化率的测定中，Hb量的测定是不可少的。
作为Hb的测定方法，想到的是用吸光度来测定。然而，前述未变性的Hb，例如，根据与氧结合的状态和未结合的状态等的其状态的不同，显示吸收最大值的波长也不同。因此即使单纯地测定的吸光度也难以准确求出Hb量。所以，过去已经提出了通过变性使Hb稳定化后再来测定其吸光度的方法。作为这样的方法，已经有，例如，氰化高铁血红蛋白法(HiCN法)、叠氮高铁血红蛋白法、月桂磺酸钠(SLS)法、碱正铁血红素法等，其中，特别是国际标准的HiCN法已经得到广泛的采用。此HiCN法是，向血液中加入含铁氰化钾和氰化钾的试剂，把Hb变成稳定的氰化高铁血红蛋白，通过测定在规定波长(540nm)的吸光度来求Hb量的方法。
发明内容
不过，由于前述HiCN法产生有害的氰废液，前述的叠氮高铁血红蛋白法产生叠氮化钠废液，所以在环境方面是有问题的。还有，前述的SLS法和碱正铁血红素法，由于在试样中加入了蛋白质变性剂SLS和强碱试剂，在用加入了前述试剂的试样去进行其它项目测定时，前述试剂例如对用酶等的测定体系有影响，存在有使得测定变得困难的问题。为此，对于处理后的试样，难以进行变性Hb的测定及其它测定的一系列操作。
因此，本发明的目的在于提供可以在没有环境问题的情况下容易且准确测定Hb量的Hb测定方法。
为了达到上述目的，本发明的Hb测定方法是一种用四唑鎓化合物使试样中的血红蛋白变性，在对得到的变性血红蛋白特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量，从此光学变化量算出前述试样中的血红蛋白量的方法。再者，在本发明中，所谓变性Hb是指用四唑鎓化合物变性的血红蛋白。
根据本发明的测定方法，用四唑鎓化合物变性的变性Hb是稳定的，与根据其形态而具有各种各样吸收波长的未变性Hb不同，由于显示吸收最大的波长在一定范围之内，就可以很容易的求得Hb量。还有，不使用前述那样的氰化合物或强碱物质，在环境方面安全，是有用方法。
在本发明的测定方法中，作为前述光学变化量，列举有，例如，吸光度和反射率等。
作为前述四唑鎓化合物，并没有特别的限制，例如可以使用后面讲的化合物，不过，特别优选的是2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐(例如，同仁化学研究所公司制造的商品WST-3)。
本发明的测定方法中，变性Hb的测定波长在440～700nm的范围为优选，500～670nm范围为更优选，540～670nm范围为特别优选。
本发明的测定方法中，前述四唑鎓化合物的加入量没有特别的限制，可以根据前述试样的种类等来适当确定。具体说，例如，每1μL的试样，加入前述四唑鎓化合物并使其达到0.001～100μmol范围为优选，更优选0.01～10μmol范围，特别优选0.05～5μmol范围。
前述试样并没有特别的限制，如后面讲的那样优选含红血球的试样，例如全血。在用全血试样的场合，四唑鎓化合物的加入量，对于1μL的前述试样，例如加入0.01～30μmol范围为优选，更优选0.05～10μmol范围，特别优选0.1～5μmol范围。再者，在全血中的血球浓度通常推定为约50重量％。
本发明的测定方法，在表面活性剂的存在下用四唑鎓化合物处理前述试样中的血红蛋白为优选。如果这样地进一步共存表面活性剂的话，则更进一步促进了Hb的变性，使得测定更迅速的进行。
前述表面活性剂的加入量，没有特别的限制，例如，可以由前述四唑鎓化合物的加入量等来适当的确定。具体说，相对于1mol的四唑鎓化合物，表面活性剂的加入量例如为0.01～70mol范围，优选0.05～50mol范围，更优选0.1～20mol范围。
本发明的测定方法中，前述试样没有特别的限制，可以列举的有全血、血浆、血清、血球等血液试样等。以含有红血球的试样为优选，具体是全血试样、血球试样等。
接着，本发明的Hb糖化率的测定方法是：用上述本发明的Hb测定方法来测定含糖化Hb试样的Hb量，另一方面，把所得到的前述变性Hb的糖化部分与果糖基氨基酸氧化酶(以下称为“FAOD”)反应，通过测定此氧化还原反应来测定Hb的糖化量，从前述Hb量和前述糖化量求得Hb糖化率。再者，所谓Hb量，是包括了糖化了的Hb和未糖化的Hb两方的。
本发明的Hb糖化率的测定方法，与前述一样，不产生有害废液，在环境方面优越，所以是有用的方法。还有，前述四唑鎓化合物与前述强碱性试剂等不同，对于采用前述氧化还原反应的酶法进行的糖化量测定不产生使酶失活等影响。为此，使用用四唑鎓化合物处理过的试样，不仅可以进行前述那样的Hb测定，而且也可以方便地进行糖化量测定的一系列操作。为此，例如，使用一个测定装置、采用一个反应体系就可以进行本发明的测定。还有，如果在试样中加入了前述四唑鎓化合物，则不仅可以使Hb变性，而且还可以除去存在于前述试样中的、影响前述氧化还原反应的还原物质的影响，这样就可以以更高的精度求出糖化率。
本发明的Hb糖化率测定方法中，与前面讲过的一样，变性Hb的测定波长在440～700nm范围为优选，在500～670nm范围为更优选，在540～670nm范围为特别优选。
本发明的测定方法中，前述氧化还原反应的测定是由其所产生的显色物质的光学变化量的测定为优选。再者，所谓光学变化量与前面讲的一样，是指例如吸光度和反射率等。
在前述那样的酶法中，测定光学变化量时，通常双波长测定为主流。在前述双波长测定中，例如，以显示测定的对象物(例如，显色物质)的最大吸收的波长为主波长来测定前述对象物，再以与此前述主波长不同的波长为副波长来校正电噪音、试样的混浊、光量变化等。所以，副波长设定在其它混在的物质不显示吸收的波长为优选。前述主波长，根据前述测定的对象物的吸收波长来适当确定，不过，一般是约650～800nm范围。在这种情况下，副波长要设定在比其高的波长约800～900nm范围。然而，如前面讲的那样，未变性Hb根据与氧结合的形态、非结合形态等的其形态，对各种各样的波长显示吸收，是不稳定的，因此，例如在用前述那样的显色性基质等的吸光度来测定糖化量时，在副波长也看到了Hb的吸收，使得难以准确进行糖化量的测定。然而，用四唑鎓化合物处理所得到的变性Hb的测定波长，在前面已经讲过了。所以，例如即使在糖化量测定中把副波长设定在800nm～900nm范围，根据本发明就没有看到前面所讲那样的依赖于形态而不稳定的未变性Hb的吸收导致的影响。因此，可以以高精度进行糖化量的测定。
作为前述显色物质的测定波长，例如，是在500～800nm范围，以在540～750nm范围为优选。
再者，如后面叙述那样，把为测定前述Hb量的测定波长与前述显色物质的测定波长设定为同一波长也行。在此场合，例如，将测定波长设定在500～670nm范围为优选，540～670nm范围为更优选。
本发明的Hb糖化率的测定方法，在使前述变性Hb的糖化部分与FAOD反应之前，对前述变性Hb进行蛋白酶处理为优选。前述FAOD要比糖化蛋白质、糖化肽更容易与糖化氨基酸、更短的糖化肽片段作用。为此，如果预先把前述变性Hb用蛋白酶分解的话，前述FAOD变得容易与糖化部分作用，因此可以提高测定精度。
如前述那样，如果适用本发明的Hb测定方法，就可以直接用使Hb变性了的试样来作为测定Hb糖化量的试样。所以，对前述试样的Hb量测定和Hb糖化量的测定例如可以按以下所示顺序来进行。
第1种方法是，例如，在对变性Hb特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量之后，使前述变性Hb的糖化部分与FAOD反应的方法。
在此第1种方法中，进行蛋白酶处理的场合，例如，在对变性Hb特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量之后，把前述变性Hb进行蛋白酶处理，使前述变性Hb分解物的糖化部分与FAOD反应也行。另外，对变性Hb进行了蛋白酶处理后，在对前述变性Hb特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量，其后，再使前述变性Hb分解物的糖化部分与FAOD反应也行。
又，第2种方法是，例如，使变性Hb的糖化部分与FAOD反应之后，进行在对前述变性Hb特异的吸收波长下的前述试样的光学变化量的测定和前述氧化还原反应的测定的方法。在此方法的场合，例如，通过把变性Hb的测定波长与显色物质的测定波长设定为不同的波长，也就可以同时测定两者的光学变化量。
在此第2种方法中进行蛋白酶处理的场合，例如，在使变性Hb的糖化部分与FAOD反应之前，将前述变性Hb蛋白酶处理为好。
本发明的Hb糖化率测定方法中，前述显色物质的光学变化量与通过使前述变性Hb的糖化部分与FAOD反应而生成的过氧化氢量相对应为优选。前述显色物质优选的是，例如，使用氧化酶和通过氧化而显色的基质(以下称为显色性基质)，通过前述氧化酶使前述过氧化氢和前述显色性基质反应时显色了的前述显色性基质。
作为前述氧化酶，没有特别的限制，但以POD为优选。作为前述显色性基质，没有特别的限制，不过从能以高灵敏度被检出来说，优选为，例如，N-(羧甲氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠(例如，商品名DA-64，和光纯药工业公司制造)。
在本发明的Hb糖化率测定方法中，前述试样并没有特别的限制，列举有与前面前述同样的物质。
附图的简单说明
图1是表示本发明的Hb测定方法的一个实施例中，用本发明的测定方法得到的Hb浓度与参比Hb浓度的相关关系的图。
实施发明的最佳形态
本发明的Hb测定方法中使用的四唑鎓化合物，例如，在四唑环的至少2个位置上有环结构取代基为好，在3个位置上有环结构取代基的结构者为更优选。
当前述四唑鎓化合物是，如前述，在前述四唑环的至少2个位置上有环结构取代基时，在前述四唑环的2位和3位有前述取代基为优选。还有，当前述四唑鎓化合物是在前述四唑环的3个位置上有环结构取代基时，在前述四唑环的2位、3位和5位有前述取代基为优选。
还有，前述四唑鎓化合物至少2个环结构取代基的环结构是苯环为优选。还有，作为除了苯环以外的环结构取代基，例如可举出在环骨架中含硫或氧、且是共振结构的取代基，例如，噻嗯基、噻唑(チアゾイル)基等。
前述四唑鎓化合物，在四唑环的至少3个位置上有环结构取代基、前述环结构取代基中的至少2个环结构取代基的环结构是苯环为优选。
前述四唑鎓化合物的至少1个环结构取代基有官能团为优选，前述官能团的数目多者为更优选。
作为前述官能团，以电子吸引性官能团为优选，例如，列举有卤基、醚基、酯基、羧基、酰基、亚硝基、硝基、羟基、磺基等。其它列举的有，例如，过氧化氢基、氧代(oxy)基、环氧基、表二氧基、氧合(oxo)等含氧的特性基团和巯基、烷基硫基、甲基硫甲基、硫代基、亚磺基、苯磺酰基(benzenesulfonyl)、苯基磺酰基(phenylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(p-toluenesulfonyl)、对甲苯基磺酰基(p-tolylsulfonyl)、对甲苯磺酰基(tosyl)、氨磺酰基、异硫氰酸酯基等含硫的特性基团等。在这些电子吸引性取代基中，优选的是硝基、磺基、卤基、羧基、羟基、甲氧基、乙氧基。还有，除了上述电子吸引性的取代基之外，例如，还可以列举苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不饱和烃基等。再者，上述官能团通过解离而离子化也行。
前述四唑鎓化合物在其四唑环的2位和3位有苯环、前述苯环中的至少1个具有至少1个从卤基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基和乙氧基中选出的官能团为优选。再者，前述两个苯环有前述官能团也可以。在前述苯环中，在任何位置(邻位、间位、对位)有前述官能团者也行。还有，对官能团的数目没有特别的限制，无论是有相同的官能团还是有不同的官能团都行。
前述四唑鎓化合物，例如，作为在前述四唑环的2位、3位和5位有苯环结构取代基的化合物，列举有，例如，2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐、2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐、3，3’-(1，1’-联苯-4，4，-二基)-双(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓盐、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-联苯)-4，4’-二基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓盐]、2，3-二苯基-5-(4-氯代苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(对二苯基)四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-(对二苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓盐、2，5-二苯基-3-(间甲苯基)四唑鎓盐和2，5-二苯基-3-(对甲苯基)四唑鎓盐等。
还有，前述四唑鎓化合物并不限于前述那样的化合物，除此以外，也可以使用在前述四唑环的2个位置上有苯环结构取代基和1个位置上有其它的环结构取代基的化合物。例如，2，3-二苯基-5-(2-噻嗯基)四唑鎓盐、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲酰基)苯基]-2H-四唑鎓盐、2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-双[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-二苯撑)二(四唑)鎓盐和3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓盐等。
另外，也可以使用前述四唑环的2个位置上有苯环结构取代基和1个位置上有非环结构的取代基的四唑鎓盐化合物，例如，列举有2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓盐、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓盐等。
在前述四唑鎓化合物中，如前述那样，优选有3个环结构取代基的化合物，更优选有3个环结构是苯环的取代基、且较多地有电子吸引性官能团者，特别优选的是前面已经讲到的2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。再者，这样的四唑鎓化合物是，例如，也可以是盐，也可以是离子化的状态等。另外，四唑鎓盐化合物，可以是1种也可以把2种以上合并使用。
作为在本发明的Hb测定方法中可以使用的前述表面活性剂，并没有特别的限制，但例如聚氧乙烯醚等为优选。此聚氧乙烯醚[CLHM-O-(CH2CH2O)NH]是聚氧乙烯链与烃链进行醚键合，作为前述烃链列举有，例如，烷基、烷基苯基等。前述的聚氧乙烯链的重均聚合度(N)在8～23的范围而另一方的碳数(L)在8～18的范围为优选，更优选前述的重均聚合度(N)在8～15的范围而烃类的碳数(L)在8～16范围，前述的重均聚合度(N)在8～10的范围而烃类的碳数(L)在8～14范围为特别优选。另外，前述烃链，例如，直链也行，有支链也行。作为前述聚氧乙烯醚的具体例子，列举有，例如，聚氧乙烯对叔辛基苯基醚、聚乙二醇(10)月桂醚、聚乙二醇(9)月桂醚等。无论是用这些中的任何一种还是2种以上合并使用都行。
更具体说，例如，可以使用市售的Triton类表面活性剂聚氧乙烯对叔辛基苯基醚等、市售的Tween类表面活性剂聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯等、市售的Brij类表面活性剂聚氧乙烯烷基醚等。除此以外，例如，也可以使用聚氧乙烯(10)月桂醚、商品名Nikkol BL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N为9，和光纯药工业公司制造)等之类的聚氧乙烯(9)月桂醚、商品名Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N为约10.5，ナカライテスク公司制造)和商品名Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N为20，ナカライテスク公司制造)等之类的聚氧乙烯辛苯基醚等。
本发明的Hb糖化率测定方法中使用的前述FAOD优选是下述式(1)所示的催化反应的FAOD。
       ......(1)
在前述式(1)中，R1表示羟基或来自于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。当反应前的糖是醛糖时，前述糖残基(R1)是醛糖残基，而反应前的糖是酮糖时，则是酮糖残基。例如，当反应前的糖是葡萄糖时，通过阿马多利重排使反应后的结构为果糖结构，但此时，糖残基(R1)是葡萄糖残基(醛糖残基)。此糖残基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，其中的n为0～6的整数。
在前述式(1)中，R2没有特别的限制，但例如，在糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白质的场合、α-氨基被糖化的场合、与此以外的氨基被糖化的场合下不同。
在前述式(1)中，α-氨基被糖化的场合，R2是以下述式(2)所示的氨基酸残基或肽残基。
     -CHR3-CO-R4    ......(2)
在前述式(2)中，R3表示氨基酸侧基。R4可以表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，可以以下述式(3)来表示。在下述式(3)中，n为0以上的整数，R3与前面一样表示氨基酸侧基。
    -(NH-CHR3-CO)n-OH      ......(3)
在前述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧基被糖化)的场合，R2可以以下述式(4)来表示。
    -R5-CH(NH-R6)-CO-R7    ......(4)
在前述式(4)中，R5表示氨基酸侧基中被糖化的氨基之外的部分。例如，糖化的氨基酸为赖氨酸时，R5是-CH2-CH2-CH2-CH2-，例如，糖化的氨基酸为精氨酸时，R5为
    -CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
在前述式(4)中，R6为氢、氨基酸残基或肽残基，例如，可以以下述式(5)表示。再者，在下述式(5)中，n为0以上的整数，R3与前面一样表示氨基酸侧基。
    -(CO-CHR3-NH)n-H       ......(5)
在前述式(4)中，R7为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，可以以下述式(6)表示。再者，在下述式(6)中，n为0以上的整数，R3与前面一样表示氨基酸侧基。
    -(NH-CHR3-CO)n-OH      ......(6)
本发明的Hb糖化率的测定方法中，作为前述蛋白酶没有特别的限制，例如，可以使用丝氨酸蛋白酶、硫赶蛋白酶、金属蛋白酶等，具体说，以胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、番瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶等为优选。更优选的是把前述糖化Hb选择性分解的蛋白酶，优选菠萝蛋白酶、番瓜蛋白酶、来自于猪胰的胰蛋白酶、金属蛋白酶、来自于Bacillus subtillis的蛋白酶等。作为前述来自于Bacillus subtillis的蛋白酶，列举有商品名为蛋白酶N(例如，フルカ公司制造)、商品名为蛋白酶N“アマノ”(天野制药公司制造)等的商品。作为前述金属蛋白酶，列举有来自于Bacillus的金属蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如，东洋纺社制造的商品トョチ-ム)等。它们中，以金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、番瓜蛋白酶为优选，金属蛋白酶为特别优选。这样，如果使用把糖化Hb选择性分解的蛋白酶的话，就可以选择性调制糖化Hb分解物，可以更进一步提高测定精度。
接下来，举出以前述全血为试样的例子来说明本发明的Hb测定方法。
首先，将全血原样地溶血，或者从全血用离心分离等通常方法分离出血球成分，将其溶血，调制成溶血试样。该溶血方法没有特别的限制，例如，可以使用采用了表面活性剂的方法、采用超声波的方法、利用渗透压差的方法等，其中使用前述表面活性剂的方法为优选。
作为溶血用的表面活性剂没有特别的限制，例如，可以使用聚氧乙烯对叔辛基苯基醚(Triton类表面活性剂等)、聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯(Tween类表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Bril类表面活性剂等)等非离子型表面活性剂。具体列举有，例如，Triton X-100、Tween-20、Brij35等商品。采用前述表面活性剂的处理条件，通常，当处理溶液中的血球浓度为1～10体积％时，加入前述表面活性剂使得在前述处理溶液中的浓度为0.1～1重量％，在室温下搅拌5秒～1分钟左右为好。
还有，在前述利用渗透压差的场合，例如，可以加入相对于全血的体积为2～100倍体积量的纯净水来溶血。
接着，在前述溶血试样中，加入前述四唑鎓化合物，进行Hb变性。
作为前述四唑鎓化合物，可以使用前面讲过的化合物，例如，当前述溶血试样中的血球浓度为0.2～2体积％时，添加以使浓度达到0.005～400mmol/L范围为优选，更优选0.02～100mmol/L范围，特别优选0.1～50mmol/L范围。具体说，当前述四唑鎓化合物是2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐时，添加以使浓度成为0.004～16mmol/L范围为优选，更优选0.02～10mmol/L范围，特别优选0.1～5mmol/L范围。
按原样来使用前述四唑鎓化合物也是可以的，不过，从操作简便性和处理效率等点来看，以溶解在溶剂中的四唑鎓化合物溶液的形式使用为优选。前述溶液的浓度可以随四唑鎓化合物的种类(例如分子量等)等来适当的选择，例如，在0.01～120mmol/L范围，优选在0.1～50mmol/L范围，在0.2～20mmol/L范围为更优选。作为前述溶剂，例如，可以使用蒸馏水、生理盐水、缓冲液等。前述缓冲液，例如，可以使用MES、MOPS、磷酸、ADA、PIPES、ACES、CHES、HEPES等缓冲液等。还有，前述缓冲液的pH例如在5.5～10.0范围为优选。
对采用前述四唑鎓化合物的处理条件并没有特别的限制，例如，为温度4～50℃范围、处理时间20秒～60分钟的范围，优选温度15～40℃范围、优选处理时间20秒～20分钟，更优选温度25C～37℃范围、处理时间30秒～6分钟。
还有，此前述四唑鎓化合物的处理在如前前述那样在表面活性剂存在下来进行时，可以进一步促进Hb的变性。为此，从操作的简便性等来看，在试样溶血时，预先加入四唑鎓化合物也行。
表面活性剂的加入量并没有特别的限制，例如，在前述溶血试样中的血球浓度在0.2～1体积％时，添加以使达到浓度0.05～50mmol/L范围为优选，更优选0.2～30mmol/L范围，特别优选0.3～10mmol/L范围。具体说，当前述表面活性剂是商品TritonX-100时，添加使得浓度达到0.2～100mmol/L的范围为优选，更优选1～30mmol/L的范围，特别优选2～20mmol/L的范围。当前述表面活性剂是商品Brij35时，添加并使得浓度达到0.1～50mmol/L的范围为优选，更优选0.5～20mmol/L那样来加入，特别优选1～10mmol/L的范围。
还有，前述表面活性剂，相对于1mol前述四唑鎓化合物，例如，添加使达到0.01～70mol范围也可以，在0.05～50mol范围为优选，在0.1～20mol范围为更优选。
具体说，在前述表面活性剂是商品TritonX-100时，相对于1mmol前述四唑鎓化合物，添加使达到0.05～15mmol范围为优选，在0.1～10mmol范围为更优选，0.2～5mmol范围为特别优选。还有，在为商品Brij35时，相对于1mmol前述四唑鎓化合物，添加使达到0.05～10mmol范围为优选，在0.1～8mmol范围为更优选，0.2～4mmol范围为特别优选。再者，在试样溶血时预先加入足够量的表面活性剂可以促进Hb变性，这也是可以的。
接下来，进行前述变性Hb的吸光度测定。如前前述，测定波长在440～700nm范围为优选，500～670nm范围为更优选，540～670nm范围为特别优选。还有，在以前述波长为主波长进行双波长测定的场合，副波长在730～900nm范围为优选，800～900nm范围为更优选，800～850nm范围为特别优选。
然后，从所测定的吸光度和预先准备的校正曲线求出Hb量。这样，如果用四唑鎓化合物使试料中的Hb变性的话，就可以容易且准确地求得变性Hb的量。
再者，上述校正曲线，例如，可以用本发明的Hb测定方法和公知的测定方法测定含各种浓度Hb的试样再由这些测定值来作出。作为前述的公知测定方法，只要是测定精度优异的方法就行，没有特别的限制，例如，国际标准的HiCN法为优选。还有，用本发明的Hb测定方法测定含有已知浓度的Hb的标准试样并由此测定值和前述已知浓度来画出校正曲线也行。
接着，关于本发明的Hb糖化率的测定方法，说明以前述全血作为试样的第1测定方法之一个例子。
首先，与前述一样，用四唑鎓化合物处理所调制的溶血试样，测定其吸光度，求其Hb量。
然后，把前述处理过的溶血试样进行蛋白酶处理，把变性Hb分解。在这样做了之后加入的FAOD，与糖化蛋白质和糖化肽相比，更容易与糖化氨基酸、更短的糖化肽片段作用。
使用番瓜蛋白酶作为前述蛋白酶来处理前述溶血试样时，通常，反应液中的蛋白酶浓度是100～30,000U/L、反应液中的血球浓度是0.07～12体积％或反应液中的Hb浓度是0.1～10g/L、反应温度为15～60℃、反应时间为10min～40h、pH在5～9范围。还有，前述的缓冲液的种类也没有特别的限制，例如，可以使用Tris盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液、磷酸缓冲液、ADA缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液等。
还有，使用金属蛋白酶作为蛋白酶来处理前述溶血试样时，通常，反应液中的蛋白酶浓度是10～10,000KU/L、反应液中的血球浓度是0.07～12体积％或反应液中的Hb浓度是0.1～10g/L、反应温度为15～60℃、反应时间为10min～40h、pH在6～9范围。前述缓冲液可以用与上述同样的。还有，其它的蛋白酶也同样可以使用。
然后，把由上述蛋白酶处理得到的变性Hb分解物用FAOD处理。由此FAOD处理，催化了前述式(1)所示的反应。
此FAOD处理，与前述蛋白酶处理同样，在缓冲液中进行为优选。其处理条件随所使用的FAOD的种类、作为测定对象物的糖化Hb的浓度等来适当的确定。
具体说是，例如，反应液中的FAOD浓度是50～50,000U/L、反应液中的血球浓度是0.01～1体积％、反应温度为15～37℃、反应时间为1～60min、pH在6～9范围。前述缓冲液的种类也没有特别的限制，可以使用与上述蛋白酶处理同样的缓冲液。
然后，加入POD和上述显色性基质，采用POD使在前述FAOD处理中生成的过氧化氢与前述显色性基质进行氧化还原反应。
作为前述显色性基质，例如，列举有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠、邻苯二胺(OPD)、将トリンダ-试剂与4-氨基安替比林组合的基质等。作为前述トリンダ-试剂，例如，列举有苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。还有，除了前述4-氨基安替比林之外，氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉腙(SMBTH)等也可以使用。在这些显色性基质中，特别优选的是，如前前述，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠。
前述氧化还原反应通常是在缓冲液中进行的，其条件由前述生成的过氧化氢的浓度等来适当的确定。通常，反应液中的POD浓度是10～20,000IU/L、显色性基质浓度是0.0001～1mmol/L、反应温度为20～37℃、反应时间为1～5min、pH在6～9范围。还有，前述缓冲液的种类没有特别的限制，例如，可以使用与上述蛋白酶处理和FAOD处理等同样的缓冲液等。
而且，由前述氧化还原反应使前述显色性基质显色，用分光光度计测定前述反应液的显色程度(吸光度)。从此吸光度和校正曲线，例如，可以通过过氧化氢的量、或直接求出Hb糖化量。
前述吸光度的检测波长没有特别的限制，可以随前述显色性基质的种类而适当的确定，但在650～900nm范围为优选，650～800nm范围为更优选，650～760nm范围为特别优选。还有，当以上述波长为主波长来进行双波长测定时，副波长优选为730～900nm范围，800～900nm范围为更优选，800～850nm范围为特别优选。再者，副波长通常设定得比主波长高，设定得至少高出30nm以上为优选，高出50nm以上为更优选。
具体说，在使用N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠作为显色基质时，测定波长在650～760nm范围为优选，690～760nm范围为更优选。还有，当以上述波长为主波长来进行双波长测定时，副波长优选为800～900nm范围，800～850nm范围为更优选。
在此糖化率测定方法中，把上述变性Hb的测定波长与显色性基质的测定波长设定成彼此互不重叠的波长为优选。进而，在对显色性基质进行双波长测定时，主波长和副波长设定在变性Hb不显示吸收的范围为优选。再者，如果在显色反应之前，在显色性基质的测定波长下测定吸光度，由此对显色反应后的吸光度进行校正，就可以把精度更提高一步。
另一方面，也可以把上述变性Hb的测定波长与显色性基质的测定波长设定成相同的波长。在此时，可以将把Hb用四唑鎓化合物变性之后测定的吸光度作为变性Hb的吸光度，进而，由此吸光度对显色反应之后测定的吸光度进行校正。也就是说，如果从显色反应后的吸光度值导出变性Hb的吸光度值的话，则其成为显色的基质的吸光度。
这样，使前述两测定波长为相同波长的场合，前述波长，例如，440～700nm的范围为优选，500～670nm为更优选，540～670nm为特别优选。
然后，从所测定的吸光度和预先准备的校正曲线求出Hb糖化量，从此Hb糖化量和前述的Hb量，算出Hb糖化率。
前述校正曲线，例如，按照本发明的Hb糖化率测定方法，测定含有已知量的糖化Hb的标准试样在显色反应后的吸光度，从此吸光度和前述已知浓度就可以制成。
再者，前述过氧化氢量，除了可以由使用了前述POD等的酶方法测定以外，还可以由电学方法来测定。
这样，如果由四唑鎓化合物使Hb变性，并测定其量的话，则可以以一连串的操作进行Hb量和糖化量的测定，由此，就可以迅速且简便地测定。还有，由于在试样中预先加入了四唑鎓化合物，所以排除了试样中存在的各种还原物质对氧化还原反应的影响，可以进一步提高测定精度。
再者，Hb的糖化率，例如，以人的Hb为对象的场合，被称为HbAlc％，因此，本发明的Hb糖化率测定方法是一种对测定HbAlc％有用的方法。
接下来，关于本发明的Hb糖化率的测定方法，说明以前述全血作为试样的第2测定方法之一个例子。
与前述一样，用四唑鎓化合物使前述溶血试样中的Hb变性，再把前述试样进行蛋白酶处理，然后进行FAOD处理。进行此种用FAOD处理了的反应液的变性Hb测定、和用分光光度计测定前述反应液的显色程度(吸光度)即可。
在此场合，为了对同一反应液进行变性Hb和显色程度的测定，有必要把对两者的测定波长设定为不同的波长。例如，变性Hb的测定波长(A)为440～700nm范围，显色程度的测定波长(B)为500～800nm范围，优选(A)在500～670nm范围、(B)在540～670nm范围，更优选(A)在540～670nm范围、(B)在540～670nm范围。再者，(A)和(B)例如设定为相差30nm以上为好。
还有，在进行双波长测定的场合，例如，可以设定成以下那样。例如，(A)的主波长在440～700nm范围，副波长在730～900nm范围，(B)的主波长在500～800nm范围、副波长在800～900nm范围为优选，(A)的主波长在500～670nm范围，副波长在730～900nm范围，(B)的主波长在540～750nm范围、副波长在800～900nm范围为更优选，(A)的主波长在540～670nm范围，副波长在800nm～850nm范围，(B)的主波长在540～750nm范围、副波长在800～850nm范围为特别优选。
实施例
接下来说明实施例。
(实施例1)
此实施例是考察用四唑鎓化合物变性处理血球中的Hb，由其吸光度求出的Hb浓度与用国际标准HiCN法测定的Hb浓度的相关关系。以下，示出了使用的试样、试剂和方法。
(试样的调制)
把所采集的正常的健康人和糖尿病患者的全血分别进行离心分离(2000G，3min)，分离回收为血球和血浆。把前述血球与血浆按预定比例(血球∶血浆＝10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6)混合。然后，把这些混合液用0.4重量％的商品TritonX-100(和光纯药工业公司制造，下同)水溶液稀释15倍(体积)，将其作为试样，调制了合计45个试样。
(标准液)
把商品ヘモコン N(アズゥェル公司制造)用2.4重量％商品TritonX-100水溶液溶解，把Hb浓度调制为预定浓度(0、50、100、200、300g/L)，来作为标准液。
(WST-3溶液：下同)
把作为四唑鎓化合物的下述式(7)所示2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓单钠盐(商品名：WST-3，同仁化学研究所公司制造，下同)溶解在纯净水中，调制为浓度1.66mM。
Figure C0181650800191
(缓冲液)
0.1mM CHES缓冲液(pH9.0)
(测定方法)
在把前述试样用纯净水稀释3倍所成的稀释液25μL中混合前述CHES缓冲液15μL后，加入前述WST-3溶液45μL。把它在37℃下恒温5min后，用生化自动分析装置(日本电子公司制造的JCA-BM8，下同)，测定主波长596nm和副波长884nm的吸光度。下面把此吸光度称之为“WST-3法的吸光度”。还有，作为参比，用和光血红蛋白试剂(ヘモグロビンテストワコ-)(商品名，和光纯药工业公司制造)由HiCN法测定Hb浓度。下面把此浓度称之为“HiCN法的Hb浓度”。
另一方面，关于前述标准液用前述WST-3法测定的吸光度，制成表示前述吸光度与Hb浓度的关系的校正曲线。所得到的校正曲线以下式来表示：
y＝505.1x-6.1692
y：Hb浓度(g/L)，x：WST-3法的吸光度。
然后，把前述试样的WST-3法的吸光度代入前述校正曲线，求出Hb浓度。图1示出了从此校正曲线所求出的Hb浓度和由HiCN法得到的前述试样的Hb浓度的结果。
图1表示出了从前述校正曲线求出的Hb浓度(g/L)与由HiCN法得到的浓度(g/L)的相关关系，所得到的相关式的斜率为0.9733，近于1，实施例1表明可以以与参比的HiCN法进行的Hb测定同样优异的精度来测定Hb的浓度。还有，其相关系数为r＝0.9978，可知能稳定地进行高精度的测定。
(实施例2)
此实施例是用本发明的Hb测定方法测定Hb量，调查与用作为参比例的由SLS法测定的Hb量的相关关系。以下，示出了所使用的试样、试剂、测定方法等。
(溶血试剂)
TAPS(同仁化学公司制造)                          140mmol/L
甘氨酰胺(ナカライテスク公司制造)                 60mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(ナカライテスク公司制造)              24g/L
(第1试剂：pH5.5)
MES(同仁化学公司制造)                             5mmol/L
WST-3                                             2mmol/L
叠氮钠(ナカライテスク公司制造)                    0.05g/L
CaCl2(ナカライテスク公司制造)                    5mmol/L
NaCl(ナカライテスク公司制造)                    150mmol/L
金属蛋白酶(商品名：トョチ-ム，东洋纺丝公司制造)      3g/L
(第2试剂：pH6.9)
FAOD(ア-クレイ公司制造)                         26KU/L
POD(东洋纺社制造)                               78KU/L
DA-64(和光纯药工业公司制造)                0.052mmol/L
Tris-HCl(ナカライテスク公司制造)             200mmol/L
(试样)
从糖尿病患者和正常健康人共71人身上分别采取全血，将其经离心分离(1000G，10min)，回收血球成分。然后，在血球成分10μL中，加入前述溶血试剂40μL，调制溶血试样(下同)。
(测定方法)
在前述溶血试样10μL中加入纯净水10μL，再加入前述第1试剂65μL，在37℃下恒温(反应液量85μL)。然后，在恒温开始后的4.5min之后，关于前述反应液用前述生化自动分析装置测定在规定波长(545nm、571nm、596nm、658nm、694nm、751nm)的吸光度。此测定值在下面称之为“第1次测定值”。
接着，在恒温开始5min之后，在前述反应液中加入前述第2试剂45μL，在37℃下恒温3min(反应液量130μL)。然后，关于该反应液用前述装置测定在前述规定波长(545nm、571nm、596nm)的吸光度。此测定值在下面称之为“第2次测定值”。
作为参比，用前述SLS法来进行Hb的测定。首先，在与前述实施例2同样的溶血试样4μL中，加入纯净水4μL，再加入下述SLS法试剂100μL，在37℃下恒温5min。然后，在恒温开始5min之后，用前述装置测定在545nm的吸光度。
(SLS法试剂)
SLS                                  0.64g
Triton X-100                         0.75g
磷酸钾缓冲液(pH7.2)                  1.0L
将对全部试样(71个检体)测定的实施例的第1次和第2次的吸光度以及SLS法的参比例的吸光度作图(未图示出)，求出实施例与参比例的相关系数。下面的表1示出了这些结果。
                       表1
测定波长   第1次的吸光度测定的相关系数     第2次的吸光度测定的相关系数
    545nm571nm596nm658nm694nm751nm     0.9930.9930.9930.9930.9930.916     0.9930.9930.989---
如上述那样，用本发明的Hb测定方法，可进行显示出高达SLS法的相关关系的测定。还有，不仅是在用第1试剂来使Hb变性后立即测定，而且即使是在用前述第2试剂进行显色反应之后，仍可以准确测定变性Hb。
(实施例3)
本实施例是用本发明的Hb糖化率测定方法测定HbAlc％，调查与参比例之相关关系的例子。
与前述实施例2同样，关于前述溶血试样(71个检体)进行第1次的吸光度测定(测定波长571nm)和第2次的吸光度测定(测定波长751nm)。另一方面，使用Hb量和HbAlc量已知的标准试样，制成了表示本发明的第1次的吸光度与已知Hb量的关系的校正曲线(Hb校正曲线)和表示本发明的第2次的吸光度与已知的HbAlc量的关系的校正曲线(HbAlc校正曲线)。
接着，把前述第1次吸光度代入前述Hb校正曲线，把第2次吸光度代入前述HbAlc校正曲线，分别求其Hb量和HbAlc量。然后，把所得到的Hb量和HbAlc量代入下式，求出HbAlc％。
HbAlc％＝(HbAlc量/Hb量)×100
作为参比例，关于相同的溶血试样(71个检体)，用前述SLS法测定Hb量，用商品ラピデイアォ-トHbAlc(SRL公司制造)来测定HbAlc％。然后，分别求出相对于参比例的Hb浓度和HbAlc％的实施例的相关系数。
其结果是，Hb量的相关系数为0.994，HbAlc％的相关系数为0.9841，可知，本发明的Hb测定方法和Hb糖化率测定方法是精度非常高的方法。
(实施例4)
此实施例是用本发明的Hb糖化率测定方法测定HbAlc％，调查与参比例的相关关系的例子。
与前面的实施例2一样，关于前述溶血试样(71个检体)，进行第1次吸光度测定和第2次吸光度测定(下面也称为“修正前的吸光度”)。再者，第1次的吸光度测定时的测定波长是596nm、658nm、694nm、751nm，此吸光度作为变性Hb的吸光度。还有，第2次的吸光度测定时的测定波长是596nm、658nm、694nm和791nm。
如前所述，根据上述实施例3的结果，在751nm进行第2次吸光度测定时的HbAlc％，相对于参比例的相关系数为0.9841，值相当高。所以，证明了在进行751nm下的吸光度测定时，可以以高精度测定HbAlc量。由此，以在751nm的第2次吸光度为基准，求出了相对于它的各波长下的第2次吸光度的相关系数。
进而，对于上述第2次吸光度，用在各波长的第1次吸光度，按下面的公式进行修正(以下称为“修正后的吸光度”)。然后，以在751nm下的修正后的吸光度为基准，求出与此相对的在各波长下的修正后的吸光度的相关关系。下面的表2示出了这些结果。
修正后的吸光度＝A2-(A1×85/130)
A1：第1次吸光度，A2：第2次吸光度。
                      表2
    测定波长                 相关系数
    修正前的吸光度     修正后的吸光度
    596nm658nm694nm751nm     -0.97850.99981.0     0.94740.99981.01.0
从上面结果可知，在各波长下，可看到高达751nm的吸光度的相关关系，通过再进行修正更提高了相关系数。而且，从实施例2的结果可知，可以以高精度来进行Hb浓度的测定。所以，从实施例2和本实施例4的结果可知，用本发明的糖化率测定方法，可以以高精度测定HbAlc％。还有，如果这样地进行修正，就可以在相同的测定波长下来进行变性Hb和糖化Hb的吸光度测定。如果是相同的测定波长的话，那么例如测定装置的条件的设定等也简单了，进而也能够简便且迅速的测定。
产业上的利用可能性
如上述那样，用本发明的Hb测定方法，可以在没有环境问题情况下容易且准确测定试样中的Hb。还有，在测定Hb的糖化率时，根据本发明的Hb测定方法，即使用四唑鎓化合物处理试样，前述四唑鎓化合物对利用了氧化还原反应的糖化量的测定也没有影响。为此，可以以一连串的操作简便且高精度地进行Hb量测定和糖化量测定。为此，如果把利用了本发明的Hb测定方法的Hb糖化率测定方法适用于，例如，临床检查领域等，就进一步提高了糖化Hb的作为糖尿病诊断等的指标物质的可靠性和重要性。

Claims (22)

1.一种血红蛋白的测定方法，其特征在于，用四唑鎓化合物溶液使试样中的血红蛋白变性以得到变性血红蛋白，该溶液pH值范围为5.5-10；在对得到的变性血红蛋白特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量，从此光学变化量算出前述试样中的血红蛋白量。
2.权利要求1中所述的血红蛋白测定方法，其中，光学变化量是吸光度或反射率。
3.权利要求1中所述的血红蛋白测定方法，其中，测定波长在440～700nm的范围。
4.权利要求1中所述的血红蛋白测定方法，其中，四唑鎓化合物在四唑环的至少2个位置上有环结构取代基。
5.权利要求1中所述的血红蛋白测定方法，其中，四唑鎓化合物在四唑环的2位和3位有苯环，前述苯环中的至少1个有从卤基、羧基、硝基、羟基、磺基、甲氧基和乙氧基中选出的至少1个官能团。
6.权利要求1中所述的血红蛋白测定方法，其中，四唑鎓化合物是2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓盐。
7.权利要求1中所述的血红蛋白测定方法，其中，相对于每1μL试样添加0.001～100μmol范围的四唑鎓化合物。
8.权利要求1中所述的血红蛋白测定方法，其中，在表面活性剂存在下，用四唑鎓化合物处理前述试样中的血红蛋白。
9.权利要求8中所述的血红蛋白测定方法，其中，表面活性剂是聚氧乙烯醚。
10.权利要求8中所述的血红蛋白测定方法，其中，相对于1mol四唑鎓化合物添加0.01～70mol表面活性剂。
11.权利要求1中所述的血红蛋白测定方法，其中，试样含有红血球。
12.一种血红蛋白糖化率的测定方法，其特征在于，对含有糖化血红蛋白的试样用权利要求1中所述的血红蛋白测定方法测定血红蛋白量，另外使所得到的变性血红蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反应，通过测定此氧化还原反应来测定血红蛋白的糖化量，由前述血红蛋白量和前述糖化量来求出血红蛋白糖化率。
13.权利要求12中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其特征在于，在使变性血红蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反应之前，用蛋白酶处理前述变性血红蛋白。
14.权利要求12中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其特征在于，在对变性血红蛋白特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量之后，使前述变性血红蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反应。
15.权利要求14中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其特征在于，在对变性血红蛋白特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量之后，用蛋白酶处理前述变性血红蛋白，再使前述变性血红蛋白分解物的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反应。
16.权利要求14中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其特征在于，用蛋白酶处理变性血红蛋白，在对前述变性血红蛋白特异的吸收波长下测定前述试样的光学变化量之后，再使前述变性血红蛋白分解物的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反应。
17.权利要求12中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其特征在于，使前述变性血红蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反应之后，进行在对前述变性血红蛋白特异的吸收波长下的前述试样的光学变化量测定和前述氧化还原反应的测定。
18.权利要求12中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其中，前述氧化还原反应的测定是由此所产生的显色物质的光学变化量的测定。
19.权利要求18中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其特征在于，前述显色物质的光学变化量与通过变性血红蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶的反应而生成的过氧化氢量对应。
20.权利要求19中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其中，前述显色物质是使用氧化酶通过使过氧化氢和通过氧化而显色的基质反应而显色的前述基质。
21.权利要求18中所述的测定方法，其中，显色物质的测定波长是650～900nm。
22.权利要求18中所述的血红蛋白糖化率测定方法，其中，用于测定血红蛋白量的测定波长和显色物质的测定波长是同一波长。
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