JP2005006509A - メタロプロテアーゼの保存方法、および前記方法を用いたメタロプロテアーゼ試薬溶液 - Google Patents
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Abstract
【課題】メタロプロテアーゼを、溶液状態で安定に保存する方法を提供する。
【解決手段】メタロプロテアーゼを溶液中でカルシウムイオンおよびナトリウムイオンと共存させた状態で保存する。前記メタロプロテアーゼの濃度は、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、カルシウムイオンの濃度は、０．１〜３０ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ナトリウムイオンの濃度は、Ｃａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となる濃度範囲である。
【選択図】 なし
【解決手段】メタロプロテアーゼを溶液中でカルシウムイオンおよびナトリウムイオンと共存させた状態で保存する。前記メタロプロテアーゼの濃度は、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、カルシウムイオンの濃度は、０．１〜３０ｍｏｌ／Ｌの範囲であり、ナトリウムイオンの濃度は、Ｃａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となる濃度範囲である。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、メタロプロテアーゼを溶液中で安定に保存する方法、および前記方法により保存する試薬溶液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素は、通常、液体の反応系において使用されるため、溶媒に溶解した酵素溶液が用いられる。しかし、酵素は、溶液中では不安定であり失活し易いため、その種類に応じて、例えば、前記酵素溶液のｐＨを調整したり、安定化剤等を添加する必要がある。特に、溶液状態で酵素を保存する場合は、その条件設定が非常に重要なものとなる。
【０００３】
プロテアーゼの一種であるメタロプロテアーゼについては（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３）、溶液を調製する場合、例えば、ｐＨ約６．０以下の酸性条件下で、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムを共存させ、安定化させることが知られている。
【０００４】
このようなメタロプロテアーゼ溶液を保存する場合には、特に、メタロプロテアーゼを約１００，０００，０００Ｕ／Ｌ以上の高濃度に設定するか、または、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムをそれぞれ５０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以上の高濃度に設定する必要があり、また、長期保存する場合においては、さらに、グリセロール等の安定化剤を添加する必要もある。しかしながら、このような条件で保存しても、常温では極めて不安定であるという問題が生じる。このため、より一層メタロプロテアーゼの失活を防止して安定性を維持し、さらに、低温に限らず、常温においてもメタロプロテアーゼの安定性を維持できる保存方法が求められている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平５−２１１８６９号公報
【特許文献２】
特開平５−２６８９５０号公報
【特許文献３】
特開平６−２７３４１８号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、メタロプロテアーゼを溶液中で安定に保存する方法および前記方法により保存する試薬溶液の提供である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のメタロプロテアーゼの保存方法は、メタロプロテアーゼを溶液中で安定に保存する方法であって、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌのメタロプロテアーゼを含む前記溶液に、０．１〜３０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋、およびＣａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となるようにＮａ＋を共存させることを特徴とする。
【０００８】
このように、前記濃度範囲になるように、溶液中でメタロプロテアーゼ、Ｃａ２＋およびＮａ＋を共存させれば、メタロプロテアーゼの安定性が向上し、例えば、低温だけでなく常温条件下においてもメタロプロテアーゼの失活を防止して安定に保存することができる。
【０００９】
本発明の保存方法において、Ｃａ２＋の濃度は、好ましくは０．１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎａ＋の濃度は、好ましくは２０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００１０】
本発明の保存方法において、ｐＨ５．０〜６．５の条件下で保存することが好ましい。
【００１１】
本発明の保存方法において、さらに０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下、「テトラゾリウム化合物」ともいう）を共存させ、ｐＨ５．０〜６．５の条件下で保存することが好ましい。
【００１２】
メタロプロテアーゼは、例えば、糖化タンパク質や糖化ペプチドの測定に使用できるが、メタロプロテアーゼを前記糖化タンパク質等に作用させる際に、前記テトラゾリウム化合物を共存させれば、前記メタロプロテアーゼが活性化され、これによって測定精度を向上できることが、本発明者らによって見出されており、すでに別途出願されている（特願２０００−２９６５３９号）。したがって、メタロプロテアーゼと前記テトラゾリウム化合物とを共存させた状態で安定に保存できれば、例えば、前記糖化タンパク質等の測定の度に、前記メタロプロテアーゼおよびテトラゾリウム化合物の試薬溶液をそれぞれ調製する必要もなく、保存した前記両者を含む溶液を使用でき、容易かつ簡便に測定に適用することができる。しかしながら、前記テトラゾリウム化合物は溶液中にＣａ２＋が存在すると沈殿してしまうのに対して、メタロプロテアーゼの保存には前述のようにＣａ２＋が必要であり、また、前記テトラゾリウム化合物はｐＨ４．０〜ｐＨ５．０で安定であるのに対し、メタロプロテアーゼはｐＨ５．５〜ｐＨ６．５で安定であり、ｐＨ４．５以下では失活し易い。このように、前記テトラゾリウム化合物およびメタロプロテアーゼの両者は、保存に際して相反する条件を必要とするため、これらを同じ溶液中で安定に保存することは困難であると考えられていた。しかし、本発明者らによるさらなる検討の結果、本発明の条件によれば、前記メタロプロテアーゼだけでなく、その活性化剤となる前記テトラゾリウム化合物をも、同じ溶液中で安定に保存できることがわかった。このため、本発明の保存方法により保存したメタロプロテアーゼ溶液を、前述のような糖化タンパク質等の測定に適用すれば、測定をさらに容易かつ簡便に行うことができる。
【００１３】
本発明の保存方法において、前記テトラゾリウム化合物の安定性をより向上できることから、さらに０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアジ化ナトリウムを共存させることが好ましい。
【００１４】
このように、さらにテトラゾリウム化合物やアジ化ナトリウム等を共存させる場合、ｐＨが５．０〜６．５の範囲であることが好ましい。
【００１５】
具体的には、例えば、ｐＨ５．０〜６．５の条件下において、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌのメタロプロテアーゼを含む溶液に、０．１〜３０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋、Ｃａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となる濃度のＮａ＋、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩および０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌのアジ化ナトリウムを共存させることが好ましい。
【００１６】
本発明の保存方法において、前記溶液が、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯからなる群から選択された少なくとも一つの緩衝液を含むことが好ましい。
【００１７】
つぎに、本発明の試薬溶液は、メタロプロテアーゼ試薬溶液であって、メタロプロテアーゼ５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌ、Ｃａ２＋０．１〜３０ｍｍｏｌ／ＬおよびＣａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となる濃度のＮａ＋を含む試薬である。このような組成の試薬溶液であれば、前述のようにメタロプロテアーゼが安定化されるため、保存が可能となる。このため、例えば、酵素反応の度に試薬溶液を調製する必要がなく、有用な試薬であるといえる。
【００１８】
本発明の試薬溶液において、ｐＨが５．０〜６．５の範囲であることが好ましい。
【００１９】
本発明の試薬溶液において、さらに２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌを含むことが好ましく、さらにアジ化ナトリウム０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌを含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の試薬溶液において、前記テトラゾリウム化合物やアジ化ナトリウムを含む場合、例えば、ｐＨが５．０〜６．５の範囲であることが好ましい。
【００２１】
具体的には、メタロプロテアーゼ５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌ、Ｃａ２＋０．１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となる濃度のＮａ＋、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌおよびアジ化ナトリウム０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌを含み、そのｐＨが５．０〜６．５の範囲であることが好ましい。
【００２２】
本発明の試薬溶液において、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯからなる群から選択された少なくとも一つの緩衝液を含むことが好ましい。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明によるメタロプロテアーゼの保存は、例えば、前記メタロプロテアーゼと、Ｃａ化合物およびＮａ化合物とを水系の溶媒に溶解してメタロプロテアーゼ水溶液を調製し、これを保存すればよい。
【００２４】
前記Ｃａ化合物およびＮａ化合物としては、前記溶媒に溶解した時に、それぞれＣａ２＋およびＮａ＋にイオン化するものであれば特に制限されない。前記Ｃａ化合物としては、例えば、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、ＣａＳＯ４等が使用できる。また、前記Ｎａ化合物としては、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４等が使用できる。これらのＣａ化合物およびＮａ化合物は、それぞれ一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２５】
前記水溶液におけるメタロプロテアーゼの濃度は、前述のように、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは１００，０００〜１０，０００，０００Ｕ／Ｌの範囲である。
【００２６】
一方、前記Ｃａ化合物の濃度は、解離したＣａ２＋濃度が０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となるように、０．１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎａ化合物の濃度は、解離したＮａ＋濃度が２０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となるように、２０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００２７】
ＣａＣｌ２とＮａＣｌの割合は、例えば、ＣａＣｌ２ Ｘｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ Ｙｍｍｏｌ／Ｌとした場合に、「Ｘ×Ｙ」が４０〜８００の範囲になるよう設定することが好ましい。以下にその例を示す。
【００２８】
前記水系の溶媒としては、例えば、水、各種緩衝液等が使用できる。前記緩衝液としては、例えば、前述のように、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ等が使用できる。
【００２９】
前記緩衝液のｐＨは、例えば、５．０〜６．５の範囲であり、好ましくは５．５〜６．５の範囲である。
【００３０】
また、調製した前記メタロプロテアーゼ水溶液のｐＨは、特に制限されないが、例えば、５．０〜６．５の範囲であり、好ましくは５．５〜６．５の範囲である。
【００３１】
前記Ｃａ２＋およびＮａ＋を共存させたメタロプロテアーゼ水溶液の保存温度は、特に制限されないが、例えば、０〜３５℃の範囲であり、好ましくは２〜２５℃の範囲であり、より好ましくは２〜１５℃の範囲である。
【００３２】
前記水溶液を４℃で保存した場合、例えば、少なくとも１２０日以上安定に保存することができる。また、Ｃａ２＋およびＮａ＋を前記範囲で含有しない場合に比べて、安定に保存できる期間が５〜３０倍以上であるという効果を奏する。
【００３３】
また、前記メタロプロテアーゼ水溶液は、さらに、前記テトラゾリウム化合物「２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩」を含有してもよい。
【００３４】
前記テトラゾリウム化合物の濃度は、例えば、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．５〜４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、メタロプロテアーゼに対する添加割合は、メタロプロテアーゼ１，０００，０００Ｕに対して、例えば、０．３〜４ｍｍｏｌの範囲である。
【００３５】
このように、前記メタロプロテアーゼ水溶液がテトラゾリウム化合物を含有する場合は、例えば、さらにアジ化ナトリウムを含有してもよい。前記アジ化ナトリウムの濃度は、例えば、０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。メタロプロテアーゼに対する添加割合は、メタロプロテアーゼ１，０００，０００Ｕに対して、例えば、０．０５〜１．２ｍｍｏｌの範囲である。また、前記テトラゾリウム化合物に対する添加割合は、前記テトラゾリウム化合物１ｍｏｌに対して、例えば、０．２〜０．５ｍｏｌの範囲である。
【００３６】
また、前記メタロプロテアーゼ水溶液が、メタロプロテアーゼ、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩およびアジ化ナトリウムの全てを含有する場合の、各成分の濃度は、例えば、メタプロテア−ゼ ５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ ２０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩 ０．１〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＮ３ ０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、メタロプロテア−ゼ １００，０００〜１０，０００，０００Ｕ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ ５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩 ０．５〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＮ３ ０．１〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３７】
このような方法によれば、メタロプロテアーゼを溶液中で保存しても、失活が抑制されるため、前述のような構成のメタロプロテアーゼ水溶液は、液体試薬としても有用なものとなる。前記メタロプロテアーゼ液体試薬の用途は、特に制限されないが、さらに、前記テトラゾリウム化合物を共存させた場合は、例えば、前述のような糖化タンパク質、特に糖化ヘモグロビンの測定等に使用することが好ましい。
【００３８】
【実施例】
（実施例１および比較例１）
この実施例は、Ｃａ２＋およびＮａ＋の存在下で、メタロプロテアーゼ水溶液を保存し、メタロプロテアーゼの失活の抑制を調べた例である。
【００３９】
Ａ．保存方法
以下の組成になるように、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびテトラゾリウム化合物を含有するメタロプロテアーゼ試薬をそれぞれ調製して、これらを４℃で４８時間保存した。そして、保存後のメタロプロテアーゼ試薬を用いて、糖化ヘモグロビンの測定を行った。
【００４０】
（メタロプロテアーゼ試薬の組成）
【００４１】
前記メタロプロテアーゼとしてはアークレイ社製（以下同じ）を、前記テトラゾリウム化合物としては商品名ＷＳＴ−３（同仁化学社製、以下同じ）を使用した。
【００４２】
Ｂ．糖化ヘモグロビンの測定
糖化ヘモグロビンの測定は、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解し、分解物における糖化されたアミノ酸残基に、糖化アミノ酸酸化還元酵素（以下、「ＦＡＯＤ」という）を作用させ、発生した過酸化水素と発色基質とをペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により酸化還元反応させて、酸化により発色した前記基質の発色量を測定することにより、糖化ヘモグロビンの量を測定する方法である。前記プロテアーゼ処理を施すのは、糖化部分にＦＡＯＤを作用させ易くするために、糖化ヘモグロビンを分解する必要があるからである。したがって、プロテアーゼの一種であるメタロプロテアーゼの前記試薬溶液を用いて、前記糖化ヘモグロビンの測定を行えば、メタロプロテアーゼの活性に応じて糖化ヘモグロビンの分解物が生成されるため、メタロプロテアーゼが安定に保存されたか否かが評価できる。以下に測定方法を示す。
【００４３】
まず、下記測定試料を水で３倍希釈（体積）した希釈液２５μＬ、前記保存したメタロプロテアーゼ試薬６０μＬおよび下記発色試薬２５μＬとを混合した。そして、この混合液（１１０μＬ）を、生化学自動分析機（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）で、３７℃、８分間反応させ、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４４】
この結果を下記表１に示す。なお、下記表１において、実施例の結果には下線を付し、比較例の結果はかっこ内に記載した。
【００４５】
（測定試料の調製）
下記組成となるように測定試料を調製した。下記ＲＢＣとは、遠心分離した血球であり、ＨｂＡ１ｃ％が５．８％、７．８％、１０．２％であるＲＢＣを、Ｈｂ濃度１００ｇ／Ｌとなるように調製した。
【００４６】
【００４７】
（発色試薬の組成）
ＦＡＯＤ ４３．８ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ １３１．４ＫＵ／Ｌ
発色基質 ８７．６ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ６．９） ２００．０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４８】
前記ＦＡＯＤとしてアークレイ社製のＦＡＯＤを、前記発色基質Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムとして商品名ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）を使用した。
【００４９】
（表１）
【００５０】
本発明における濃度範囲でＣａＣｌ２およびＮａＣｌを含有するメタロプロテアーゼ試薬を使用した比較例（かっこ内）は、短時間で吸光度の低下が発生したが、一方、実施例（下線）は、比較例（かっこ内）に比べて高い吸光度を示した。これは、メタロプロテアーゼが十分に糖化ヘモグロビンに作用しているからであり、このことから、保存したメタロプロテアーゼは、十分に安定性が保たれて失活が防止されているといえる。
【００５１】
（実施例２および比較例２）
この実施例は、Ｃａ２＋およびＮａ＋の存在下で、メタロプロテアーゼ水溶液を保存し、失活の抑制を調べた例である。
【００５２】
Ａ．保存方法
以下の組成になるように、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびテトラゾリウム化合物を含有するメタロプロテアーゼ試薬（ａ〜ｆ）をそれぞれ調製して、これらを所定の温度（４℃、２５℃）で保存し、所定の期間経過後（０日、５日、９日、２０日、２６日、３３日）、サンプリングを行った。そして、サンプリングした保存後のメタロプロテアーゼ試薬を用いて、糖化ヘモグロビンの測定を行った。なお、メタロプロテアーゼ試薬ａ，ｄ，ｆが実施例であり、メタロプロテアーゼ試薬ｂ，ｃ，ｅが比較例である。
【００５３】
（メタロプロテアーゼ試薬の組成）
【００５４】
Ｂ．糖化ヘモグロビンの測定
まず、下記測定試料を水で３倍希釈（体積）した希釈液２５μＬ、前記保存したメタロプロテアーゼ試薬（ａ〜ｅ）６０μＬおよび前記発色試薬２５μＬとを混合した。そして、この混合液（１１０μＬ）を、前記生化学自動分析機で、３７℃、８分間反応させ、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５５】
（測定試料の調製）
下記組成となるように測定試料を調製した。なお、下記溶血液は、実施例１と同様にして調製し、そのＨｂ濃度は１００ｇ／Ｌとした。
【００５６】
【００５７】
この結果を下記表２、３および図１〜６に示す。なお、下記表２および図１〜図３は、前記メタロプロテアーゼを４℃で保存した場合の吸光度の結果であり、下記表３および図４〜図６は、２５℃で保存した場合の吸光度の結果である。また、図１および図４は、ＣａＣｌ２添加（ｅ）、無添加（ｂ，ｃ）の場合の吸光度と保存日数との関係を示したグラフであり、図２および図５は、ＮａＣｌ濃度を変化させた場合（ｄ，ｅ）の吸光度と保存日数との関係を示したグラフであり、図３および図６は、ｐＨを変化させた場合（ａ，ｅ）の吸光度と保存日数との関係を示したグラフである。
【００５８】
（表２）
【００５９】
（表３）
【００６０】
（１）ＣａＣｌ２の必要性について
前記表３に示すように、ＣａＣｌ２およびＮａｃｌの両方を含む実施例ｅによれば、ＣａＣｌ２を含まない以外は実施例ｅと同じ比較ｃに比べて、高い吸光度を示した。これはＣａＣｌ２およびＮａｃｌを共存させることによって、十分な安定性でメタロプロテアーゼを保存できたためといえる。
【００６１】
（２）ｐＨについて
前記表２、３および図３、６に示すように、保存温度がいずれの場合であっても、ｐＨ５．５の条件よりもｐＨ６．５の条件で保存する方が、より一層メタロプロテアーゼを安定に保存できることがわかった。
【００６２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の保存方法によれば、メタロプロテアーゼを安定に保存することができる。このため、メタロプロテアーゼの液体試薬が必要な場合でも、使用の度に試薬を調製する必要がないため、試薬の低コスト化が可能となり、測定操作も簡便なものとなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の保存方法の一実施例において、塩化カルシウム存在下におけるメタロプロテアーゼの保存日数（４℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図２】前記実施例において、ＮａＣｌ濃度を変化させた状態におけるメタロプロテアーゼの保存日数（４℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図３】前記実施例において、ｐＨ変化させた状態におけるメタロプロテアーゼの保存日数（４℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図４】前記実施例において、塩化カルシウム存在下におけるメタロプロテアーゼの保存日数（２５℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図５】前記実施例において、ＮａＣｌ濃度を変化させた状態におけるメタロプロテアーゼの保存日数（２５℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図６】前記実施例において、ｐＨ変化させた状態におけるメタロプロテアーゼの保存日数（２５℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【発明が属する技術分野】
本発明は、メタロプロテアーゼを溶液中で安定に保存する方法、および前記方法により保存する試薬溶液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素は、通常、液体の反応系において使用されるため、溶媒に溶解した酵素溶液が用いられる。しかし、酵素は、溶液中では不安定であり失活し易いため、その種類に応じて、例えば、前記酵素溶液のｐＨを調整したり、安定化剤等を添加する必要がある。特に、溶液状態で酵素を保存する場合は、その条件設定が非常に重要なものとなる。
【０００３】
プロテアーゼの一種であるメタロプロテアーゼについては（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３）、溶液を調製する場合、例えば、ｐＨ約６．０以下の酸性条件下で、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムを共存させ、安定化させることが知られている。
【０００４】
このようなメタロプロテアーゼ溶液を保存する場合には、特に、メタロプロテアーゼを約１００，０００，０００Ｕ／Ｌ以上の高濃度に設定するか、または、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムをそれぞれ５０ｍｍｏｌ／Ｌおよび１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以上の高濃度に設定する必要があり、また、長期保存する場合においては、さらに、グリセロール等の安定化剤を添加する必要もある。しかしながら、このような条件で保存しても、常温では極めて不安定であるという問題が生じる。このため、より一層メタロプロテアーゼの失活を防止して安定性を維持し、さらに、低温に限らず、常温においてもメタロプロテアーゼの安定性を維持できる保存方法が求められている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平５−２１１８６９号公報
【特許文献２】
特開平５−２６８９５０号公報
【特許文献３】
特開平６−２７３４１８号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、メタロプロテアーゼを溶液中で安定に保存する方法および前記方法により保存する試薬溶液の提供である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のメタロプロテアーゼの保存方法は、メタロプロテアーゼを溶液中で安定に保存する方法であって、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌのメタロプロテアーゼを含む前記溶液に、０．１〜３０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋、およびＣａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となるようにＮａ＋を共存させることを特徴とする。
【０００８】
このように、前記濃度範囲になるように、溶液中でメタロプロテアーゼ、Ｃａ２＋およびＮａ＋を共存させれば、メタロプロテアーゼの安定性が向上し、例えば、低温だけでなく常温条件下においてもメタロプロテアーゼの失活を防止して安定に保存することができる。
【０００９】
本発明の保存方法において、Ｃａ２＋の濃度は、好ましくは０．１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎａ＋の濃度は、好ましくは２０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００１０】
本発明の保存方法において、ｐＨ５．０〜６．５の条件下で保存することが好ましい。
【００１１】
本発明の保存方法において、さらに０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下、「テトラゾリウム化合物」ともいう）を共存させ、ｐＨ５．０〜６．５の条件下で保存することが好ましい。
【００１２】
メタロプロテアーゼは、例えば、糖化タンパク質や糖化ペプチドの測定に使用できるが、メタロプロテアーゼを前記糖化タンパク質等に作用させる際に、前記テトラゾリウム化合物を共存させれば、前記メタロプロテアーゼが活性化され、これによって測定精度を向上できることが、本発明者らによって見出されており、すでに別途出願されている（特願２０００−２９６５３９号）。したがって、メタロプロテアーゼと前記テトラゾリウム化合物とを共存させた状態で安定に保存できれば、例えば、前記糖化タンパク質等の測定の度に、前記メタロプロテアーゼおよびテトラゾリウム化合物の試薬溶液をそれぞれ調製する必要もなく、保存した前記両者を含む溶液を使用でき、容易かつ簡便に測定に適用することができる。しかしながら、前記テトラゾリウム化合物は溶液中にＣａ２＋が存在すると沈殿してしまうのに対して、メタロプロテアーゼの保存には前述のようにＣａ２＋が必要であり、また、前記テトラゾリウム化合物はｐＨ４．０〜ｐＨ５．０で安定であるのに対し、メタロプロテアーゼはｐＨ５．５〜ｐＨ６．５で安定であり、ｐＨ４．５以下では失活し易い。このように、前記テトラゾリウム化合物およびメタロプロテアーゼの両者は、保存に際して相反する条件を必要とするため、これらを同じ溶液中で安定に保存することは困難であると考えられていた。しかし、本発明者らによるさらなる検討の結果、本発明の条件によれば、前記メタロプロテアーゼだけでなく、その活性化剤となる前記テトラゾリウム化合物をも、同じ溶液中で安定に保存できることがわかった。このため、本発明の保存方法により保存したメタロプロテアーゼ溶液を、前述のような糖化タンパク質等の測定に適用すれば、測定をさらに容易かつ簡便に行うことができる。
【００１３】
本発明の保存方法において、前記テトラゾリウム化合物の安定性をより向上できることから、さらに０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアジ化ナトリウムを共存させることが好ましい。
【００１４】
このように、さらにテトラゾリウム化合物やアジ化ナトリウム等を共存させる場合、ｐＨが５．０〜６．５の範囲であることが好ましい。
【００１５】
具体的には、例えば、ｐＨ５．０〜６．５の条件下において、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌのメタロプロテアーゼを含む溶液に、０．１〜３０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋、Ｃａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となる濃度のＮａ＋、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩および０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌのアジ化ナトリウムを共存させることが好ましい。
【００１６】
本発明の保存方法において、前記溶液が、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯからなる群から選択された少なくとも一つの緩衝液を含むことが好ましい。
【００１７】
つぎに、本発明の試薬溶液は、メタロプロテアーゼ試薬溶液であって、メタロプロテアーゼ５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌ、Ｃａ２＋０．１〜３０ｍｍｏｌ／ＬおよびＣａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となる濃度のＮａ＋を含む試薬である。このような組成の試薬溶液であれば、前述のようにメタロプロテアーゼが安定化されるため、保存が可能となる。このため、例えば、酵素反応の度に試薬溶液を調製する必要がなく、有用な試薬であるといえる。
【００１８】
本発明の試薬溶液において、ｐＨが５．０〜６．５の範囲であることが好ましい。
【００１９】
本発明の試薬溶液において、さらに２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌを含むことが好ましく、さらにアジ化ナトリウム０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌを含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の試薬溶液において、前記テトラゾリウム化合物やアジ化ナトリウムを含む場合、例えば、ｐＨが５．０〜６．５の範囲であることが好ましい。
【００２１】
具体的には、メタロプロテアーゼ５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌ、Ｃａ２＋０．１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となる濃度のＮａ＋、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌおよびアジ化ナトリウム０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌを含み、そのｐＨが５．０〜６．５の範囲であることが好ましい。
【００２２】
本発明の試薬溶液において、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯからなる群から選択された少なくとも一つの緩衝液を含むことが好ましい。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明によるメタロプロテアーゼの保存は、例えば、前記メタロプロテアーゼと、Ｃａ化合物およびＮａ化合物とを水系の溶媒に溶解してメタロプロテアーゼ水溶液を調製し、これを保存すればよい。
【００２４】
前記Ｃａ化合物およびＮａ化合物としては、前記溶媒に溶解した時に、それぞれＣａ２＋およびＮａ＋にイオン化するものであれば特に制限されない。前記Ｃａ化合物としては、例えば、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、ＣａＳＯ４等が使用できる。また、前記Ｎａ化合物としては、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４等が使用できる。これらのＣａ化合物およびＮａ化合物は、それぞれ一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００２５】
前記水溶液におけるメタロプロテアーゼの濃度は、前述のように、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌの範囲であり、好ましくは１００，０００〜１０，０００，０００Ｕ／Ｌの範囲である。
【００２６】
一方、前記Ｃａ化合物の濃度は、解離したＣａ２＋濃度が０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となるように、０．１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、Ｎａ化合物の濃度は、解離したＮａ＋濃度が２０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲となるように、２０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００２７】
ＣａＣｌ２とＮａＣｌの割合は、例えば、ＣａＣｌ２ Ｘｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ Ｙｍｍｏｌ／Ｌとした場合に、「Ｘ×Ｙ」が４０〜８００の範囲になるよう設定することが好ましい。以下にその例を示す。
前記水系の溶媒としては、例えば、水、各種緩衝液等が使用できる。前記緩衝液としては、例えば、前述のように、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ等が使用できる。
【００２９】
前記緩衝液のｐＨは、例えば、５．０〜６．５の範囲であり、好ましくは５．５〜６．５の範囲である。
【００３０】
また、調製した前記メタロプロテアーゼ水溶液のｐＨは、特に制限されないが、例えば、５．０〜６．５の範囲であり、好ましくは５．５〜６．５の範囲である。
【００３１】
前記Ｃａ２＋およびＮａ＋を共存させたメタロプロテアーゼ水溶液の保存温度は、特に制限されないが、例えば、０〜３５℃の範囲であり、好ましくは２〜２５℃の範囲であり、より好ましくは２〜１５℃の範囲である。
【００３２】
前記水溶液を４℃で保存した場合、例えば、少なくとも１２０日以上安定に保存することができる。また、Ｃａ２＋およびＮａ＋を前記範囲で含有しない場合に比べて、安定に保存できる期間が５〜３０倍以上であるという効果を奏する。
【００３３】
また、前記メタロプロテアーゼ水溶液は、さらに、前記テトラゾリウム化合物「２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩」を含有してもよい。
【００３４】
前記テトラゾリウム化合物の濃度は、例えば、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．５〜４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。また、メタロプロテアーゼに対する添加割合は、メタロプロテアーゼ１，０００，０００Ｕに対して、例えば、０．３〜４ｍｍｏｌの範囲である。
【００３５】
このように、前記メタロプロテアーゼ水溶液がテトラゾリウム化合物を含有する場合は、例えば、さらにアジ化ナトリウムを含有してもよい。前記アジ化ナトリウムの濃度は、例えば、０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．１〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。メタロプロテアーゼに対する添加割合は、メタロプロテアーゼ１，０００，０００Ｕに対して、例えば、０．０５〜１．２ｍｍｏｌの範囲である。また、前記テトラゾリウム化合物に対する添加割合は、前記テトラゾリウム化合物１ｍｏｌに対して、例えば、０．２〜０．５ｍｏｌの範囲である。
【００３６】
また、前記メタロプロテアーゼ水溶液が、メタロプロテアーゼ、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩およびアジ化ナトリウムの全てを含有する場合の、各成分の濃度は、例えば、メタプロテア−ゼ ５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ ２０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩 ０．１〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＮ３ ０．０３〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、メタロプロテア−ゼ １００，０００〜１０，０００，０００Ｕ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．５〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ ５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌ、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフィドフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩 ０．５〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＮ３ ０．１〜１．２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３７】
このような方法によれば、メタロプロテアーゼを溶液中で保存しても、失活が抑制されるため、前述のような構成のメタロプロテアーゼ水溶液は、液体試薬としても有用なものとなる。前記メタロプロテアーゼ液体試薬の用途は、特に制限されないが、さらに、前記テトラゾリウム化合物を共存させた場合は、例えば、前述のような糖化タンパク質、特に糖化ヘモグロビンの測定等に使用することが好ましい。
【００３８】
【実施例】
（実施例１および比較例１）
この実施例は、Ｃａ２＋およびＮａ＋の存在下で、メタロプロテアーゼ水溶液を保存し、メタロプロテアーゼの失活の抑制を調べた例である。
【００３９】
Ａ．保存方法
以下の組成になるように、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびテトラゾリウム化合物を含有するメタロプロテアーゼ試薬をそれぞれ調製して、これらを４℃で４８時間保存した。そして、保存後のメタロプロテアーゼ試薬を用いて、糖化ヘモグロビンの測定を行った。
【００４０】
（メタロプロテアーゼ試薬の組成）
前記メタロプロテアーゼとしてはアークレイ社製（以下同じ）を、前記テトラゾリウム化合物としては商品名ＷＳＴ−３（同仁化学社製、以下同じ）を使用した。
【００４２】
Ｂ．糖化ヘモグロビンの測定
糖化ヘモグロビンの測定は、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで分解し、分解物における糖化されたアミノ酸残基に、糖化アミノ酸酸化還元酵素（以下、「ＦＡＯＤ」という）を作用させ、発生した過酸化水素と発色基質とをペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により酸化還元反応させて、酸化により発色した前記基質の発色量を測定することにより、糖化ヘモグロビンの量を測定する方法である。前記プロテアーゼ処理を施すのは、糖化部分にＦＡＯＤを作用させ易くするために、糖化ヘモグロビンを分解する必要があるからである。したがって、プロテアーゼの一種であるメタロプロテアーゼの前記試薬溶液を用いて、前記糖化ヘモグロビンの測定を行えば、メタロプロテアーゼの活性に応じて糖化ヘモグロビンの分解物が生成されるため、メタロプロテアーゼが安定に保存されたか否かが評価できる。以下に測定方法を示す。
【００４３】
まず、下記測定試料を水で３倍希釈（体積）した希釈液２５μＬ、前記保存したメタロプロテアーゼ試薬６０μＬおよび下記発色試薬２５μＬとを混合した。そして、この混合液（１１０μＬ）を、生化学自動分析機（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）で、３７℃、８分間反応させ、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４４】
この結果を下記表１に示す。なお、下記表１において、実施例の結果には下線を付し、比較例の結果はかっこ内に記載した。
【００４５】
（測定試料の調製）
下記組成となるように測定試料を調製した。下記ＲＢＣとは、遠心分離した血球であり、ＨｂＡ１ｃ％が５．８％、７．８％、１０．２％であるＲＢＣを、Ｈｂ濃度１００ｇ／Ｌとなるように調製した。
【００４６】
（発色試薬の組成）
ＦＡＯＤ ４３．８ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ １３１．４ＫＵ／Ｌ
発色基質 ８７．６ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ酸緩衝液（ｐＨ６．９） ２００．０ｍｍｏｌ／Ｌ
【００４８】
前記ＦＡＯＤとしてアークレイ社製のＦＡＯＤを、前記発色基質Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムとして商品名ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）を使用した。
【００４９】
（表１）
本発明における濃度範囲でＣａＣｌ２およびＮａＣｌを含有するメタロプロテアーゼ試薬を使用した比較例（かっこ内）は、短時間で吸光度の低下が発生したが、一方、実施例（下線）は、比較例（かっこ内）に比べて高い吸光度を示した。これは、メタロプロテアーゼが十分に糖化ヘモグロビンに作用しているからであり、このことから、保存したメタロプロテアーゼは、十分に安定性が保たれて失活が防止されているといえる。
【００５１】
（実施例２および比較例２）
この実施例は、Ｃａ２＋およびＮａ＋の存在下で、メタロプロテアーゼ水溶液を保存し、失活の抑制を調べた例である。
【００５２】
Ａ．保存方法
以下の組成になるように、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌおよびテトラゾリウム化合物を含有するメタロプロテアーゼ試薬（ａ〜ｆ）をそれぞれ調製して、これらを所定の温度（４℃、２５℃）で保存し、所定の期間経過後（０日、５日、９日、２０日、２６日、３３日）、サンプリングを行った。そして、サンプリングした保存後のメタロプロテアーゼ試薬を用いて、糖化ヘモグロビンの測定を行った。なお、メタロプロテアーゼ試薬ａ，ｄ，ｆが実施例であり、メタロプロテアーゼ試薬ｂ，ｃ，ｅが比較例である。
【００５３】
（メタロプロテアーゼ試薬の組成）
Ｂ．糖化ヘモグロビンの測定
まず、下記測定試料を水で３倍希釈（体積）した希釈液２５μＬ、前記保存したメタロプロテアーゼ試薬（ａ〜ｅ）６０μＬおよび前記発色試薬２５μＬとを混合した。そして、この混合液（１１０μＬ）を、前記生化学自動分析機で、３７℃、８分間反応させ、主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５５】
（測定試料の調製）
下記組成となるように測定試料を調製した。なお、下記溶血液は、実施例１と同様にして調製し、そのＨｂ濃度は１００ｇ／Ｌとした。
【００５６】
この結果を下記表２、３および図１〜６に示す。なお、下記表２および図１〜図３は、前記メタロプロテアーゼを４℃で保存した場合の吸光度の結果であり、下記表３および図４〜図６は、２５℃で保存した場合の吸光度の結果である。また、図１および図４は、ＣａＣｌ２添加（ｅ）、無添加（ｂ，ｃ）の場合の吸光度と保存日数との関係を示したグラフであり、図２および図５は、ＮａＣｌ濃度を変化させた場合（ｄ，ｅ）の吸光度と保存日数との関係を示したグラフであり、図３および図６は、ｐＨを変化させた場合（ａ，ｅ）の吸光度と保存日数との関係を示したグラフである。
【００５８】
（表２）
（表３）
（１）ＣａＣｌ２の必要性について
前記表３に示すように、ＣａＣｌ２およびＮａｃｌの両方を含む実施例ｅによれば、ＣａＣｌ２を含まない以外は実施例ｅと同じ比較ｃに比べて、高い吸光度を示した。これはＣａＣｌ２およびＮａｃｌを共存させることによって、十分な安定性でメタロプロテアーゼを保存できたためといえる。
【００６１】
（２）ｐＨについて
前記表２、３および図３、６に示すように、保存温度がいずれの場合であっても、ｐＨ５．５の条件よりもｐＨ６．５の条件で保存する方が、より一層メタロプロテアーゼを安定に保存できることがわかった。
【００６２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の保存方法によれば、メタロプロテアーゼを安定に保存することができる。このため、メタロプロテアーゼの液体試薬が必要な場合でも、使用の度に試薬を調製する必要がないため、試薬の低コスト化が可能となり、測定操作も簡便なものとなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の保存方法の一実施例において、塩化カルシウム存在下におけるメタロプロテアーゼの保存日数（４℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図２】前記実施例において、ＮａＣｌ濃度を変化させた状態におけるメタロプロテアーゼの保存日数（４℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図３】前記実施例において、ｐＨ変化させた状態におけるメタロプロテアーゼの保存日数（４℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図４】前記実施例において、塩化カルシウム存在下におけるメタロプロテアーゼの保存日数（２５℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図５】前記実施例において、ＮａＣｌ濃度を変化させた状態におけるメタロプロテアーゼの保存日数（２５℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
【図６】前記実施例において、ｐＨ変化させた状態におけるメタロプロテアーゼの保存日数（２５℃）と糖化ヘモグロビンに相当する吸光度の関係を示したグラフである。
Claims (1)
- メタロプロテアーゼを溶液中で安定に保存する方法であって、５０，０００〜２０，０００，０００Ｕ／Ｌのメタロプロテアーゼを含む溶液に、０．１〜３０ｍｍｏｌ／ＬのＣａ２＋、およびＣａ２＋濃度とＮａ＋濃度との積が４０〜８００ｍｍｏｌ２／Ｌ２となるようにＮａ＋を共存させることを特徴とする保存方法。
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